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Orientadora: Profa. Dra. Giselle Cerchiaro Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biotecnociência, Santo André, 2020. A proteína príon celular (PrPC) exerce inúmeras funções celulares e cognitivas, dentre elas se destacam funções como sinalizadora e auxiliar na fixação da memória, também pode se ligar aos metais divalentes, em especial com até 5 íons cobre através de seu domínio octarepetido. Estudar essa relação permite não só concluir o papel da PrPC no sistema nervoso central mediado via cobre, como inferir se o fenótipo observado em doenças priônicas é consequência de falhas na interação metal-PrPC. Este trabalho tem como objetivo o estudo da influência de quelantes metálicos de cobre sob condições de estresse oxidativo, visando avaliar o desempenho destes quelantes na viabilidade e no ciclo celular de astrócitos.Para isso, células de astrócitos de camundongos foram utilizadas do tipo selvagem (WT) e nocaute para a PrPC (KO), bem como quelantes (Neocuproína e Triethilenotetramina). Os resultados de viabilidade celular por Trypan Blue mostraram uma diminuição da viabilidade das células tratadas com CuSO4, ZnSO4, Neocuproína, TRIEN, comparadas ao controle negativo em ambas as linhagens. Além de uma diminuição de viabilidade celular da Neocuproína e um aumento da viabilidade celular do TRIEN ambos mediante condição oxidativa pelo peróxido (H2O2). No ensaio de ciclo celular via citometria de fluxo verificou-se que as células tratadas com os devidos tratamentos não apresentaram alterações no ciclo celular quando comparadas com suas respectivas células controles (células sem tratamentos). No ensaio de peroxidação lipídica observamos que células das linhagens WT e KO induz um aumento de danos lipídeos para o tratamento com CuSO4 quando comparamos os tempos de 24 e 48 h. Os resultados obtidos nos ensaios de viabilidade celular, ciclo celular e peroxidação lipídica demonstraram uma tendência de dados qualitativos. A Neocuproína pode proteger as células de alteração da homeostase do cobre causada pela condição oxidativa, segundo ensaio de viabilidade celular. No ensaio de ciclo celular houve uma diminuição da população na fase Sub G1 que indica a fragmentação do DNA, sob o tratamento com a Neocuproína. Portanto, esses dados iniciais poderão estabelecer uma base para novas pesquisas. The cellular prion protein (PrPC) performs numerous cellular and cognitive functions, among which functions such as signaling and assisting in memory fixation, can also bind to divalent metals, especially with up to 5 copper ions through its octarepeted domain. Studying this relationship allows not only to conclude the role of PrPC in the central nervous system mediated via copper, but also to infer whether the phenotype observed in prionic diseases is a consequence of failures in the metal-PrPC interaction. This work aims to study the influence of metallic copper chelators under oxidative stress conditions, aiming to evaluate the performance of these chelators in the viability and cell cycle of astrocytes. For that, cells from astrocytes of mice were used in the wild type (WT) and knockout for PrPC (KO), as well as chelators (Neocuproin and Triethylene Tetramine). The results of cell viability by Trypan Blue showed a decrease in the viability of cells treated with CuSO4, ZnSO4, Neocuproin, TRIEN, compared to the negative control in both strains. In addition to a decrease in cell viability of Neocuproin and an increase in cell viability of TRIEN both under oxidative condition by (H2O2). In the cell cycle assay via flow cytometry it was found that the cells treated with the appropriate treatments did not show changes in the cell cycle when compared to their respective control cells (cells without treatments). In the lipid peroxidation assay, we observed that cells from the WT and KO lines induce an increase in lipid damage for treatment with CuSO4 when comparing the 24 and 48 h times. The results obtained in the tests of cell viability, cell cycle and lipid peroxidation demonstrated a trend in qualitative data. Neocuproin can protect cells from changes in copper homeostasis caused by the oxidative condition, according to a cell viability test. In the cell cycle assay there was a decrease in the population in the Sub G1 phase, which indicates DNA fragmentation, under treatment with Neocuproin. Therefore, these initial data may establish a basis for further research.

Príons são proteínas que causam um grupo de doenças neurodegenerativas invariavelmente fatais, sendo uma das mais conhecidas a encefalopatia espongiforme bovina (ou doença da vaca louca). A proteína príon celular (PrPc), rica em estrutura α-helicoidal, sofre uma mudança na sua estrutura secundária produzindo a proteína patológica (PrPSc; o príon) na qual prevalecem folhas-β. Devido à falta de dados estruturais de alta resolução dos príons, simulações de dinâmica molecular (DM) podem ser particularmente úteis para estudar o redobramento de PrP. Estudos experimentais e computacionais, descritos na literatura, indicam que a utilização de pH ácido é capaz de criar certa instabilidade estrutural, produzindo um ganho de estrutura-β na região N-terminal antes desestruturada. Este trabalho se propõe a investigar computacionalmente as mudanças estruturais na proteína príon celular do hamster Sírio induzidas por alteração de pH. Para isso, foi avaliada a influência de diferentes campos de força (GROMOS96 53a6, GROMOS96 43a1, AMBER99SB, AMBER99SB-ILDN, CHARMM27 e OPLS) simulados para as condições de pH neutro e ácido. A partir das análises, observou-se uma forte dependência dos resultados com o campo de força empregado. Além disso, somente os campos de força GROMOS96 53a6 e AMBER99SB demonstraram tendência à expansão do núcleo de folhas-β na região N-terminal da proteína simulada sob pH ácido e conseguiram representar adequadamente a condição neutra. As estruturas correspondentes a esses campos de força em pH ácido, foram, então, utilizadas como ponto de partida para novas simulações de DM em pH neutro (pH 7,4). Essa situação de retorno ao pH neutro ocorre quando o príon sai do compartimento endossomal (submetido a pH ácido) e retorna à superfície externa celular (onde estaria submetida novamente a pH neutro). Os resultados desse estudo de retorno ao pH neutro apontaram para a não reversibilidade de PrPSc, com a manutenção da cauda N-terminal voltada para a extremidade N-terminal da α-hélice HB. Prions are proteins that cause a group of invariably fatal neurodegenerative diseases, one of the most known being bovine spongiform encephalopathy (or mad cow disease). The cellular prion protein (PrPC), rich in α-helical structure, undergoes a change in its secondary structure producing the pathological protein (PrPSc; the prion) in which β-sheet prevails. Due to the lack of high resolution structural data of the prions, molecular dynamics simulations (MD) may be particularly useful to study the refolding of PrP. Experimental and computational studies, described in the literature, indicate that the use of acidic pH is capable to create some structural instability, producing a gain of β-structure in the previously unstructured N-terminal region. This work proposes to investigate computationally the structural changes in the cellular prion protein of the Syrian hamster induced by pH change. For this, the influence of different force fields (GROMOS96 53a6, GROMOS96 43a1, AMBER99SB, AMBER99SB-ILDN, CHARMM27 and OPLS) were evaluated for neutral and acid pH conditions. From the analysis, a strong dependence of the results with the force field was observed. In addition, only the GROMOS96 53a6 and AMBER99SB force fields showed a tendency to expand the β-sheet nucleus in the N-terminal region of the simulated protein under acid pH and were able to adequately represent the neutral condition. The structures corresponding to these force fields under acidic pH were then used as the starting point for new MD simulations under neutral pH. This situation of return to the neutral pH occurs when the prion leaves the endosomal compartment (submitted to acid pH) and returns to the external cellular surface (where it would be submitted again to neutral pH). The results of this neutral pH return study pointed to the non-reversibility of PrPSc, with the maintenance of the N-terminal tail facing the N-terminal end of the α-helix HB.

