Search

Introduction: Playing is an important child occupation, and its assessment should be part of the therapeutic process to analyze the child's occupational performance and plan interventions based on this occupation. The Child-Initiated Play Make-A-Play Assessment (ChIPPA) has already been translated, cross-culturally adapted, and validated for the Brazilian population. Objective:To review the scope of ChIPPA and identify how it has been described and addressed in national and international literature. Method: Between January and June 2021, articles were searched in the PubMed, Scopus, BVS, ERIC, CINAHL, Web of Science, and PsycInfo databases, using search strategies with different syntaxes according to the method of each. basis: Chippa OR “Child-Initiated Pretend Play Assessment”, ChIPPA OR “Child-Initiated Pretend Play Assessment” OR “Child-Initiated Pretend Play Assessment” OR “Child-Initiated Pretend Play Assessment”, Chippa OR “Child-Initiated Pretend Play Assessment” AND Publication Type: Journal. Results: 25 articles were found, between 2000 and 2021, 971 children between 3 and 12 years of age, with typical and atypical development, developed in analytical observational (cross-sectional and cohort) and experimental studies; methodological (validation of the instrument and cultural adaptation of the instrument); and descriptive. Conclusion: The ChiPPA has been described in the literature as an assessment that allows correlating pretend to play with preschoolers' verbal, social, academic, and sensory processing skills. It is a practical, valid, and reliable outcome measure, allowing the assessment of typical and atypical children in different contexts and countries, including Brazil. Introdução: O brincar é uma importante ocupação infantil e sua avaliação deve fazer parte do processo terapêutico para analisar o desempenho ocupacional da criança e planejar intervenções embasadas nessa ocupação. A Avaliação do Brincar de Faz de Conta Iniciado pela Criança (ChIPPA) já foi traduzida, adaptada transculturalmente e validada para a população brasileira. Objetivo: Realizar uma revisão do escopo sobre a ChIPPA e identificar como tem sido descrita e abordada na literatura nacional e internacional. Método: Entre janeiro e junho de 2021, foi realizada a busca dos artigos nas bases de dados PubMed, Scopus, BVS, ERIC, CINAHL, Web of Science e PsycInfo, usando estratégias de busca com diferentes sintaxes de acordo com o método de cada base: Chippa OR “Child-Initiated Pretend Play Assessment”, ChIPPA OR “Child-Initiated Pretend Play Assessment” OR “Avaliação do faz de conta iniciado pela criança”, Chippa OR “Child-Initiated Pretend Play Assessment” AND Publication Type: Journal. Resultados: Foram localizados 25 artigos, entre 2000 e 2021, envolvendo 971 crianças entre 3 e 12 anos de idade, com desenvolvimento típico e atípico, desenvolvidos em estudos analíticos observacionais (transversais e de coorte) e experimentais; metodológicos (validação do instrumento e de adaptação cultural de instrumento); e descritivos. Conclusão: A ChiPPA tem sido descrita na literatura como uma avaliação que permite correlacionar o faz de conta e as habilidades verbais, sociais, acadêmicas e de processamento sensorial de préescolares. É uma medida de desfecho eficaz, válida e confiável, permitindo avaliar crianças típicas e atípicas em diferentes contextos e países, inclusive no Brasil.

Não recebi financiamento The Surveying Experience can be seen as part of the Science of Nature and Mathematics of the High School curriculum, and allows the student to know how to create the "map", object of use for the construction of various types of works. The present work has as objective to approach an experience in the field, of activities with mathematical concepts, mainly of the trigonometry and the geometry, that are used in the practice of the Surveying, clarifying to the student, the importance and the application of the same ones. This experience was developed with a group of students from the first grade of a private school, whose proposal is based on the teaching process of Waldorf pedagogy, which suggests, mainly, to teach some external classes, such as an extension of the classroom. Various instruments were used to measure terrains, such as theodolite, trena, sights, beacon, as well as materials for drawings such as square, protractor, compass, scaler, ruler and others. Through this work, one can perceive the great interest and a new look of the students in this area of mathematics, which makes it possible and effective. A Vivência de Agrimensura pode ser vista como parte das Ciências da Natureza e Matemática do currículo do Ensino Médio, e proporciona ao estudante conhecer como se nasce o “mapa”, objeto de uso para a construção de diversos tipos de obras. O presente trabalho tem como objetivo abordar uma experiência em campo, de atividades com conceitos matemáticos, principalmente da trigonometria e da geometria, que são utilizados na prática da Agrimensura, esclarecendo ao estudante, a importância e a aplicação dos mesmos. Essa experiência foi desenvolvida com um grupo de estudantes da primeira série do Ensino Médio de uma escola particular, cuja proposta é pautada no processo de ensino da pedagogia Waldorf, que sugere, principalmente, ministrar algumas aulas externas, como uma extensão de sala de aula. Foram utilizados diversos instrumentos próprios para a medição de terrenos, como teodolito, trena, mira, baliza, além de materiais para desenhos como esquadro, transferidor, compasso, escalímetro, régua e outros. Através desse trabalho, pode-se perceber o grande interesse e um novo olhar dos estudantes nesta área da matemática, o que o torna possível e eficaz.

RESUMO: esta revisão integrativa da literatura objetivou identificar estudos sobre como o brincar simbólico/faz de conta de pré-escolares tem sido avaliado, quais os objetivos destes estudos e quais instrumentos têm sido utilizados para avaliar esse comportamento. Os dados foram coletados nas bases de dados CINAHL (Cumulative Index to Nursing and Allied Health Literature), PubMed, Web of Science, PsycINFO (Psychology Information), Scopus, e BVS (Biblioteca Virtual em Saúde), entre os anos 2009 e 2015, utilizando-se palavras-chave e descritores do DeCS (Descritores em Ciência da Saúde) e do MeSH (Medical Subject Headings), em diferentes combinações: criança pré-escolar/child preschool; brinquedo terapêutico/play therapy; faz de conta/make believe/pretend play; jogo simbólico/symbolic play. A amostra final constituiu em 16 artigos. As publicações sobre o brincar simbólico/faz de conta de pré-escolares têm sido tênues, demonstrando que ainda há muito a avançar no assunto. Dentre os instrumentos citados verifica-se que o Child Initiated Pretend Play Assessment (ChIPPA) foi o mais utilizado, estando presente em cinco artigos, envolvendo população diversa (deficiência cognitiva, lesão cerebral adquirida, paralisia cerebral e autismo). Os estudos focalizam, em sua maioria, crianças de desenvolvimento típico, objetivando obter um parâmetro para identificação do desempenho do brincar simbólico/faz de conta esperado, além de demonstrar que ao se avaliar este brincar é possível verificar outros aspectos importantes para o desenvolvimento infantil, como os emocionais e cognitivos, as habilidades sociais e de comunicação, possibilitando identificar possíveis déficits destas crianças e auxiliar os profissionais em suas práticas clínicas. ABSTRACT: this integrative review of the literature aimed to identify studies about how the symbolic play/pretend play by preschool children has been evaluated, what the objectives of these studies are and which instruments have been used to evaluate this behavior. The data were collected in the CINAHL (Cumulative Index to Nursing and Allied Health Literature), PubMed, Web of Science, PsycINFO (Psychology Information), Scopus, and VHL (Virtual Health Library) databases between 2009 and 2015, using keywords and descriptors of DeCS (Health Science Descriptors) and MeSH (Medical Subject Headings), in different combinations: criança pré-escolar/preschool child; brinquedo terapêutico/play therapy; faz de conta/make believe/pretend play; jogo simbólico/symbolic play. The final sample consisted of 16 papers. Publications about the symbolic play/pretend play by preschoolers have been tenuous, demonstrating that there is still much to be done. Among the mentioned instruments, the Child Initiated Pretend Play Assessment (ChIPPA) was the most used, being present in five papers, involving diverse population (cognitive disability, acquired cerebral lesion, cerebral palsy and autism). Most studies focus on children of typical development, aiming to obtain a parameter to identify the performance of symbolic play / pretend play, as well as to demonstrate that when evaluating this play, it is possible to verify other important aspects for children's development, such as emotional and cognitive, social and communication skills, making it possible to identify possible deficits of these children and to assist professionals in their clinical practices.

Resumo Os autores apresentam um relato de caso de vítima de acidente de trabalho com ferimento penetrante em região inguinal direita com peça metálica em espiral, que evoluiu com fístula arteriovenosa da artéria femoral profunda com a veia femoral profunda associado a pseudoaneurisma envolvendo essas estruturas e a veia femoral comum. As fístulas arteriovenosas ocorrem frequentemente após traumas e a associação com pseudoaneurisma é fato raro, devendo ser tratadas precocemente após seu diagnóstico. O ultrassom duplex é atualmente o exame mais utilizado para a avaliação inicial e a arteriografia, o padrão ouro para diagnóstico. No paciente em questão foi realizado tratamento convencional com abordagem cirúrgica direta, sutura arterial e ligaduras venosas. Entretanto, nos dias atuais a cirurgia endovascular e a compressão guiada por ultrassom são métodos terapêuticos que têm sido utilizados com sucesso. O paciente evoluiu sem intercorrência, recebendo alta para acompanhamento ambulatorial com preservação do membro. Abstract This article describes the case of a work accident victim with a penetrating wound to the right inguinal region caused by a metal spiral. The patient developed an arteriovenous fistula between the deep femoral artery and deep femoral vein, combined with a pseudoaneurysm surrounding these structures and the common femoral vein. Arteriovenous fistulas frequently occur after traumas, but the combination of fistula and pseudoaneurysm is rare. It is recommended that they be treated immediately after diagnosis. Duplex ultrasound is the most widely used method for initial assessment and arteriography is the gold standard for diagnosis of arteriovenous fistulas. Endovascular surgery has recently been used successfully in such cases. However, this patient was treated conventionally using a direct surgical approach, arterial suture and venous ligatures, and the limb was saved. The patient developed no complications and was discharged to outpatients follow-up.

A molécula adaptadora myeloid differentiation primary response gene 88 (MyD88) está envolvida na ativação de receptores Toll-like (TLRs), os quais são responsáveis pelo reconhecimento precoce pelas células do hospedeiro de patógenos invasores e pelo desencadeamento da resposta imunológica. O objetivo do presente estudo foi caracterizar o desenvolvimento e a progressão de lesões periapicais induzidas experimentalmente em dentes de camundongos knockout (KO) para a molécula MyD88 (MyD88 KO), comparados a animais wild-type (WT). Lesões periapicais foram induzidas nos primeiros molares inferiores de 30 camundongos WT e de 30 camundongos MyD88 KO. Decorridos 7, 21 e 42 dias, os animais foram submetidos à eutanásia em câmara de CO2 e as mandíbulas foram removidas e submetidas ao processamento histotécnico. A seguir, cortes representativos foram corados com hematoxilina e eosina (HE), para descrição das características do canal radicular e das regiões apical e periapical e para contagem do número de células inflamatórias (neutrófilos), em microscopia de luz, e para mensuração da área das lesões periapicais, em microscopia de fluorescência. Espécimes sequenciais foram analisados por meio de: histoenzimologia para a atividade da TRAP, para contagem de osteoclastos; coloração de Brown & Brenn, para localização de bactérias; e imunohistoquímica, para identificação de marcadores da osteoclastogênese (RANK, RANKL e OPG). Os dados foram submetidos à análise estatística por meio dos testes não-paramétricos de Mann-Whitney, Kruskal-Wallis e pós-teste de Dunn, utilizando o programa SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) versão 17.O, com nível de significância de 5%. As demais análises foram expressas de maneira qualitativa. Com relação à extensão das lesões periapicais, o grupo MyD88 KO apresentou valores significantemente maiores do que o grupo WT nos períodos de 7 (p=0,001) e 21 dias (p=0,05), sendo que após 42 dias foi observada tendência de maiores valores, porém sem diferença significante (p=0,09). Foi observada maior quantidade de neutrófilos no grupo MyD88 KO, em comparação aos animais WT (p=0,01 em 7 dias; p=0,004 em 21 dias; e p

