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Submitted by Carlos Alberto Zanutto Bassetto Júnior null (cbjunior@fc.unesp.br) on 2016-06-30T16:14:01Z No. of bitstreams: 1 DocNãoPublicação_carlosbassettojr.pdf: 427722 bytes, checksum: fe38077e0c0376645f906842534a3f88 (MD5) Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-07-05T16:31:24Z (GMT) No. of bitstreams: 1 bassettojunior_caz_dr_bauru.pdf: 201721 bytes, checksum: afaa803c4d84d32fc5d6b4fc9fe23555 (MD5) Made available in DSpace on 2016-07-05T16:31:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 bassettojunior_caz_dr_bauru.pdf: 201721 bytes, checksum: afaa803c4d84d32fc5d6b4fc9fe23555 (MD5) Previous issue date: 2016-06-23 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Esta tese teve como objetivo estudar as moléculas orgânicas (N-alquilbenzenossulfonamidas) como inibidoras de canais para potássio do tipo KV3.1, heterologamente expressos em células L-929. Com o presente estudo constatou-se que as moléculas, N-alquilbenzenossulfonamidas, produzem efeitos inibitórios sobre KV3.1. Através da técnica de whole cell patch clamp, observou-se que os valores de IC50 para as moléculas que bloquearam o canal foram 13,5 μM, 16,9 μM, 25,9 μM, 34,2 μM, 34,9 μM e 60 μM, respectivamente, para 4-cloro-3-nitro-N-butilbenzenossulfonamida (SMD2), 4-cloro-3-nitro-N-furfutilbenzenossulfonamida (SMD3), 4-[N-(3’aminopropil)-2-pirrolidona]-3-nitro-N-butilbenzenossulfonamida (SMD2_APP), 4-[N-(3’aminopropil)-2-pirrolidona]-3-nitro-N-furfurilbenzenossulfonamida (SMD3_APP), 4-cloro-N-butilbenzenossulfonamida (SMD2_SN) e 4-cloro-N-furfurilbenzenossulfonamida (SMD3_SN). O efeito de todas as moléculas mostrou-se reversível quanto à ligação com o canal e todas atuaram como bloqueadores de canal aberto. Em SMD2, molécula que mostrou o menor valor de IC50, observou-se um deslocamento de -8 mV em relação ao controle, nas curvas de condutância versus voltagem, nas cinéticas de ativação e na recuperação a partir da inativação em relação à voltagem. O SMD2 não alterou as constantes de tempo de desativação, embora tenha mudado as constantes de ativação e inativação, além de ter induzido o fenômeno de tail crossover. Observou-se que para potenciais mais despolarizados, ocorreu o alívio do bloqueio (Block Relief). Não foi observado o efeito da dependência do pH para o bloqueio e SMD2 não mudou a seletividade do canal. Constatou-se que pulsos despolarizantes de curta duração induzem efeitos menos intensos, ao passo que pulsos despolarizantes mais longos, produzem efeitos mais intensos de SMD2 sobre o canal. Além disso, foi observado que, quanto mais o canal é usado, ou seja, aberto, mais ele é bloqueado por SMD2. Todos esses dados sugerem que SMD2 não interage com o estado fechado e nem com o estado inativado do canal, mas sim com seu estado aberto, apresentando também um efeito dependente de uso. De um ponto de vista farmacológico, isso indica que SMD2 pode ser uma molécula importante na modulação da atividade dos canais KV3.1, presentes em células com altas frequências de disparos de potencial de ação, podendo constituir uma nova classe de moduladores farmacológicos desses canais. This thesis had the aim of studying the organic molecules (N-alkylbenzenesulfonamides) that block KV3.1 potassium channel heterologously expressed in L-929 cells. It was found that N-alkylbenzenesulfonamides have restrained effects on KV3.1. Through the whole cell patch clamp technique, it was observed that the values of IC50, for molecules that block the channel, were 13,5 μM, 16,9 μM, 25,9 μM, 34,2 μM, 34,9 μM and 60 μM, respectively 4-Chloro-3-nitro-N-butylbenzenesulfonamide (SMD2), 4-Chloro-3-nitro-N-furfurylbenzene-sulfonamide (SMD3), 4-[N-(3′-Aminopropyl)-2-pyrrolidone]-3-nitro-N-butylbenzenesulfona-mide (SMD2_APP), 4-[N-(3′-Aminopropyl)-2-pyrrolidone]-3-nitro-N-furfurylbenzene-sulfonamide (SMD3_APP), 4-Chloro-N-butyllbenzenesulfonamide (SMD2_SN) e 4-Chloro-N-furfurylbenzenesulfonamide(SMD3_SN). The effect of all molecules was reversible regards to the linking with the channel and all act as open channel blocker. In SMD2, molecule