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Submitted by Glauber de Assunção Moreira (glauber.moreira@ufba.br) on 2019-02-21T18:04:58Z No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO Reis, Luã Tainã.pdf: 2438307 bytes, checksum: 25a1ae5a30321a9fc569f6f37faeef7e (MD5) Approved for entry into archive by Setor de Periódicos (per_macedocosta@ufba.br) on 2019-02-21T18:45:16Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO Reis, Luã Tainã.pdf: 2438307 bytes, checksum: 25a1ae5a30321a9fc569f6f37faeef7e (MD5) Made available in DSpace on 2019-02-21T18:45:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO Reis, Luã Tainã.pdf: 2438307 bytes, checksum: 25a1ae5a30321a9fc569f6f37faeef7e (MD5) Os receptores nucleares (RN) fazem parte de uma superfamília de fatores de transcrição que são ativos mediante interação com ligantes e controlam amplamente a fisiologia humana através do controle da expressão gênica. Diversas moléculas podem se ligar e alterar a atividade destes receptores, desde cofatores até hormônios, tais como o estrógeno e o hormônio tireoidiano. Devido a essas características, os RN são alvos de pesquisa, principalmente no campo de drug design onde moléculas sintéticas são produzidas para causar uma resposta em genes alvo. Além dos hormônios endógenos e das drogas sintéticas, moléculas encontradas em plantas também podem modular estes receptores. O Brasil possui grande biodiversidade e, associado a isto, amplo conhecimento sobre o uso de plantas medicinais. Neste trabalho foram testadas plantas indicadas previamente por levantamento etnobotânico como possíveis ligantes vegetais moduladores do receptor de hormônio tireoidiano. Para tal foram feitos ensaios in vitro com o receptor full length clonado em E. coli e usado em ensaios de gene-reporter para medir possível ativação gênica sobre os genes controlados pelo TRβ. Quatro plantas demonstraram capacidade moduladora sobre este receptor: o Cajanus cajan, a Abarema cochliocorpos e a Borreria verticillata e Stillingia saxatilis. A descoberta de compostos naturais com capacidade de ativar e inibir genes abre um campo novo na farmacologia e biotecnologia de importância imensurável devido ao grande número de receptores nucleares existentes (mais de 100), que controlam a fisiologia humana, e por isso estão envolvidos com inúmeras patologias. Nuclear receptors (NR) are part of a superfamily of transcription factors that are active through interaction with ligands and widely control human physiology through gene expression. Many molecules can bind and change the activity of these receptors, from cofactors to hormones, such as estrogen and triiodothyronine. According to that, NR are targets of research, mainly in the field of drug design, where synthetic molecules are produced to cause a response in target genes. In addition to the endogenous hormones and synthetic drugs, molecules found in plants can also modulate these receptors. Brazil has a great biodiversity and, in addition to that, extensive knowledge about the use of medicinal plants. In this work plants indicated beforehand by ethnobotanical survey as possible plant ligands of thyroid hormone receptor were tested as modulators. With this purpose, in vitro assays were done with full length receptor cloned in E. coli and used in gene-reporter assays to measure possible activation of genes controlled by TRβ. Three plants demonstrated capacity on modulating this receptor: Cajanus cajan, Abarema cochliocorpos and Borreria verticillata. The discovery of natural compounds with ability to activate and inhibit genes opens a new field in pharmacology and biotechnology of immeasurable importance due to the large number of existing nuclear receptors (more than 100), which control human physiology, and are involved in numerous pathologies.