The purpose of this work consists of analyzing Physics textbooks ( from the teacher) indicated by the national programme for books from high school in the year of 2007.Trough this study we will verify the content of Gravitation, mainly if this subject presents proposal which provides an interdisciplinarity and transdisciplinarity teaching. The traditional and fragmented way of the dissemination of science is not related to a teaching capable of turning the student a critical person in face of several information that are provided from the textbooks.We have the knowledge that the majority of teachers use the textbook as the main pedagogical support and an important resourse in the education practice. In this sense, to analyze the textbooks verifying the contents and proposals on a global training education, where the student can note the interrelationship among several areas of knowledge, will be able to provide methodological and pedagogical allowances, becoming a new tool in the process of teaching Physics. The study will be divided into four chapters, in the first one we will outline the definitions for the terms interdisciplinarity and transdisciplinarity and its historical context. In the second, we will see a historical approach about Gravitation according to the analysis of some researchers. In the third chapter, we will study the role of textbooks in the teaching-learning process and we will comment the manner of evaluation used by the textbooks indicated by the national programme in 2007. Finally, in the last one, we will present a methodological research and the analysis of textbooks, indicating the information provided by this study. Este trabalho consiste na análise dos livros didáticos de física (do professor) indicados pelo Programa Nacional do Livro para o Ensino Médio (PNLEM), inscritos no PNLEM/2007, para verificarmos, no que diz respeito ao conteúdo de Gravitação, se eles apresentam propostas que proporcionam um ensino em perspectiva interdisciplinar e transdisciplinar. A forma tradicional e fragmentada de difusão da ciência não atende as demandas por um ensino voltado à formação de indivíduos capazes de terem um pensamento crítico, diante das diversas informações que lhes são oferecidas. É sabido que a maioria dos professores tem como suporte pedagógico o livro didático, constituindo dessa forma um importante recurso na prática docente. Neste sentido, analisar nos livros didáticos, conteúdos e propostas que direcionem o ensino numa formação global, onde o aluno perceba a inter-relação existente entre as diversas áreas do conhecimento, poderá fornecer subsídios metodológicos e pedagógicos, constituindo-se uma nova ferramenta para o ensino de física. Dividido em quatro capítulos, destacaremos no primeiro, as definições para os termos interdisciplinaridade e transdisciplinaridade e seu contexto histórico. No segundo, apresentaremos uma abordagem histórica a respeito da Gravitação, segundo a análise de alguns pesquisadores da área. No terceiro, faremos uma reflexão sobre o papel do livro didático no processo ensino-aprendizagem e destacaremos os critérios utilizados na avaliação dos livros inscritos no PNLEM/2007. E por fim, no quarto capítulo, apresentaremos a metodologia de pesquisa e a análise dos livros didáticos, destacando as informações fornecidas pela análise. 143 f

A produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) por leucócitos polimorfonucleares (LPMNs) durante a fagocitose é essencial para a defesa do organismo contra microrganismos invasores. Entretanto, em algumas doenças ocorre a deposição de imunocomplexos, o que leva à produção e liberação excessiva dessas EROs, e conseqüente lesão nos tecidos hospedeiro. Neste trabalho avaliamos o efeito de substâncias naturais (quercetina e 7-aliloxicumarina) sobre a produção de EROs por LPMNs de coelho, estimulados com imunocomplexos de imunoglobulina G (ICIgG), empregando o ensaio de quimioluminescência (QL) dependente de luminol (QL lum) e de QL dependente de lucigenina (QL luc). A interação entre ICIgG e LPMNs, mediada pelo receptor de membrana Fcgama, foi observada por microscopia eletrônica de transmissão, pela intensa marcação dos ICIgG com partículas de ouro coloidal. Os resultados obtidos indicaram que as substâncias analisadas inibiram a QL lum e a QL luc e que tais efeitos não parecem estar relacionados com a inibição da fagocitose, conforme observado no ensaio por microscopia eletrônica. The generation of reactive oxygen species (EROs) by polymorphonuclear leukocytes (LPMNs) during phagocytosis plays a key role in the organism defense against invading microorganisms. However, in some diseases the immune complexes deposition occurs, that causes an increase in the production and release of EROs. Consequently, the host tissue is damaged. In this work we studied the effect of natural compounds (quercetin and 7-allyloxycoumarin) on EROs generation by rabbit (LPMNs) stimulated with immunecomplexes (IC) of chicken egg albumin (antigen) and class G immuneglobulins (IgG) - ICIgG. The EROs production was measured by chemiluminescence assay (QL) enhanced by luminol (QL lum) or by lucigenin (QL luc). The interaction between ICIgG (conjugated with colloidal gold) e LPMNs, mediated by Fcgamma membrane receptor, was observed by transmission electron microscopy. The results indicated that the studied compounds inhibited QL lum and QL luc. They also suggest that such effects are not related to phagocytosis inhibition, as observed by the electron microscopy assay.

A Hipomineralização Molar-Incisivo (HMI) é um termo que designa uma alteração qualitativa do esmalte dentário de origem multifatorial, que afeta um ou mais primeiros molares permanentes, podendo também acometer incisivos permanentes, com graus de severidade variáveis. O padrão-ouro para o diagnóstico é o exame clínico visual, podendo ser exercido com auxílio de índices que descrevem suas características, entretanto, o grande desafio encontrado é avaliar a profundidade do tecido envolvido, sendo que a maior parte destas opacidades é sobreposta à estrutura dentária, tornando-se difícil de avaliar com precisão, utilizando apenas o exame clínico visual. Sendo assim, o objetivo do presente estudo é avaliar de forma descritiva e quantitativa os dentes acometidos pela hipomineralização, por meio da tomografia de coerência óptica para fins de diagnóstico por imagem. Neste estudo, foram utilizados vinte dentes permanentes e decíduos hipomineralizados, classificados de acordo com os critérios de Ghanim et al., 2017, e separados por grupos de acordo com os graus de severidade, cada dente apresentou três varreduras na área afetada e uma varredura na área sadia do próprio dente com a formação de suas imagens ópticas correspondentes. Nas análises qualitativas, na maioria das imagens, foram observadas características de uma linha brilhante em relação ao esmalte e logo abaixo há um alto nível do espalhamento de fótons, ocorrendo a disseminação de sombreamentos, sendo identificados como áreas hipomineralizadas, nas quais o sinal de dispersão pode ser usado como critério de diagnóstico. Nas análises quantitativas, o teste de Tukey foi feito para avaliar as médias do coeficiente de atenuação óptico que não houve diferenças significativas e dos parâmetros de textura, sendo que o grupo grave foi mais homogêneo e correlacionado e de menor contraste do que os grupos controle e leve. Portanto, a utilização deste método, por meio destas técnicas de processamento, revela avanços futuros quanto ao diagnóstico por imagem da HMI. Molar-Incisor Hypomineralization (MIH) is a term that designates a qualitative alteration of the dental enamel of multifactorial origin that affects one or more first permanent molars, and may also affect permanent incisors, with varying degrees of severity. The gold standard for the diagnosis is the visual clinical examination, which can be performed with the help of indices that describe its characteristics, however the great challenge encountered is to assess the depth of the involved tissue, with most of these opacities being superimposed on the dental structure, making it difficult to accurately assess using only visual clinical examination. Therefore, the objective of the present study is to descriptively and quantitatively evaluate the teeth affected by hypomineralization, through optical coherence tomography for diagnostic imaging purposes. In this study, 20 hypomineralized permanent and deciduous teeth were used, classified according to the criteria of Ghanim et al., 2017, and separated into groups according to degrees of severity, each tooth presented three scans in the affected area and one scan in the affected area. of the tooth itself with the formation of its corresponding optical images. In the qualitative analyses, in most of the images it was observed characteristics of a bright line in relation to the enamel and just below there is a high level of photon scattering, with the spread of shading occurring, being identified as hypomineralized areas, in which the scattering signal can be used as a diagnostic criterion. In the quantitative analyses, the Tukey test was performed to evaluate the averages of the optical attenuation coefficient, which showed no significant differences, and of the texture parameters, with the severe group being more homogenous and correlated and with lower contrast than the control and Light. Therefore, the use of this method through these processing techniques reveals future advances in the imaging diagnosis of HMI.

O objetivo do presente estudo in vitro foi comparar elásticos ortodônticos intermaxilares dos tipos látex e não látex (Dentaurum, Newtown, PA, EUA, diâmetro 3/16\'\', de força média) por meio da quantificação da endotoxina bacteriana aderida, avaliação da rugosidade superficial, análise qualitativa da micromorfologia superficial e da avaliação da força e do diâmetro interno desses elásticos, após ensaio de deformação. Para a quantificação da endotoxina bacteriana, efetuada por meio do teste QCL-1000(TM) em leitor de ELISA, os elásticos ortodônticos foram divididos em 5 grupos conforme segue: Grupos experimentais: elásticos ortodônticos intermaxilares do tipo látex (n=12) e não-látex (n=12), contaminados por 24 horas pela solução de endotoxina previamente preparada; Grupos Controles Negativos: elásticos ortodônticos intermaxilares do tipo látex (n=6) e não-látex (n=6) retirados de suas embalagens originais, sem contaminação pela solução de endotoxina e; Grupo Controle Positivo (n = 6): corpos de prova de aço inoxidável (réplicas metálicas), contaminados pela solução de endotoxina. Os valores foram obtidos em UE/mL e transformados em escores para análise estatística. Paralelamente, uma análise descritiva qualitativa da micromorfologia estrutural (n=6 elásticos de cada tipo látex e não látex) e análise quantitativa da rugosidade superficial (valores em µm) (n=10 elásticos de cada tipo) foram realizadas em microscopia confocal a laser. Essas análises foram realizadas no tempo 0 e após 24 e 72 horas em ensaio de deformação. Da mesma forma, foi realizada avaliação da força (valores em g) e do diâmetro interno (valores em mm) de ambos os tipos de elásticos (n=10), nos períodos de 0, 24 e 72 horas, por meio de um dinamômetro e um paquímetro digital, respectivamente. Os dados foram analisados por meio do programa estatístico GraphPad Prism® 5, por meio dos testes Shapiro Wilk, Kruskal-Wallis, Dunn, ANOVA e Bonferroni, sendo o nível de significância de 5% adotado para todas as análises. De acordo com os resultados obtidos observou-se que a endotoxina bacteriana se aderiu em ambos os elásticos testados, sem diferença estatisticamente significante entre elásticos látex, não látex e réplicas de aço inoxidável (p>0,05). A microestrutura da superfície de ambos os elásticos apresentou irregularidades e porosidades, inicialmente e nos períodos de 24 e 72 horas após ensaio de deformação. Após 24 horas, a rugosidade superficial dos elásticos do tipo látex foi significantemente menor em comparação aos elásticos do tipo não látex (p0.05). Com relação à força, os elásticos do tipo não látex apresentaram valores significativamente maiores, em comparação aos do tipo látex, nos períodos de 0, 24 e 72 horas (p 0.05). The microstructure of the surface of both elastics showed irregularities and porosities, initially and in the periods of 24 and 72 hours after strain test. After 24 hours, the surface roughness of the latex elastics was significantly lower compared to non-latex elastics (p 0.05). Regarding force, the non-latex elastics showed significantly higher values, compared to the latex types, in the periods of 0, 24 and 72 hours (p

