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Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Pós-Graduação em Biologia Microbiana, 2021. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). O interesse na utilização de Bacillus thuringiensis (Bt) como biopesticida, ao invés de produtos químicos, e seu espectro de toxicidade restrito ao alvo contribuíram para o estabelecimento de diversas coleções de estirpes de Bt ao redor do mundo. Bacillus thuringiensis é uma bactéria gram-positiva aeróbica, que pode ser isolada de diversos locais tais como água, solo, teias de aranha e insetos mortos, sendo a bactéria entomopatogênica mais utilizada como biopesticida mundialmente. O uso em grande escala se deve aos cristais proteicos citoplasmáticos formados durante a esporulação, denominados δ-endotoxinas (Cry e Cyt), além de proteínas secretadas durante a fase vegetativa (Vip e Sip). Para a caracterização de novos isolados de Bt vários métodos são utilizados, incluindo métodos moleculares como a reacao em cadeia da polimerase em tempo real quantitativa (qPCR). A qPCR é capaz de monitorar a reação enquanto ela progride (em tempo real) e os dados são coletados ao longo da PCR. Tendo em vista a importância da caracterização das estirpes de Bt para o desenvolvimento de novos bioinseticidas ou eventos transgênicos, para prospecção de novos genes cry, cyt, vip e sip com potencial entomocida, para identificação de novos genes nas estirpes de Bt e auxilio no entendimento da distribuição e diversidade das estirpes e genes de Bt, esse trabalho teve como objetivo criar um sistema de identificação de genes baseado em reações de qPCR com base nos genes cry1, cry2, cry3, cry4, cry5, cry6, cry7, cry8, cry9, cry10, vip1, vip2, vip3, cyt1, cyt2 e sip para caracterização de 257 estirpes de Bacillus spp. da Coleção de Bactérias de Invertebrados da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, analisando o grau de correlação entre a distribuição dessas estirpes com a origem do substrato de onde a estirpe foi isolada e entre a sua distribuição e condições geoclimáticas. Foi possível observar que os genes cry1, cry2 e vip3a/b ocorrem de maneira homogênea no território brasileiro e alguns genes são encontrados em regiões especificas. O maior reservatório de variabilidade está dentro das estirpes de Bt em cada região, e sugere-se que tanto as condições geoclimáticas, quanto os cultivos regionais, interferem na diversidade genética que as estirpes de Bt apresentam, e que estirpes de Bt podem trocar constantemente informações genética. The interest in the use of Bt as a biopesticide, instead of chemicals, and its toxicity spectrum restricted to the target contributed to the establishment of several collections of Bt strains around the world. Bacillus thuringiensis (Bt) is a gram-positive aerobic bacterium, which can be isolated from several places, such as water, soil, spider webs and dead insects, being the most used entomopathogenic bacterium as a biopesticide worldwide. The large-scale use is due to the cytoplasmic protein crystals formed during sporulation called δ-endotoxins (Cry and Cyt), in addition to proteins secreted during the vegetative phase (Vip and Sip). For the characterization of new Bt isolates several methods are used including molecular methods such as the quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR). qPCR is able to monitor the reaction as it progresses and data is collected over the course of the PCR. Owing the importance of the characterization of Bt strains to the development of new bioinsecticides or transgenic events, for the prospection of new cry, cyt, vip and sip genes with potential entomocide, for the identification of new genes in the Bt strains and aid in understanding distribution and diversity of Bt strains and genes, this work aimed to create a gene identification system based on qPCR reactions based on the genes cry1, cry2, cry3, cry4, cry5, cry6, cry7, cry8, cry9, cry10, cry11a, vip1, vip2, vip3, cyt1, cyt2 and sip for characterization of 257 strains of Bacillus spp. of the Ivertebrate Bacteria Collection of Embrapa Genetic Resources and Biotechnology, analyzing the degree of correlation between the distribution of these strains and the origin of the substrate from which the strain was isolated and between its distribution and geoclimatic conditions. It was possible to observe that the genes cry1, cry2 and vip3a/b occur homogeneously in the Brazilian territory and some genes are found in specific regions. The biggest reservoir of variability is within the Bt strains in each region, and it is suggested that both geoclimatic conditions and regional crops interfere with the genetic diversity that the Bt strains present, and that Bt strains can constantly exchange genetics information.