Orientador: Munir Salomão Skaf Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química Resumo: Receptores Nucleares (NRs) são proteínas que regulam a transcrição de genes, sendo alvos importantes para o desenho de fármacos. NRs são formados por quatro domínios, sendo o mais essencial deles, o Domínio de Ligação com o Ligante (LBD), responsável pelo reconhecimento seletivo de ligantes e ativação de sua função. Nesta Tese são utilizadas simulações de Dinâmica Molecular (MD) para o estudo do LBD de dois importantes NRs: Receptor do Hormônio Tireoideano (TR) e Receptor de Estrogênios (ER). Os estudos envolvendo o LBD do TR iniciaram-se pela investigação de um novo segundo sítio de ligação dos hormônios tireoideanos (T3 e T4). Foi mostrado que os hormônios se mantêm ancorados ao segundo sítio, possuindo grande mobilidade e múltiplos modos de ligação. Estimativas do DG de dissociação indicam que este novo sítio deve existir em solução aquosa, sendo T4 o hormônio com maior afinidade e candidato a ligante natural. O segundo objetivo da Tese foi a modelagem molecular da estrutura do LBD do TR sem ligantes (apo-TR) através da combinação de resultados de simulações de MD e experimentos de troca de hidrogênio/deutério. O modelo do apo-TR obtido mostra que a-hélice H12 ancora-se na H3, o que explica as mudanças de hidratação nesta região apontadas pelos experimentos. O terceiro objetivo da Tese foi elucidar os mecanismos moleculares que levam a alterações da atividade em duas mutações dos TRs: M369Ra e P452Lb. As simulações de M369Raindicam que o resíduo mutado interage com T3 no segundo sítio, o que pode explicar o aumento de sua afinidade por este ligante. As simulações de P452Lbsugeriram que esta mutação altera a posição da H12, levando a redução da cavidade de interação com co-ativadores e das interações do T3 com o primeiro sítio. O último estudo da Tese investigou uma conformação alternativa do LBD do ERb , que tem potencial para explicar como este subtipo promove repressão parcial da transcrição de genes regulada pelo ERa. Os cálculos de DG entre as conformaçõs clássica e alternativa indicam que a alternativa é estável, sendo o mínimo global de energia livre. Abstract: Nuclear receptors (NRs) are proteins that regulate the gene transcription and thus are important targets for drug development. NRs are composed of four structural domains. The most important of them is the Ligand Binding Domain (LBD), responsible for the selective recognition of ligands and activation of NR function. In this Doctoral Thesis, Molecular Dynamics (MD) Simulation are used to study two important NRs LBD: Thyroid Hormone Receptor (TR) and Estrogen Receptor (ER). Studies involving TR began by investigating a new second binding site of thyroid hormones (T3 and T4) in the TR LBD. It has been shown that hormones remain anchored to the second site and have high mobility and multiple binding modes. Estimates of dissociation DG indicate that this new site can exist in aqueous solution. T4 has the higher affinity and may be the natural ligand of this site. The second objetive of the Thesis was the molecular modeling of the TR LBD structure without ligands (apo-TR) by combining results of MD simulations and hydrogen deuterium exchange experiments. The obtained model of apo-TR shows that H12 a-helix is anchored in H3 which explains the hydration changes in this region indicated by the experiments. The third goal was to elucidate the molecular mechanisms that lead to changes in the activity of two TR mutations: M369Ra and P452Lb. Simulations of M369Ra indicate that the mutated residue can interact directly with T3 in the second binding site, explaining the increase of its affinity. Simulations of P452Lbsuggested that this mutation changes the H12 position, leading to loss of ligand interaction with the rst binding site and reduction of coactivator cavity. The last study investigated a new alternative conformation of ERb LBD, which has the potential to explain how this subtype promotes the partial repression of ERagene transcription. Calculation of DG between classic and alternative conformations indicate that the alternative is stable and the global minimum of free energy. Doutorado Físico-Química Doutor em Ciências

Orientador: Munir Salomão Skaf Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química Resumo: Receptores de androgênio (AR) são membros da superfamília de receptores nucleares que incluem os receptores de esteroides, entre outros. O AR liga os esteroides sexuais endógenos diidrotestosterona e testosterona. O desenvolvimento normal do fenótipo masculino e do sistema reprodutivo necessita de ações pré- e pósnatais promovidas pela interação do AR com esses hormônios. Mutações no gene do receptor de androgênio podem levar a várias doenças como o câncer de próstata e a síndrome de insensibilidade ao androgênio (AIS). Substituições diferentes no mesmo resíduo de aminoácido podem resultar em impactos variáveis na atividade do receptor levando a diferentes graus de AIS. Um grande número de mutações tem sido reportado para o AR envolvendo AIS e células tumorais de câncer de próstata e sua localização e função podem ajudar a entender como essas