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Dissertação de Mestrado em Genética Molecular Comparativa e Tecnológica O trigo é um dos cereais mais importantes para a alimentação e agricultura a nível mundial, por isso muitos países têm desenvolvido esforços para a caracterização e avaliação da diversidade genética das suas populações ou “landraces” deste cereal. No IBB-CGB/UTAD tem-se vindo a caracterizar uma colecção antiga de trigos portugueses, composta por 48 cultivares de trigo mole (Triticum aestivum 2n = 6x = 42; AABBDD) e 51 cultivares de trigo rijo (T. turgidum e T. durum; 2n = 4x = 28; AABB), bem como 30 linhas da “landrace” de trigo mole ‘Barbela’. Os objectivos deste trabalho eram caracterizar esta colecção de trigos com base em marcadores moleculares RAPD e ISSR e em componentes morfológicos e de produção. Com os marcadores RAPD obteve-se 71,3% de polimorfismo nos trigos moles, 72,7% nos trigos rijos e 54,1% nas linhas de trigo ‘Barbela’. Também se obteve 78,6% de polimorfismo ISSR nos trigos moles, 81,3% nos trigos rijos e 55,7% nas linhas de trigo ‘Barbela’. Os ISSRs evidenciaram maior taxa de polimorfismo do que os RAPDs. Neste trabalho foram construídos dendrogramas de similaridade genética, utilizando o método de agrupamento UPGMA e o coeficiente de Jaccard para trigos moles, rijos e linhas de ‘Barbela’ com a totalidade dos dados RAPD e com a totalidade dos dados ISSR. No geral, os dendrogramas agruparam os trigos moles por variedades botânicas, os trigos rijos por espécies e as linhas de trigo ‘Barbela’ por região de colheita, quer para RAPDs quer para ISSRs. A combinação dos dois sistemas de marcadores originou resultados similares. No que concerne aos componentes morfológicos e de produção, estes evidenciaram uma elevada variabilidade genética entre cultivares e entre variedades botânicas. Os dendrogramas UPGMA de similaridade genética, utilizando o coeficiente da distância euclidiana confirmaram a elevada variabilidade genética anteriormente observada, uma vez que não foi possível agrupar os trigos por variedades botânicas, espécies ou regiões de colheita. Na análise da diversidade genética os ISSRs revelaram ser mais informativos que os RAPDs, sendo os marcadores morfológicos e de produção os menos informativos. The wheat is one of the most important cereals for food and agriculture worldwide, so many countries have developed efforts to the characterization and evaluation of the genetic diversity of their populations or landraces of this cereal. In IBB-CGB/UTAD we have been characterizing an old portuguese wheat collection, composed by 48 bread wheat cultivars (Triticum aestivum 2n = 6x = 42; AABBDD) and 51 durum wheat cultivars (T. turgidum e T. durum; 2n = 4x = 28; AABB), as well as 30 lines of the ‘Barbela’ bread wheat landrace. The goals of this work were to characterize this wheat collection based on molecular markers RAPD and ISSR and based on morphological and yield traits. With RAPD markers we got 71,3% of polymorphism in bread wheats, 72,7% in durum wheats and 54,1% in ‘Barbela’ lines. We also got 78,6% of ISSR polymorphism in bread wheats, 81,3% in durum wheats and 55,7% in ‘Barbela’ lines. The ISSR molecular markers showed higher polymorphism level then RAPD markers. In this study, UPGMA dendrograms were built using the Jaccard coefficient to the bread wheat, durum wheat and ‘Barbela’ lines, with the RAPD data and with the ISSR data. In general, bread wheats were clustered by botanical varieties, durum wheats by species and ‘Barbela’ lines by sampling area, as for RAPDs as for ISSRs. The combination of the two marker sistems gave rise to similar results. Morphological and yield traits showed a high genetic variability within cultivars and within botanical varieties. UPGMA dendrograms of genetic similarity, using the euclidian distance coefficient confirmed the high genetic variabitity, once wheats did not cluster by botanical varieties, species or sampling areas. In the genetic diversity analysis, ISSRs were more informatives than RAPDs, and the morphological and yield markers were the less informatives.

