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Orientador: Cristina Elisa Alvarez Martinez Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A citricultura é uma atividade econômica importante no Brasil, ameaçada por doenças que atacam as culturas, como o cancro cítrico causado pela bactéria Xanthomonas citri, o que leva a um rendimento reduzido e a perdas econômicas significativas. É essencial, portanto, a realização de estudos para a compreensão dos mecanismos de virulência de X. citri, contribuindo para melhorar sua detecção e controle. Fatores sigma bacterianos (?) são subunidades dissociáveis da RNA polimerase responsáveis pelo reconhecimento de promotores e por promover o início de transcrição. Dentre eles, a família de fatores sigma extracitoplasmáticos (ECF), regula a expressão gênica em resposta a sinais detectados no envelope bacteriano. O nosso grupo de pesquisa vem realizando o estudo dos fatores ECF codificados pelos genes xac4128 (ecfK) e xac4129 (ecfL). Estes são encontrados em um grupamento gênico que codifica um sistema de secreção do tipo VI (SS6), um complexo proteico que atravessa o envelope bacteriano e injeta proteínas diretamente em células procarióticas e eucarióticas ou para o meio extracelular. O gene ecfL tem contexto genômico típico de fatores ECF envolvidos na resposta a carência de ferro, também chamados de FecI (?FecI). Membros deste grupo são codificados em operon com o gene que codifica um fator anti-sigma chamado FecR e na vizinhança de um gene que codifica um receptor dependente de TonB (TBDR, do inglês TonB-dependent receptor), chamado FecA, que atua na ativação do fator sigma em resposta a sinais do ambiente externo. A análise do transcriptoma de uma linhagem com níveis aumentados de ecfL levou à identificação do regulon deste fator ECF, que é composto por 3 genes, xac4131, xac4132, xac4133, localizados na vizinhança de ecfL no genoma de X. citri. A análise informática das proteínas codificadas pelos genes do regulon de EcfL revelam que o gene xac4131 codifica um homólogo a FecA, sugerindo que a proteína atue na ativação de ?FecI e, possivelmente, na captação de nutrientes ou outras pequenas moléculas, função caracterizada para membros desta família de receptores de membrana externa. O gene xac4132 codifica uma proteína com domínio de fosfatase ácida dependente de histidina, este domínio é encontrado em fitases, enzimas que degradam o ácido fítico, a principal fonte de fosfato armazenado em plantas e solos. O gene xac4133 codifica uma proteína que combina um domínio de lectina do tipo jacalina, envolvido na ligação a carboidratos, o que sugere uma interação com superfície de células eucarióticas, e um domínio da família EEP (exonuclease-endonuclease-fosfatase), típico de enzimas que atuam na clivagem de ligações fosfodiéster, geralmente em DNA e fosfolipídeos, o que sugere uma função de endonuclease ou de esfingomielinase. Esfingomielinases bacterianas são enzimas secretadas que atuam na desestruturação de membranas eucarióticas, permitindo, por exemplo, o escape do fagossomo e a sobrevivência bacteriana no hospedeiro. Um possível papel como toxinas secretadas pelo SS6 é, portanto, sugerido pelos domínios encontrados em Xac4132 e Xac4133. Porém, a caracterização fenotípica de ?ecfL indica que o gene não é necessário para a resistência a predação e, da mesma forma, os genes ecfL, xac4132 e xac4133 não apresentam indução de expressão durante co-incubação com D. discoideum (Lima et al., submetido), característica observada para os genes do SS6 e seu regulador EcfK (Bayer-Santos et al., 2018). A redução de virulência observada para a linhagem ?ecfL pode indicar que as proteínas Xac4132 e Xac4133 atuem na célula hospedeira durante a infecção. Assim, apesar de conhecer o regulon de ecfL e ter dados fenotípicos interessantes para a linhagem mutante em ecfL, estudos complementares são necessários para que seja possível compreender a função deste fator sigma ECF na fisiologia de X. citri. Por esse motivo, o objetivo do trabalho é a caracterização bioquímica e funcional das proteínas codificadas pelos membros do regulon do fator sigma alternativo ecfL de X. citri. Assim, este estudo poderá levar a identificação de novas funções importantes para a virulência de X. citri e para a sobrevivência e adaptação ao ambiente Abstract: Citriculture is an important economic activity in Brazil, threatened by diseases that attack crops, such as citrus canker caused by the bacterium Xanthomonas citri, which leads to reduced yields and significant economic losses. It is therefore essential to carry out studies to understand the virulence mechanisms of X. citri, contributing to improve its detection and control. Bacterial sigma factors (?) are dissociable subunits of RNA polymerase responsible for the recognition of promoters and for promoting the initiation of transcription. Among them, the extracytoplasmic sigma factor (ECF) family regulates gene expression in response to signals detected in the bacterial envelope. Our research group has been studying the ECF factors encoded by the xac4128 (ecfK) and xac4129 (ecfL) genes. These are found in a gene cluster that encodes a type VI secretion system (SS6), a protein complex that crosses the bacterial envelope and injects proteins directly into prokaryotic and eukaryotic cells or into the extracellular medium. The ecfL gene has a typical genomic context of ECF factors involved in the response to iron deficiency, also called FecI (?FecI). Members of this group are encoded in an operon with the gene encoding an anti-sigma factor called FecR and in the vicinity of a gene encoding a TonB-dependent receptor (TBDR), called FecA, which acts on activation of the sigma factor in response to signals from the external environment. The transcriptome analysis of a strain with increased levels of ecfL led to the identification of the regulon of this ECF factor, which is composed of 3 genes, xac4131, xac4132, xac4133, located in the vicinity of ecfL in the genome of X. citri. Computer analysis of the proteins encoded by the EcfL regulon genes reveals that the xac4131 gene encodes a FecA homolog, suggesting