doenças devem ser tratadas. Entretanto, pouco se sabe sobre como as mutações mudam a estrutura e a dinâmica do AR, uma vez que apenas poucas estruturas cristalográficas de mutantes foram obtidas. Neste trabalho, apresentamos estudos de simulação de dinâmica molecular de algumas estruturas do AR humano com mutações localizadas no domínio de ligação do ligante (LBD) em comparação com a estrutura nativa complexadas com o ligante sintético metiltrienolona (R1881). Nosso objetivo é investigar as bases moleculares das mudanças sutis no receptor causadas pelas mutações que afetam sua afinidade pelo ligante R1881. Embora nenhum dos resíduos mutados deste estudo interajam diretamente com o ligante, os resultados das simulações indicaram que as mutações causam mudanças estruturais e dinâmicas no AR-LBD na região onde se localiza a mutação e na cavidade de ligação do ligante (LBP). A principal mudança observada foi o deslocamento do resíduo Arg752, facilitando a entrada de moléculas de água no LBP e o reposicionamento de cadeias laterais dos resíduos do domínio F, uma importante região que contribui para a estabilidade da estrutura do AR-LBD e da conformação ativa da hélice 12. Os resultados obtidos mostram que essas mutações, que ocorrem naturalmente, são exemplos de resíduos que não estão em contato direto com o ligante e não pertencem à região de recrutamento do coativador, mas que possuem um importante papel na ligação do ligante e na ativação do receptor por estabilizar a hélice 12 e o domínio F na conformação ativa Abstract: Androgen receptors (AR) are members of the superfamily of nuclear receptors that includes the steroid receptors, among others. AR binds the male endogenous sex steroids, dihydrotestosterone and testosterone. Normal development of the male phenotype and reproductive system requires pre- and postnatal actions promoted by AR interaction with these hormones. Mutations in the androgen receptor gene may lead to several diseases like prostate cancer (PCa) and the androgen insensitivity syndrome (AIS). Different substitutions at the same amino acid residue may result in variable impact on the activity of the receptor leading to different degrees of AIS. A number of mutations have been reported for the AR in AIS and PCa tumor cells and their location and function may help us to understand how these diseases should be treated. Nevertheless, not much is known about how the mutations change the structure and dynamics of the AR since only a few crystallographic structures of mutants were obtained. In this work we present molecular dynamics simulation (MD) studies of some human AR mutations located in the ligand binding domain (LBD) in comparison with wild type (WT) structure in complex with the synthetic ligand methyltrienolone (R1881). Our goal is to investigate the molecular basis of subtle changes in the receptor caused by mutations in the AR-LBD/R1881 affinity. Although the mutated residues do not interact with the ligand, the simulations results indicated that the mutants cause structural and dynamical changes in the AR-LBD in the region in which the mutation is placed and in the binding pocket (LBP). The principal change observed was the displacement of residue Arg752, facilitating water penetration in LBP, and the repositioning of F-domain side chains, which makes important contributions to the stability of the AR-LBD structure and helix 12 active conformation. The results obtained show that these naturally occurring mutations are examples of residues that are not in contact with the ligand and do not belong to coactivator recruitment region, but which do have an important role in ligand binding and receptor activation by stabilizing the helix H12 and the F-domain in the active conformation Doutorado Físico-Química Doutor em Ciências

Orientador: Munir Salomão Skaf Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química Resumo: O Receptor Ativador da Proliferação de Peroxissomos g (PPARg) e membro de uma família de receptores nucleares cuja atividade é regulada por ligantes. O PPARg atua no metabolismo de lipídios e promove a sensibilização sistêmica à insulina, sendo, portanto, um alvo em potencial para o desenvolvimento de fármacos antidiabéticos. Dentre os ligantes desse receptor, o mais conhecido é a rosiglitazona (RSG), um agonista total que tem a utilização limitada por seus efeitos adversos: toxicidade cardiovascular, ganho de peso e retenção hídrica. A utilização de agonistas parciais é uma alternativa promissora para a redução desses efeitos, já que, apesar de apresentarem menor efeito farmacológico, conseguem desacoplar a sensibilização à insulina do acúmulo de triglicerídeos. Neste trabalho, realizamos simulações de dinâmica molecular do PPARg ligado a um agonista parcial recentemente descoberto, o GQ16. O complexo PPARg-RSG também foi simulado e utilizado como comparativo, para estudar os modos de ligação dos ligantes e suas influências sobre a dinâmica do PPARg. O mecanismo clássico de ativação do receptor é através da estabilização de uma de suas hélices (H12). Analisando-se a estabilidade da H12 durante as simulações observamos que esta permaneceu mais estável em presença da RSG em relação ao