RESUMO: A encefalopatia espongiforme bovina (EEB), causada por um príon infectante, surgiu na década de 1980 na Europa como uma nova doença nos rebanhos bovinos e, desde então, estão sendo tomadas várias ações para sua prevenção e controle. A restrição da alimentação de ruminantes com subprodutos de origem animal e a remoção e destruição dos materiais de risco específico para a doença das carcaças em frigoríficos se mostraram efetivas medidas para o controle da doença, além de reduzirem a exposição humana ao agente, pois se trata de uma importante zoonose. No entanto, em 2004 os primeiros casos atípicos de EEB foram diagnosticados, nos quais os agentes causais apresentavam alterações de peso molecular na prova de Western blot, em relação ao agente da forma clássica. Além das diferenças moleculares dos agentes, as apresentações clínicas mostraram-se diferenciadas nas formas atípicas, acometendo principalmente bovinos com idade superior a oito anos. Por se tratar de uma nova forma da doença, muitos estudos estão sendo conduzidos buscando elucidar a patogenia, epidemiologia e seu potencial zoonótico. Objetivou-se neste estudo revisar os principais aspectos relacionados às EEB atípicas enfatizando sua etiologia, epidemiologia, sinais clínicos, diagnóstico e medidas de controle. ABSTRACT: Bovine spongiform encephalopathy (BSE), caused by an infectious prion, emerged in the 1980s in Europe as a new disease in cattle and, since then, several actions are being taken for its prevention and control. Restricting the feeding of ruminants with animal by-products and the removal and destruction of specific risk materials (SRM) for the condition of carcasses in slaughterhouses have been proven effective to control the disease, in addition to the reduction of human exposure to the agent, as this is an important zoonosis. However, in 2004 the first atypical cases of BSE were diagnosed, in which the causative agents showed different molecular weights in Western blot (WB), compared to the classical form of the agent. In addition to the molecular differences, clinical presentations proved to be differentiated in atypical forms, affecting mainly cattle older than eight years. Because it is a new form of the disease, many studies are being conducted to elucidate the pathogenesis, epidemiology and zoonotic potential of atypical BSE. The aim of this study was to review the main aspects of atypical BSE emphasizing its etiology, epidemiology, clinical signs, diagnosis and control and prevention measures.

As doenças priónicas são um conjunto de patologias que afetam irreversivelmente o sistema nervoso central. Na despoletar destas doenças estão as proteínas infeciosas, os priões. Existem várias doenças que se inserem nesta categoria, no entanto pode-se destacar em particular a doença de Creutzfeldt-Jakob. Metais como o cobre, ferro e manganês são metais cruciais e necessários aos processos fisiológicos. Existem vários mecanismos antioxidantes, como a superóxido dismutase e a catalase, essenciais para combater o stress oxidativo na célula que por vezes é provocado por estes metais. Atualmente pensa-se que os metais com atividade redox têm um papel importante na evolução das doenças neurodegenerativas. A interação entre os metais e as proteínas do sistema nervoso central mostra-se crucial no desenvolvimento ou ausência de neurodegeneração. Os agentes quelantes de metais podem desta forma ser usados como terapêuticas em doenças associadas a metais. The prion diseases are a group of diseases that irreversibly affects the central nervous system. At the onset of these diseases are infectious proteins, prions. There are several diseases that fall into this category, but we can highlight in particular the Creutzfeldt-Jakob disease. Metals such as copper, iron and manganese metals are critical and required for physiological processes. There are several antioxidants mechanisms , such as superoxide dismutase and catalase, which are essential to combat oxidative stress in the cell which is sometimes caused by these metals. Currently it is believed that the metals with redox activity play an important role in development of neurodegenerative diseases. The interaction between the metals and the central nervous system proteins shown to be crucial in the development or absence of neurodegeneration. The metal chelating agents may thereby be used as therapeutics in diseases associated with metals.

