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RESUMO O estudo foi conduzido com o objetivo de avaliar sorologicamente 952 lotes de galinhas reprodutoras com idade entre 6 e 65 semanas, de diversas regiões do País durante os anos de 2003 e 2004. Foram analisadas 139.096 e 121.818 amostras de soro através da prova de soroaglutinação rápida para Mycoplasma gallisepticum e Mycoplasma synoviae, respectivamente. Os soros foram inativados a 56º C, por 30min e processados à prova de soroaglutinação rápida com antígenos comerciais. Adicionou-se partes iguais de antígeno e soro, homogenizando a mistura e após 2min verificou-se a presença ou não de grumos, indicando a formação de reação antígeno-anticorpo. Inicialmente utilizou-se soro bruto, e posteriormente soro diluído na proporção de 1:10 em salina 0,85% de NaCl. Das amostras analisadas, 1,58% (1920) apresentaram resultado positivo na diluição 1:10 ao antígeno testado de MS e negativas ao antígeno testado de M. gallisepticum. Considerandose esses resultados pode-se suspeitar da presença de M. synoviae nesses plantéis, indicando que a prova de soroaglutinação rápida pode ser utilizada preliminarmente como monitoria, facilitando a conduta laboratorial a ser seguida, direcionando outros testes sorológicos e ações de isolamento e a identificação dos agentes com maior precisão. ABSTRACT This study was conducted to evaluate the serological responses of 952 flocks of breeder chickens with ages between 6 and 65 weeks, from several areas of the country during the years of 2003 and 2004. A total of 139,096 and 121,818 serum samples were analyzed by rapid serum agglutination test for Mycoplasma gallisepticum and Mycoplasma synoviae, respectively. The sera were inactivated at 56º C, for 30min and processed by the rapid serum agglutination test with commercial antigens. Similar parts of antigen and serum were added, the solution was mixed and after 2min the presence or not of clots was verified, indicating the antigenantibody formation. Initially crude serum was used, and later serum diluted in the proportion of 1:10 in saline 0.85% of NaCl. Of the analyzed samples, 1.58% (1920) resulted positive for the tested antigen in the dilution 1:10 of M. synoviae and negative for M. gallisepticum. Considering these results, the presence of MS in these flocks can be suspected, indicating that rapid serum agglutination test can be used as a control, to facilitate the laboratorial procedures followed, leading to other serological tests and isolation actions and the identification of agents with greater precision.

RESUMO: O presente estudo teve como objetivo investigar a presença de Mycoplasma gallisepticum e M. synoviae em diferentes espécies de psitacídeos cativos no Brasil Central. Um total de 300 amostras foram coletadas e corresponderam a 41 espécies de psitacídeos da fauna brasileira, provenientes do CETAS, criadouro comercial e criadouro conservacionista. Quatorze espécies apresentaram amostras positivas para M. gallisepticum destacando a maracanã-verdadeira (Primolius maracana) (01/02, 50%), a arara-canindé (Ara ararauna) (15/48, 33,3%) e a jandaia-verdadeira (Aratinga jandaia) (03/10, 30%). Amostras do CETAS obtiveram total de 21,62% (16/74) de amostras positivas, do criadouro comercial 15,7% (19/121) e do criadouro conservacionista 6,66% (7/105). Apenas três espécies foram positivas para M. synoviae sendo essas, a maracanã-pequena (Primolius maracana) (1/10 - 10%), arara-macao (Ara macao) (1/12, 8,3%) e arara-canindé (Ara ararauna) (2/48, 4,1%). O CETAS obteve 2,7% (2/74) de amostras positivas totais, enquanto o criadouro conservacionista obteve total de 1,9% (2/105) de amostras. Não ocorreram amostras positivas para M. synoviae no criadouro comercial. Os resultados mostraram um considerável número de amostras positivas para M. gallisepticum em espécies da família Psittacidae, indicando que estes animais podem ser uma fonte de infecção silenciosa para outras aves, uma vez que não apresentaram sintomatologia clínica. ABSTRACT: The study aimed to investigate the presence of Mycoplasma gallisepticum and M. synoviae in different species of captive parrots, in Central Brazil. A total of 300 samples were collected from 41 brazilian species of Psittacidae at three captivities: Centro de Triagem de Animais