Dissertação de Mestrado em Recursos Genéticos e Melhoramento de Espécies Agrícolas e Florestais A hibridação interespecífica permite a criação de linhas com interesse agronómico e o aumento da variabilidade genética. Os triticales são alopoliplóides criados pelo Homem com o objectivo de reunir a elevada produtividade e boa qualidade do trigo para panificação com a rusticidade, adaptabilidade (nomeadamente a solos pobres, ácidos e arenosos) e teor em lisina superior do centeio. O triticale (xTriticosecale Wittmack) resulta do cruzamento entre espécies do género Triticum L. e do género Secale L. Os tritodeuns (xTritordeum Ascherson et Graebner) são anfiplóides entre Hordeum chilense e diferentes Triticum spp, que servem de ponte para transferir genes de H. chilense para o trigo ou para o triticale. Cruzamentos interespecíficos entre tritordeum e triticale permitem a criação de mixogenomas de cromossomas de centeio e H. chilense ou translocações entre estes genomas. Os genes ribossomais constituem o sistema ideal para estudar a expressão génica a nível citológico, uma vez que é possível visualizar microscopicamente o resultado da sua expressão, tanto em células interfásicas como metafásicas, utilizando a técnica de coloração pelo nitrato de prata. Os genes ribossomais activos formam uma segunda constrição visível em cromossomas metafásicos. A metilação do DNA é uma modificação epigenética crucial do genoma que está envolvida na regulação de muitos processos celulares. Estes incluem o desenvolvimento embrionário, a transcrição, a estrutura da cromatina, a inactivação do cromossoma X, o “imprinting” genómico e a estabilidade cromossómica. Os fenómenos epigenéticos são transmissíveis e representam um estado alternativo da actividade génica que não é explicável por mutação, alterações sequenciais ou regulação normal do desenvolvimento. A metilação faz parte de um sistema tão importante quanto o conjunto de genes de um genoma que as células usam para determinar onde e quando um determinado gene vai ser expresso durante o desenvolvimento. Este sistema é colocado no DNA na forma de marcas epigénicas que são herdadas durante a divisão celular, mas não alteram a sequência de DNA. No presente trabalho efectuaram-se cruzamentos de triticale hexaplóide (cultivar 'Douro') com tritordeum hexaplóide (linhas avançadas HT9, HT31 e HT67) e estudou-se a cruzabilidade. Os cruzamentos sujeitos a tratamento com dicamba e tiossulfato de prata tiveram uma maior produção de sementes híbridas relativamente ao controlo (sem tratamento hormonal) e que esse tratamento conduzia a uma maior taxa de germinação das sementes híbridas. Em ambos os casos (com e sem tratamento hormonal) o cruzamento 'Douro' x HT31 foi o que apresentou uma cruzabilidade triticale x tritordeum mais elevada. Verificou-se também o efeito ano na cruzabilidade. Estudámos a actividade nucleolar dos progenitores triticale (AABBRR) e tritordeum (AABBHchHch) e dos híbridos F1 (AABBRHch ) usando a técnica de coloração pelo nitrato de prata. Os genes ribossomais provenientes dos cromossomas 1B e 6B do trigo estavam presentes em ambos os progenitores e nos híbridos F1, os provenientes da cevada 5Hch e 6Hch estavam activos quer no tritordeum quer nos híbridos triticale x tritordeum e os genes ribossomais do cromossoma 1R proveniente do centeio estava suprimido no triticale e nos híbridos triticale x tritordeum. Em todos o número máximo de NORs corados pelo nitrato de prata nas células em c-metafase correspondia ao número máximo de nucléolos das respectivas células interfásicas. As células incorporam a 5-azacitidina (um análogo da Citosina) no DNA durante a transcrição e no RNA durante a tradução. A incorporação de 5-azacitidina no DNA ou no RNA inibe as