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Biologia, Pós-Graduação em Biologia Microbiana, 2018. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). Em 1990, Woese e colaboradores classificaram os seres vivos em três domínios distintos: Bacteria, Archaea e Eukarya. Inicialmente, as archaeas foram relacionadas apenas a ambientes extremos como fontes termais, ambientes salinos, ácidos e anaeróbios. Posteriormente, com avanço das técnicas moleculares, foram detectadas archaeas em diversos ambientes não extremos como solos, sedimentos e ambientes aquáticos, revelando a ubiquidade desse domínio. No entanto, o cultivo laboratorial de archaeas não extremas ainda é pouco expressivo e muitos aspectos de sua biologia permanecem desconhecidos. Trabalhos prévios de nosso grupo resultaram na obtenção de culturas mistas de archaeas e bactérias, a partir de amostras de um aquário residencial de água doce. Diferentes tipos coloniais foram obtidos e, no presente trabalho, a cultura denominada Kappa C foi caracterizada. A manutenção dessa cultura foi realizada em meios confeccionados empregando-se a água do aquário acrescida de antibióticos e antifúngicos, com o objetivo de tornar o meio seletivo para archaeas. Paralelamente, foi adicionado cloreto de amônio em alguns meios de cultura, visando o enriquecimento de archaeas oxidantes amônia (AOA). Os microrganismos presentes no tipo colonial Kappa C foram caracterizados quanto à morfologia celular por diferentes técnicas de microscopia, revelando pequenas células cocóides e bacilos. As células presentes no cultivo foram submetidas à extração de DNA total para a realização de ensaios de PCR com os iniciadores específicos para o gene codificador de rRNA 16S de Archaea, Bacteria, assim como para o gene amoA de Archaea. Os resultados revelaram a presença de diversas sequências classificadas como archaeas metanogênicas, do filo Euryarchaeota. Foram também obtidas sequências classificadas como pertencentes aos grupos I.1b de Thaumarchaeota, capazes de oxidar amônia, e grupo I.1c, que ainda não possui representantes cultivados. Também foram identificadas sequências classificadas nos filos Bathyarchaeota e Parvarchaeota, que também não apresentam representantes cultivados até o momento. Apesar do uso de antibióticos de amplo espectro, as análises revelaram a presença de sequências de bactérias do gênero Pandoraea. Dessa forma foi revelado que o tipo colonial Kappa C consiste em uma co-cultura de diferentes archaeas e, pelo menos um gênero de bactéria. In 1990, Woese and contributors classified the organisms in three distinct domains: Bacteria, Archaea and Eukarya. Initially, archaeas were associated to extreme environments, like hot springs, saline, acid and anaerobic sites. With the advances in molecular approaches, archaeas were detected in several environments like soils, sediments, aquatic environments, revealing the ubiquity of this domain. On the other hand, the cultivation of non-extreme archaeas is still incipient and many aspects of their biology remain unknown. Previous works of our group resulted in the cultivation of mixed cultures of bacteria and archaea from a freshwater residencial aquarium samples. Diferent colonial types were described, and in the present work the colonial type named Kappa C was further characterized. This culture was inoculated in culture media composed of the water of the aquarium added with antibiotics and antifungal agents in order to make the medium selective for archaeas. Some culture media were also added with ammonium chloride in order to enrich for ammonia oxidizing archaeas (AOAs). The morphology of Kappa C colonial type cells were characterized by different techniques of microscopy, revealing small coccoid and rod shaped cells. The cells present in the culture were submitted to total DNA extraction and PCR essays using specific primers directed to the rRNA 16S gene of Archaea and Bacteria, as well as the archaeal amoA gene. The results, revealed the presence of sequences of methanogenic archaeas, of the Euryarchaeota phylum. Sequences classified as belonging to groups I.1b of Thaumarchaeota were obtained, which are ammonia oxidizers, and I.1c group, which do not yet has cultured representatives. Sequences from the phyla Bathyarchaeota and Parvarchaeota were also identified, which also do not present cultivated representatives until now. Despite the use of broad spectra antibiotics, our analyses revealed the presence of bacterial sequences of the Pandoraea genus, revealing that the Kappa C colonial type consists of a co-culture of different archaeas and at least one genus of bacteria.