FACEPE As Doencas Prionicas, tambem conhecidas como Encefalopatias Espongiformes Transmissiveis (EET), fazem parte de um grupo de doencas raras e invariavelmente fatais e incidem em diversos animais, incluindo o homem, e sao ocasionadas pelo acumulo de uma proteina insoluvel denominada PríonScrapie (PrPsc). Fazem parte deste grupo a Encefalopatia Espongiforme Bovina (EEB), CronicWastingDisease (CWD) nos cervideos, Scrapie em ovinos e nos humanos Doenca de Creutzfeldt-Jakob(DCJ), Kuru, Gerstmann-Straussler-ScheinkerDisease (GSS) e Insonia Familiar Fatal. Uma forte caracteristica das EET e a altaheterogeneidade clinica e histopatologica, tendo como o codon 129 da proteina príon o maior fator para esta variabilidade. Por conta desta variabilidade e a falta de biomarcadores determinantes para as Doencas Prionicas, o estudo clinico dos casos se torna crucial para o diagnostico diferencial. Nesta tese, criamos um banco de dados online, o epiCJD, para centralizar informacoes epidemiologicas a fim de orientar medicos e servir como apoio aos gestores de saude. Utilizamos os registros dos casos ate entao coletados pelo Centro de Doencas Prionicas da Alemanha. Alem disso, foram analisados Aβ42 e a proteina Tau atraves de eletroquimioluminiescencia (MSD) como possiveis biomarcadores para diagnostico diferencial. Apos a analise dos dados, observamos que a distribuicao geografica dos registros nao indicam clusters ou hotspots, obedecendo basicamente o tamanho populacional. A distribuicao de acordo com o genero nao difere de outras populacoes descritas na literatura e os primeiros sintomas sao compativeis com os descritos previamente, bem como a idade media do inicio da doenca. A distribuicao genotipica do codon 129 esta de acordo com a literatura. Quanto ao MSD, observamos que a quantificacao foi ligeiramente superior nos niveis de TAU e significativamente superior Aβ42 em relacao aos controles, DA e DCJ. Baixos niveis de Aβ42 e alto nivel de TAU se mostraram caracteristicas em DA e DCJ, comparado aos controles. Como perspectivas futuras, o banco de dados sera alimentado por outros dados, alem dos provenientes da Alemanha, a fim de observar se ha ou nao variacoes entre outras populacoes. A tecnica MSD se mostrou promissora podendo, depois de melhoramentos, ser uma ferramenta de diagnostico molecular. Prion diseases, or Transmissible Spongiform Encephalopathies (TSEs), are part of a group of rare diseases and invariably fatal and focus on various animals, including humans, and are caused by the accumulation of insoluble protein called Prion Scrapie (PrPsc). Bovine Spongiform Encephalopathy (BSE), CronicWastingDisease (CWD) in deer, scrapie in sheep and Creutzfeldt-Jakob disease (CJD), Kuru, Gerstmann-Straussler-ScheinkerDisease (GSS) and Fatal Familial Insomnia, in humans, are example of TSEs. A strong feature of the TSE is the high heterogeneity clinical and histopathological, with the codon 129 of the prion protein the biggest factor for this variability. Because of this variability and lack of biomarkers to determine the prion diseases, the clinical study of cases becomes crucial for the differential diagnosis. In this thesis, we have created an online database, epiCJD, to centralize epidemiological information in order to guide physicians and serve as support for public health managers. We use records from German Prion Disease Center. Furthermore, Ab42 were analyzed and Tau protein by electrochemiluminescence-based detection system (MSD) as biomarkers for the differential diagnosis. The distribution according to gender does not differ from other populations described in the literature and the first symptoms are consistent with those described previously, as well as the average age of onset of the disease. The genotype distribution of the 129 codon is in agreement with the literature. As for the MSD,we noted that the quantification was slightly higher levels of TAU and Ab42 significantly higher compared to controls, AD and CJD. Low levels of Ab42 and high TAU proved characteristics in AD and CJD, compared to controls. As future prospects, the database will be fed by other data, in addition to from Germany, in order to observe whether there are variations among other populations. MSD technique proved promising and may, afterimprovements, to be a molecular diagnostic tool.