that the protein acts in the activation of ?FecI and, possibly, in the uptake of nutrients or other small molecules, a function characterized for members of this family of outer membrane receptors. The xac4132 gene encodes a protein with a histidine-dependent acid phosphatase domain, this domain is found in phytases, enzymes that degrade phytic acid, the main source of phosphate stored in plants and soils. The xac4133 gene encodes a protein that combines a jacalin-like lectin domain, involved in carbohydrate binding, which suggests an interaction with the surface of eukaryotic cells, and an EEP (exonuclease-endonuclease-phosphatase) family domain, typical of enzymes that act in the cleavage of phosphodiester bonds, generally in DNA and phospholipids, which suggests an endonuclease or sphingomyelinase function. Bacterial sphingomyelinases are secreted enzymes that act to disrupt eukaryotic membranes, allowing, for example, phagosome escape and bacterial survival in the host. A possible role as toxins secreted by SS6 is therefore suggested by the domains found in Xac4132 and Xac4133. However, the phenotypic characterization of ?ecfL indicates that the gene is not necessary for resistance to predation and, similarly, the genes ecfL, xac4132 and xac4133 do not show expression induction during co-incubation with D. discoideum (Lima et al., submitted), a characteristic observed for the SS6 genes and its regulator EcfK (Bayer-Santos et al., 2018). The virulence reduction observed for the ?ecfL lineage may indicate that the Xac4132 and Xac4133 proteins act in the host cell during infection. Thus, despite knowing the ecfL regulon and having interesting phenotypic data for the ecfL mutant strain, further studies are needed to understand the role of this ECF sigma factor in the physiology of X. citri. For this reason, the objective of this work is the biochemical and functional characterization of the proteins encoded by the regulon members of the alternative sigma factor ecfL of X. citri. Thus, this study may lead to the identification of new important functions for the virulence of X. citri and for survival and adaptation to the environment Mestrado Microbiologia Mestre em Genética e Biologia Molecular CNPQ 134147/2019-7 FAPESP 2019/03406-4

Orientador: Juliana Velasco de Castro Oliveira Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Apesar dos avanços nas práticas agrícolas, é necessário aumentar a produção global de alimentos e energia a partir de biomassa adotando medidas ambientalmente sustentáveis. Várias bactérias que promovem o crescimento vegetal (BPCV) podem aumentar consideravelmente o rendimento das culturas agrícolas através de uma ampla variedade de mecanismos. Recentemente muitos estudos estão sendo conduzidos com compostos orgânicos voláteis (COVs), que são pequenas moléculas de natureza lipofílica derivadas de uma ampla gama de vias biossintéticas. Esses metabólitos são capazes de promover o crescimento das plantas e sua utilização em culturas agrícolas é promissora, uma vez que não dependem do contato direto e da colonização das raízes ou parte aérea, tornando-os moléculas ideais para mediar as interações entre organismos a curta e longa distância. Até o momento, muitos trabalhos mostraram o efeito positivo dos COVs em plantas modelo, como Arabidopsis thaliana. No entanto, existem poucos estudos que mostram o impacto dos mesmos em plantas C4 e em culturas agrícolas, abrindo perspectivas para novas descobertas. Assim, os principais objetivos deste projeto foram: (i) avaliar o potencial de diferentes gêneros bacterianos de nossa coleção em promover o crescimento de plantas modelos C3 A. thaliana e C4 Setaria viridis mediadas por COVs; (ii) testar a eficiência dos isolados selecionados após minimização do efeito do dióxido de carbono (CO2); (iii) estabelecer uma metodologia robusta de metabolômica baseada em HS-SPME/GC-MS para identificação dos COVs; (iv) identificar os COVs produzidos pelos isolados selecionados através de HS-SPME/GC-MS; (v) analisar e selecionar os COVs identificados para avaliação funcional em ambas plantas modelo. Dos 14 isolados testados, identificamos 7 que aumentaram eficientemente o crescimento das plantas modelos avaliadas, sendo: MTS P6A5 e CRD P6B3 por promoverem A. thaliana; AI2.2-A e CTB P6B8 em S. viridis; IAT P3B1, IAT P6F4 e FBJ P1E2 por promoverem o crescimento de ambas. A promoção do crescimento na parte aérea e comprimento total das raízes de A. thaliana variou entre 190-320 % e 40-110 %, respectivamente, enquanto em S. viridis observamos um aumento entre 190 e 350 % na biomassa da parte aérea e em cerca de 100 % do comprimento das raízes. Além disso, identificamos dois isolados (MTS P5D6 e ITA P2F2) que possuem efeito antagônico na promoção do crescimento das plantas. Os melhores isolados, mesmo em condições de minimização do efeito do CO2, também foram eficientes no aumento da biomassa total das plântulas em diferentes magnitudes. Pela análise do volatiloma dos isolados selecionados através do pipeline desenvolvido pelo grupo, foi possível identificar 105 COVs candidatos a moléculas indutoras do crescimento vegetal. Dos 10 COVs selecionados para validação funcional, os compostos sintéticos acetoína, 2,3-butanediol, 2-heptanona e álcool fenetílico foram responsáveis por aumentarem entre 14 e 24 % o crescimento de S. viridis, evidenciando a eficiência destes compostos como moduladores do crescimento vegetal. Este é o primeiro relato da promoção do crescimento da planta modelo S. viridis mediado por COVs bacterianos, que certamente poderá gerar insights para o desenvolvimento de tecnologias inovativas para a promoção da agricultura sustentável em importantes culturas do agronegócio brasileiro Abstract: Despite advances in agricultural practices, it is necessary to increase the global production of food and energy from biomass by adopting environmentally sustainable approaches. Several bacteria that promote plant growth (PGPB) can significantly increase the yield of agricultural crops through a variety of mechanisms. Recently, many studies are being carried out with volatile organic compounds (VOCs), which are small