Os objetivos desse estudo foram avaliar: o efeito do ALN no desenvolvimento de lesões periapicais (LP) induzidas em ratas ovariectomizadas (Capítulo 1); a influência da redução dos níveis de estrógeno na composição microbiana da cavidade bucal e consequentemente no desenvolvimento da lesão periapical (Capítulo 2). Para a realização do estudo do Capítulo 1, 25 ratas foram divididas em 3 grupos: sham (controle), ovariectomia (OVX), e OVX+ALN. Um dia após a realização da OVX, os animais do grupo OVX+ALN começaram a receber a medicação, via gavagem. Decorridas 9 semanas, os primeiros molares de todos os animais foram submetidos à indução de LP. Após 21 dias, foi realizada a eutanásia dos animais. Fêmures foram analisados para registro da densidade mineral óssea (BMD) e os blocos de tecido ósseo contendo os primeiros molares inferiores foram submetidos ao processamento histotécnico e à coloração com hematoxilina e eosina (HE) para análise da LP em microscopia convencional. Paralelamente, foi realizada a análise morfométrica da área das LP por imunofluorescência, histoenzimologia para a quantificação de osteoclastos e coloração de DAPI para quantificação de osteócitos apoptóticos. Além disso, os primeiros molares superiores foram utilizados para a análise da expressão gênica de citocinas pró-inflamatórias (IL-1β, IL-6 e TNF-α) e marcadores da osteoclastogênese (RANKL/OPG). Já para a realização do estudo do Capítulo 2, 36 ratas foram divididas em 4 grupos: sham (controle), ovariectomia (OVX), sham + lesão periapical (Sham+LP) e ovariectomia + lesão periapical (OVX+LP). A indução da LP também ocorreu após 9 semanas seguindo o mesmo protocolo descrito acima. Após o período experimental de 21 dias, foi realizada a colheita microbiológica da cavidade bucal dos animais, por meio de esfregaço com microbrush nas regiões de bochechas, assoalho bucal e língua e posteriormente os animais foram submetidos à eutanásia. As amostras foram analisadas pelo método Checkerboard DNA-DNA Hybridization, para verificar a presença de 40 espécies bacterianas as quais foram divididas em complexos microbianos de Socransky. A análise da área das lesões periapicais foi realizada por microscopia de flourescência. Os resultados foram submetidos aos testes ANOVA e Kruskal-Wallis e aos pós-testes de Tukey e Dunn, com nível de significância de 5%. A análise dos resultados do Capítulo 1 permitiu evidenciar que a OVX reduziu a BMD do fêmur e o tratamento com ALN foi capaz de prevenir a perda óssea (p0,05). Já a análise dos resultados do Capítulo 2 permitiu evidenciar que a microbiota bucal foi alterada em condições de deficiência de estrógeno. Os grupos OVX apresentaram maior quantidade de bactérias, em comparação ao grupo SHAM, na maioria dos complexos microbianos (p0,05). Os animais do grupo controle (com ou sem lesão), sem considerar a influência da deficiência de estrógeno, não apresentaram diferença estatisticamente significante (p>0,001) em nenhum dos complexos microbianos. As lesões periapicais nos animais OVX apresentaram-se significativamente maiores em comparação aos animais SHAM (p 0.05). The analysis of the results of Chapter 2 showed that the oral microbiota was altered under conditions of estrogen deficiency. The OVX groups had a higher amount of bacteria compared to the SHAM group in most of the microbial complexes (p 0,05). The animals in the control group (with or without lesion), disregarding the influence of estrogen deficiency, did not present a statistically significant difference (p> 0.001) in any of the microbial complexes. The periapical lesions in OVX animals were significantly higher compared to SHAM animals (p

Objetivo: Avaliar, in vivo, o efeito do tratamento endodôntico em sessão única utilizando a Terapia Fotodinâmica Antimicrobiana (aPDT) no reparo de lesões periapicais induzidas em dentes de cães, por meio da avaliação histopatológica e imunohistoquímica da angiogênese e de marcadores de formação óssea. O tratamento endodôntico em duas sessões com curativo de demora à base de hidróxido de cálcio (CH) foi utilizado como controle. Métodos: Lesões periapicais foram induzidas em 48 pré-molares superiores e inferiores de 6 cães, com 12 meses de idade. Após instrumentação dos canais radiculares, os dentes foram divididos, aleatoriamente, em 4 grupos: CH/120dias (d) e CH/180dias (d): canais radiculares preenchidos com curativo à base de CH; aPDT/120d e aPDT/180d: canais radiculares condicionados com fotossensibilizador à base de fenotiazina (10 mg/mL), por 1 minuto e irradiados com laser de diodo em toda a extensão dos canais, conforme as recomendações do fabricante. Em seguida, todos os canais radiculares foram obturados com cimento AH Plus e, após 120 ou 180 dias, os animais foram eutanasiados e os blocos contendo dentes e tecido ósseo foram submetidos ao processamento histotécnico e à coloração de hematoxilina e eosina (HE) para a análise descritiva da região periapical e mensuração das lesões periapicais, em microscopia convencional, e contagem de vasos sanguíneos sob luz convencional e no modo fluorescente. A análise imunohistoquímica foi realizada para avaliação dos marcadores da formação óssea osteopontina (OPN) e fosfatase alcalina (ALP). Os dados obtidos foram analisados estatisticamente utilizando os testes two-way ANOVA e qui-quadrado, com nível de significância de 5%. Resultados: Aos 120 dias, os dentes do grupo CH/120d apresentaram processo de reparo avançado, com ligamento periodontal apenas ligeiramente aumentado, presença abundante de fibras colágenas e escassas células inflamatórias. Os dentes do grupo aPDT/120d apresentaram o ligamento periodontal moderadamente aumentado e o infiltrado inflamatório era moderado. Poucas fibras colágenas foram observadas. Aos 180 dias, o mesmo padrão foi observado. As lesões periapicais nos grupos tratados com curativo à base de hidróxido de cálcio foram menores que as lesões nos grupos tratados com aPDT (p

As peçonhas ofídicas apresentam uma grande diversidade de componentes proteicos e estes podem variar dependendo de diversos fatores, como espécie, hábitos alimentares e comportamentais, ontogenia e até mudanças sazonais. Este alto grau de variabilidade pode levar a mudanças na fisiopatologia do envenenamento ofídico. No Brasil, as serpentes da espécie Crotalus durissus são capazes de habitar várias regiões do país e sua peçonha está sujeita a variabilidade, levando a uma grande dificuldade no tratamento do envenenamento, que é realizado por infusão do soro antiofídico. O estudo proteômico permite conhecer os componentes expressos pela glândula de peçonha. Sendo assim, este trabalho teve como objetivos realizar uma análise comparativa das diferenças intraespecíficas na composição proteica das peçonhas de 22 espécimes de Crotalus durissus collilineatus através de técnicas ômicas, avaliar a capacidade neutralizante do soro antiofídico produzido pelo Instituto Butantan contra essas peçonhas, avaliar a atividade hialuronidásica de cada peçonha e comparar as alterações bioquímicas e imunológicas de camundongos após o envenenamento crotálico experimental. Para isto, as peçonhas de 22 serpentes da espécie C. d. collilineatus, da região de Catalão - GO, foram fracionadas em uma coluna de fase reversa C-18 acoplada a um sistema de cromatografia líquida rápida de proteínas e analisadas por eletroforese em gel de poliacrilamida e métodos de espectrometria de massas. Inicialmente, foi observado que as peçonhas destas 22 serpentes variaram entre as cores branca e amarela. Os perfis cromatográficos foram semelhantes, entretanto, apresentaram diferenças qualitativas e quantitativas significativas de alguns componentes, por exemplo, apenas duas das peçonhas apresentaram a proteína crotamina. Outros componentes previamente relatados em outros estudos também foram identificados, como, o complexo da crotoxina, serinoproteases, metaloproteases e convulxina. Pela primeira vez foi possível evidenciar por técnicas proteômicas alguns componentes para a subespécie C. d. collilineatus, como: fator de crescimento neural, enzima conversora de angiotensina, fosfodiesterase, 5\'-nucleotidase, carboxipeptidase, glutaminil ciclase, glutationa peroxidase, NADH desidrogenase e fosfolipase B. Através do método de ELISA, constatou-se que o soro anticrotálico produzido pelo Instituto Butantan foi capaz de reconhecer todas as peçonhas utilizadas, embora algumas frações isoladas não tenham sido reconhecidas com tanta eficácia. A atividade hialuronidásica também foi avaliada, evidenciando que as peçonhas de algumas serpentes não apresentaram atividade detectável desta enzima. Por fim, o envenenamento crotálico experimental em camundongos Balb/c revelou que peçonhas diferentes são capazes de produzir alterações bioquímicas e imunológicas distintas. Assim, as vítimas do envenenamento podem necessitar de tratamentos diferenciados. Este trabalho mostrou que existem variações intraespecíficas importantes nas peçonhas de C. d. collilineatus, sendo que algumas podem ser mais miotóxicas que outras, evidenciadas por induzirem grandes aumentos dos níveis de creatina quinase. Além disso, este estudo proteômico revelou a presença de novos componentes proteicos na peçonha de C. d. collilineatus, contribuindo significativamente para o conhecimento de sua composição. Adicionalmente, estes dados indicam que quanto mais diversificado for o pool de peçonhas utilizado para a imunização de cavalos, melhor será o soro anticrotálico produzido, de forma que o único tratamento para este acidente seja ainda mais eficaz. Snake venoms present a wide variety of protein components and these can vary depending on several factors such as species, eating and behavioral habits, ontogeny and even seasonal changes. This high degree of variability can lead to changes in the pathophysiology of snake bite envenoming. In Brazil, snakes of the species Crotalus durissus are capable of inhabiting various regions of the country and its venom is subject to variability, leading to a high difficulty in treating envenoming, which is performed by the infusion of an antivenom. Proteomic studies allow the knowledge of the components expressed by the venom gland. Thus, this study aimed to perform a comparative analysis of intraspecific differences in the protein composition of the venoms of 22 specimens of Crotalus durissus collilineatus through omics techniques, to evaluate the neutralizing capacity of antivenom produced by Instituto Butantan against these venoms, to evaluate the hyaluronidase activity of each venom and to compare the biochemical and immunological changes of mice after experimental crotalic envenoming. In this way, the snake venoms of the 22 species of C. d. collilineatus, from Catalão - GO region, were fractionated on a reverse phase column C-18 coupled to a fast protein liquid chromatography system and analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis and mass spectrometry methods. Initially, it was observed that the venoms of these 22 snakes varied between white and yellow colors. The chromatographic profiles were similar, however, presenting significant qualitative and quantitative differences of some components, for example, only two venoms showed the protein crotamine. Other components previously reported in other studies were also identified, such as crotoxin, serine proteases, metalloproteases and convulxin. For the first time, it was possible to demonstrate, by proteomic techniques, some components not found thus far in the subspecies C. d. collilineatus, such as nerve growth factor, angiotensin converting enzyme, phosphodiesterase, 5\'-nucleotidase, carboxypeptidase, glutaminyl cyclase, glutathione peroxidase, NADH dehydrogenase, and phospholipase B. By ELISA method, it was found that the crotalic serum produced by the Instituto Butantan was able to recognize all the venoms used, although some isolated fractions have not been recognized effectively. The hyaluronidase activity was also evaluated, showing that the venom of some snakes do not presented detectable activity of this enzyme. The experimental crotalic envenoming in Balb/c mice revealed that different venoms are able to produce different biochemical and immunological changes. Thus, the victims of envenoming may need different treatments. This study demonstrated that there are significant intraspecific variations in the venom of C. d. collilineatus, and some of them may be more myotoxic than others, evidenced by an increasing of creatine kinase levels. Furthermore, the proteomic study revealed the presence of new protein components in the venom of C. d. collilineatus, significantly contributing to the knowledge of its composition. In addition, these data indicate that the more diverse the pool of the venoms used for the immunization of horses, better will be the anticrotalic serum produced, so that the only treatment for this accident will be even more effective