Orientador: Prof. Dr. Luis Paulo Barbour Scott Tese (doutorado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2015. Mecanismos biologicos envolvidos nas fibras amiloides e sua agregacao ainda sao um dos topicos mais investigados cientificamente. As prions estao entre estas proteinas que agregam-se sob certas condicoes. Estas proteinas adotam duas diferentes formas: i) a forma celular (PrPC) e ii) a forma infecciosa denominada scrapie (PrPSc) que possui propensao a agregacao. Na forma infecciosa, essa proteina pode causar diversas doencas tais como a encefalopatia espongi-forme bovina, doenca de Creutzfeldt-Jakob e doenca de Gerstmann-Straussler-Scheinker. As PrPC e PrPSc sao diferentes com relacao as estruturas secundarias e terciarias. A PrPC contem um numero menor de folha-¿À quando comparada a PrPSc. Nenhuma estrutura da PrPSc foi resolvida ate o presente momento e, alem disso, o mecanismo molecular da transicao entre a PrPC e PrPSc e o processo de agregacao da forma scrapie nao sao bem compreendidos apesar dos numerosos estudos realizados nesta area. Neste trabalho, foi aplicada uma nova metodologia de simulacao recentemente desenvolvida que permite promover grandes mudancas estruturais, nomeada como MDeNM (Molecular Dynamics with excited Normal Modes), com o objetivo de investigar e compreender a transicao conformacional entre a PrPC e PrPSc. Este metodo combina modos normais e dinamica molecular, a partir de movimentos coletivos ativados cineticamente que devem contribuir para um novo rearranjo estrutural dificilmente alcancado por simulacoes de dinamica molecular tradicional. Alem disso, estudos termodinamicos foram realizados com o modelo baseado em estrutura (SBM), que caracteriza as transicoes energeticas. Os resultados do SBM mostraram que as estruturas geradas por MDeNM podem corresponder a via de transicao entre a conformacao nao-infecciosa e a desnovelada. A combinacao de MDeNM e SBM mostrou-se util para extrair informacoes estruturais e energeticas relacionadas a conversao da prion para as formas infecciosas. Os resultados mostraram um aumento significativo na formacao da folha-¿À sob condicoes de baixo pH e considerando a PrP na forma trimerica e tambem em agregados. Estas simulacoes permitiram a caracterizacao de estados intermediarios na transicao da PrPC para a PrPSc, e a proposicao um mecanismo de conversao da PrPC para PrPSc. Estudos iniciais relacionados aos mutantes da prion e o modelo Coarse-Grained tambem foram realizados neste trabalho. Biological mechanisms involved in the amyloid fibrils and aggregation belong yet to very hot topics of scientific investigation. Prions are among proteins that aggregate under certain conditions. They adopt two different forms: i) the cellular form (PrPC) and ii) infectious form called scrapie (PrPSc) having the propensity to aggregate. In the infectious form, the prion may cause many diseases such as bovine spongiform encephalopathy (commonly known as mad cow disease), Creutzfeldt-Jakob disease and Gerstmann-Straussler-Scheinker disease. The PrPSc and PrPC are widely different regarding secondary and tertiary structures. PrPC contains a much smaller number of ¿À-strands compared to PrPSc. No structures of PrPSc have been solved until nowadays, and furthermore the molecular mechanism of the transition between PrPC and PrPSc, and the aggregation process of the scrapie form are not well understood besides numerous studies achieved in this field. In this work, we applied a recently developed simulation method allowing to promote large structural changes, namely the MDeNM (Molecular Dynamics with excited Normal Modes) in order to better investigate and understand the conformational transition between PrPC and PrPSc. This method makes a combined use of normal modes and molecular dynamics, consisting to kinetically activate collective motions that might contribute to new structural rearrangements difficult to achieve by simple standard MD simulations. Furthermore, a thermodynamical study was achieved with the well know ¿¿-carbon structure-based model (SBM), which characterizes the energetic transitions. SBM results showed that the PrPSc structures that were generated with MDeNM must correspond to the transition pathways between the non-infectious native PrPC and the fully unfolded conformations. The combination of MDeNM and SBM was useful to extract structural to energetical information related to the prion conversion to the frustrated infections forms. The results showed a significant increase in ¿À-sheet formation under low pH condition and when PrPC was in trimeric form, and also when larger assemblies. These simulations allowed us to characterize intermediate states in the transition from the cellular prion to PrPSc, and a model of conversion from PrPC to PrPSc. Also, studies with mutants of prion and Coarse-Grained were performed in this work.

Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina Veterinária O tremor epizoótico (TE) é uma encefalopatia espongiforme transmissível (EET) que ocorre naturalmente em ovinos, caprinos e muflões. É uma doença conhecida há mais de 250 anos. Caracteriza-se pela acumulação da isoforma patológica- proteína priónica resistente (PrPres ou PrPsc) de uma proteína fisiológica do hospedeiro- proteína priónica celular (PrPc) no sistema nervoso central, conduzindo à progressiva neurodegeneração e morte. O tremor epizoótico ou scrapie, representa o protótipo das doenças priónicas. Existem dois tipos de scrapie classificados até à data, o scrapie clássico e o scrapie atípico/Nor98. A suscetibilidade a qualquer dos tipos de scrapie é determinada por polimorfismos do gene priónico. O scrapie clássico é uma doença infecciosa sendo que o scrapie atípico/Nor98 é visto como uma doença de ocorrência esporádica e dependente da mudança espontânea de conformação da proteína priónica. O tipo de scrapie mais prevalente em Portugal é o scrapie atípico/Nor98. Assim, elaborou-se o presente estudo retrospetivo com o intuito de determinar o potencial de ocorrência de scrapie no nosso país entre 1995 e 2002, examinando, pela técnica de imunohistoquímica (IHQ), amostras de tecido nervoso de pequenos ruminantes arquivadas no Laboratório de Patologia do Instituto Nacional de Investigação Agrária e Veterinária (INIAV), e contribuir para a caracterização epidemiológica desta doença no nosso país. ABSTRACT - Retrospective study on scrapie in Portugal - Scrapie is naturally occurring transmissible spongiform encephalopathy (TSE) in sheep, goat and mufflons almost worldwide and it is known for about 250 years. It is characterized by the accumulation of an abnormal isoform- resistant prion protein (PrPres or PrPsc) of host encoded prion protein- cellular prion protein (PrPc) in the central nervous system leading to progressive neurodegeneration and death. Scrapie represents the prototype of the so-called prion diseases. It is observed to date as two types, classical and atypical/Nor98 scrapie. The susceptibility to both types is modulated by polymorphisms of the prion gene. Whereas classical scrapie is clearly a naturally occurring transmissible disease, atypical scrapie seems to be caused by spontaneous misfolding of prion protein. The most prevalent type of scrapie in Portugal is the atypical/Nor 98 strain. This retrospective study intends to find out the potential occurrence of scrapie in Portugal before 2002, examining through imunohistochemistry (IHC) samples of small ruminants archived from 1995 to 2002 in the Pathology laboratory from INIAV (Instituto Nacional de Investigação Agrária e Veterinária – The National Institute for Agricultural and Veterinary Research), contributing to the epidemiological characterization of the disease in this country.