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2018. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). A presença de uma camada proteica de superfície (camada S) é comum em organismos procarióticos. As proteínas que compõem essa camada apresentam a propriedade de se auto-organizar em arranjos simétricos estáveis, que as confere um alto potencial biotecnológico. Apesar de presente em quase todas as archaeas, existem poucos relatos do uso de proteínas de camada S desses organismos em estudos aplicados. Além disso, os estudos descrevendo a estrutura de proteínas desse tipo são escassos. Assim, esse trabalho tem o objetivo de caracterizar estruturalmente as proteínas de camada S da archaea halófila Haloferax volcanii, utilizá-las para a construção de envelopes celulares biomiméticos para o estudo de membranas e a expressão dessa proteína em E. coli para construção de fusões gênicas de interesse. As proteínas foram obtidas a partir da cultura de células de H. volcanii e caracterizadas por ensaios de espalhamento de luz dinâmico, dicroísmo circular e espectroscopia de fluorescência. Microscopia eletrônica de transmissão foi utilizada para observar a formação do arranjo cristalino das proteínas purificadas, bem como de envelopes celulares de H. volcanii. Foram produzidas monocamadas lipídicas por Langmuir-Blodgett utilizando os lipídios DPPE, DPPC e DPhPE. A estrutura secundária da proteína é afetada pelo pH, de maneira que uma maior quantidade de folhas beta foi detectada em valores mais altos. Esse mesmo fator influencia também a sua estrutura terciária, de maneira que em valores mais alcalinos as regiões próximas aos resíduos de triptofano da proteína interagem mais com o meio. No entanto, ensaios de espalhamento de luz dinâmico indicaram formação de oligômeros em todos os pHs testados, havendo picos monodispersos, indicando a capacidade de cristalização da proteína em todas as condições. No entanto, imagens de microscopia revelam que os arranjos formados nessas condições não estão de acordo com o normalmente observado na superfície celular desse organismo, algo que foi somente possível em condições de alta salinidade. A concentração de íons de sódio, magnésio e cálcio no meio afeta a estrutura secundária e terciária da proteína, influenciando assim a sua propriedade de auto-arranjo. Nos ensaios de Langmuir-Blodgett, foi observada a cristalização das proteínas sobre as diferentes superfícies lipídicas, sugerindo assim um possível potencial no uso dessas proteínas para produção de envelopes celulares artificiais. Foi também possível a expressão de proteínas de camada S de H. volcanii em E. coli. The presence of a protein surface layer, known as the S-layer, is commonly found in prokaryotic cell envelopes. This layer is composed of proteins that self-assemble into a paracrystalline surface structure, a property that has been extensively used in biotechnological research. Despite its detection in almost all archaea described to date, there are very few reports in the literature using these proteins for applied purposes. Furthermore, studies describing structural aspects of these proteins are scarce. Thus, the objective of the present study was to investigate the structural properties of the Haloferax volcanii S-layer protein, use them for production of biomimetic S-layer supported lipid platforms and heterologous expression of S-layer fusion proteins in E. coli. The S-layer proteins were purified directly from H. volcanii cells and their structural properties were evaluated through dynamic light scattering, circular dichroism and fluorescence spectroscopy. Transmission electron microscopy was used for analyses of the protein’s self-assembly properties as well as H. volcanii cell envelope preparations. Lipid monolayers using DPPE, DPPC and DPhPE were produced through Langmuir-Blodgett. The protein’s secondary structure is affected by pH values in the medium, with higher beta sheet detection in more alkaline values. This factor also affects the protein’s tertiary structure, with higher tryptophan exposure to the environment in higher pH. Dynamic light scattering essays revealed oligomer formation in all pH values evaluated, indicating that the protein’s self-assembly process occurs in these conditions. However, micrograph