lipophilic-looking molecules derived from a wide range of biosynthetic pathways. These metabolites are able to promote plant growth and their use in crops is promising, since they do not depend on direct contact and roots or shoots colonization, making them ideal molecules to mediate interactions between organisms at short and long distance. To date, many studies have shown the positive effect of VOCs on model plants, such as Arabidopsis thaliana. However, there are few studies showing their impact on C4 plants and crops, opening up prospects for new discoveries. Therefore, the main purposes of this project were: (i) to evaluate the potential of different bacterial genera from our collection in promoting growth of model plants C3 A. thaliana and C4 Setaria viridis mediated by VOCs; (ii) to test the effectiveness of the selected isolates after minimizing the carbon dioxide (CO2) effect; (iii) to establish a robust metabolomics pipeline based on HS-SPME/GC-MS for VOCs identification; (iv) to identify the VOCs produced by the selected isolates using HS-SPME/GC-MS; (v) to analyse and select the identified VOCs for functional evaluation in both model plants. 7 out of 14 isolates tested were identified as they efficiently increased the growth of model plants, being: MTS P6A5 and CRD P6B3 for promoting in A. thaliana; AI2.2-A and CTB P6B8 in S. viridis; IAT P3B1, IAT P6F4 and FBJ P1E2 for promoting the growth of both. The growth promotion in shoot and total root length of A. thaliana ranged between 190-320 % and 40-110 %, respectively, while in S. viridis we observed an increase between 190 and 350 % in shoot biomass and about 100 % in root length. In addition, we identified two isolates (MTS P5D6 and ITA P2F2) that had an antagonistic effect in promoting plant growth. The best isolates, even under an environment that minimizes the CO2 effect, were also efficient in increasing the seedlings total biomass in different ranges. From the analysis of the volatilome emitted by selected isolates through the pipeline developed by the group, it was possible to identify 105 VOCs candidates for plant growth-inducing molecules. 10 VOCs were selected for functional validation, and the results demonstrated that the synthetic compounds acetoin, 2,3-butanediol, 2-heptanone and phenethyl alcohol were responsible for increasing between 14 and 24 % the S. viridis growth, evidencing the efficiency of these compounds as plant growth modulators. This is the first report showing the growth promotion of S. viridis model plant mediated by bacterial VOCs, which will certainly generate insights for the development of innovative technologies to promote sustainable agriculture in important Brazilian agribusiness Mestrado Genética de Microorganismos Mestre em Genética e Biologia Molecular FAPESP 2018/04184–2; 2017/20521-6 CAPES 001

Orientador: Cristina Elisa Alvarez Martinez Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: As bactérias são capazes de perceber o meio biótico e abiótico e se adaptar alterando a expressão gênica. Os fatores de transcrição são proteínas capazes de se ligar a regiões promotoras no DNA aumentando ou diminuindo a eficiência de recrutamento da RNA polimerase e a transcrição dos genes. A bactéria Xanthomonas citri subsp. citri (X. citri) é fitopatogênica de diversas espécies de citros de importância econômica. Quando em contato com o mesófilo causa o cancro cítrico, doença caracterizada pela presença de lesões em folhas e frutos, reduzindo a qualidade de frutos e a produtividade agrícola. O objetivo deste trabalho foi analisar o papel do fator de transcrição da família AraC/ XylS denominado TagK na expressão dos genes do sistema de secreção do tipo VI (SSVI), maquinaria que atua na translocação de toxinas e proteínas efetoras envolvidas na patogenicidade e competição com organismos procariontes e eucariontes. As análises de filogenia indicaram que TagK, assim como outros reguladores já descritos na literatura, como SoxS, MarA e Rob de E. coli, não possui o domínio de ligação a indutor e o domínio de ligação ao DNA no mesmo polipeptídio e, portanto, precisa de outros reguladores que aumentem ou diminuam sua própria transcrição. Foi possível observar também que as linhagens que possuem o SSVI pertencente ao mesmo clado de X. citri tem tagK associado ao cluster do SSVI, o que não ocorre com os demais clados. Além disso, a análise de homologia com outros reguladores da família já caracterizados experimentalmente, indicou a presença de resíduos conservados que são importantes para a ligação da proteína ao promotor (S40 e R96) e para manutenção da estrutura terciária (L44, F48, L72, F98, P106). Resultados experimentais indicaram que a superexpressão de tagK em X. citri promoveu aumento dos níveis de RNA mensageiro de genes essenciais para o funcionamento do SSVI e que foi responsável por regular todos os genes presentes no contexto genômico do SSVI, além do SSV inserido no SSVI de X. citri. Dados anteriores do nosso grupo de pesquisa demostraram que o fator sigma ecfK de X. citri é essencial para a resistência à predação pela ameba de solo Dictyostelium discoideum e para a indução da expressão do SSVI nestas condições. Os resultados obtidos no presente trabalho suportam a hipótese de que TagK atue diretamente na indução da transcrição dos genes do SSVI e, portanto, abaixo de EcfK na via de regulação, já que a superexpressão de tagK foi suficiente para restaurar o fenótipo selvagem às linhagens que possuem a deleção do fator sigma ecfK. Portanto, de acordo com o modelo proposto, quando X. citri recebe o sinal para que o SSVI seja ativado, EcfK se liga a RNA polimerase e ativa a transcrição de tagK, que é o responsável por ativar os genes do SSVI, levando ao acúmulo das proteínas Abstract: Bacteria are able to sense the biotic and abiotic environment and to adapt by changing gene expression. Transcription factors are proteins capable of binding to promoter regions in the DNA, increasing or decreasing the efficiency of RNA polymerase recruitment and gene transcription. The bacterium Xanthomonas citri subsp. citri (X. citri) is phytopathogenic of several economically important