Scrapie é uma doença neurodegenerativa infecciosa que afeta ovinos e caprinos, o qual está relacionada a uma alteração conformacional da proteína priônica, que leva a deposição e agregação da proteína no sistema nervoso central. A predisposição a infecção pelo agente príon está associado a polimorfismos de nucleotídeos únicos no gene da proteína priônica. Os principais polimorfismos relacionados à infecção estão presentes nos códons 136, 154 e 171, sendo o genótipo VRQ o mais suscetível e o ARR o genótipo mais resistente. O presente estudo teve como objetivo identificar os polimorfismos de nucleotídeos únicos em ovinos das raças Suffolk, Dorper e Santa Inês, provenientes de surtos de scrapie clássico e de rebanhos livre de scrapie, os quais os proprietários estavam dispostos a colaborar com o projeto. O primeiro trabalho analisou polimorfismos de nucleotídeos únicos em 15 códons do gene da proteína priônica em um rebanho Suffolk afetado com scrapie clássico no Brasil. Dos 15 códons analisados, 3 apresentaram polimorfismos (136, 143 e 171). O códon 171 apresentou o maior número de polimorfismos, os quais foram encontradas todas as formas alélicas. Quando avaliado os grupos de risco, cerca de 96% do rebanho pertenceu aos grupos 1 a 3 (risco muito baxi a moderado). O segundo trabalho relatou o desenvolvimento da técnica de PCR em tempo real, baseado em sondas TaqMan, para a identificação de polimorfismos nos códons 136, 154 e 171 e sua aplicabilidade em rebanhos brasileiros. Um total de 142 amostras foram analisadas por PCR em tempo real. Ao comparar os resultados do PCR em tempo real com o sequenciamento, 100% das amostras foram idênticas. Para o códon 136, a maioria dos ovinos apresentou o genótipo AA. Para o códon 154, o genótipo RR foi o mais frequente, e para o códon 171, os genótipos mais frequentes foram QQ e QR. O terceiro trabalho descreve a caracterização de três surtos de scrapie clássico em ovinos da raça Dorper, em diferentes regiões do sul do Brasil. Os surtos ocorreram nos anos de 2011 a 2013, sendo que no segundo e no terceiro foram identificados ovinos do primeiro caso. Além disso, foi analisada a associação de scrapie com a genotipagem do gene da proteína priônica em ovinos presentes nos três rebanhos. No total, 22 ovinos foram positivos no teste de imuno-histoquímica, sendo que 4 deles apresentaram sinais clínicos da doença. Em todos os estudos, presentes as três raças analisadas, foi possível evidenciar a presença de ovinos, na sua maioria, geneticamente suscetíveis a infecção, pois a maioria pertenceu ao grupo de risco 3, considerado moderado. Scrapie is an infectious neurodegenerative disease affecting sheep and goats. This is related to an altered conformational of the prion protein (PrPSc) that leads to the deposition and aggregation of protein in the central nervous system. The predisposition to prion infection agent is associated with single nucleotide polymorphisms in the prion protein gene. The mostly polymorphisms related with infection are present in codons 136, 154 and 171, being more susceptible genotype VRQ and ARR more resistant genotype. This study aimed to identify single nucleotide polymorphisms in sheep breeds Suffolk, Dorper and Santa Ines, from outbreaks of classical scrapie flocks and free scrapie flocks, which the owners were willing to collaborate with the project. The first article analyzed single nucleotide polymorphisms in 15 codons of the prion protein gene in a Suffolk sheep affected with classical scrapie in Brazil. Of the 15 codons analyzed, 3 showed polymorphisms (136, 143 and 171). Codon 171 showed the greatest number of polymorphisms, which were found all allelic forms. When assessed risk groups, about 96% of the herd belonged to groups 1 to 3 (very baxi to moderate risk). The second article reported the development of PCR real time based on TaqMan probes for the identification of polymorphisms in codons 136, 154 and 171 and their applicability in Brazilian herds. A total of 142 samples were analyzed by real-time PCR. When comparing the results of real time PCR with the sequencing of the samples were 100% identical. For codon 136, the majority of the sheep had the AA genotype. For codon 154, the RR genotype was the most frequent, and the codon 171, the most common genotypes were QQ and QR. The third article describes the characterization of three outbreaks of classical scrapie in Dorper sheep, in different regions of southern Brazil. The outbreaks occurred in the years 2011-2013, and the second and third were identified sheep of the first case. Furthermore, it was analyzed its association with genotyping prion protein gene in sheep present the three herds. In total, 22 sheep were positive in immunohistochemical testing, and 4 of them showed clinical signs of disease. In all studies, presents three races analyzed, it was possible to demonstrate the presence of sheep, mostly genetically susceptible to infection because the majority belonged to the risk group 3, considered moderate.

Scrapie é uma doença infecciosa, neurodegenerativa fatal, causada pelo príon scrapie (PrPsc). Apresenta-se tanto na forma clássica em ovinos e caprinos geneticamente susceptíveis quanto na forma atípica em ovinos. A primeira notificação oficial do Brasil à Organização Mundial de Saúde Animal (OIE), um caso da forma clássica diagnosticado no Rio Grande do Sul ocorreu em 1985, mas a doença já havia sido diagnosticada no mesmo Estado em 1978. Este trabalho objetivou descrever dois surtos de Scrapie em ovinos em Mato Grosso do Sul (MS), Brasil e investigar, por meio de imuno-histoquímica (IHQ) a presença de PrPsc no Sistema Nervoso Central (SNC) de ovinos examinados entre 2003 e 2010. Na primeira parte observaram-se dois ovinos com sinais clínicos típicos de scrapie, detalhando-se os sinais neurológicos, dados epidemiológicos, histopatológicos e amostras teciduais em duplicata desses ovinos foram encaminhadas para realização de diagnóstico de Raiva e para diagnóstico IHQ para príon. Na segunda parte realizou-se levantamento de laudos de necropsia e diagnósticos histopatológicos de ovinos, no período de maio de 2003 a março de 2010. Amostras de sistema nervoso central de 51 casos foram selecionados, incluindo os dois já com diagnóstico de Scrapie mencionados acima; os tecido de todos esses ovinos foram submetidos à IHQ para detecção de proteína priônica. Os 49 ovinos avaliados apresentaram resultado negativo na IHQ para príon. Scrapie is a fatal neurodegenerative infectious disease, caused by the scrapie prion (PrPsc), that can both in the as the classic form in genetically susceptible sheep and goats and in the atypical form in sheep. The first official notification of scrapie from Brazil was made to the World Organization for Animal Health (OIE) in 1985, in the state of Rio Grande do Sul, although the disease was first documented in this Brazilian state in 1978. The objective this paper was to describe two outbreaks of scrapie in sheep from Mato Grosso do Sul (MS), Brazil, and to investigate by immunohistochemistry (IHC) the presence of PrPsc in samples from the CNS of sheep examined during 2003 and 2010. The study was conducted in two stages; the first was the observation of two sheep with typical clinical signs of scrapie that underwent clinical examination with emphasis on neurological parameters, epidemiological data collection, necropsy and collection of samples in duplicate forwarded to the diagnosis of rabies, and for the IHC diagnosis of Transmissible Spongiform Encephalopathies. In the second part of the study, a survey was made the necropsy reviewing gross findings and histopathological diagnoses in sheep from May 2003 to March 2010. Samples of the central nervous system of fifty-one cases, including the two sheep mentioned above were subjected to IHC for detection of prion protein. The other 49 sheep, although displaying neurological-disease which should be included as scrapie differential diagnosis, had their tissues submitted to IHC resulting negative.