images showed that these oligomers do not resemble the lattice found on the H. volcanii cell surface, and correct lattice formation was only achieved in higher salt concentrations. The concentrations of sodium, magnesium and calcium ions in the environment affect the protein’s secondary and tertiary structures, which influences the protein’s functional properties. On the Langmuir-Blodgett essays, an increase of surface pressure was detected on all lipid monolayers tested, indicating a potential use of the H. volcanii S-layer proteins in artificial lipid platform production. It was also possible to isolate the protein’s encoding gene and heterologous protein expression was successful in E. coli cells.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2015. Há quase 25 anos foi proposto que os procariotos poderiam ser divididos em dois domínios distintos: Bacteria e Archaea. As archaeas foram inicialmente associadas apenas a ambientes extremos, mas com o aumento do uso de abordagens moleculares, membros deste domínio passaram a ser detectados em diversos habitats do nosso planeta, evidenciando sua ubiquidade. Além disso, posteriormente foram identificadas archaeas com metabolismos de importância ecológica que antes acreditavam-se estar restritos a bactérias, como a oxidação de amônia. Apesar dos avanços trazidos pelas técnicas moleculares, a obtenção de cultivos laboratoriais ainda é imprescindível para a compreensão de vários aspectos da biologia dos microrganismos. No Brasil, ainda são escassos os estudos sobre Archaea nos diferentes ambientes naturais. O Cerrado é um extenso e importante bioma de nosso país, mas pouco se sabe sobre a comunidade de archaeas nos solos de suas diferentes fitofisionomias. Além disso, queimadas são eventos ecológicos importantes no Cerrado e não existem estudos sobre o seu efeito na população de archaeas de solos deste ambiente. Assim, este trabalho teve como objetivo avaliar e comparar a comunidade de Archaea em solos de Cerrado sensu stricto que não sofrem queimadas há anos e solos de áreas queimadas bienalmente, além da detecção de archaeas com potencial para oxidação de amônia nestes solos. Outro objetivo do trabalho foi a obtenção de culturas de archaeas provenientes do solo deste bioma. Amostras de solo coletadas em triplicata foram submetidas à extração de DNA total, que foi utilizado em ensaios de PCR com os iniciadores específicos para os genes rRNA 16S e amoA de Archaea. Os resultados obtidos revelaram que a grande maioria das sequências obtidas pertence aos grupos I.1b e I.1c do filo Thaumarcheota. No entanto, apesar das semelhanças encontradas nas análises realizadas, as amostras de solo da área protegida do fogo apresentaram maior abundância de thaumarchaeotas do grupo I.1c, enquanto o solo da área queimada apresentou mais sequências do grupo I.1b. Análises do gene amoA, amplificado em todas as amostras, indicaram archaeas com o potencial para a oxidação de amônia possivelmente não descritas anteriormente ocorrendo nos solos de Cerrado. Para o estabelecimento do cultivo de archaeas do solo de Cerrado, meios de cultura foram confeccionados a partir de um coado de solo e suplementados com agentes antimicrobianos. Após vários repiques, o DNA das colônias observadas foi extraído e amplificado com iniciadores para os domínios Archaea e Bacteria. A análise das sequências obtidas indicou uma cocultura entre uma bactéria do gênero Novosphingobium e uma archaea do grupo I.1c de Thaumarchaeota, que ainda não apresenta qualquer representante cultivado descrito na literatura. It has been almost 25 years since the proposal that divided prokaryotes in two different domains: Bacteria and Archaea. The archaea were initially associated exclusively with extreme environments, but the increasing utilization of molecular approaches revealed that members of this domain were ubiquitous and could be detected in different environments on Earth. Furthermore, metabolisms of ecologic importance that were thought to be restricted to bacteria were later detected in archaea, such as the ability to oxidize ammonia. This fact highlights that, despite the advances brought by molecular approaches, cultivation of microorganisms in laboratory is still essential for understanding many aspects of their biology. Currently, there are very few studies about Archaea in the natural environments of Brazil. The Brazilian savanna, known as Cerrado, is an extensive and important biome of our country, but little is known about the Archaea community in soils of its different phytophysiognomies. Furthermore, fires