citrus species. When in contact with the mesophyll, X. citri causes citrus canker, a disease characterized by the presence of lesions on leaves and fruit, which reduces fruit quality and agricultural productivity. The objective of this work was to analyze the role of the AraC/XylS transcription factor denominated TagK in the expression of the type VI secretion system (T6SS), an apparatus that acts in the translocation of toxins and effector proteins involved in pathogenicity and competition with prokaryotic and eukaryotic organisms. Phylogeny analyses indicated that, similarly to regulators already described in the literature such as SoxS, MarA and Rob from E. coli, TagK does not present the inducer-binding domain and the DNA-binding domain on the same polypeptide, therefore other regulators are required to augment or reduce its own transcription. It was also possible to observe that the strains that have the T6SS belonging to the same X. citri clade have tagK associated with the T6SS cluster, which does not occur with the other clades. Moreover, homology analysis with other previously experimentally characterized regulators of the family indicated the presence of conserved residues involved in DNA binding (S40 and R96) and tertiary structure stability (L44, F48, L72, F98, P106) in TagK. The experimental results indicated that overexpression of tagK in X. citri promoted an increase in the mRNA levels of genes required for the functioning of the T6SS, and that it was responsible for regulating all genes present in the genomic context of the T6SS, in addition to the T5SS genes inserted in the T6SS gene cluster of X. citri. Previous data from our research group have shown that the X. citri sigma factor ecfK is essential for resistance to predation by the soil amoeba Dictyostelium discoideum and for inducing T6SS expression under these conditions. Results from this work support the hypothesis that TagK acts downstream from EcfK in the signaling cascade that induces the T6SS, since the overexpression of tagK was sufficient to restore the wild phenotype to the strains with ecfK deletion. According to the proposed model, when X. citri receives the signal for T6SS expression, EcfK binds to the RNA polymerase and activates the transcription of tagK, which is responsible for activating T6SS genes, leading to protein accumulation Mestrado Microbiologia Mestra em Genética e Biologia Molecular FAPESP 2018/01852-4 CAPES 0

Orientador: Marcelo Brocchi Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: "Salmonella enterica" é um patógeno geralmente adquirido por meio do consumo de alimentos contaminados com essa bactéria. Pode causar gastroenterite e bacteremia em humanos, também sendo capaz de infectar diversos outros animais como répteis, aves, mamíferos e ainda sobreviverem em diversos ambientes. S. enterica é um bastonete Gram-negativo, não formador de esporo, anaeróbio facultativo, móvel e que pertence à família Enterobacteriaceae. Devido à importância de "Salmonella" spp. no escopo clínico e de saúde pública, é sempre importante aprofundar o conhecimento sobre os processos celulares e os determinantes patogênicos desta bactéria. Proteínas associadas ao nucleóide (NAPs) auxiliam na compactação do DNA e também influenciam processos celulares como replicação do DNA e transcrição de genes. Dentre as NAPs de bactérias Gram-negativas, YbaB, proteína homóloga à EbfC é uma NAP pouco caracterizada. O gene ybaB forma operon com recR, gene que codifica para uma proteína de recombinação, envolvida com o sistema de reparo de DNA. Genes ybaB/ebfC estão amplamente presentes nos genomas de bactérias e archaeas de diferentes Filos de procariotos, o que sugere que YbaB/EbfC desempenhe papel biológico importante. Assim, o objetivo principal dessa tese foi o de investigar o papel biológico de YbaB sobre o metabolismo e regulação gênica global de "Salmonella enterica" Typhimurium. Para isso, foi construída uma árvore filogenética para YbaB e outra para RecR, a fim de verificar a distribuição e a variabilidade dessas proteínas por todos os grupos de procariotos. Também foram realizadas análises de seleção natural buscando verificar a existência de seleção positiva nesses genes (Capítulo I). Como é de nosso conhecimento, bactérias desenvolveram uma série de mecanismos adaptativos que lhes permitem sobreviver e crescer na presença de diferentes fatores de estresse provenientes do ambiente. Modificações das propriedades da membrana ou mudanças no estado geral de energia, morfologia e propriedades da superfície celular, estão entre tais mecanismos adaptativos. Assim, também foram realizados ensaios fenotípicos e experimentos em modelos in vivo com mutantes para ybaB, buscando investigar principalmente o papel dessa proteína frente a estresses de envelope (Capítulo II). Ainda dentro desse objetivo, utilizando-se de técnica de sequenciamento de nova geração (RNA-Seq), foram avaliados quais os genes foram diferencialmente expressos, quando há maiores níveis de YbaB (superexpressão de ybaB) (Capítulo III). Os resultados mostram que YbaB é uma proteína conservada e amplamente distribuída entre os diferentes grupos de bactérias. YbaB/EbfC e RecR estão sob seleção positiva em Firmicutes, e em Gammaproteobacteria apenas YbaB/EbfC. Também foi observado que o mutante 'delta'ybaBrbsrecR é atenuado em modelo invertebrado de larvas. Além disso, YbaB parece estar envolvido em sistemas de resposta ao estresse do envelope, choque térmico e com a motilidade em S. enterica Typhimurium. A via Psp (phage shock proteins - proteínas de choque de fago) de resposta ao estresse do envelope parece ser a principal afetada por alterações nos níveis de transcritos de ybaB. Desafios futuros incluem o esclarecimento do mecanismo pelo qual YbaB participa de respostas ao estresse do envelope e também sobre a motilidade de S. enterica Typhimurium Abstract: "Salmonella enterica" is a pathogen usually acquired through the consumption of food contaminated with this bacterium. It can cause gastroenteritis and bacteremia in humans, also being able to infect several other animals such as reptiles, birds, mammals and still