Os neutrófilos são os leucócitos circulantes mais abundantes. Apesar de serem importantes no combate às infecções, o intenso recrutamento e a consequente ativação dessas células levam à liberação de mediadores inflamatórios que estão relacionados com o agravamento do quadro clínico de inúmeras doenças. Dessa forma, nos últimos anos tem-se intensificado a procura por substâncias terapêuticas que minimizem os danos teciduais ocasionados pela infiltração neutrofílica. Estudos prévios do grupo de pesquisa mostraram que as 3-fenilcumarinas, que constituem uma classe de produtos naturais de origem vegetal, são substâncias promissoras como moduladores do metabolismo oxidativo de neutrófilos. Em continuidade a essas investigações, o derivado sintético 3-fenilcumarínico 6,7-diidroxi-3-[3\',4\'- metilenodioxifenil]-cumarina (C13) foi selecionado, por apresentar o grupo substituinte ortodiidroxi nas posições C-6 e C-7 do esqueleto cumarínico e a metilenodioxila ligada ao anel fenílico, no intuito de avaliar o seu efeito nas demais funções efetoras dos neutrófilos, como também em um modelo animal de inflamação articular. Foi avaliado o efeito modulatório in vitro da C13 sobre a quimiotaxia, a produção de ERO e interação com o sítio ativo da mieloperoxidase (MPO), a fagocitose de imunocomplexos (IC), a desgranulação da enzima elastase, a atividade microbicida sobre Candida albicans, a mobilização e o influxo de cálcio, a polimerização do citoesqueleto, e a formação e liberação das NETs em neutrófilos humanos. A C13 inibiu, de forma dependente da concentração, o metabolismo oxidativo de neutrófilos estimulados via receptores de IgG (Fc?R) e/ou de complemento (CR), utilizando-se diferentes tipos de IC e foi capaz de interagir com o sítio ativo da MPO. Nas concentrações próximas da necessária para inibir 50% do metabolismo oxidativo (~ 2µmol/L), a C13 não interferiu nas demais funções efetoras dos neutrófilos avaliadas. No entanto, na maior concentração avaliada (20 µmol/L), a C13 inibiu cerca de: 30% da capacidade das células de migrar a favor dos agentes quimiotáticos n-formil-metionil-leucil-fenilalanina (fMLP) e leucotrieno B4; 70% da fagocitose de IC mediada por CR; 40% e 80% da desgranulação estimulada por fMLP e IC imobilizados, respectivamente; 50% do processo de formação e liberação das NETs. Esta concentração de C13 também interferiu na polimerização do citoesqueleto de actina, mas não inibiu: a quimiotaxia de neutrófilos frente à interleucina (IL) 8; a capacidade fagocítica de IC estimulada via Fc?R e Fc?R+CR; e a atividade microbicida sobre C. albicans. Na segunda parte deste trabalho, foi avaliada a toxicidade da C13 sobre neutrófilos mantidos em condições de cultura celular por 6 e 12 h. Nos períodos avaliados, essa substância não alterou a viabilidade dos neutrófilos. Por último, a C13 foi incorporada em vesículas lipossomais e sua atividade biológica foi avaliada em ratos Wistar com inflamação articular induzida por zimosan. O tratamento dos animais com a C13 lipossomal (1mg/Kg) reduziu a formação do edema e a infiltração de leucócitos e neutrófilos na sinóvia inflamada, mas não alterou a concentração sinovial das citocinas inflamatórias fator de necrose tumoral ?, IL-1? e IL-6. Portanto, o derivado 3-fenilcumarínico C13 pode servir de protótipo para o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos com aplicação no tratamento de doenças onde há intensa participação dos neutrófilos. Neutrophils are the most abundant circulating leukocytes. Although neutrophils are important to fight against infections, the massive recruitment and consequent activation of these cells result in the release of inflammatory mediators that are associated with worsening of the clinical condition in many diseases. In this sense, the search for new therapeutic compounds that minimize tissue damage caused by neutrophil infiltration has been intensified in the past few years. Previous studies have demonstrated that 3-phenylcoumarins, a class of plantderived natural compounds, are promising modulators of neutrophil oxidative metabolism. To continue these investigations, we selected the 3-phenylcoumarin derivative 6,7-dihydroxy-3- [3?,4?-methylenedioxyphenyl]-coumarin (C13), bearing the 6,7-dihydroxyl and the 3?,4?- methylenedioxyl groups, to further assess its effects on the other effector functions of neutrophils, as well as on in an animal model of articular inflammation. We examined the in vitro modulator effect of C13 on the human neutrophil chemotaxis, production of ROS and interaction with active site of myeloperoxidase (MPO), phagocytosis of immune complexes (IC), degranulation, killing of Candida albicans, calcium mobilization and influx, cytoskeleton polymerization, and the formation and release of NETs. C13 inhibited, in a concentration-dependent manner, the neutrophil ROS generation elicited via IgG (Fc?R) and/ or complement (CR) receptors using different types of IC and it interacted with active site of MPO. At concentrations near to that required to suppress the ROS production by 50% (~ 2µmol/L), C13 did not modulate the other neutrophil effector functions assessed. However, at the highest concentration tested (20 µmol/L), C13 inhibited nearly: 30% of the cell ability to migrate towards n-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP) and leukotriene B4; 70% of CR-mediated phagocytosis of IC; 40% and 80% of cell degranulation triggered by fMLP and immobilized IC, respectively; and 50% of the NETs formation and release process. Such C13 concentration also interfered in the actin cytoskeleton polymerization, but it did not suppress the neutrophil: chemotaxis towards interleukin (IL) 8; capacity to phagocytose IC elicited via Fc?R and Fc?R+CR; and killing of C. albicans. In the second part of this study, we examined whether C13 was toxic towards neutrophils maintained in culture for 6 and 12 h. At the time points assessed, this compound did not change the viability of neutrophils. Finally, we incorporated C13 into liposomes and examined its biological activity in Wistar rats of zymosan-induced articular inflammation. Treatment of animals with liposomal C13 reduced edema formation, and leukocyte and neutrophil infiltration in the inflamed synovia, but it did not change the synovial concentration of the inflammatory cytokines tumor necrosis factor ?, IL-1?, and IL-6. Therefore, the 3-phenylcoumarin derivative C13 can be a prototype for the development of novel therapeutic agents to be used in the treatment of diseases where neutrophils have intense participation.

Os neutrófilos são células fagocíticas do sistema imunológico mobilizadas principalmente no combate a infecções. Estas células são capazes de matar os micro-organismos através da desgranulação, que leva à liberação de moléculas antimicrobianas, e da produção de espécies reativas de oxigênio. Embora o recrutamento de neutrófilos seja essencial para a proteção do organismo, sua ativação excessiva resulta na intensa liberação de moléculas citotóxicas no meio extracelular, o que pode desencadear o desenvolvimento e/ou agravar o quadro clínico de doenças autoimunes e inflamatórias, como a artrite reumatoide. Uma possível abordagem terapêutica para o tratamento destas doenças é a modulação das funções efetoras dos neutrófilos. Estudos prévios mostraram que o extrato etanólico das folhas de Baccharis dracunculifolia (EEBd) possui grande potencial terapêutico, uma vez que apresenta expressiva atividade antioxidante frente ao metabolismo oxidativo dos neutrófilos. Para dar continuidade à investigação da atividade anti-inflamatória e/ou imunomoduladora deste extrato, o presente trabalho avaliou, na primeira etapa, o seu efeito modulatório sobre importantes funções efetoras de neutrófilos que medeiam o reconhecimento a e eliminação de patógenos - fagocitose, desgranulação e atividade microbicida - e sobre a atividade de enzimas lisossomais. Verificou-se que o EEBd, dependendo da concentração, inibe o metabolismo oxidativo dos neutrófilos sem alterar a capacidade de defesa das células. Na segunda etapa, foi avaliada a atividade antioxidante de sete compostos isolados do EEBd - ácido cafeico, ácido cumárico, ácido ferúlico, ácido cinâmico, aromadendrina-4?-metil éter, isosacuranetina e hispidulina - frente ao metabolismo oxidativo dos neutrófilos, a fim de propor possíveis marcadores químicos para as atividades biológicas do extrato. Os resultados apontaram o ácido cafeico como um potencial marcador químico da atividade biológica em questão. Na terceira etapa, com o intuito de aumentar a biodisponibilidade e favorecer o uso terapêutico dos produtos naturais estudados, o EEBd e o ácido cafeico foram incorporados em lipossomas, e constatou-se que a incorporação não alterou suas atividades antioxidantes frente aos neutrófilos, quando comparado às respectivas amostras na forma livre. Por fim, foi avaliado o efeito terapêutico do EEBd e do ácido cafeico, ambos na forma livre e incorporada em lipossomas, em um modelo animal de artrite. Verificou-se que as amostras na forma livre melhoraram expressivamente os parâmetros inflamatórios nas articulações, promovendo redução do edema e da migração de células totais e de neutrófilos, e discreta diminuição da concentração das citocinas inflamatórias TNF-?, IL-6 e IL-1?. Além disso, a incorporação do EEBd e do ácido cafeico em lipossomas pode auxiliar na redução das suas concentrações necessárias para a obtenção dos efeitos terapêuticos desejados. Assim, pode-se concluir que o EEBd tem grande potencial para se tornar um agente terapêutico adjuvante no tratamento de doenças inflamatórias mediadas por neutrófilos, sendo o ácido cafeico um possível marcador químico para a atividade anti-inflamatória do extrato. Neutrophils are phagocytic immune cells mobilized primarily to fight against infections. These cells are capable to kill microorganisms through degranulation, which leads to the release of antimicrobial molecules, and production of reactive oxygen species. Although neutrophil recruitment is essential for host protection, excessive activation of these cells culminates in intense discharge of cytotoxic molecules to the extracellular milieu, which can elicit the development of and/or aggravate the clinical condition in autoimmune and inflammatory diseases such as rheumatoid arthritis. Modulation of the effector functions of neutrophils is a possible therapeutic approach to treat these diseases. Previous studies have shown that the ethanolic extract of Baccharis dracunculifolia leaves (EEBd) has a great therapeutic potential due to its significant antioxidant effect towards the oxidative metabolism of neutrophils. To continue investigating the anti-inflammatory and/or immunomodulatory action of such extract, the first part of the present work examined its modulator effect on three important effector functions of human neutrophils that mediate recognition and clearance of pathogens - phagocytosis, degranulation, and microbial killing - and on the activity of lysosomal enzymes. EEBd inhibited the oxidative metabolism of neutrophils without affecting their defense ability, depending on the extract concentration used. To propose possible chemical markers for the biological effects of the extract, the second part of this study evaluated the antioxidant activity of seven compounds isolated from EEBd - caffeic acid, coumaric acid, ferulic acid, cinnamic acid, aromadendrin-4\'-methyl ether, isosakuranetin, and hispidulin - towards the oxidative metabolism of neutrophils. The results pointed to caffeic acid as a potential chemical marker for this biological activity. The third part of this investigation aimed to improve the bioavailability and favor the therapeutic use of the natural products studied. EEBd and caffeic acid were incorporated into liposomal carrier systems. The incorporation of both samples into liposomes did not alter their antioxidant activity towards neutrophils, as compared with their respective free forms. Finally, this study examined the therapeutic effect of EEBd and caffeic acid, both in the free form and incorporated into liposomes, in an animal model of arthritis. The free samples markedly improved the joint inflammatory parameters: they reduced edema and migration of total cells and neutrophils, and slightly lowered the levels of the inflammatory cytokines tumor necrosis factor ? and interleukin 6 and 1? (TNF-?, IL-6, and IL-1?, respectively). In addition, incorporation of EEBd and caffeic acid into liposomes can help to reduce their concentrations required to achieve the desired therapeutic effect. Based on the set of results obtained in this study, we conclude that EEBd has a great potential to become a therapeutic adjuvant in the treatment of neutrophil-mediated inflammatory diseases, and that caffeic acid is a possible chemical marker of the anti-inflammatory activity of the extract.