are important ecological events in Cerrado and there are no studies about its effects on the Archaea populations in soils. Therefore, this study aimed to evaluate and compare the archaea community of Cerrado sensu stricto soils of an area that has long been protected from fire and another that has been submitted to biennial prescribed fires. It also aimed to detect archaea with the potential for ammonia oxidation in these soils. Another objective of this study was the establishment of archaea from Cerrado soils in culture. Soil samples were submitted to DNA extraction, which was used for PCR essays with specific primers for Archaea rRNA 16s and amoA genes. Results showed that most of the sequences obtained were from I.1b e I.1c groups of Thaumarchaeota. Despite the similarities found in the analysis, samples from the protected site showed higher abundance of I.1c thaumarchaeotes, while in samples from the frequently burned site more sequences from group I.1b were detected. Analysis of the amoA gene, which was amplified from all samples, showed that there are possibly previously undescribed archaea with ammonia oxidation potential in Cerrado soils. For the establishment of archaea cultures, culture media were made from soil filtrates and supplemented with antimicrobial agents. After several transfers, DNA extracted from the obtained colonies was used for PCR essays with specific primers for Archaea and Bacteria domains. The sequences obtained revealed a coculture between a bacteria of Novosphingobium genus and an archaea from group I.1c of Thaumarchaeota, a group that so far does not have any cultured representative described in the literature.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Biologia, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2013. O domínio Archaea possui características em comum com os domínios Bacteria e Eukarya, e ao mesmo tempo apresenta características próprias. Até o momento, são raros os estudos sobre a filogenia e diversidade de archaeas de ambientes naturais do Brasil e, por esta razão, este trabalho tem como objetivo avaliar a diversidade de Archaea em sedimentos de lagoas do cerrado em diferentes estações, por meio da caracterização de genes de rRNA 16S. Amostras de sedimentos lacustres, coletadas em diferentes lagoas do Parque Nacional das Sempre Vivas, foram submetidas à extração de DNA total e o DNA foi utilizado em experimentos de PCR empregando os pares de iniciadores 340f/1000r ou 21f/958r, específicos para o domínio Archaea. Os fragmentos amplificados foram clonados em um vetor plasmidial e transformados em E. coli. O DNA plasmidial de clones recombinantes foi extraído, quantificado e submetido ao sequenciamento automático. Em uma das amostras, proveniente da Lagoa Rio Preto Alto (LRPA), observamos um grande predomínio de membros do filo Euryarchaeota, especialmente metanogênicos. Nos demais sedimentos, coletados na bacia Baixo Inhancica (RIB4 e RIB5) foi observado um predomínio de sequências do filo Thaumarchaeota sobre os filos Euryarchaeota e Crenarchaeota na estação seca, mas ainda foi possível observar sequências do filo Euryarchaeota. Na estação de transição seca/chuvosa, não foram encontradas sequências do filo Euryarchaeota e houve quase exclusivamente sequências do filo Thaumarchaeota. As estimativas de alfa-diversidade mostraram uma maior riqueza da comunidade de Archaea nos sedimentos coletados na estação seca e as curvas de rarefação indicaram que a amostragem dos ambientes foi adequada. As amostras de estações diferentes apresentaram diferenças significativas pelas técnicas de beta-diversidade ∫-Libshuff e gráfico de Análise de Componentes Principais (PCA). _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT The Archaea domain has characteristics in common with the Bacteria and Eukarya domains, while presenting unique traits. Currently there are few studies on the phylogeny and diversity of Archaea in Brazilian environments; therefore, this study’s objective is to estimate the diversity of Archaea communities in lake sediments of the Brazilian Savannah, Cerrado, in different seasons by rRNA 16S analysis. Lake sediment samples, obtained from different lakes in the park “Parque Nacional das Sempre Vivas”, were submitted to DNA extraction, which was used in PCR assays using archaea-specific primers 340f/1000r or 21f/958r. The amplified fragments were cloned into E. coli. Plasmid DNA was extracted, quantified and submitted to standard sequencing procedures. In one of the samples, collected in the lake “Lagoa Rio Preto Alto” (LRPA), we