CAPES, CNPq A Doença de Alzheimer (DA) e a Doença de Creutzfeldt-Jakob (DCJ) apresentam caráter neurodegenerativo, ocasionadas pelo acúmulo extracelular de proteínas insolúveis. Dentre alguns fatores de risco, as mutações nos códons M129V e E200K do gene PRNP são os mais importantes na DCJ. Alguns estudos foram realizados com o códon 129, sendo bastante controversos. Este trabalho teve como objetivo verificar a influência dos códons 129 e 200 e a presença da mutação E200K na DA. 145 amostras de DNA de pacientes com DA e 198 controles foram genotipadas para os códons 129 e 200 através da técnica da PCR e digestão enzimática com as enzimas NspI para o códon M129V e BsmAI, para o códon 200. Onze pacientes e oito controles foram sequenciados com o MegaBace1000. Quarenta e dois pacientes e quarenta e dois controles foram genotipados para o códon 129 sendo 16 MM, 20 MV e 6 VV nos pacientes e 24 MM, 15 MV e 3 VV nos controles. Não foram encontradas diferenças estatísticas significativas. Para a mutação E200K, 61 pacientes e 75 controles foram genotipados, não ocorrendo mutação em nenhuma amostra. Nossos dados corroboram com outros grupos mostrando que o códon 129 parece não estar associado a DA. A baixa frequência da mutação E200K pode justificar a ausência desta na nossa amostragem, o que precisa ser confirmado com maior número de amostras, com devida atenção pela possível estratificação associada a grupos étnicos e outros fatores como cosegregação de outros genes associados ao PRNP. Este trabalho contribuiu para um melhor conhecimento do perfil neuroepidemiológico da população local.

FACEPE , CNPQ. As doenças priônicas são um grupo de doenças neurodegenerativas e irremediavelmente fatais que afetam humanos e algumas outras espécies de mamíferos. Entre estas, as mais conhecidas são a doença de Creutzfeldt-Jakob (CJD) que acomete humanos, o scrapie em ovinos e a encefalopatia espongiforme bovina (BSE). A Chronic Wasting Disease (CWD) é a forma priônica que acomete os cervídeos e tem sido considerada como problema de saúde pública nos EUA e Canadá. Pesquisas recentes têm mostrado que alguns animais apresentam maior resistência à infecção da doença. Esta resistência tem sido comumente associada com alterações na sequência de nucleotídeos do gene que codifica a proteína priônica (PRNP). Polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) em códons específicos alteram a susceptibilidade ao desenvolvimento da CWD na família Cervidae. Objetivando identificar a presença/ausência dos polimorfismos, e consequentemente a potencial susceptibilidade ao desenvolvimento da doença em cervídeos neotropicais, no presente trabalho foram analisadas 60 amostras de três espécies: Veado catingueiro (Mazama gouazoubira, n:11), Veado campeiro (Ozotoceros bezoarticus, n:18) e Cervo do Pantanal (Blastocerus dichotomus, n:31). Um fragmento de aproximadamente 800pb do exon 3 do gene PRNP foi amplificado por PCR e posteriormente sequenciado. As sequências foram alinhadas e os resultados mostraram que a sequência nucleotídica dos animais neotropicais é altamente conservada. Todos os animais apresentaram os polimorfismos associados à susceptibilidade nos códons de interesse (Q95, G96, M132 e S225). Apesar disto, a CWD nunca foi notificada em espécies neotropicais.