Os neutrófilos representam a primeira linha de defesa do hospedeiro, atuando na contenção e eliminação de patógenos. Contudo, alterações na vida média, no excessivo recrutamento e ativação dos neutrófilos estão associados a danos teciduais e a doenças inflamatórias e autoimunes. A modulação das funções efetoras dos neutrófilos pode auxiliar no tratamento de tais patologias. Neste sentido, os produtos naturais constituem uma importante fonte de novas substâncias imunomoduladoras. Um estudo recente demonstrou que, a inibição do metabolismo oxidativo de neutrófilos pelo extrato etanólico bruto das folhas de Baccharis dracunculifolia (EEBBd) correlaciona-se com a proporção entre ácido cafeico (CaA) e outros compostos fenólicos contidos nesta amostra. Para dar prosseguimento à investigação do potencial imunomodulador do EEBBd e do CaA, os objetivos do presente estudo foram avaliar o efeito modulador desses produtos naturais: (i) em três funções efetoras de neutrófilos humanos - fagocitose, atividade microbicida e metabolismo oxidativo estimulado por agentes independentes de receptores (forbol-12-miristato-13-acetato; PMA) e dependentes apenas de receptores Fcgama (imunocomplexos não-opsonizados; IC) ou de receptores Fcgama associados a receptores do complemento (imunocomplexos opsonizados com complemento; IC-SHN); (ii) na atividade da mieloperoxidase (MPO); (iii) na expressão de receptores de membrana; (iv) e na captura (scavenger) de H2O2 e HOCl. O CaA foi mais efetivo do que o EEBBd em inibir a atividade da MPO e em capturar H2O2 e HOCl. A análise in silico revelou que o CaA bloqueia a entrada do sítio ativo da MPO através da interação com os resíduos Gln-91, His-95 e Arg-239; os dois últimos resíduos são essenciais para clivar o H2O2 e para estabilizar o sítio ativo, respectivamente. A eficiência dos agentes utilizados para estimular o metabolismo oxidativo, medido por quimioluminescência dependente de lucigenina e de luminol, ocorreu na seguinte ordem: PMA > IC-SHN > IC. Embora o PMA tenha sido o agente mais efetivo em estimular o metabolismo oxidativo, ambas as amostras (EEBBd e CaA) inibiram com maior intensidade esta função celular estimulada por PMA do que a mesma função estimulada por IC-SHN e IC. Além disso, ambas, EEBBd e CaA, não alteraram os níveis de expressão dos receptores TLR2, TLR4, CD16, CD32, e CD11b/CD18. Nas maiores concentrações avaliadas, EEBBd (50 ug/mL) e CaA (90 ug/mL) não foram citotóxicos para os neutrófilos. O EEBBd inibiu intensamente a capacidade fagocítica e reduziu discretamente a capacidade microbicida dos neutrófilos frente à Candida albicans. Portanto, o CaA contribui para ação inibitória do EEBBd no metabolismo oxidativo e na atividade da MPO, mas não na capacidade fagocítica e microbicida de neutrófilos. Por fim, o efeito imunomodulador do CaA e do EEBBd não é mediado por alterações na viabilidade celular ou na expressão de receptores de membrana em neutrófilos. O conjunto de resultados obtidos pode auxiliar na elucidação do mecanismo de ação destes produtos naturais sobre as funções efetoras de neutrófilos, bem como no desenvolvimento de novos fármacos para o tratamento de doenças inflamatórias mediadas pela ativação exacerbada de neutrófilos. Neutrophils represent the first line of host defense that acts in the containment and clearance of pathogens. However, changes in life span and excessive recruitment and activation of neutrophils are associated with tissue damage and inflammatory and autoimmune diseases. Modulation of the effector functions of neutrophils can help to treat these pathologies. In this sense, natural products constitute an important source of novel immunomodulating compounds. A recent study has demonstrated that the neutrophil oxidative metabolism inhibition by the crude ethanol extract of Baccharis dracunculifolia (EEBBd) leaves correlates with the ratio of caffeic acid (CaA) to other phenolic compounds that exist in it. To continue investigating the immunomodulating potential of EEBBd and CaA, the present study aimed to examine whether these natural products modulate: (i) three effector functions of human neutrophils phagocytosis, microbial killing, and oxidative metabolism elicited by a receptor-independent stimulus (phorbol-12-myristate-13-acetate; PMA) and by receptor-dependent stimuli that bind Fcgama receptors alone (non-opsonized immune complexes; IC) or in combination with complement receptors (complement-opsonized immune complexes; IC-SHN); (ii) myeloperoxidase (MPO) activity; (iii) expression of membrane receptors; (iv) H2O2 e HOCl scavenging. CaA was more effective than EEBBd in inhibiting MPO activity and scavenging H2O2 and HOCl. The in silico analysis revealed that CaA blocks the entrance of the active site of MPO through the interaction with Gln-91, His-95, and Arg-239; the two last residues are essential to cleave H2O2 and stabilize the active site, respectively. The agents used to stimulate the oxidative metabolism, as measured by the lucigenin- and luminol-dependent chemiluminescence assays, acted in the following ranking order of efficiency: PMA > IC-SHN > IC. Although PMA was the most efficient agent at stimulating the neutrophil oxidative metabolism, both samples (EEBBd and CaA) suppressed the PMA-induced oxidative metabolism more effectively than they suppressed the same cell function elicited by IC-SHN and IC. Both EEBBd and CaA did not alter the levels of TLR2, TLR4, CD16, CD32, and CD11b/CD18 receptors expression. At the highest concentrations tested, EEBBd (50 ug/mL) and CaA (90 ug/mL) were not toxic towards neutrophils. EEBBd strongly diminished the phagocytic capacity and slightly reduced the Candida albicans killing ability of neutrophils. In conclusion, CaA contributes to the EEBBd inhibitory action on the oxidative metabolism and MPO activity but not on the phagocytic capacity and microbial killing ability of neutrophils. Furthermore, the immunomodulating effect of CaA and EEBBd is not mediated by alterations in either cell viability or expression of membrane receptors in neutrophils. Together, the results can help to unravel the mechanism of action of these natural products on the effector functions of neutrophils, and to develop new drugs to treat inflammatory diseases mediated by neutrophil overactivation.

As leishmanias são parasitas intracelulares obrigatórios que utilizam fagócitos (em especial os macrófagos), para sua sobrevivência e propagação. Estes parasitas são interiorizados via interação com diversos receptores da superfície celular, como o receptor CR3 (MAC-1; CD18/CD11b), componente da família das 2-integrinas. As B2-integrinas são importantes em diferentes mecanismos imunológicos, como a adesão e migração de células, fagocitose e modulação de vias de sinalização intracelulares. Estudos demonstram que a molécula CD18 (constituinte de todas as B2-integrinas) está envolvida na resposta imune na leishmaniose experimental, mas há controvérsias quanto a sua importância na defesa contra esta infecção. Leucotrienos e prostaglandinas são mediadores lipídicos envolvidos em diversos mecanismos da resposta imune inata e adaptativa. Na leishmaniose, os leucotrienos são considerados cruciais para a defesa do organismo por induzir mecanismos efetores celulares, como fagocitose e atividade microbicida. Por outro lado, as prostaglandinas (em especial PGE2) exercem efeito imunossupressor sobre estes mecanismos, podendo favorecer o desenvolvimento da doença. Entretanto, não há conhecimento sobre a relação entre a expressão das B2-integrinas e a produção destes mediadores lipídicos na leishmaniose e a importância destas moléculas na resposta imune contra esta infecção. Assim, o objetivo desta tese foi investigar o efeito da redução da expressão das B2-integrinas na produção de citocinas, quimiocinas e de medidores lipídicos, em modelo de infecção experimental por L. amazonensis. Para isso, camundongos da linhagem C57BL/6 selvagens (WT) e com baixa expressão de CD18 (CD18 Low), foram infectados com promastigotas de L. amazonensis na pata posterior, e o desenvolvimento da infecção foi acompanhado por 5 e 8 semanas após a inoculação. Com base nos resultados obtidos, os animais CD18 Low apresentaram maior carga parasitária nas patas, em comparação com os camundongos selvagens. Além disso, a maior suscetibilidade dos camundongos CD18 Low foi independente da produção de NO e de IL-10 e da redução de IL-12 mediada por IL-4. Estes animais também apresentaram reduzida produção de IFN-gama. Além disso, os camundongos CD18 Low tiveram alterações na produção de LTB4 e de PGE2 ,as quais podem ter reduzido as respostas efetoras das células no sítio da infecção. Também demonstramos que a migração de neutrófilos e de eosinófilos para o sítio de infecção ocorreu de modo independente da expressão de CD18. O maior edema e recrutamento de eosinófilos nas patas dos camundongos CD18 Low foi independente da produção de MCP-1 e parcialmente dependente de RANTES. Entretanto, a produção de LTC4 pareceu ter sido o principal responsável por estes efeitos, em conjunto com PGD2. Deste modo, nossos resultados mostram que a baixa expressão de CD18 favorece o desenvolvimento da infecção por L. amazonensis. Leishmania are obligate intracellular parasites that use phagocytes (especially macrophages) for their survival and propagation. These parasites are internalized through interaction with several receptors of cellular surface, such as the CR3 receptor (Mac-1; CD18/CD11b), component of the B2-integrins family. B2- integrins are involved in important immune mechanisms, such as cell adhesion, cell migration, phagocytosis and modulation of intracellular signaling pathways. Studies have shown that the CD18 molecule (component of all B2-integrins), is involved in the immune response in experimental leishmaniasis, but its importance in the host defense against this infection is still controversial. Leukotrienes and prostaglandins are lipid mediators involved in various mechanisms of innate and adaptive immune response. In leishmaniasis, leukotrienes are considered critical for the host defense, once it induces cellular effector mechanisms such as phagocytosis and microbicide activity. On the other hand, prostaglandins (in particular PGE2), lead to immunosuppressive effects on these mechanisms and may favor development of disease. However, it is unknown whether there is an interaction between the B2 integrins expression and the production of these mediators in leishmaniasis and the role of these molecules in host defense against this disease. Thus, the aim of this thesis was to verify the effect of reduced expression of B2-integrins in cytokines, chemokines and lipid mediators production, in experimental model of L. amazonensis infection. For this purpose, wild type mice (WT) and mice with reduced CD18 expression (CD18Low) from C57BL/6 strain were infected with L. amazonensis promastigotes in the hind footpad. The development of the infection was assessed for 5 and 8 weeks after inoculation. Our results showed that the CD18Low mice had higher parasite load in footpad, compared to wild-type mice. Moreover, the higher susceptibility of CD18Low mice was independent of NO and IL-10 production and independent of IL-12 reduction mediated by IL-4. These mice also showed reduced IFN- gamma production. CD18Low mice had alterations in LTB4 and PGE2 levels in site of infection, which may have altered the effector cell responses. We also demonstrated that the migration of neutrophils and eosinophils to the site of infection was CD18-independent. Moreover, the higher edema and eosinophils recruitment in CD18Low mice was MCP-1-independent and partially dependent of RANTES. However, LTC4 production seemed to be the main factor for edema and migration of eosinophils, together with PGD2. Thus, our results show that the reduction on CD18 expression favors the development of L. amazonensis infection.

A produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) pelos neutrófilos, que representa um mecanismo essencial da imunidade inata contra agentes infecciosos, pode ser desencadeada por imunocomplexos (IC) associados ou não com componentes do sistema complemento. Os IC são normalmente eliminados da circulação pela ligação aos receptores de complemento do tipo 1 em eritrócitos, que os transportam até o baço e o fígado, onde são fagocitados por macrófagos residentes. Porém, defeitos neste mecanismo de eliminação podem levar à deposição de IC nos vasos e tecidos. Em algumas doenças inflamatórias, onde ocorre uma intensa deposição de IC, pode acontecer o recrutamento e a ativação maciça de neutrófilos pelos IC. Nessa situação, os mecanismos endógenos de defesa tecidual não conseguem controlar as alterações desencadeadas pelos fatores oxidantes e líticos liberados pelos neutrófilos, levando à possível lesão tecidual e consequências funcionais e estruturais para o organismo. Nessa perspectiva, tem-se intensificado, nos últimos anos, a procura por novos compostos terapêuticos com capacidade de reduzir os danos aos tecidos adjacentes ao acúmulo de IC, neutrófilos, ERO e enzimas líticas, expostos a níveis deletérios desses componentes. Assim, neste trabalho foi avaliado o potencial antioxidante de um conjunto de dez derivados 3-fenilcumarínicos no metabolismo oxidativo de neutrófilos humanos estimulados por ICs, empregando-se o ensaio de quimioluminescência dependente de luminol e de lucigenina (QLlum e QLluc, respectivamente). Posteriormente, foi avaliada a citoxicidade das amostras, através do ensaio de exclusão do azul de tripan e medida da atividade da lactato desidrogenase liberada, bem como sua capacidade de sequestrar HOCl e inibir a atividade das enzimas NADPH oxidase e mieloperoxidase (MPO). Observou-se que todas as amostras avaliadas inibiram a QLlum e a QLluc, sendo que cinco delas tiveram efeito inibitório maior que ou igual a 50% (C6, C13, C13a, C24 e C24a)*. Este efeito biológico não foi mediado pela citotoxicidade das 3-fenilcumarinas, nas condições avaliadas. Dentre essas amostras, o derivado 3-fenilcumarínico C13, que foi o mais efetivo em inibir a QLluc, possui duas características que parecem estar relacionadas com tal efeito: um grupo substituinte orto-diidroxi no esqueleto cumarínico e um grupo metilenodioxila no anel fenílico. Além do mais, todas as substâncias que possuem o grupo metilenodioxila no anel fenílico (C1, C6, C6a, C13, C13a) apresentaram efeito inibitório da QLluc maior que as respectivas análogas sem este substituinte (C15, C18, C18a, C24, C24a). A inibição da QLluc parece ser independente da inibição da atividade da NADPH oxidase, visto que as substâncias apresentaram efeito inibitório discreto no consumo de O2 pelos neutrófilos estimulados por IC. Por outro lado, as amostras C13 e C24, que têm em comum a presença do grupo substituinte 6,7-diidroxi, apresentaram os maiores efeitos inibitórios sobre a QLlum, apresentando IC50 semelhante. Essas duas substâncias também foram as mais ativas em inibir a atividade da enzima MPO e em sequestrar o HOCl. Para esses dois ensaios, a atividade biológica observada foi dependente do número de hidroxilas na estrutura do derivado 3-fenilcumarínico. Os resultados deste trabalho mostram que a atividade antioxidante dos derivados 3-fenilcumarínicos sobre o metabolismo oxidativo de neutrófilos humanos está relacionada às características estruturais dessas moléculas. Dentre a série de substâncias avaliadas, C13 e C24 são as amostras mais promissoras para uso como protótipos de moléculas com aplicação terapêutica na modulação desta função neutrofílica. Production of reactive oxygen species (ROS) by neutrophils, which is an essential mechanism of innate immunity against infectious agents, can be triggered by immune complexes (IC) associated or not with components of the complement system. IC are normally cleared from the circulation by binding to complement receptor type 1 on erythrocytes and transport to spleen and liver, where they are phagocytized by resident macrophages. However, defects in this clearance mechanism can lead to deposition of IC in vessels and tissues, favoring neutrophil chemotaxis. In some inflammatory diseases there is intense deposition of IC, which triggers massive recruitment and activation of neutrophils. In these situations, the endogenous tissue defense mechanisms are not able to regulate the local disorders provoked by the oxidant and lytic compounds released by neutrophils, and tissue damage as well as structural and functional consequences to the organism might occur. In this perspective, the last years have been marked by an intense search for new therapeutic compounds able to reduce the damage to tissues surrounding the site of accumulation of IC, neutrophils, ROS and lytic enzymes, exposed to deleterious levels of these components. So, the present work reports the evaluation of the antioxidant potential of ten 3-phenylcoumarin derivatives in the neutrophil oxidative metabolism stimulated with IC, through the luminol- and lucigenin-dependent chemiluminescence assay (QLlum and QLluc, respectively). Further, cytotoxicity of the samples was evaluated by the trypan blue exclusion assay and measurement of lactate dehydrogenase activity, as well as their ability to scavenge HOCl and inhibit NADPH-oxidase and myeloperoxidase (MPO) activity. We found that all the samples inhibited QL-lum and QLluc, being the inhibitory effect of five of them higher than or equal to 50% (C6, C13, C13a, C24 e C24a)*. This biological effect was not mediated by cytotoxicity of the 3-phenylcoumarins, under the conditions assessed. Compound C13, which was the most effective inhibitor of QLluc among the set of phenylcoumarins tested, has two structural features that seem to be related to this effect: an orto-dihydroxyl group in the coumarin moiety and a methylenedioxyl group attached to the phenyl ring. Moreover, the inhibitory effect of all 3-phenylcoumarins bearing the methylenedioxyl group (C1, C6, C6a, C13, C13a) was higher than that found to their analogues without this group (C15, C18, C18a, C24, C24a). The CLluc inhibition by phenylcoumarins seems to be independent of inhibition of NADPH-oxidase activity, since these compounds had a slight inhibitory effect in the O2 consumption by IC-stimulated neutrophils. On the other hand, compounds C13 and C24, which shares the 6,7-dihydroxyl group, had the highest inhibitory effects on CLlum with similar IC50 values among the samples tested. These compounds were also the most active ones to inhibit MPO activity and scavenge HOCl. Such biological effects were dependent on the number of hydroxyl groups in the 3-phenylcoumarin moiety. The results of this work show that the antioxidant activity of 3-phenylcoumarin derivatives in the oxidative metabolism of human neutrophils is related to the structural characteristics of these molecules. Among the set of compounds evaluated, C13 and C24 are the most promising samples to be used as prototypes of moleculse with therapeutic application in the modulation of neutrophil function.

Lipossomas (LUV) são estruturas compostas por uma bicamada lipídica que se organizam de forma semelhante a vesículas, contendo um compartimento aquoso em seu interior. Têm sido avaliados como potenciais carreadores de fármacos. No entanto, após sua administração, in vivo, opsoninas do soro adsorvem-se em sua superfície contribuindo para que o sistema fagocitário mononuclear (SFM) reconheça essas partículas, favorecendo sua remoção da circulação. O sistema complemento (SC) parece ter papel importante neste processo, principalmente por gerar fragmentos ativos do componente C3 (C3b/iC3b) que se depositam nas vesículas lipossomais e são reconhecidos por receptores do complemento presentes, por exemplo, nos polimorfonucleares. Antioxidantes, como a quercetina, têm demonstrado importantes e benéficos efeitos sobre a saúde humana, porém sua baixa solubilidade em água e biodisponibilidade limitam seu uso. Assim, o desenvolvimento apropriado de carreadores de flavonoides seria de grande importância para sua aplicabilidade in vivo. O objetivo do presente trabalho é avaliar a ativação das proteínas do SC por lipossomas compostos de fosfatidilcolina de soja e colesterol (PC:CHOL) ou colesteril-etil-éter (PC:CHOL-OET), contendo ou não quercetina. O consumo das vias clássica (VC) e alternativa (VA) provocado pelas diferentes vesículas foi analisado por ensaio hemolítico e a quantificação de iC3b e anticorpos naturais (IgG e IgM) na superfície dessas partículas foi realizada através de kits de ELISA. A ativação de C3 por vesículas contendo ou não quercetina foi avaliada por imunoeletroforese bidimensional (IEF). Os resultados mostram que lipossomas vazios, compostos por grande quantidade de colesterol, consomem mais os componentes do complemento para ambas as vias, VC e VA. Ainda, a substituição de colesterol por colesteril-etil éter reduziu o consumo das duas vias, mas a ativação do SC ainda é dependente da quantidade deste composto. A incorporação de quercetina não alterou o consumo de ambas as vias. O depósito de iC3b, IgG ou IgM nas vesículas compostas de PC:CHOL-OET na proporção de massa 3:1 foi o menor comparado aos demais. A IEF mostrou que vesículas PC:CHOL vazias induzem maior clivagem de C3 em relação às vesículas PC:CHOL-OET. Ainda, a incorporação de quercetina reduz a conversão de C3 em seus fragmentos. Essas observações sugerem que a preparação lipossomal PC:CHOL-OET em proporção de massa 3:1 parece ser a mais adequada para dar continuidade aos estudos que deverão culminar na tentativa de utilizá-la como carreadora de quercetina para administração in vivo Liposomes (LUV) are structures composed by lipid bilayer that are organized similarly to vesicles, containing an aqueous compartment inside. They have been evaluated as potential drug carriers, however, after in vivo administration, serum opsonins are adsorb on the surface, contributing to their clearance from the circulation by mononuclear phagocytes system (MPS). The complement system (CS) seems to play an important role in this process, mainly to generate active fragments of the C3 component (C3b/iC3b) that are deposited in the liposomal vesicles and are recognized by complement receptors present, for example, in polymorphonuclear cells. Antioxidants such as quercetin have demonstrated significant and beneficial effects on human health, but its low water solubility and bioavailability limit their use. Thus, the proper development of flavonoids carriers would be of great importance to its applicability in vivo. The objective of this study is to evaluate the activation of SC proteins by liposomes composed of soy phosphatidylcholine and cholesterol (PC: CHOL) or cholesteryl ethyl ether (PC: CHOL-OET), with or without quercetin. The consumption of the classical (CP) and alternative pathway (AP) caused by the different vesicles was analyzed by hemolytic assay and quantification of iC3b and natural antibodies (IgG and IgM) on the surface of these particles was performed using ELISA kits. The activation of C3 by vesicles with or without quercetin was assessed by two-dimensional immunoelectrophoresis (IEF). The results show that empty liposomes, composed of large amounts of cholesterol, consume more CS components in both pathways, CP and AP. Moreover the replacement of cholesterol by cholesteryl ethyl ether reduced the consumption of both pathways, but the activation of the SC is still dependent on the amount of the compound. The incorporation of quercetin did not alter the consumption of both pathways. The deposition of iC3b, IgG or IgM in vesicles composed of PC: CHOL-OET at mass ratio of 3:1 was the lowest compared to the others. The IEF showed that empty vesicles of PC:CHOL induce less cleavage of C3 in relation to vesicles of PC: CHOL-OET. In addition, the incorporation of quercetin reduces the conversion of C3 into its fragments. These observation suggest that the liposomes PC:CHOL at mass ratio 3:1 seems to be the most appropriate to continue the studies that could culminate in an attempt to use it as a carrier to administrate quercetin in vivo