metiltransferases causando assim hipometilação nessa sequência, afectando a ligação das proteínas de regulação ao DNA e RNA. Com a incorporação de 5-azacitidina durante a germinação, o NOR do cromossoma 1R foi corado pelo nitrato de prata, o que indica que se encontrava activo na interfase precedente. Esta activação ocorreu quer no triticale quer nos híbridos AABBRHch, sugerindo que a metilação é um processo reversível. Interspecific hybridization allows the creation of lines with agronomic interest and the increase of genetic variability. Triticales are man made allopolyploids brought up to assemble the wheat high productivity and good panification quality and rye rusticity, adaptability (such as poor, acid and sandy soils) and lisine higher contents. Triticale (xTriticosecale Wittmack) is the resulting cross between Triticum L. and Secale L. genera. Tritodeuns (xTritordeum Ascherson et Graebner) are Hordeum chilense and different Triticum spp amphiploids, that can be used to transfer Hordeum chilense genes to wheat or Triticale. Interspecific crosses between tritordeum and triticale allow the criation of rye and H. chilense chromosome mixogenomes or translocations between them. Ribosomal genes are the ideal system to study genic expression at cytological level, because it is possible to see microscopically the result of its expression, as much in interphase as in metaphase cells, using the salt-nylon silver staining technique. Robosomal active genes have a secondary constriction visible in metaphase chromosomes. DNA methylation is a crucial epigenetic modification envolved in the regulation of many cell processes. These include embryo development, transcription, chromatin structure, X-chromosome inactivation, genomic imprinting and chromosomal stability. Epigenetic phenomena are heritable and represent an alternative state of genic activity which is not explicable by mutation, sequencing alteration nor normal development regulation. Methylation is a part of a system as important as the genome's gene set, used by the cells in order to determine where and when a gene is going to be expressed during development. This system is set upon the DNA as epigenetic marcs inherited during cell division, but do not alter DNA sequence. In this work crosses between hexaploid triticale (cultivar 'Douro') and hexaploid tritordeum (advanced lines HT9, HT31 e HT67) were made and crossability was studied. Crosses treated with dicamba and silver tiosulfate had higher seed set than control. In both cases (with and without hormonal treatment) 'Douro' x HT31 crosses registered higher triticale x tritordeum crossability. Year effect was also verified. We studied nuclear activity of triticale (AABBRR), tritordeum (AABBHchHch) and F1 hybrids (AABBRHch) using the silver stainig technique. Ribosomal genes 1B and 6B coming from wheat were present in both progenitors and in F1 hybrids, 5Hch e 6Hch from barley were active in tritordeum and in triticale x tritordeum hybrids and 1R chromosome ribosomal genes were suppressed in triticale and in triticale x tritordeum hybrids. In all cases, the maximum number of Ag-NORs in c-metaphase cells corresponded to maximum number of nucleoli in interphase cells Cells incorporate 5-azacytidine in DNA during transcription and in RNA during translation. The incorporation of 5-azacytidine in DNA or RNA inhibits methyltransferses causing hypomethylation in that sequence, affecting regulation protein bandage to DNA and RNA. With 5-azacytidine incorporation during seed germination, 1R chromosome NOR was stained by silver nitrate, indicating that it was active in the precedent interphase. This activation occurred in triticale and in F1 hybrids AABBRHch, suggesting the reversibility of methylation.