Os príons são proteínas que causam um grupo de doenças neurodegenerativas invariavelmente fatais, sendo uma das mais conhecidas a encefalopatia espongiforme bovina (ou doença da vaca louca). A proteína príon celular (PrPc), rica em estrutura α-helicoidal, sofre uma mudança na sua estrutura secundária produzindo a proteína patológica (PrPSc; o príon) na qual prevalecem folhas-β. Devido a falta de dados de estruturais de alta resolução dos príons, simulações de DM podem ser particularmente úteis para estudar o redobramento de PrP. Estudos experimentais e computacionais, descritos na literatura, indicam que a utilização de pH ácido é capaz de criar alguma instabilidade estrutural, produzindo um ganho de estrutura-β na região N-terminal antes desestruturada. Este trabalho se propõe a investigar computacionalmente as mudanças estruturais na proteína príon celular do hamster Sírio induzidas por alteração de pH. Para isso, foi avaliada a influência do uso de diferentes campos de força (GROMOS, AMBER e OPLS), diferentes estados de protonação dos resíduos de histidina, diferentes condições iniciais e diferentes métodos de cálculo de interações eletrostáticas de longo alcance (GRF e SPME). A partir da evolução temporal das estruturas secundárias, foi observada uma forte dependência dos resultados com o uso de diferentes parâmetros de simulação. De fato, a tendência de pH descrita na literatura não foi claramente observada neste trabalho. Isso pode estar associado com a necessidade de se investir mais em múltiplas simulações de dinâmica molecular para quantificar com maior precisão o comportamento estrutural dos fragmentos protéicos em cada pH de estudo. Prions are proteins that cause a group of invariably fatal neurodegenerative diseases, one of the most known being bovine spongiform encephalopathy (or mad cow disease). The cellular prion protein (PrPc), rich in α-helical structure, undergoes a change in its secondary structure producing the pathological protein (PrPSc, the prion) in which β-sheet structure prevails. Because of the lack of high-resolution prion structural data, MD simulations can be particularly useful to study PrP misfolding. Experimental and computational studies, described in literature, indicate that the use of low pH is capable to create some structural instability, producing a gain of β-structure content in the otherwise unstructured N-terminal region. This work aims to investigate computationally structural changes in the cellular prion protein of Syrian hamster induced by pH change. For this, we evaluated the influence of different force fields (GROMOS, AMBER and OPLS), different protonation states of histidine residues, different initial conditions and different methods for calculating long-range electrostatic interactions (GRF and SPME). From the time evolution of the secondary structures, we observed a strong dependence on the simulation parameters. In fact, the pH tendency described in literature was not clearly observed in this work. It may be associated with the need to invest more in multiple molecular dynamics simulations to quantify more accurately the structural behavior of the protein fragments in each pH study.

Ratos que não expressam a proteína prion celular (PrPc) são mais sensíveis a crises epilépticas induzidas por diferentes protocolos. O hipocampo desses animais apresenta um brotamento supragranular de fibras musgosas semelhante ao observado em pacientes com epilepsia de lobo temporal relacionada a esclerose hipocampal (ELT-EH). Esses achados sugerem que a PrPc pode estar envolvida na epileptogênese da ELT-EH. Nós estudamos nessa tese a localização imunoistoquímica da PrPc no hipocampo de animais submetidos ao modelo de epilepsia de lobo temporal por pilocarpina (MELTP)em diferentes tempos de status epilepticus em ratos. Nesse trabalho induzimos estado de mal epileptico (EE) com o uso de pilocarpina em três diferentes grupos de ratos Wistar adultos. Os animais foram sacrificados 18 horas, 5 dias e 2 meses após a indução do EE. Os resultados foram comparados com cérebros controles de ratos que receberam injeções de solução salina. As lâminas foram processadas para coloração por hematoxilinaeosina, imunohistoquímica e neo-Timm. Observamos um aumento da expressão de PrPc nas regiões CA1 e CA3 do hipocampo 18 horas depois da injeção de pilocarpina. Essa expressão aumentada persistiu na região CA1 no quinto dia após a injeção. Não observamos diferenças significativas na expressão de PrPc durante a fase aguda do MELTP nas regiões CA2 e granular do hipocampo. No grupo crônico (2 meses) a PrPc foi observada na mesma localização em que se observou brotamento de fibras musgosas. Concluímos com esse trabalho que a expressão da PrPc é diferente nas diversas fases do modelo de epilepsia induzido por pilocarpina. A expressão transitória da proteína prion durante a fase aguda do modelo pode refletir mudanças de expressão visando tornar as células mais resistentes ao dano induzido pelas crises convulsivas. Alternativamente, essa expressão aumentada pode estar relacionadas à apotose ou então às fases iniciais da neuroplasticidade. A expressão de PrPc na mesma região dos brotamentos de fibras musgosas na fase crônica pode estar relacionada à neuroplasticidade, epileptogênese, neurotransmissão ou, ainda, estar implicada na proteção celular contra crises convulsivas recorrentes. Devido aos diversos achados relacionados a PrPc, sugerimos que o modelo de epilepsia do lobo temporal induzido pela pilocarpina possa ser um interessante modelo para o estudo do papel fisiológico da PrPc. Mice lacking cellular prion protein (PrPc) are more sensitive to seizures induced by four different pharmacological protocols. The hippocampal formation of these animals exhibits supragranular mossy fiber sprouting which resembles that observed in patients with mesial temporal lobe epilepsy related to hippocampal sclerosis (MTLEHS). These findings suggest that the PrPc may be involved in epileptogenesis in MTLE-HS. Here we investigated the immunohistochemical localization of the PrPc in the hippocampus of animals submitted to the pilocarpine model of temporal lobe epilepsy (PMTLE). Status epilepticus (SE) was induced with pilocarpine in three different groups of adult Wistar rats. The animals were sacrificed 18 hours, 5 days, and 2 months after SE induction and the results were compared to the respective saline-injected control animals. Slices were processed for hematoxylin-eosin, PrPc immunohistochemistry and neo-Timm .PrPc was increased in the CA1 and in CA3 regions of the hippocampus 18 hours after pilocarpine injection. PrPc continued to be increased in the CA1 region of the hippocampus five days after pilocarpine injection. In the CA2 and granular regions of the hippocampus we did not observe significant differences in PrPc expression during the acute phase of PMTLE. In the chronic group, PrPc was expressed co-localized with mossy fiber sprouting. Cellular prion protein is differentially expressed at different phases of the pilocarpine model of epilepsy. Transient expression of PrPc during the acute phase of the pilocarpine model may reflect changes which may render cells more resistant to seizure-induced damage and may be related to apoptosis or may to the initial phases of neuroplasticity. During the chronic period, PrPc is co-expressed in the same regions of mossy fiber sprouting. In chronic animals, PrPc might be related to neuroplasticity, epileptogenic processes, neurotransmission, or alternatively may be implicated in cellular protection against recurrent seizures.