survive in different environments. S. enterica is a Gram-negative rod-shaped bacterium, non-spore forming, facultative anaerobic, mobile and belonging to the Enterobacteriaceae family. Due to the importance of "Salmonella" spp. in the clinical and public health scope, it is always important to deepen the knowledge about the cellular processes and the pathogenic determinants of this bacterium. Nucleoid-associated proteins (NAPs) act on DNA compacting, influencing cellular processes such as DNA replication and gene transcription. Among the NAPs of Gram-negative bacteria, YbaB, a protein homologous to EbfC is a poorly characterized NAP. ybaB forms an operon with recR, a gene that codes for a recombination protein, involved with the DNA repair system. ybaB/ebfC genes are widely present in the genomes of bacteria and archaeae from different phyla of prokaryotes, suggesting that YbaB/EbfC plays an important biological role. Thus, the main objective of this thesis was to investigate the biological role of YbaB on the metabolism and global gene regulation of "Salmonella enterica" Typhimurium. For this purpose, a phylogenetic tree was constructed for YbaB and another for RecR, to verify the distribution and sequence variability of these proteins in all groups of prokaryotes. Analyzes of positive selection were also carried out in order to understand some aspects of the evolution of these genes (Chapter I). As we know, bacteria have developed a series of adaptive mechanisms that allow them to survive and grow in the presence of different stress factors from the environment. Modifications in the properties of the membrane or changes in the general state of energy, morphology, and properties of the cell surface, are among such adaptive mechanisms. Thus, phenotypic and in vivo assays were also carried out with mutants for ybaB, seeking to investigate mainly the role of this protein in the face of envelope stresses (Chapter II). Still within this objective, using RNA-Seq, it was evaluated which genes were differentially expressed under higher levels of YbaB expression (overexpression of ybaB) (Chapter III). The results show that YbaB is a conserved protein and widely distributed among different groups of bacteria. YbaB/EbfC and RecR are under positive selection in Firmicutes, and in Gammaproteobacteria only YbaB/EbfC. It was also observed that the mutant 'delta'ybaBrbsrecR is attenuated in an invertebrate model of larvae. In addition, YbaB appears to be involved in response to envelope stress, heat shock and motility in S. enterica Typhimurium. The Psp pathway (phage shock proteins) of envelope stress response seems to be the main one affected by changes in the levels of ybaB transcripts. Future challenges include clarifying the mechanism by which YbaB participates in responses to envelope stress and on the motility of S. enterica Typhimurium Doutorado Genética de Microorganismos Doutora em Genética e Biologia Molecular CNPQ 142190/2017-9 CAPES 001

Orientador: Marcelo Brocchi Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Salmonella enterica é um importante patógeno de humanos e outros animais que causa a zoonose denominada Salmonelose. Embora a maior parte dos casos de infecção humana seja causado pela Salmonella enterica subespécie enterica, o aparecimento de subespécies não-enterica invasivas têm sido relatado e associados ao contato com animais contaminados, principalmente anfíbios e répteis. Adicionalmente, o aumento do número de cepas multirresistentes de Salmonella spp. com maior patogenicidade tem sido descrito globalmente. Portanto, o presente trabalho teve por objetivo caracterizar o perfil fenotípico de susceptibilidade a antimicrobianos de amostras de Salmonella spp. isoladas de infecções humanas no estado de São Paulo entre 2000 e 2019, além de caracterizar o genótipo de resistência e virulência de isolados multirresistentes (MDR), Typhi e subespécie não-enterica através do sequenciamento completo do genoma. Dentre as 810 amostras estudadas, 43.82% foram resistentes a pelo menos um antibiótico. A maior parte das amostras apresentou resistência às seguintes classes de antimicrobianos: aminoglicosídeos (32.10%), tetraciclinas (13.81%) e ß-lactâmicos (13.21%). Ademais, 71 isolados apresentaram perfil de multirresistência, 11 foram produtores de ESBL e um foi considerado resistente à colistina. De acordo com os dados do sequenciamento genômico todos os isolados sequenciados apresentaram bombas de efluxo relacionadas à resistência antimicrobiana. Dentre os quatro isolados MDR, três apresentaram genes AMR adicionais que estão associados à elementos móveis, como blatem-1B, dfrA1/14, tetA, sul1/2, floR, e qnrE1. Dentro do limite de nosso conhecimento o presente trabalho é o primeiro a descrever a presença do gene de resistência à quinolona mediado por plasmídeo (PMQR) qnrE1 em um isolado clínico de Salmonella I 4,[5],12:i:-. Todos os isolados sequenciados tanto da subespécie enterica quanto não-enterica apresentaram divergências em relação a presença de "Salmonella Pathogenicity Islands" (SPIs) e bacteriófagos. Os bacteriófagos Gifsy-1 e 2 abrigaram importantes fatores de virulência como o gene gogB no isolado de variante monofásica, e o gene sodC1 nos isolados de Enteritidis e de variante monofásica. Apesar das diferenças apresentadas, todos os isolados apresentaram importantes genes relacionados à invasão e sobrevivência intracelular das SPI-1/2/3. Adicionalmente, as amostras da subespécie não-enterica apresentaram fatores de virulência associados a outros patógenos como Yersinia spp. e Escherichia coli patogênicas. Apesar das deleções encontradas nas cinco principais SPIs e da ausência de SPI-6, entre as amostras da subespécie não-enterica, elas mostraram a habilidade de invadir e sobreviver macrófagos J774 assim como a cepa Salmonella Typhimurium ATCC 14028. Além do mais, durante os ensaios in-vivo em Galleria mellonella os isolados não-enterica apresentaram taxas de mortalidades superiores à S. Typhimurium UK-1. Em conclusão, as amostras estudadas no presente trabalho apresentaram menor susceptibilidade ao aminoglicosídeos, tetraciclinas e ?