Dissertação de Mestrado em Genética Molecular Comparativa e Tecnológica O grupo Praomys (Rodentia, Muridae) representa um dos mais diversos e abundantes grupos de roedores do Velho Mundo. Este complexo grupo, ao qual pertence a espécie em estudo neste trabalho Praomys tullbergi (PTU), distingue-se por ser um dos mais difíceis de sistematizar. A caracterização molecular e citogenética das espécies é um dos critérios taxonómicos de maior importância. Como a maioria das espécies do grupo Praomys continua desprovida dessa informação, o objectivo desta dissertação foi caracterizar detalhadamente o cariótipo de Praomys tullbergi e a construção de um mapa cromossómico de elevada resolução desta espécie com os genomas modelo Mus musculus (MMU) e Rattus norvegicus (RNO). Desta forma foi possível reconstruir a história evolutiva ao nível da arquitectura do genoma de Praomys tullbergi e determinar as suas relações filogenéticas com as espécies índex MMU e RNO. A análise citogenética do P. tullbergi revelou um cariótipo (2n=34) essencialmente acrocêntrico, sendo o cromossoma X submetacêntrico e o Y acrocêntrico. Na caracterização da composição molecular das sequências deste cariótipo, a aplicação de fluorocromos que coram especificamente regiões AT (DAPI) e GC (CMA3) seguidos de bandeamento-C (CBP) permitiu detectar nos cromossomas quais as regiões heterocromáticas mais ricas em sequências AT e GC. Esta metodologia permitiu estudar a heterocromatina constitutiva (HC) do cariótipo de P. tullbergi e desta forma obter informação mais pormenorizada acerca da natureza da HC. Assim, foi possível encontrar, pelo menos, seis classes de HC nos autossomas: uma centromérica, duas intersticiais (composição GC e AT+GC) e três classes de HC telomérica (GC, AT e AT+GC). O cromossoma X revelou ser composto por três classes de HC: uma pericentromérica e duas intersticiais (composição GC e AT+GC). Paralelamente procedeu-se ao mapeamento físico das sequências teloméricas (TTAGGG)n e sequências LINE-1 em preparações cromossómicas de PTU. Da análise das sequências de DNA telomérico de P. tullbergi, verificou-se, como esperado, que estas se encontravam predominantemente nas extremidades físicas dos cromossomas, mas foram ainda detectados diversos locais teloméricos intersticiais (ITS – “Interstitial telomeric sites”) localizados nas regiões pericentroméricas e intersticiais dos autossomas e ainda intersticialmente no cromossoma X. Considerando que os cromossomas num estado evolutivo mais primitivo contêm sequências teloméricas localizadas apenas nos telómeros (Meyne et al. 1990) e com base nos resultados obtidos, o cariótipo de PTU deverá ser considerado mais rearranjado, uma vez que foram detectados ITSs em vários cromossomas desta espécie. A análise da distribuição e densidade relativa das sequências LINE-1 nos cromossomas de PTU revelou uma distribuição ubíqua destas sequências na maioria dos cromossomas, não se tendo desta forma verificado uma acumulação preferencial das sequências LINE-1 nos cromossomas sexuais em comparação com os autossomas, como proposto por alguns autores. Além da caracterização do cariótipo, a análise comparativa dos genomas de PTU, MMU e RNO por CCP (ou “cross-species chromosome painting”) permitiu a construção dos respectivos mapas comparativos relativamente aos cromossomas de P. tullbergi. Os resultados indicaram o P. tullbergi como o roedor estudado que apresenta o genoma mais rearranjado, com 66 segmentos sinténicos relativamente a MMU e 61 segmentos conservados com o genoma de RNO. Os principais rearranjos encontrados entre PTU e os genomas modelo analisados foram principalmente translocações em tandem e inversões, que terão ocorrido durante a evolução cromossómica de Praomys tullbergi. Foi ainda possível reconstruir os processos evolutivos ocorridos nos cromossomas de Praomys tullbergi desde o genoma ancestral dos Muroidae. Entre os genomas ancestral e PTU contabilizam-se aproximadamente 32 segmentos sinténicos nos autossomas originados por, pelo menos 23 rearranjos cromossómicos, sendo estes principalmente translocações em tandem, algumas fissões, uma inversão e transposição do centrómero. É de salientar que a elevada resolução do mapa comparativo de PTU foi possível porque se utilizaram dois genomas modelo em simultâneo, MMU e RNO, cujas sintenias cromossómicas estão confirmadas com elevada resolução a partir das bases de dados resultantes dos projectos de genoma. De referir ainda que este trabalho é o primeiro estudo comparativo realizado