A doença de Creutzfeldt-Jakob (CJD) é uma forma de demência pré-senil de rápida evolução, geralmente fatal em um ano. Casos autóctones no Brasil têm sido raramente descritos assim como achados de ressonância magnética. Mulher, natural de Ponta Grossa PR, branca , 54 anos , foi admitida no serviço em outubro de 2001 com quadro de amaurose bilateral cortical progressiva desde há 1 mês do internamento. Nunca viajou ao exterior e foi somente submetida a uma cirurgia de redução do estômago, para obesidade. História familial sem relato de casos semelhantes. Logo após o internamento a paciente desenvolveu quadro de disfasia mista, hemiparesia flácida direita, com movimentos coreoatetóticos e crises parciais motoras. Paciente evoluiu com quadro demencial progressivo; atualmente, acamada, torporosa, dependente de alimentação enteral, recebendo mepacrina, fenitoína e clorpromazina , estabilizando o quadro até final de maio de 2002. Exames laboratoriais negativos ou normais. Pesquisa de proteína 14-3-3 no líquor foi positiva; enolase-neurônio-específica no líquor foi normal. Estudo genético do gen PRNP não revelou mutação descrita anteriormente. EEG (23/10/2001) revelou intensa atividade irritativa hemisfério cerebral esquerdo. Estudo de ressonância magnética revelou áreas de hipersinal em T2 e FLAIR em regiões temporal esquerda e bioccipital; gânglios da base normal. Imagens de DWI mostraram hipersinal nas mesmas áreas.Outro EEG (15/03/2002) revelou padrão periódico de ondas trifásicas sugestivos de CJD. A paciente fez uso de mepacrina associado a clorpromazina com aparente estabilização do quadro, até seu óbito por complicações infecciosas pulmonares em abril de 2003. Creutzfeldt-Jakob disease (CJD) is a presenile dementia characterized by rapidly progressive mental deterioration, myoclonic jerking, and other less common neurological signs. Few autoctonous cases have been described in Brazil. A 54-year-old white woman, was admitted in our service with a month history of progressive, bilateral cortical blindness. After admission, she developed right partial motor seizures( right facial, upper and lower limbs), she became progressively aphasic( mixed aphasia). Seizures were controlled with phenytoin, but she developed choreoathetotic movements on her right dimidium, with partial control after introduction of chlorpromazine 25 mg q/d. She could no longer stand up or walk due to severe ataxia. The first EEG (October, 2001) showed left hemisphere severe seizure activity (status epilepticus partialis). She was delivered home with enteral nutrition, phenytoin , chlorpromazine and mepacrine 100 mg qd. The following laboratorial tests were negative or normal: blood series, platelets, ESR, kidney and liver function, copper, ceruloplasmin, VDRL, HIV, HTLV-1, lactate, and cerebral DSA (performed in other service).A spinal tap with normal opening pressure was perform and CSF examination was normal. CSF 14-3-3 protein was positive, CSF specific neuronal enolase 7.5 ng/ml(normal). Genetic study of PRNP gene did not disclosed any known mutation. A MRI (October, 2001) showed areas of hyperintense signal (T2 and FLAIR) without Gd-enhancement on T1, in the left temporal lobe and in both occipital lobes; basal ganglia have a normal appearance. DWI imaging showed bright areas at the same sites. An EEG (March, 2002) disclosed a periodical sharp triphasic waves pattern, suggestive of CJD. A second MRI (April, 2002) showed mild generalized atrophy, no ventricular dilatation, and the hyperintense sites disappeared. She remained clinically stable and under use of chlorpromazine and mepacrine until she died due to pulmonary complications on April, 2003.

A doença de Creutzfeldt-Jakob (DCJ) é a encefalopatia espongiforme subaguda transmissível mais frequente nos seres humanos. Aproximadamente 85% dos casos pertencem à forma esporádica da doença. Os outros 15% consistem na forma genética e iatrogênica. Relatamos o caso de uma paciente com a forma esporádica da doença de Creutzfeldt-Jakob, com comprometimento medular e apresentação clínica caracterizada por síndrome demencial e cerebelar, miofasciculação com arreflexia difusa e crises convulsivas do tipo tônico-clônico generalizada. É rara a associação das duas últimas manifestações clínicas. O caso foi considerado como provável DCJ até confirmação por autópsia e imunohistoquímica. Concluímos que se deve sempre pensar na DCJ em pacientes que apresentam demência rapidamente progressiva e, na ausência de sinais piramidais ou extrapiramidais, pensar em acometimento periférico e/ou medular.

A doença de Creutzfeldt-Jakob (DCJ) é a encefalopatia espongiforme subaguda transmissível mais frequente nos seres humanos. Aproximadamente 85% dos casos pertencem à forma esporádica da doença. Os outros 15% consistem na forma genética e iatrogênica. Relatamos o caso de uma paciente com a forma esporádica da doença de Creutzfeldt-Jakob, com comprometimento medular e apresentação clínica caracterizada por síndrome demencial e cerebelar, miofasciculação com arreflexia difusa e crises convulsivas do tipo tônico-clônico generalizada. É rara a associação das duas últimas manifestações clínicas. O caso foi considerado como provável DCJ até confirmação por autópsia e imunohistoquímica. Concluímos que se deve sempre pensar na DCJ em pacientes que apresentam demência rapidamente progressiva e, na ausência de sinais piramidais ou extrapiramidais, pensar em acometimento periférico e/ou medular. Creutzfeldt-Jakob disease (CJD) is the most common subacute transmissible spongiform encephalopathy. Approximately 85% of the cases are sporadic. The remaining 15% consist of genetic and iatrogenic forms. We report a sporadic form of CJD with spinal cord involvement and a clinical manifestation characterized by dementia and cerebellar syndrome, myofasciculation with absent reflexes and seizures. The two last manifestations are rare. The clinical hypothesis was probable CJD which was confirmed with autopsy and immunohistochemistry. We conclude that CJD should always be suspected when rapidly progressive dementia occurs and the absence of pyramidal or extrapyramidal signs suggest a spinal cord and/or peripheral nerve involvement.