which showed the smallest value of IC50, it was observed a displacement of -8 mV compared to control, for conductance curves versus voltage, for the kinetics of activation and for the recovery from inactivation in relation to voltage. SMD2 did not change the deactivation of time constants, although it changed the activation and inactivation constants, and more, SMD2 have induced tail crossover phenomenon. It was observed that, for more depolarized potentials, there was a block relief. It was not observed the effect of pH dependence for the block and SMD2 did not change the channel selectivity. It was observed that, short duration depolarizing pulses prompt less intense effects, whereas long duration depolarizing pulses prompt more intense effects of SMD2 on the channels. Furthermore, it was observed that the more the channel is used, in an open state, the more it is blocked by SMD2. All of these data suggest that SMD2 does not interact neither with the closed state nor the inactivated state of channel, but with its open state presenting an use-dependent manner, also showing a use-dependent effect. In a pharmacological point of view, this indicates that SMD2 may be an important molecule in the modulation of the activity in the KV3.1 channels, presents in cells with high frequency of firing of action potential and may constitute a new class of pharmacological modulators.

Submitted by ROBERTO PAULO CORREIA DE ARAÚJO (ppgorgsistem@ufba.br) on 2016-10-18T14:55:15Z No. of bitstreams: 1 Milena Ramos Reis.pdf: 2152638 bytes, checksum: 876fac844a4f4a8b22cb82e9cdeb5f3b (MD5) Made available in DSpace on 2016-10-18T14:55:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Milena Ramos Reis.pdf: 2152638 bytes, checksum: 876fac844a4f4a8b22cb82e9cdeb5f3b (MD5) O carvacrol, um monoterpeno fenólico encontrado nos óleos essenciais de diversas plantas do gênero Origanum, já demonstrou causar hipotensão e vasodilatação em diferentes leitos vasculares de ratos normotensos, porém, seu efeito em ratos hipertensos ainda não foi elucidado. O objetivo deste estudo foi investigar os efeitos cardiovasculares do carvacrol em ratos espontaneamente hipertensos (SHR) e comparar com normotensos Wistar, utilizando ensaios farmacológicos in vitro (estudos funcionais e celulares) e in vivo. Nos ensaios funcionais in vitro, anéis de artéria mesentérica superior isolada de animais hipertensos e normotensos foram précontraídos com FEN (1μM) e o efeito de carvacrol (10-8-10-3M) foi observado. Em SHR, este monoterpeno induziu vasodilatação dependente de concentração (pD2=5,13 ± 0,05; Emáx=115,14 ± 5,46%; N=8) e, após a remoção do endotélio funcional, a potência da droga foi alterada significantemente (pD2=4,91 ± 0,05 N=9; p

Among the natural products with experimentally proven analgesic properties, the monoterpernes are of great importance, recognized as the main chemical constituents of essential oils from aromatic plants. ( )-Carvone is an example of monoterpene with antinociceptive properties, founded as the main active constituent of oils from some species of the genus Mentha. Since the peripheral antinociceptive mechanism of ( )-carvone is not well established, this study aimed to better characterize it. Initially, it was performed a structure-activity study by which was possible to demonstrate the importance of the carbonyl group into the molecule of ( )-carvone, during its blocking effect in the rat peripheral nervous excitability, as also that the replacement of that group for a hydroxyl enhanceed this effect. After shown that ( )-carvone had low cytotoxicity, we investigated the effects of this monoterpene in the voltage-gated sodium channels of (Nav) and the transient receptor potential vanilloid 1 (TRPV1), involved in peripheral nociception, using neurons from the dorsal root ganglion (DRG) of rats. With the technique of Whole-cell Patch-clamp it was demonstrated that ( )-carvone (1 mM) was able to reduce Na+ influx from 8.7±1.6 nA (control) to 5.3±1.1 nA (p