por “painting” cromossómico numa espécie do género Praomys. Praomys group (Rodentia, Muridae) represents one of the most diverse and abundant rodent groups of the Old World. This complex group, that comprises (in which belongs) the species in focus in this work, Praomys tullbergi (PTU), is known for being one of the most difficult rodents group to systematize. Molecular and Cytogenetic characterization of species are crucial taxonomic criteria. As the majority of Praomys group still lacks these information, one of the goals of this work was exactly the thorough characterization of Praomys tullbergi karyotype, as well as the construction of a physical high resolution comparative map of this species using the model genomes Mus musculus (MMU) e Rattus norvegicus (RNO). This strategy allowed the recreation of the evolutionary history of P. tullbergi genome architecture and the determination of its phylogenetic proximity with the índex species MMU e RNO. Cytogenetic analysis of P. tullbergi revealed a karyotype (2n=34) essentially acrocentric, being the X chromosome a submetacentric and the Y an acrocentric. In the molecular composition characterization of this karyotype, the use of fluorochromes specific for DNA regions rich in AT (DAPI) or GC (CMA3) base pairs, followed by C-banding (CBP) permitted to detect which heterochromatic regions in the chromosomes are richer in AT or GC DNA sequences. This methodology allowed characterizing the constitutive heterochromatin (CH) fraction of PTU karyotype, and in this way, to achieve detailed information about the CH nature. It was thus possible to discriminate, at least, six CH classes in the autosomes: one centromeric, two interstitial (GC and AT+GC composition) and three telomeric CH classes (GC, AT and AT+GC). The sex chromosome X revealed to be composed by three CH classes: one pericentromeric and two interstitial (GC AT+GC). Simultaneously and in a parallel platform, the physical mapping of (TTAGGG)n telomeric and LINE-1 sequences was performed in PTU chromosome preparations. Analysis of telomeric sequences revealed, as expected, the predominantly location at the chromosome’s ends, however and interestingly, several interstitial telomeric sites (ITS) were also detected at the pericentromeric and interstitial regions of the some autosomes and interstitially in the X chromosome. Based on the assumption that chromosome primitive forms contain telomeric sequences strictly located at the telomeric regions (chromosome ends) (Meyne et al. 1990) and by the results obtained along this work, P. tullbergi genome should be considered highly rearranged, since ITSs were detected in several chromosomes. The analysis of the distribution and relative density of LINE-1 sequences in PTU chromosomes revealed an ubiquitous distribution throughout the majority of this species chromosomes, in opposition to what havebeen found by several other authors, that verified a preferential accumulation of these sequences in the sex chromosomes (in comparison with he autosomal complement). Besides karyotype description and characterization, the comparative genomics performed between PTU and the two índex genomes Mus musculus (MMU) and Rattus norvegicus (RNO) by “Comparative Chromosome Painting” (CCP or “Cross-species Chromosome Painting”) allowed the construction of high resolution physical comparative maps. Results indicate P. tullbergi as the highly rearranged rodent studied so far, presenting 66 syntenyc segments with MMU and 61 syntenyc segments with RNO genome. The main rearrangements detected between PTU and these two genomes are tandem translocations and inversions, probably occurred during evolutionary chromosome reshaping of Praomys tullbergi. Moreover, it was possible to recreate the evolutionary processes that sculpted the chromosomes of this species since the ancestral Muroidea karyotype form. Between this putative ancestral genome and the one of PTU, its possible to account for 32 syntenic segments in the autosomes, generated by, at least, 23 chromosomal rearrangements, mainly tandem translocations, a few fissions, one inversion and centromere transposition. The high resolution of PTU physical comparative map was only possible by the simultaneous use of the two model genomes, MMU e RNO, whose chromosomal syntenies were precisely validated using the genome projects resulting databases. Finally is important to refer that this was the first comparative study by chromosome “painting” of a Praomys genus species genome.