Silvestres (CETAS), a conservation and a commercial captivity. Fourteen species presented positive samples for M. galisepticum, the most affected were blue-winged macaw (Primolius maracana) (01/02, 50%), blue-and-yellow macaw (Ara ararauna) (15/48, 33.3%), and jandaia parakeet (Aratinga jandaia) (03/10, 30%). CETAS facility showed 21.62% (16/74) of positive samples, while the commercial captivity showed 15.7% (19/121), and the conservation captivity 6.66% (7/105). Only three species presented positive samples for M. synoviae: blue-winged macaw (Primolius maracana) (1/10, 10%), scarlet macaw (Ara macao) (1/12, 8.3%) e blue-and-yellow macaw (Ara ararauna) (2/48, 4.1%). CETAS facility showed 2.7% (2/74) of positive samples, while the conservation captivity presented 1.9% (2/105), and no positive samples were found in the commercial captivity. Results showed a considerable number of positive samples for M. galisepticum in species of Psittacidae family, indicating that these animals can be a silent source of infection for other birds, since they did not present clinical symptoms.

A laringotraqueíte infecciosa (LTI) é uma doença que acomete o aparelho respiratório de galinhas. Em novembro de 2010, foi notificada sua ocorrência no sul do Estado de Minas Gerais. Visando a necessidade de controle da doença, foram realizadas coletas periódicas programadas em 17 das 27 granjas da região. No total, 159 galinhas de postura de idades múltiplas foram necropsiadas, sendo coletadas amostras de seios e conchas nasais, laringe, traqueia, pulmões, conjuntiva e encéfalo para posterior processamento histopatológico. Para extração de DNA, foram coletados apenas traqueia e gânglio trigêmeo, e em seguida era procedida a PCR. Durante a vigência do projeto (2012-2013), ocorreram três episódios isolados (em diferentes momentos) sugestivos de LTI, relacionados com a introdução de aves não vacinadas. As galinhas foram examinadas por veterinários do Instituto Mineiro de agropecuária (IMA), e amostras foram coletadas e enviadas ao laboratório de patologia da UFMG (um total de 18 galinhas). Cinco amostras positivas para o vírus da LTI (GaHV-1), incluindo uma amostra de estudos anteriores (2011), tiveram fragmentos do genoma sequenciados. Dois fragmentos para o gene ICP4, e um fragmento para o gene TK, onde foram alinhados a outras estirpes depositadas no GenBank. As galinhas coletadas durante as visitas foram examinadas também quanto à presença de lesões histopatológicas sugestivas de outros patógenos respiratórios, e à PCR foram pesquisados Mycoplasma gallisepticum e Mycoplasma synoviae. Um fragmento da região intergênica (IGSR) e um fragmento do gene mgc2, do genoma do M. gallissepticum, foram sequenciados e caracterizados. Dezoito codornas (Coturnix japonica) de postura da região também foram avaliadas quanto à presença de lesões para LTI à histopatologia, assim como para DNA viral à PCR. As galinhas coletadas durante as visitas programadas às granjas apresentaram lesões inespecíficas, e apenas quatro apresentaram células sinciciais à histopatologia, porém sem corpúsculo de inclusão. Já as galinhas enviadas pelo IMA, apresentaram lesões compatíveis com LTI, que consistiam em laringite e traqueíte fibrinosa aguda difusa moderada associada a descamação do epitélio e fusão de células epiteliais formando sincícios contendo corpúsculo de inclusão intranuclear. As amostras sequenciadas tiveram 100% de identidade entre elas, não havendo alteração nos fragmentos analisados durante três anos consecutivos (2011, 2012 e 2013). Além disso, as estirpes de Minas Gerais apresentaram mutações não sinônimas quando comparadas com as estirpes de um surto ocorrido em 2002, em São Paulo. As sequências obtidas não foram caracterizadas como de origem vacinal por não apresentaram as deleções observadas nas vacinas vivas atenuadas (CEO e TCO). Na análise do fragmento do gene TK não foi observada a mutação na posição 252 do gene, de uma treonina para metionina (relacionada a maior virulência da estirpe). Os achados epidemiológicos (baixa mortalidade e morbidade) associados à análise molecular do gene TK sugeriram que as estirpes eram de menor virulência. As vacinas vectoradas para LTI (FPV e HVT) foram implementadas na região em Agosto de 2011, porém, como esta alternativa começou a ser