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico A caracterização de canais iônicos em células tronco é importante pelo fato destas estruturas atuarem no controle da proliferação e diferenciação destas células. Há poucos trabalhos focados nos canais iônicos presentes nas membranas plasmáticas das células tronco e nenhum deles trata das células tronco mesenquimais da geléia de Wharton do cordão umbilical humano (whMSC). O cordão umbilical é uma fonte importante de células tronco para tão esperada terapia celular. Estes fatos motivaram o estudo dos canais iônicos das whMSC como objetivo maior do presente trabalho. Foi utilizada a técnica de patch-clamp na configuração whole-cell e a atuação de inibidores específicos para identificar os canais iônicos presentes nas whMSC. Os inibidores escolhidos foram: tetraetilamonio (TEA) e 4-aminopiridina (4-AP) como inibidores de canais de potássio dependentes de voltagem e de Ca2+, Glibenclamida (GB) um inibidor de canais de potássio dependentes de ATP, canais aniônicos dependentes de volume celular e CFTR e 5-nitro-2-(3-phenylpropylamino) ácido benzóico (NPPB) um potente bloqueador dos canais de cloreto, mas que também é capaz de bloquear os canais de potássio dependentes de Ca2+ de condutância intermediária. Os resultados mostraram que as correntes iônicas ativadas por voltagem das whMSC podem ser bloqueadas consideravelmente por TEA (10 mM), 4-AP (5 mM) e NPPB (100 μM) indicando a presença dos canais de K+ dependentes de voltagem e de Ca2+ e de canais de Cl- dependentes de voltagem conforme descrito para células tronco de outras origens. Utilizando GB (100 μM) observamos um aumento (estimulação) significativo da corrente. Este é um resultado inédito, pois estudos anteriores demonstram que o GB atua inibindo a corrente iônica transmembrana. Em todos os casos, com todos os inibidores testados, os efeitos foram reversíveis. Estes resultados demonstram que as membranas citoplasmáticas das whMSC possuem canais de K+ dependentes de voltagem e de Ca2+ e canais de Cl- dependentes de voltagem. O surpreendente efeito da glibenclamida indica a presença de canais iônicos desconhecidos nas membranas das whMSC

It was been demonstrated that curine and reticuline, induced a vasodilator effect in the rat small mesenteric arteries through inhibition of voltage-gated Ca2+ channels (VGCC). These compounds, curine and reticuline were isolated from the root barks of Chondrondendron platyphyllum and Ocotea duckei Vattimo, respectively, therefore the aim of this work was to evaluate the vasodilator mechanism of curine and reticuline, bisbenzylisoquinoline alkaloids (BBA), isolated from the root barks of Chondrondendron platyphyllum and Ocotea duckei Vattimo, respectively, using functional and molecular approaches. Tension measurements in aorta rings, whole-cell patch-clamp and confocal techniques were employed to study the action of these alkaloids. The A7r5 smooth muscle derived cell line was used for Ca2+ currents measuring and the intracellular calcium concentration ([Ca2+]i) were evaluated using confocal microscopy. The main results are as follows: in aortic rings, curine (3 - 300 μM) antagonized KCl (60 mM) and Bay K8644 (3 x 10-7 M) induced contractions. In whole-cell configuration, curine reduced the voltage-activated peak amplitude of ICa,L in a concentration-dependent manner. However, the Ca+2 current density versus voltage relationship and maximal activation voltage of ICa,L were not changed. Moreover curine did not also affect the steady-state activation of ICa,L, but shifted the steady-state inactivation curve of ICa,L for more negative potentials, however this effect was not changed in the presence of IBMX, dbcAMP and 8-brcGMP, suggesting that cyclic mononucleotides, such as cAMP and cGMP, are not involved in curine effect. In confocal experiments, curine inhibited the rise on the [Ca2+]i induced by KCl (60 mM) in dispersed vascular smooth muscle cells. In reference to reticuline (3 300 μM) was verified that alkaloid agonized CaCl2 and KCl-induced contractions and elicited vasorelaxation in aortic rings. In whole-cell configuration, reticuline reduced the voltage-activated peak amplitude of ICa,L in a concentration-dependent