GQ16. As simulações revelaram que enquanto a RSG interage diretamente com um resíduo da H12, o GQ16 interage através de uma molécula de água, estabilizando mais fracamente a H12. Essa diferença de comportamento entre os ligantes pode estar por trás da menor ativação promovida pelo GQ16 em relação a RSG, o que está de acordo com os estudos funcionais que mostraram que o GQ16 atua como agonista parcial. Estudos recentes mostram que características estruturais do receptor são importantes na ativação ligante-específica. Um desses fatores auxiliares da ativação do PPARg está relacionado a fosforilação de uma serina (S245) do receptor, mediada por uma proteína quinase, a Cdk5. As simulações revelaram que há uma maior estabilização do loop que contém a S245 em presença do GQ16. Além disso, vimos que o resíduo K244, vizinho ao alvo da fosforilação pela Cdk5, varre um espaço conformacional menor em relação ao complexo PPARg-RSG. Esses resultados sugerem que o GQ16 possibilitaria um bloqueio mais efetivo da fosforilação, ao estabilizar esse loop como um todo, incluindo o resíduo K244 e deixando a S245 menos suscetível a acção da Cdk5 Abstract: The Peroxisome Proliferator-Activated Receptors gamma (PPARg) is a member of a family of nuclear receptors whose activity is regulated by ligands. The PPARg acts on lipid metabolism and promotes systemic insulin sensitization, therefore being a potential target for the development of antidiabetics agents. Among the ligands of this receptor, the most popular is rosiglitazone (RSG), a full agonist which has restricted use by its side effects: cardiovascular toxicity, weight gain and water retention. The use of partial agonists is a promising alternative to reduce these effects because they can uncouple insulin sensitization from the triglyceride accumulation. In this work, we performed molecular dynamics simulation to investigate the dynamics of PPARg in presence of a partial agonist recently discovered, GQ16 and rosiglitazone (RSG). The classic mechanism of receptor activation is through the stabilization of one of its helixes (H12). Analyzing the stability of H12 during the simulations we found that it remained more stable in the presence of RSG in relation to GQ16. The simulations revealed that while RSG interacts directly with a residue of H12, GQ16 interacts through a water molecule, thus destabilizing somewhat the productive conformation of H12. This difference in behavior promoted by the ligands may underlie the lower GQ16-induced activation in relation to the RSG, which is consistent with the functional studies that showed that GQ16 acts as partial agonist. Recent studies show that structural characteristics are important in receptor ligand-specific activation. One of these auxiliary factors of the activation of PPARg is related to the phosphorylation of a serine (S245) receptor mediated by a protein kinase, Cdk5. The simulations revealed that there is a greater stabilization of the loop containing the S245 in the presence of GQ16. In addition, we found that the residue K244, neighboring the target of phosphorylation by Cdk5, sweeps a narrower conformational space in relation to complex PPARg-RSG. These results suggest that GQ16 enable a more effective blocking of the phosphorylation by stabilizing this loop as a whole, including the residue K244, letting S245 less susceptible to the action of Cdk5 Mestrado Físico-Química Mestre em Química

Os receptores ativados por proliferadores de peroxissoma (PPARs) são fatores de transcrição pertencentes à família de receptores nucleares que regulam a homeostase da glicose, metabolismo de lipídeos e inflamação. Três proteínas, codificadas por genes distintos, têm sido identificadas: PPARalfa, PPARbeta e PPARgama, que controlam a expressão gênica pela ligação a elementos responsivos específicos (PPREs) localizados na região promotora. Estudos recentes sugerem que a ativação do PPARgama pode diminuir a progressão da aterosclerose e aumentar a sensibilidade à insulina, podendo ser um potencial alvo terapêutico para o tratamento de diversas enfermidades, incluindo o diabetes melito do tipo 2 e dislipidemia. Esta revisão destaca os estudos recentes e os avanços das principais funções que esse receptor desempenha no metabolismo, com ênfase nos mecanismos moleculares e eficácia terapêutica. The peroxisome proliferators-activated receptors (PPARs) are transcription factors belonging to the family of nuclear receptors that regulate glucose homeostasis, lipid metabolism and inflammation. Three proteins, encoded by distinct genes, have been identified: PPARalpha, PPARbeta and PPARgamma, which control gene expression by binding to specific response elements (PPREs) in the promoters. Recent studies suggest that activation of PPARgamma might decrease atherosclerosis progression and increase the insulin sensitivity, might be a potential therapeutic target for the treatment of a diverse array of disorders, including type 2 diabetes and dyslipidaemia. This review highlights recent studies, which have advanced our understanding of the pivotal role that this receptor plays in metabolism, with particular reference to the molecular mechanisms and therapeutic efficacy.