-lactâmicos, com uma baixa proporção de isolados apresentando perfil MDR, ou de produção de ESBL. Todavia, como apontado pelos dados de WGS, os isolados de MDR carregavam genes AMR em elementos móveis, o que pode contribuir para uma dispersão rápida destes genes entre amostras bacterianas. Em adição, mesmo que subespécies não-enterica sejam mais comuns entre animais de sangue frio, nosso estudo descreve pela primeira vez no Brasil isolados invasivos das subespécies salamae e diarizonae em infecções humanas Abstract: Salmonella enterica is an important pathogen to humans and other animals causing the zoonosis denominated as Salmonellosis. Although most cases of human-infections are caused by Salmonella subspecies enterica, the emergence of invasive non-enterica subspecies have been reported and associated to contact with infected animals, especially reptiles and amphibians. Additionally, the emergence of multidrug resistant strains (MDR) of Salmonella spp. with increased pathogenicity has been described worldwide. Therefore, this project aimed to characterize the antimicrobial resistance phenotype of S. enterica samples isolated from human infections in São Paulo state over the period of 2000 to 2019, besides characterizing the resistance and virulence genotype of MDR, Typhi and non-enterica subspecies samples through whole-genome sequencing (WGS). Among the 810 samples studied, 43.82% were resistant to at least one antibiotic. The majority of samples were resistant to the following antimicrobial classes: aminoglycosides (32.10%), tetracycline (13.83%) and ß-lactams (13.21%). Moreover, 71 isolates were considered MDR, 11 were ESBL-producers and one was colistin-resistant. According to the whole-genome sequencing results all samples investigated presented efflux pumps correlated with antimicrobial resistance (AMR). Among the four MDR isolates sequenced, three presented additional AMR genes associated with mobile elements, such as blatem-1B, dfrA1/14, tetA, sul1/2, floR, and qnrE1. To the best of our knowledge the present work is the first to describe the plasmid-mediated quinolone resistance (PMQR) gene qnrE1 in a clinical isolate of Salmonella I 4,[5],12:i:-. All sequenced samples subspecies enterica and non-enterica presented divergences among the presence of Salmonella Pathogenicity Islands (SPIs) and bacteriophages. The phages Gifsy-1/2 harbored important virulence factors likewise gogB in the monophasic variant isolate and sodC1 in the monophasic variante and Enteritidis isolate. Despite divergences found, all samples harbored SPI-1/2/3 genes considered important to invasion and intracellular surveillance. In addition to that, the subspecies non-enterica samples presented virulence factors associated with other pathogens such as Yersinia spp. and pathogenic Escherichia coli. Despite deletions in SPI-1/3/4/5, and absence of SPI-6 found among the subspecies non-enterica samples, they have shown the ability to invade and survive within J774 macrophages likewise S. Typhimurium ATCC 14028. Furthermore, during the in-vivo assays with Galleria mellonella the subspecies non-enterica isolates presented higher killing rates compared to S. Typhimurium UK-1. In conclusion, our work shows that a high percentage of samples herein tested showed a decreased susceptibility to aminoglycosides, teracyclines and ?-lactams, with a small proportion of them presenting a MDR profile or ESBL-production. Nevertheless, as shown by WGS the MDR strains carried AMR genes presented in mobile elements, which can contribute to their rapid dissemination among bacterial strains. Moreover, although non-enterica subspecies are more prevalent among cold-blooded animals, our study describes for the first time in Brazil invasive isolates of subspecies salamae and diarizonae causing human-infections Mestrado Genética de Microorganismos Mestra em Genética e Biologia Molecular CAPES 001

Orientador: Marcelo Brocchi Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A violaceína é um pigmento violeta derivado do triptofano e produzido por bactérias ambientais que apresenta múltiplas atividades biológicas, incluindo forte inibição de patógenos Gram-positivos. Neste trabalho, aplicamos uma combinação de abordagens experimentais para identificar o mecanismo de ação da violaceína sobre bactérias Gram-positivas, utilizando S. aureus e B. subtillis. Ensaios de microscopia de fluorescência mostraram que a violaceína permeabiliza rápida e drasticamente células de B. subtlis e S. aureus. A permeabilização celular foi acompanhada pelo aparecimento de descontinuidades visíveis ou rasgos na membrana citoplasmática, mas não afetou a parede celular. Utilizando experimentos in vitro, mostramos que a violaceína se liga diretamente aos lipossomos feitos com lipídios comerciais e bacterianos e perturba a sua estrutura e permeabilidade. Além disso, simulações de dinâmica molecular foram empregadas para revelar como a violaceína se insere nas bicamadas lipídicas. Dessa forma, nossos resultados combinados demonstram que a membrana citoplasmática é o alvo primário da violaceína em bactérias Gram-positivas. As implicações deste achado para o desenvolvimento da violaceína como agente terapêutico são discutidas Abstract: Violacein is a tryptophan-derived purple pigment produced by environmental bacteria which displays multiple biological activities, including strong inhibition of Gram-positive pathogens. Here we applied a combination of experimental approaches to identify the mechanism by which violacein kills Gram-positive bacteria using S. aureus and B. subtillis. Fluorescence microscopy showed that violacein quickly and dramatically permeabilizes B. subtilis and S. aureus cells. Cell permeabilization was accompanied by the appearance of visible discontinuities or rips in the cytoplasmic membrane, but it did not affect the cell wall. Using in vitro experiments, we showed that violacein binds directly to liposomes made with commercial and bacterial phospholipids and perturbs their structure and permeability. Furthermore, molecular dynamics simulations were employed to reveal how violacein inserts itself into lipid bilayers. Thus, our combined results demonstrate that the cytoplasmic membrane is the primary target of violacein in bacteria. The implications of this finding for the development of violacein as a therapeutic agent are discussed Doutorado Microbiologia Doutor em Genética e Biologia Molecular CAPES 001