O sistema imune inato é organizado por processos complexos que envolvem os diversos tipos celulares que culminam na eliminação de uma variedade de microorganismos a fim de proteger o organismo de infecções. Os neutrófilos são células importantes neste sistema, sendo capazes de migrar rapidamente ao foco da infecção. Estas células reconhecem e fagocitam partículas estranhas e atuam no sentido de elimina-los através da produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), proteínas antimicrobianas e enzimas proteolíticas dos grânulos, que são liberadas no fagossomo e no espaço extracelular. Entretanto, em algumas doenças inflamatórias e autoimunes têm sido encontradas lesões nos tecidos envolvendo a produção excessiva de EROs pelos neutrófilos, desencadeada por imunocomplexos (ICs) via receptores Fc gama (Fc) e de complemento (CR). Assim, a modulação da ativação destes receptores e da produção de EROs é importante na manutenção da homeostasia. Nas últimas décadas, flavonóides são considerados como metabólitos secundários promissores mostrando atividade antioxidante e imunomodulatória. Neste trabalho foi avaliado o efeito modulatório dos flavonóides galangina, kaempferol, quercetina e miricetina em algumas funções efetoras de neutrófilos humanos, como o metabolismo oxidativo estimulado via receptores de membrana Fc e/ou CR, fagocitose e atividade microbicida, além do efeito citotóxico, antioxidante e inibitório dessas substâncias sobre a atividade das enzimas mieloperoxidase (MPO) e NADPH oxidase. Os flavonóides analisados mostraram um efeito modulatório negativo no metabolismo oxidativo dos neutrófilos humanos na seguinte ordem: galangina> kaempferol> quercetina > miricetina. Embora a galangina tenha exercido maior atividade, sua ação antioxidante e inibitória na atividade das enzimas MPO e NADPH oxidase foi a menos efetiva dentre os flavonóides avaliados. Além disso, esta substância inibiu de maneira mais acentuada a resposta celular mediada por ambos os receptores Fc e CR quando comparado a estimulação destes receptores individualmente. As substâncias contendo o grupo catecol, quercetina e miricetina mostraram elevada eficiência na inibição da atividade das enzimas NADPH oxidase e MPO, e na redução do radical livre 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH). De maneira geral, os flavonóides não interferiram no processo fagocítico e no mecanismo microbicida, e não induziram toxicidade e morte celular por apoptose ou necrose. Os resultados apresentados neste trabalho mostram uma possível aplicação destes flavonóides como fármacos de origem natural em doenças inflamatórias que apresentem acúmulo de neutrófilos, sendo uma ferramenta promissora para o tratamento efetivo destas doenças. The innate immune system is composed of complex biological processes involving a variety of cell types that eliminate invading microorganisms to protect the host against infection. Neutrophils are key effector cells of this system, being able to migrate rapidly to infection sites. These cells recognize and engulf foreign particles by phagocytosis, and act to destroy them through production and release of reactive oxygen species (ROS), antimicrobial proteins and proteolytic granule enzymes, which are delivered to the phagossomes and to the extracellular environment. However, tissue damage related to excessive neutrophil ROS production triggered by immune complexes (ICs) via Fc-gamma (FcR) and complement receptors (CR) has been found in some inflammatory and autoimmune diseases. So, modulation of both the activation of these receptors and ROS generation are important to the maintenance of body homeostasis. In the last decades, flavonoids have been considered promising plant secondary metabolites with antioxidant and immunomodulatory activity. This study evaluated the modulator effect of four flavonoids (galangin, kaempferol, quercetin and myricetin) in some human neutrophil effector functions, such as the oxidative metabolism stimulated via FcR and CR classes of membrane receptors, phagocytosis and microbicidal activity, as well as the cytotoxic, antioxidant and inhibitory effect of these compounds in the MPO and NADPH oxidase activity. The flavonoids studied showed a negative modulator effect in the human neutrophils oxidative metabolism in the following ranking order: galangin > kaempferol > quercetin > myricetin. Although galangin had shown the highest activity, it was the least effective antioxidant and inhibitor of MPO and NADPH oxidase activity among the flavonoids tested herein. Furthermore, this compound inhibited more the cellular response mediated by both Fc and CR receptors than by each one of them individually. The flavonoids bearing the catechol group, quercetin and myricetin, had a high efficiency to inhibit NADPH oxidase and MPO activity, as well as to reduce the 2,2-diphenyl-1-picrylhidrazil (DPPH) free radical. In general, the flavonoids did not interfere in the phagocytic process and microbicidal mechanism, and also did not induce toxicity and cell death by apoptosis or necrosis. The group of results presented here provides a possible application of these flavonoids as drugs of natural source in inflammatory diseases with excessive neutrophil infiltration, being a promising tool for an effective treatment of these illnesses.

Tem sido reportado que os danos induzidos pela radiação ultravioleta (RUV) são devidos principalmente pela geração de espécies reativas de oxigênio (EROs). Assim, compostos capazes de inibir a ação e a formação destas EROs, são capazes de proteger a pele dos danos induzidos pela RUV. O objetivo deste trabalho foi obter o extrato padronizado de calêndula (calendula officinalis), avaliar sua toxicidade em cultura de células e sua eficácia antioxidante. Além disso, formulações tópicas contendo este extrato foram desenvolvidas e sua capacidade de penetração na pele foi avaliada. Foi avaliado também, o efeito protetor do extrato de calêndula e de formulações tópicas adicionadas deste extrato contra os danos induzidos pela radiação UVB na pele, em camundongos sem pêlos irradiados com radiação UVB. O conteúdo de polifenóis, flavonóides, rutina e narcissina encontrado no extrato de calêndula foram 0,46%, 0,29%, 239 µg/mL e 1,83 mg/mL, respectivamente. A avaliação da eficácia antioxidante demonstrou o efeito dose-dependente do extrato de calêndula contra diferentes radicais. O experimento de citotoxicidade demonstrou que o extrato de calêndula não foi tóxico para fibroblastos de camundongo (L929), células de hepatoma humano (HepG2) e células de melanoma de camundongo (B16F10) em concentrações abaixo ou iguais a 100 µL/mL. Entretanto, em concentrações maiores ou iguais a 200 µL/mL foi observado efeito tóxico. Todas as formulações foram estáveis fisicamente e funcionalmente. A formulação tipo gel foi mais eficiente para reter o extrato de calêndula na pele, uma vez que foram detectados 0,21 µg/cm2 de narcissina e 0,07 µg/cm2 de rutina na epiderme viável. O extrato de calêndula e a formulação gel foram capazes de manter os níveis de GSH próximos aos níveis de animais não irradiados. Entretanto, o extrato de calêndula e a formulação gel não foram capazes de inibir a atividade de metaloproteinases e mieloperoxidases aumentadas pela irradiação UVB. Além disso, a formulação gel adicionada de extrato de calêndula reduziu modificações histológicas induzidas pela radiação UVB na pele, como modificações das fibras de colágeno. A aplicação tópica de extrato de calêndula em formulações tipo gel promoveu efeito fotoprotetor em camundongos sem pêlo, provavelmente devido a uma possível melhoria da síntese de colágeno no tecido conjuntivo subepidermal. Estes resultados dão boas perspectivas para utilizar o extrato de calêndula topicamente ou oralmente para prevenir e/ou tratar os danos induzidos pela radiação UV na pele. It has been reported that UV-induced damage is due mainly to the generation of reactive oxygen species (ROS). Then, compounds able to inhibit the action and the formation of these ROS, will be able to protect the skin from UV-induced damage. Thus, the purpose of this work was to obtain standardized marigold extract (calendula officinalis), to evaluate their toxicity in cell culture and their antioxidant efficacy. In addition, topical formulations added with this extract were developed and their penetration skin capacity was evaluated. It was also investigated, the protective effect of the marigold extract and of the topical formulations added with this extract against UVB-induced damages in skin, in ultraviolet-irradiated hairless mice. The polyphenols, flavonoids, rutin and narcissin contents found in marigold extract were 0.46%, 0.29%, 239 µg/mL and 1.83 mg/mL, respectively. The evaluation of antioxidant efficacy demonstrated the dose-dependent effect of marigold extract against different radicals. Cytoxicity experiments demonstrated that marigold extract was not cytotoxic for mice fibroblasts (L929), human hepatoma cells (HepG2) and mouse melanoma cells (B16F10) at concentrations less than or equal to 100 µL/mL. However, at concentrations greater than or equal to 200 µL/mL were observed toxic effects. All formulations were physical and functionally stable. Gel formulation was the most effective for delivery of marigold extract in skin, since it was detected 0.21 µg/cm2 of narcissin and 0.07 µg/cm2 of rutin in the viable epidermis. Marigold extract and gel formulation were able to maintain glutathione reduced levels close to non-irradiated animals. However, marigold extract and gel formulation were not able to inhibit the gelatinase-9 and myeloperoxidase activities increased by UVB irradiation. In addition, gel formulation added to marigold extract reduced the histological skin changes induced by UVB-irradiation, as modifications of collagen fibrils. Topical application of marigold extract in gel formulation provided photoprotective effect in hairless mice, probably related to a possible improvement of the collagen synthesis in the subepidermal connective tissue. These results give good perspectives to apply marigold extract topically and orally in order to prevent and/or treat UV-damaged skin.