manner, but did not change the characteristics of current density versus. voltage relationship. Reticuline shifted leftwards the steady-state inactivation curve of ICa,L, however this effect was not changed after application of dibutyryl cyclic adenosine monophosphate to the cell. In cells pretreated with forskolin, an adenylate cyclase activator, the addition of reticuline caused further inhibition of the Ca2+ currents suggesting an additive effect, indicating that cyclic mononucleotides were not involved. Taken together the results have shown that curine and reticuline elicits vasorelaxation due to the blockade of the L-type voltage-dependent Ca2+ current in rat aorta smooth muscle cells. The reported effect may contribute to the potential cardioprotective efficacy of curine and reticuline. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES Curina e reticulina são alcalóides isolados das cascas do caule e raízes de Chondrondendron platyphyllum e de Ocotea duckei Vattimo, respectivamente. Estudos anteriores demonstraram que esses alcalóides são capazes de induzir efeito vasodilatador em artéria mesentérica e aorta de rato, respectivamente, devido possível inibição dos canais para Ca2+ dependentes de voltagem (VGCC). O objetivo deste trabalho foi investigar o mecanismo vasodilatador de curina e reticulina realizando experimentações funcionais e moleculares. Foram utilizadas medidas de tensão em anéis de aorta de rato, e empregadas técnicas de patch-clamp e de microscopia confocal para estudos da ação desses alcalóides. Também foram utilizadas células A7r5, uma linhagem de células musculares lisas embrionária derivada de aorta torácica de rato, que foram usadas para medir as correntes de Ca2+ macroscópicas e a concentração de cálcio intracelular ([Ca2+]i), que foram avaliadas usando a técnicas de patch-clamp e microscopia confocal, respectivamente. Os principais resultados são: em anéis de aorta, curina (3 - 300 μM) antagonizou as contrações induzidas por KCl (60 mM) e Bay K8644 (3 x 10-7 M). Na configuração whole-cell patch clamp , curina reduziu a amplitude da corrente de cálcio do tipo L (ICa,L) de maneira dependente de concentração. Porém, curina não alterou as características das correntes na relação corrente-voltagem. A voltagem de ativação máxima para ICa,L não foi diferente em relação ao controle. Além disso, curina também não afetou a ativação no estado estacionário das ICa,L, mas deslocou a curva da inativação estacionária para potenciais mais negativos. No entanto, esse efeito promovido por curina não foi alterado na presença de IBMX, dbcAMP e 8- brcGMP, sugerindo que os mononucleotídeos cíclicos, como APMc e GMPc, não estão envolvidos no efeito da curina. Em experimentos com microscopia confocal curina inibiu os transientes de cálcio intracelulares, e reduziu o aumento de [Ca2+]i induzidos por KCl (60 mM) em células de músculo liso vascular. Em relação à reticulina (3 300 μM), foi verificado que esse alcalóide antagonizou as contrações induzidas por CaCl2 e KCl, provocando vasorelaxamento em anéis de aorta. Na configuração whole-cell patch clamp , reticulina também reduziu a amplitude das ICa,L de maneira dependente de concentração, mas não mudou as características da corrente na relação corrente-voltagem. A reticulina deslocou para potenciais mais negativos a curva de inativação estacionária para as ICa,L. Porém, esse efeito não foi alterado após a aplicação de dbcAMP e 8-brcGMP. Em células pré-tradadas com forskolina, um ativador da adenilil ciclase, a adição da reticulina causou uma inibição adicional das correntes de Ca2+ que sugere um efeito aditivo da reticulina, indicando que os mononucleotídeos cíclicos não estão envolvidos. Dessa forma, curina e reticulina provocaram vasorelaxamento, devido ao bloqueio das correntes de Ca2+ dependentes de voltagem do tipo-L em células de músculo liso, em cultura e recémdispersas, de aorta de rato, revelando que esses alcalóides têm um importante potencial como modelo químico para a concepção e posterior desenvolvimento de novos fármacos com propriedade protetora cardiovascular.