testada pela primeira vez no Brasil, tornou-se extremamente importante o seu acompanhamento. A introdução das vacinas vectoradas foram efetivas em reduzir a infecção viral, prevenindo a doença clínica e reduzindo a presença do DNA viral, especialmente no gânglio trigêmeo. Dentre as coinfecções observadas, a micoplasmose foi a principal, e a partir do sequenciamento de fragmentos do genoma, o M. gallisepticum foi caracterizado com alta variação nucleotídica entre as estirpes. As codornas não apresentaram lesões para GaHV-1 e os tecidos foram negativos à PCR, sugerindo que estas não estão envolvidas na manutenção do vírus na área. Embora a região não tenha apresentado outros surtos significativos de LTI, os resultados indicam que o vírus ainda encontra-se presente e circulante entre as aves e as granjas. Medidas de biosseguridade devem ser adotadas, e visam reduzir ou impedir oportunidades de disseminação do vírus. Além disso, o programa de vacinação deve ser uniforme para evitar a infecção de aves susceptíveis e a ocorrência de doença clínica, e este deveria ser estendido não só as aves comerciais, como também às aves de subsistência. Infectious laryngotracheitis (ILT) is a disease that affects the respiratory tract of chickens. In November 2010, its occurrence has been reported in southern Minas Gerais. For control of the disease, regular scheduled collections of tissues in 17 of the 27 farms in the area were carried out. In total, 159 laying hens of multiple ages were necropsied, and samples of sinuses and nasal turbinates, larynx, trachea, lungs, brain and conjunctiva were collected for further histological processing. For DNA extraction only trachea and trigeminal ganglion were collected, and then PCR was performed During the period of the project (2012-2013), three isolated episodes (at different times) suggestive of ILT, related to the introduction of unvaccinated birds occurred. The chickens (total of 18) were examined by veterinarians of Instituto Mineiro de Agropecuária (IMA), and samples were collected and sent to the pathology laboratory at UFMG. Five positive samples for ILT virus (GaHV -1), including a sample from previous studies (2011), had their genome fragments submitted to sequencing. Two fragments of ICP4 gene and a fragment of TK gene, which have been aligned to other strains, were deposited in GenBank. The chickens collected during the visits were also examined for the presence of histopathological lesions suggestive of other respiratory pathogens, and PCR was performed for Mycoplasma gallisepticum and Mycoplasma synoviae. Specific regions of the M. gallisepticum genome, a fragment of the intergenic region (IGSR) and a fragment of mgc2 gene, were sequenced and characterized. Eighteen egg-laying quails (Coturnix japonica) of the region were also evaluated for the presence of lesions for ILT by histopathology, as well as PCR for viral DNA. The chickens collected during scheduled visits to the farms had nonspecific lesions, and only four showed syncytial cells at histopathology, but without intranuclear inclusion bodies. On the other hand, chickens sent by IMA showed lesions compatible with ILT, which consisted of acute moderate diffuse fibrinous laryngitis and tracheitis associated with desquamation of epithelium and fusion of epithelial cells forming syncytia containing intranuclear inclusion bodies. The samples were sequenced and 100 % identity was observed among them, with no change in the fragments analyzed for three consecutive years (2011, 2012 and 2013). Furthermore, strains of Minas Gerais showed non-synonymous mutations compared with strains from an outbreak occurred in 2002, in São Paulo. The sequences obtained were not characterized as vaccine strains because no deletions were seen, in contrast to the sequence of the live attenuated vaccines (CEO and TCO). In the analysis of the TK gene fragment , mutation were not observed at position 252 of the gene for a threonine to methionine (related to the increased virulence of the strain). The epidemiological findings (low mortality and morbidity) associated with molecular analysis of the TK gene suggested less virulent strains. The vector vaccines for ILT (HVT and FPV) were implemented in the region in August 2011; however, as this alternative began to be tested for