O câncer de próstata (CP) é uma das principais causas de doença e morte, representando no Brasil a segunda causa de óbitos por câncer em homens. A hiperplasia prostática benigna (HPB) é uma doença progressiva de alta prevalência, com evidências histológicas em 50% dos homens aos 50 anos e 90% aos 80 anos de idade. A patogênese das neoplasias prostáticas tem sido associada à ação dos androgênios e a seu receptor nuclear específico, embora os mecanismos moleculares que envolvem os processos de proliferação, diferenciação e apoptose não estejam bem estabelecidos, assim como os mecanismos de transformação neoplásica e carcinogênese. Co-ativadores e co-repressores podem também contribuir para a carcinogênese prostática, ligando-se diretamente aos receptores nucleares, recrutando proteínas adicionais e interagindo com a maquinaria transcricional para aumentar a transcrição de genes-alvo. Polimorfismos do receptor de androgênios e da 5 redutase tipo 2 foram identificados e poderiam estar associados com risco para CP. Genes reguladores do ciclo celular e da apoptose, bem como fatores de crescimento, também participam de processos relacionados com a tumorigênese prostática. Assim, alterações no padrão da expressão gênica do tecido normal podem levar ao desenvolvimento do fenótipo maligno e potencialmente estes genes podem servir como marcadores de prognóstico. Com o advento de novas tecnologias moleculares, o número de genes marcadores potenciais para o CP cresce dia a dia, mas os dados atuais requerem ainda validação com maior número de amostras e correlação com o processo da doença. Trazê-los do ambiente de laboratório para o uso clínico requer uma análise rigorosa e há, portanto, um longo caminho ainda a percorrer. Prostate cancer (PC) is one of the main causes of disease and death and represents the second cause of death among men in Brazil. Benign prostate hyperplasia is a progressive and prevalent disease. It is estimated that men present around 50% and 90% of histological evidences of prostate hyperplasia at 50 and 80 years, respectively. While the pathogenesis of prostate neoplasias has been closely related to androgen and their specific nuclear receptor, the molecular mechanisms of cell growth, differentiation and apoptosis processes are still not clearly established. Co-activators and co-repressors could also contribute to prostate carcinogenesis by their binding to nuclear receptors or by interacting with the transcriptional machinery in order to increase the transcription of target genes. AR and type 2 5 reductase polymorphisms seem to be associated to the risk for PC. In addition, apoptosis and cellular cycle regulator genes, as well as growth factors, have been reported to be associated with the prostate tumorigenesis. Therefore, changes on the gene expression of normal tissue may be associated to the development of malign phenotype and these genes could be regarded as candidates of prognosis markers. The number of these genes increases every day but the present data needs further studies and correlation with the disease progression.

Os hormônios tireoideanos (HTs) são necessários para a diferenciação, crescimento e metabolismo de diversos tecidos de vertebrados. Seus efeitos são mediados pelos receptores do hormônio tireoideano (TRs), membros da superfamília dos receptores nucleares. Estes receptores são fatores de transcrição modulares que se ligam em seqüências específicas do DNA denominadas elementos responsivos ao TR, que são encontrados nos promotores dos genes regulados pelo HT. Os TRs são codificados por dois genes distintos, a e b, localizados nos cromossomos 17 e 3, respectivamente. Estas isoformas apresentam diferentes funções e sua expressão é específica para cada tecido. O TR se liga ao DNA como monômero, homodímero ou heterodímero com o receptor de retinóide X (RXR). Além disso, o TR modula a atividade transcricional (repressão ou ativação) através da interação com correpressores e co-ativadores, na ausência e na presença do T3, respectivamente. A compreensão do mecanismo molecular da ação do receptor do hormônio tireoideano e a definição de sua estrutura cristalográfica contribuirão para a aquisição de novos conceitos envolvidos na transcrição e nos distúrbios hormonais presentes nas doenças endócrinas, assim como facilitará o desenho de novas drogas, agonistas ou antagonistas, com grande valor terapêutico. Thyroid hormones (TH) are involved in normal differentiation, growth, and metabolism in several tissues of all vertebrates. Their actions are mediated by the TH receptors (TRs), members of the nuclear hormone receptor superfamily. These receptors are transcription factors that bind to DNA on specific sequences, the TR response element (TREs), in promoters of target genes. Two genes encode TRs, a e b, located in chromosomes 17 and 3, respectively. These isoforms show different functions and exhibit a tissue specific expression. TRs function as monomers, homodimers or heterodimers with retinoid X receptor (RXR) and modulate transcription activity (repression or activation) by interacting with co-repressor and coactivators, which associate with TR in the absence or presence of T3, respectively. Understanding the molecular mechanism of TR action and the definition of its crystallographic structure will provide new insights into transcription mechanisms and will facilitate the design of new drugs with greater therapeutic value.