Orientador: Cristina Elisa Alvarez Martinez Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Os fatores sigma alternativos do grupo 4, também chamados ECF ("extracytoplasmic function") atuam principalmente na resposta a estresses detectados no envelope bacteriano e representam, juntamente com seus fatores anti-sigma cognatos, um importante mecanismo de transdução de sinal em bactérias. A bactéria Xanthomonas citri subsp. citri (X. citri) causa a doença cancro cítrico, que atinge a produção de laranja e de outras frutas cítricas de grande importância econômica. Curiosamente, dois genes que codificam fatores ECF (ecfK e ecfL) são encontrados em um grupamento gênico que codifica o sistema de secreção do tipo VI (SS6) de X. citri. Os SS6 são importantes maquinarias de translocação de proteínas através do envelope bacteriano e o estudo funcional do SS6 de X. citri demonstrou seu papel na resistência a predação pela ameba de solo Dictyostelium discoideum e o papel de EcfK na indução da expressão destes genes. O presente trabalho teve como objetivo caracterizar a função de EcfL, que possui contexto genômico típico de membros do grupo de fatores sigma ECF envolvidos na regulação da resposta a carência de ferro. Para isso, foram construídas linhagens mutantes nos genes que codificam EcfL e uma proteína transmembrana candidata a fator anti-sigma de EcfL. Os resultados obtidos indicam que ecfL é importante para o crescimento em carência de fosfato e para a utilização de ácido fítico como fonte deste nutriente. Observou-se também que a linhagem mutante em ecfL tem virulência reduzida em plantas hospedeiras, não se observando diferenças na capacidade de indução de resposta hipersensível em plantas resistentes. Além disto, os resultados demonstram que ecfL não é necessário para a resposta a carência de ferro e para a resistência a predação por D. discoideum Abstract: Bacterial alternative sigma factors of group 4, also called ECF ("extracytoplasmic function") act mainly in response to cell envelope stress and represent, along with their cognate anti-sigma factors, an important mechanism of signal transduction in bacteria. Xanthomonas citri subsp. citri (X. citri) causes citrus canker disease, which affects the production of orange and other citrus fruits of great economic importance. Interestingly, two genes encoding ECF factors - ecfK and ecfL - are found in a gene cluster that encodes the type VI secretion system (T6SS) of X. citri. T6SS are multiprotein complexes that transverse the bacterial envelope and promote protein translocation to target cells or the extracellular milieu. The X. citri T6SS is required for increased resistance to predation by the soil amoeba Dictyostelium discoideum and induction of T6SS genes is dependent on EcfK. The present work aimed to characterize the function of X. citri ecfL, which has a genomic context typical of ECF sigma factors involved in the response to iron starvation. For that, mutant strains in the genes encoding EcfL and its putative cognate anti-sigma factor were constructed. Results obtained in this study indicated that ecfL is required for growth under low phosphate conditions and in the presence of phytic acid as the sole phosphate source. The ecfL mutant strain displays reduced virulence in host plants and is not impaired in the ability to induce hypersensitive response in resistant plants. We also show that ecfL is not required for the response to iron starvation or for resistance to predation by D. discoideum Mestrado Microbiologia Mestra em Genética e Biologia Molecular CNPQ 133118/2017-7 FAPESP 2018/01852-4 CAPES

Orientador: Celso Eduardo Benedetti Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O gás sulfídrico (H2S) é amplamente conhecido como um gás tóxico, uma vez que inibe a respiração aeróbica por competir com o oxigênio e se ligar fortemente a centros metálicos da citocromo C oxidase (Cox). O operon bigR (Biofilm-Associated Growth Repressor) descoberto em Xylella fastidiosa e conservado em Agrobacterium tumefaciens e outras fitobactérias associadas à solo e raízes, atua na detoxificação do H2S. O mecanismo de detoxificação de H2S mediado pelo operon bigR envolve a oxidação do H2S à sulfito. O operon bigR codifica o repressor BigR, a proteína bifuncional Blh que apresenta atividades de sulfotransferase (ST) e dioxigenase de enxofre (SDO), e um transportador de sulfito composto por três proteínas de membrana. Em estudos anteriores do grupo, verificou-se que a ligação do repressor BigR ao seu DNA alvo depende do estado redox das cisteínas conservadas C42 e C108, as quais, quando oxidadas na forma de ligação dissulfeto intracadeia altera a conformação do domínio helix-turn-helix do repressor, impedindo sua ligação ao DNA, ativando assim o operon. Porém, a natureza da molécula sinalizadora responsável pela oxidação de BigR permanecia desconhecida. Ainda, em estudos genéticos anteriores, verificou-se que a proteína Blh era necessária para a oxidação do H2S a sulfito e importante para manter o crescimento da bactéria em condições de hipóxia. Entretanto, o mecanismo bioquímico pelo qual Blh promove tais fenótipos não era conhecido. Aqui, demostramos que o próprio H2S é capaz de oxidar BigR e dissociá-lo do DNA, levando assim à ativação do operon. Além disso, demonstramos que as atividades enzimáticas promovidas pelos domínios ST e SDO de Blh ocorrem de forma acoplada e dependente de glutationa reduzida, e que essas atividades se mostraram essenciais para manutenção da respiração aeróbica em condições de hipóxia. Tanto as atividades de ST e SDO de Blh produzem sulfito como produto de reação. Assim, sabendo-se que o íon sulfito é tóxico para plantas, estudamos o possível efeito do sulfito em folhas de citros infectadas por X. fastidiosa. Verificamos que sulfito causa clorose em folhas de citros e que plantas de laranja doce infectadas com