the first time in Brazil, it has become extremely important to monitor the birds from that area. The introduction of vector vaccines was effective in reducing viral infection, preventing clinical disease and reducing the presence of viral DNA, especially in the trigeminal ganglion. Among the co-infections observed, mycoplasmosis was the most prevalent, and from the sequencing of genomefragments, the M. gallisepticum was characterized with high nucleotide variation among the strains. No lesions to GaHV-1 were observed in tissue of quails by histopathology and in addition, all of them were negative by PCR, suggesting that they are not involved in the maintenance of the virus in the area. Although no other significant outbreaks of ILT was reported in the area, these results indicate that the virus is still present and circulating among birds and poultry farms. Biosecurity measures must be adopted with the aim to reduce or prevent chances of spreading the virus. Moreover, the vaccination program should be uniform in order to avoid infection of susceptible birds and the occurrence of clinical disease, and this should be extended not only to commercial poultry, but to backyard chickens as well.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2010 O Mycoplasma synoviae é um dos mais importantes patógenos de aves domésticas em todo o mundo, sendo o agente causador de doenças respiratórias, sinovites e doenças sistêmicas, e, por consequência, torna-se responsável por grandes perdas econômicas na produção avícola. Com a recente conclusão do sequenciamento do genoma do M. synoviae, deu-se novo impulso na realização de estudos pós-genômicos. O presente trabalho apresenta o mapa proteômico preliminar das proteínas citoplasmáticas do M. synoviae, desenvolvido utilizando a eletroforese bidimensional associada à espectrometria de massa. Os mapas proteômicos foram realizados em duas faixas de pH (pH 4 a 7 e pH 3 a 10), e em dois tamanhos de tiras de IPG (7 cm e 13 cm). As proteínas foram identificadas utilizando espectrometria de massa MALDI/TOF e a ferramenta de busca MASCOT. Baseado na sequência genômica um total de 42 sequências codificantes de DNA (CDSs) foram identificadas, sendo que as proteínas mais abundantes foram a chaperona DnaK, o fator de elongação Tu e a tiol peroxidase. De acordo com a classificação funcional, a maioria das proteínas identificadas pertence à classe de metabolismo (39%) e à classe de armazenamento e processamento de informação (29%). Finalmente, foi realizada uma análise imunológica, na qual identificamos duas proteínas antigênicas de M. synoviae reconhecidas pelo soro de animais imunizados com esse patógeno, sendo elas a frutose-bifosfato aldolase e a proteína hipotética MS53_0025. O mapa proteômico obtido será útil como referência para outras análises de expressão protéica em M. synoviae. Mycoplasma synoviae is a major pathogen of poultry throughout the world, being the causative agent of respiratory diseases, synovitis and systemic diseases, and consequently, it is responsible for great economic losses in poultry production. Recently the sequencing of M. synoviae genome was concluded and this accomplishment has stimulated pos-genomic studies This study presents the preliminary proteomic map of citoplasmatic proteins of M. synoviae, constructed using two-dimensional gel electrophoresis in combination with mass spectrometry. The proteomic maps were produced in two pH ranges (pH 3-10 and pH 4-7), and using two different IPG strips lengths (7 cm and 13 cm). Proteins were identified using MALDI/TOF mass spectrometry and the search engine MASCOT. Based on the genome sequence of M. synoviae, a total of 42 different coding DNA sequences (CDSs) were identified. The most prominent proteins were the molecular chaperone DnaK, the elongation factor Tu and thiol peroxidase. According to the functional classification, the majority of the identified proteins belong to the class of metabolism (39%) and the class of information storage and processing (29%). Finally, we performed an immunological analysis which identified two antigenic proteins from M. synoviae recognized by sera from animals immunized with this pathogen. The proteome map obtained will be useful as reference for further analysis of protein expression in M. synoviae.