O uso de enxaguatórios bucais contendo substâncias ativas antimicrobianas tem sido proposto como um importante meio de redução da formação de biofilme dental supragengival quando usados concomitantemente com higienização mecânica da cavidade bucal. A microemulsão é um moderno sistema de liberação de fármacos, que pode solubilizar tanto compostos lipo quanto hidrossolúveis. Foi demonstrado que extratos de Baccharis dracunculifolia (Bd), popularmente conhecido como alecrim-do-campo apresentaram atividade anticariogênica, sugerindo sua utilização em produtos para higiene bucal. No entanto, o extrato de Baccharis dracunculifolia é pouco solúvel em água. No presente trabalho, nós desenvolvemos e caracterizamos microemulsões com extrato e óleo essencial das folhas de Bd para incorporar em formulação de enxaguatório bucal sem álcool, com finalidades preventiva e terapêutica, contendo extrato hidroetanólico e óleo essencial das folhas de Baccharis dracunculifolia e avaliar o seu efeito sobre fatores de virulência de Streptococcus mutans (S. mutans) in vitro. Foram obtidos 4 diagramas de fase pseudo-ternário: 1. Labrasol® (L-polietilenoglicol-8-caprilato/caprato)/Plurol® (P-isoestearato de poligliceril) (3:1)/Oleato Etila - (LP); 2. PEG 40 (óleo de rícino hidrogenado e etoxilado)/Sorbitol (2:1)/ Oleato de etila - (PSO); 3. PEG 40/Sorbitol (2:1)/Miristato de isoropila - (PSM) e 4. PEG 40/Sorbitol/Glicerol (1:1:1)/Oleato de etila e óleo essencial de B. dracunculifolia - (PSG). Os sistemas foram caracterizados (microscopia óptica, estabilidade preliminar, reologia, pH, tamanho de gotículas, viscosidade, condutividade elétrica, densidade relativa e índice de refração). Foram desenvolvidas 4 formulações enxaguatórias com a microemulsão escolhida e submetidas à análise sensorial por teste de preferência. O efeito do enxaguatório bucal contendo o extrato hidroetanólico e óleo essencial de B. dracunculifolia foi avaliado in vitro, sobre fatores cariogênicos de S. mutans: inibição do potencial acidogênico, concentração inibitória mínima (CIM) e influência no perfil de crescimento. Além disso, foram avaliados citotoxicidade por MTT e capacidade de manchamento de dentes de estoque pelo padrão CIELAB do enxaguatório bucal. O sistema microemulsionado escolhido apresentou as seguintes propriedades físico-químicas: viscosidade de 12,40 cP, tamanho de gotícula 19,53 nm, condutividade 204,63 µS/cm, pH final 4,95, densidade relativa 1,0394g/mL, índice de refração igual a 1,3595. A formulação escolhida para desenvolver o enxaguatório bucal, apresenta pH final igual a 5,89, densidade igual a 1,0425 g/mL, índice de refração de 1,3614 e viscosidade igual a 12,0 cP. O enxaguatório bucal apresentou atividade inibitória sobre a produção bacteriana de ácidos, com valor de CI50 igual a 128 µg de extrato bruto/mL da formulação, apresentando CIM (Concentração Inibitória Mínima) igual a 400 g de extrato bruto/mL da formulação, para uma concentração final de inóculo igual a 5 x 103 ufc/mL. Na avaliação de mudança de coloração dos dentes, o enxaguatório bucal de referência Periogard® (contendo digluconato de clorexidina 0,12%) e o enxaguatório de B. dracunculifolia apresentaram valores de E iguais a 2,62 e 0,55 unidades CIELAB, respectivamente, evidenciando que o primeiro mancha os dentes e o segundo não, mas que os dois são clinicamente aceitáveis. Além disso, enxaguatorio bucal contendo extrato e óleo essencial de B. dracunculifolia apresenta baixa interferência na proliferação celular, por teste de MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolium). Os resultados sugerem que a formulação final escolhida possui propriedades antimicrobianas superiores ao extrato hidroetanólico bruto, com baixo efeito citotóxico, credenciando-o para avaliação clínica. The use of antimicrobial mouthrinses to help the plaques supragengival control and gingivitis has been shown to significantly contribute to patients daily oral hygiene. Formulations based on microemulsions have several interesting characteristics such as the ability to protect labile drugs, their release control, and to increase their solubility and bioavailability. It has been demonstrated that extracts from Baccharis dracunculifolia (Bd), a Brazilian shrub species, popularly known as alecrim-do-campo, show anticariogenic properties, which suggests its appliance into oral care products. However, Baccharis dracunculifolia extracts are poorly water soluble. In this work, we have developed and characterized microemulsions in which Baccharis dracunculifolia extract and essential oil may be incorporated to produce a clear solution in an alcohol-free mouthrinse. Four Bd extract - containing microemulsion systems (1) ethyl oleate/Labrasol®/Plurol® (LP), (2) isopropyl miristate/PEG 40/Sorbytol (PSM), (3) ethyl oleate/PEG 40/Sorbytol (PSO) and (4) ethyl oleate/Baccharis dracunculifolia extract/essencial oil/PEG 40/Sorbytol/Glycerol (PSG), were prepared in aqueous mixtures at room temperature, using the conventional titration technique. The pseudo-ternary phase diagrams were prepared at room temperature. The systems were characterized by optical microscopy, preliminary stability, rheology, pH, droplet size, electrical conductivity, relative density, viscosity and refractive index. The inhibitory effect on bacterial acid production was evaluated through the potentiometric measurement of pH from bacterial suspensions treated with serial concentrations of Bd mouthrinse (16 - 400 µg/mL). For the antibacterial activity assay, the inhibitory effect on bacterial growth and the minimum inhibitory concentrations (MIC) were determined. Bd mouthrinses four formulations sensory analysis was evaluated at preference test. The citotoxicity was evaluated by MTT method and staining potential was measured by CIELAB standart. Two regions were identified in the first diagram (bifasic system and microemulsion) while three regions were identified on the others (bifasic system, emulsion and microemulsion). All systems displayed an oil-in-water microemulsion region. The system chosen for the mouthrinse presented viscosity (12.40 cP), droplet size (19.53nm), conductivity (204.63 S/cm), pH (4.95), relative density (1.0394g/mL) and refractive index (1.3595). The chosen mouthrinse presented viscosity (12.00 cP), droplet size (19.53nm), final pH (5.89), relative density (1.0425g/mL) and refractive index (1.3614). The mouthrinse displayed inhibitory effects upon S. mutans virulence factors. The IC50 value for the inhibitory effect on the bacterial acid production was 128 µg/mL. The MIC value was 400µg/mL. Bd mouthrinse tested by the agar diffusion method, was not displayed growth inhibition. The acrylic resin teeth stainability test displayed E values of 2.62 CIELAB units for the reference mouthrinse (Periogard®) and 0,55 for Bd mouthrinse. According to results, the reference mouthrinse (Periogard®) causes resin acrylic teeth color variation while Bd mouthrinse did not cause teeth staining or cytotoxicity by MTT method. The Results indicate that these systems could be an interesting Bd vehicle for a mouthrinse and suggest that the final rising formulation has antimicrobial properties superior to the rough hydroetanolic extract, with low cytotoxic effect, turning it credible to clinical evaluation.

Em estudo anterior, observamos que o Met-RANTES, antagonista de receptores CCR1 e CCR5 para quimiocinas, injetado pela via endovenosa (i.v.) reduziu a resposta febril induzida pelo lipopolissacarídeo (LPS) de E. coli, demonstrando o envolvimento da quimiocina RANTES (Regulada sob ativação, expressa e secretada por células T normais) nesta resposta. Além disso, a injeção intrahipotalâmica (i.h.) da RANTES dose-dependentemente aumentou a temperatura corporal de ratos, o qual foi caracterizado como febre, pois foi acompanhada de redução da temperatura da cauda, uma resposta termorregulatória para retenção de calor. Observamos também, que a RANTES aumenta a concentração de prostaglandinas no fluido cerebroespinhal (CSF) e que a febre por ela induzida é sensível aos inibidores não-seletivos para as ciclooxigenases e seletivo para COX-2 (Machado et al., 2007). No presente estudo, aprofundamos a investigação sobre os mediadores, incluindo as prostaglandinas, envolvidos na resposta febril induzida pela RANTES. Verificamos que o paracetamol reduziu, enquanto o diclofenaco de sódio aboliu a resposta febril induzida pela RANTES. Ainda, a injeção i.h. da RANTES promoveu significativa expressão do RNAm para COX-2 no hipotálamo, confirmando ser a COX-2 a enzima responsável pela síntese de prostaglandinas envolvidas no efeito pirogênico desta quimiocina. Através da administração de corante in situ e de cortes histológicos, pode-se averiguar o trajeto da cânula bem como a profundidade alcançada pela agulha durante a injeção na área pré-óptica hipotalâmica anterior (AH/POA). Padronizamos a dose do Met-RANTES (i.h.) que não seria capaz de alterar a temperatura retal dos animais. Posteriormente, avaliou-se o efeito de diferentes doses do Met-RANTES, administrado via intrahipotalâmica, na resposta febril induzida pelo LPS ou pela RANTES. Entretanto, nas doses administradas o pré-tratamento com o antagonista não foi capaz de reduzir a febre induzida por ambos os estímulos. Contudo, o Met-RANTES (i.v.) reduziu a febre induzida pelo TNF-alfa (i.h.), reproduzindo resultados anteriores. O pré-tratamento com Met-RANTES (i.v.) não modificou a febre induzida pela injeção central de interleucina (IL)-6, fator liberador de corticotropina (CRF) e bradicinina (BK). Adicionalmente, a injeção de LPS (i.v.) ou TNF-alfa (i.h.) elevou a concentração da RANTES no tecido hipotalâmico. Antalarmina (antagonista de receptores CRF1) e alfa-helical CRF9-41 (antagonista de receptores CRF1 e CRF2) que reduziram a febre induzida pelo CRF, não alteraram a febre induzida pela administração i.h. da RANTES. O antagonista de receptores B1 (DALBK) que reduziu a segunda fase da resposta febril induzida pela BK, não foi capaz de modificar a febre induzida pela RANTES. Da mesma forma, o antagonista de receptores B2 (Hoe-140) que reduziu a resposta febril induzida pela BK durante todo o período de experimentação, não modificou a febre promovida pela RANTES. Por outro lado, verificamos que o anticorpo anti-IL-6 administrado i.h. reduziu a febre induzida pela IL-6 e pela RANTES. Ainda, a injeção de LPS (i.v.) ou RANTES (i.h.) elevou a concentração de IL-6 no CSF, mas não de IL-1 e TNF-. A RANTES promoveu ativação do fator nuclear-kB (NF-kB) e aumentou a expressão do RNAm para as citocinas IL-1beta, TNF-alfa e IL-6 no hipotálamo dos animais. O pré-tratamento com Met-RANTES reduziu, na 2,5 e 6 h, a neutrofilia induzida pelo LPS. Em síntese, nossos resultados demonstram que durante a resposta febril induzida pelo LPS, este induz a síntese de TNF-alfa o qual promove a síntese da quimiocina RANTES que, ativando os receptores CCR1 e CCR5 promove a transmigração do NF-kB do citoplasma para o núcleo e a subseqüente síntese de IL-6 e de COX-2, esta última, a responsável pela síntese de prostaglandina E2 (PGE2), um dos mediadores finais da resposta febril induzida pelo LPS. Além disso, a RANTES parece ser um mediador da resposta de fase aguda, uma vez que, promove dois sinais importantes desta resposta, febre e neutrofilia. We showed before that Met-RANTES, CCR1 and CCR5 receptor antagonist, intravenously injected (i.v.) reduced fever induced by lipopolysaccharide (LPS, E. coli), demonstrating the involvement of RANTES (Regulated on activation, normal T cells expressed and secreted) in this response. Also, intrahypothalamic (i.h.) injection of RANTES dose-dependently increased body temperature of rats, this increase was characterized as fever, because it was accompanied of a reduction in the tail skin temperature, a thermoregulatory response for heat retention. We also verified that RANTES increased the concentration of prostaglandin (PG)E2 in the cerebrospinal fluid (CSF), which was sensible to non-selective and selective blockers to cyclooxygenase (COX)-2 (Machado et al., 2007). In the present study, it was investigated which others mediators, including prostaglandins, are involved in the RANTES-induced fever. The effect of paracetamol and sodium diclofenac on fever induced by RANTES was also investigated. Paracetamol reduced, while sodium diclofenac abolished the RANTES-induced fever. The intrahypothalamic (i.h.) RANTES injection promoted a significant COX-2 mRNA expression in the hypothalamus, confirming the role of the COX-2 enzyme in the synthesis of prostaglandin involved in the pyrogenic effect of this chemokine. Through administration of dye in situ and histological analyses, we confirmed that the injection in the preoptic area of the anterior hypothalamus (AH/POA) was correct. Subsequently, we evaluated the effect of different doses of Met-RANTES (i.h.) in the fever induced by both LPS and RANTES. Centrally injected, Met-RANTES did not modify the fever induced by LPS or RANTES. On the other hand, Met-RANTES (i.v.) reduced TNF-alpha-induced fever, but did not modify the fever induced by interleukin (IL)-6, corticotrophin releasing factor (CRF) and bradykinin (BK). Additionally, the injection of LPS (i.v.) or TNF-alpha (i.h.) increased RANTES concentration in the hypothalamus. Antalarmin (a CRF receptor 1 antagonist) and alpha-helical CRF9-41 (CRF 1 and 2 receptor antagonist) that reduced CRF-induced fever did not modify the fever induced by RANTES (i.h.). DALBK (bradykinin B1 receptor antagonist) that reduced the second phase of BK-induced fever did not modify RANTES-induced fever. In the same way, Hoe-140 (bradykinin B2 receptor antagonist) that reduced the fever induced by BK during the whole period of observation, did not modify RANTES-induced fever. On the other hand, we verified that anti-rat IL-6 antibody (i.h.) reduced the fever induced by both IL-6 and RANTES. In addition, the administration of LPS (i.v.) or RANTES (i.h.) increased the CSF IL-6 concentration, but not of IL-1 and TNF-. RANTES promoted nuclear factor-kB (NF-kB) activation and increased IL-1beta, TNF-alpha and IL-6 mRNA expression in the hypothalamus. Pretreatment of the animals with Met-RANTES reduced the LPS-induced neutrophilia. In synthesis, our results suggest that in the fever induced by LPS, RANTES induces TNF- synthesis, which promotes the synthesis of RANTES that, activating CCR1/CCR5 receptors, promotes NF-kB transmigration of cytoplasm to the nucleus and subsequent synthesis of IL-6 and COX-2. The latter, in turn, is responsible by (PGE2) synthesis, one of the final mediators of the febrile response induced by LPS. Moreover, RANTES seem to be a mediator of the acute phase response since it promoted two important signs of this response, fever and neutrophilia.