X. fastidiosa apresentam maiores níveis de sulfito e de transcritos dos genes SiR (Sulfito redutase) e SO (sulfito oxidase) envolvidos na detoxificação do sulfito em plantas. Os dados sugerem, portanto, que plantas infectadas com X. fastidiosa, com sintomas da Clorose Variegada dos Citros (CVC), estão sob estresse de sulfito e que o sulfito produzido pela atividade do operon bigR poderia contribuir para o desenvolvimento dos sintomas da CVC Abstract: Hydrogen sulfide (H2S) is well recognized as a toxic gas due to its capacity to strongly compete with oxygen for the cytochrome c oxidase (Cox), thus blocking aerobic respiration in many organisms. The bigR operon (Biofilm-Associated Growth Repressor), originally described in Xylella fastidiosa and Agrobacterium tumefaciens, and found conserved in related phytobacteria associated with soil and roots, plays a central role in H2S detoxification. The mechanism by which H2S is eliminated by the bigR operon involves the oxidation of the sulfur atom of H2S into sulfite. The bigR operon encodes the BigR repressor, the bifunctional Blh that shows sulfurtransferase (ST) and sulfurdioxygenase (SDO) activities, and a sulfite transporter. In a previous study, it was shown that the binging of BigR to its target DNA depends on the redox status of its two cysteines C42 e C108, which, when oxidized into an intrachain disulfide bond, changes the conformation of the helix-turn-helix domains of the repressor, disrupting its interaction with DNA, thus activating the operon. However, the nature of the signaling molecule responsible for BigR oxidation remained elusive for many years. In addition, in previous genetic studies, it was found that the Blh protein was necessary for H2S oxidation and required for bacterial growth under hypoxia. Nevertheless, the biochemical mechanism by which Blh promotes such phenotypes was not known. Here, we show that H2S was capable of inducing the disulfide bond formation between C42 and C108 inactivating the repressor and activating do operon. Moreover, we show that enzymatic activities displayed by the ST e SDO domains of Blh are coupled and dependent of reduced glutathione, and that these activities are essential to maintain aerobic respiration under hypoxia. We also found that both the ST e SDO reactions produce sulfite as a product. Thus, knowing that sulfite is toxic to plants, we investigated a possible effect of sulfite toxicity in citrus infected with X. fastidiosa showing typical Citrus Chlorosis Variegated (CVC) symptoms. We found that sulfite causes chlorosis in citrus leaves and that sweet orange plants infected with X. fastidiosa showed higher sulfite contents and higher levels of transcripts for the SiR (Sulfite reductase) and SO (sulfite oxidase) genes, which are involved in sulfite detoxification in plants. Our data thus suggest that plants infected with X. fastidiosa are under sulfite stress and that sulfite that is produced as a result of the activity of the bigR operon might contribute to the development of CVC symptoms Doutorado Genética Vegetal e Melhoramento Doutora em Genética e Biologia Molecular FAPESP 2013/24042-0

Resumo O presente texto aborda o contributo que as manifestações artísticas populares poderão desempenhar na elaboração de um currículo de formação de professores e animadores artísticos vocacionados para a intervenção e criação em contextos culturais diversos. Tomando como exemplo as Brincas de Évora, pretendemos equacionar os seus sincretismos na promoção do desenvolvimento comunitário. As Brincas de Évora são uma manifestação performativa de cariz popular, que insiste em continuar a preparar-se no secretismo dos Invernos eborenses e a sair à rua durante os 4 dias de Carnaval. No entanto, apesar de se ter assistido a movimentos de revitalização na década de oitenta e tudo indiciar uma existência já longa nos reportórios das tradições orais da região, as referências às Brincas enquanto objecto de estudo são raras. Trata-se de uma representação dramática versejada em décimas que alia a música e a coreografia das contradanças ao encontro ritual com as comunidades dos bairros e aldeias circundantes de Évora. Embora outrora só fosse realizada por homens tem vindo a assistir-se à incorporação de elementos femininos nalguns grupos, o que indicia sinais de actualização. Por se tratar de uma manifestação dinâmica, multi-expressiva e interactiva continua a exercer sobre os participantes uma grande motivação no sentido da sua preservação, mesmo que a nível temático, as ficcionalidades abordadas simulem desfasamentos dos sentidos do quotidiano e da contemporaneidade. Nas práticas contemporâneas de criação e formação artística tem-se assistido a um vivo interesse pelas soluções performativas populares. A identificação de princípios comuns que atravessam a diversidade de contextos e grupos culturais - eixos universais de teatralidade - estão na base de interessantes propostas de formação teatral. Também o trabalho teatral inspirado na diversidade, quer dos participantes, quer das propostas dramatúrgicas, têm sido fonte de reflexão e criatividade artística durante as últimas décadas (Barba 1991, Brook 2002) encontrando eco a vários níveis: na construção de novos objectos artísticos, através de uma reapropriação e acentuando uma esteticização crescente; na conceptualização de inovadoras metodologias de criação e de formação, traduzida nas recentes abordagens de cunho antropológico da dança e do teatro; na transformação em mercadoria cultural mas consequente descontextualização deste tipo de manifestações, acentuando o carácter espectacular e diminuindo a função ritual, celebratória e de sociabilidade. Com a investigação em curso pretende-se não só, o aprofundamento do estudo deste fenómeno através da disponibilização de um recurso com funções de difusão e arquivo, mas também seleccionar os elementos da performance popular "eficazes"e actualizá-los ao nível da formação de animadores e operadores teatrais em contextos comunitários diversos. Assim sendo, esta comunicação consubstanciará a possibilidade de viajar (com bilhetes de ida e volta!) entre a educação formal e não formal.