Foi realizado o isolamento do vírus rábico em morcego insetívoro Nyctinomops macrotis capturado próximo à represa Billings e à mata Atlântica, no Município de Diadema, SP (Brasil). A pesquisa do antígeno rábico no tecido cerebral do morcego apresentou resultado positivo na reação de imunofluorescência direta. O isolamento do vírus rábico no tecido cerebral e nas glândulas salivares do morcego foi obtido através da inoculação intracerebral em camundongos. O Município de Diadema não apresentava casos de raiva animal desde 1982, sendo este o primeiro relato da presença do vírus rábico em morcego insetívoro.The rabies virus was isolated from an insectivorous bat, Nyctinomops macrotis, trapped in Diadema, SP, Brazil, in a public building near a water supply reservoir. Fluorescent antibodies against rabies virus were detected in cerebral tissue and the viral isolation was made after the inoculation of cerebral tissue and salivary gland suspension in mice. There have been no recorded cases of animal rabies in Diadema since 1982, and this is the first isolation of the rabies virus in an insectivorous bat in the city.