were able to observe a high number of sequences affiliated to Euryarchaeota, especially methanogens. In the sediments collected in the Baixo Inhancica bay (RIB4 and RIB5), in the dry season members of the Thaumarchaeota phylum predominated over the other phyla. It was still possible to detect members of the Euryarchaeota phylum though. In the sediments collected in the transition period between the dry and rainy seasons we were not able to detect sequences affiliated to Euryarchaeota and there were almost exclusively sequences of the Thaumarchaeota phylum. The α-diversity estimates showed that the communities of Archaea in sediments collected in the dry season had higher richness and the non-parametric estimates showed that both the environments have been well sampled. There is a significant difference between the sediment samples collected in different seasons, shown by the statistical test ∫-Libshuff and by the Principal Component Analysis graphic (PCA).

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Biologia, Departamento de Biologia Celular, Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2012. O Domínio Archaea vem sendo descrito principalmente através de técnicas moleculares, independentes de cultivo e, atualmente, é dividido em dois filos formalmente aceitos, Crenarchaeota e Euryarchaeota, além de quatro outros propostos – Korarchaeota, Nanoarchaeota, Thaumarchaeota e Aigarchaeota. Uma vez que sequências do gene de rRNA 16S de Archaea foram descritas a partir de amostras de diferentes ambientes, as archaeas passaram a ser consideradas organismos ubíquos na natureza. Este trabalho tem como objetivo caracterizar a riqueza de archaeas em amostras de solo de Cerrado - a principal vegetação do Brasil Central, sendo a segunda maior do país. O DNA metagenômico de amostras em duplicata de solos provenientes de duas fitofisionomias distintas, cerrado denso e mata de galeria, foi extraído empregando-se o PowerSoil DNA Isolation Kit (MOBio Laboratories Inc.). A construção de bibliotecas genômicas foi feita a partir de experimentos de PCR, com iniciadores Archaea-específicos, visando amplificar regiões do gene de rRNA16S a partir do DNA extraído das diferentes amostras. Os resultados obtidos a partir dos fragmentos sequenciados revelaram identidade com o domínio Archaea em 96% das sequências, todas pertencentes ao filo Crenarchaeota (possivelmente Thaumarchaeota), principalmente aos grupos I.1b e I.1c. Somente nas amostras de Mata de Galeria foram encontradas sequências do grupo I.1a. A riqueza de Archaea foi maior em cerrado denso do que em mata de galeria. Os cálculos não-paramétricos tais como as curvas de rarefação indicam que a amostragem do ambiente foi adequada. As amostras das duas fitofisionomias apresentam diferenças significativas pelas técnicas estatísticas de β-diversidade ∫-Libshuff e pelo gráfico de Análise de Principais Coordenadas (PCA). ______________________________________________________________________________ ABSTRACT The domain Archaea has been described mostly by culture-independent methods. Currently it is divided into two well accepted phyla, namely the Euryarchaeota and Crenarchaeota, and an additional four proposed phyla: Korarchaeota, Nanoarchaeota, Thaumarchaeota and Aigarchaeota. Since their 16S rDNA sequences have been described from diverse ecosystems not classified as extreme, Archaea is now considered ubiquitous and not a domain of only extreme organisms. This work describes the richness of the Archaea domain retrieved from soil samples of the Cerrado biome – the main vegetation of Central Brazil and second largest biome in the country. The metagenomic DNA from two replicas of each two distinct phytophysiognomies, cerrado denso and mata de galeria, was extracted using the PowerSoil DNA Isolation Kit (MOBio Laboratories Inc.). The four DNA libraries were constructed through PCR amplification of the 16S rDNA using Archaea-specific primers. Our results reveal that 96% of the sequenced fragments have identity with the domain Archaea. All of these sequences are from the phylum Crenarchaeota (possibly Thaumarchaeota), predominantly affiliated to group I.1b and I.1c. Sequences afilliated to the group I.1a were only found on the soil from mata de galeria. The soils from cerrado denso have a greater richness of Archaea than those from mata de galeria. The non-parametric estimatives showed that both the environments have been well sampled. There is a significant difference between the soil samples of the two phytophysiognomies shown by the statistical test of ∫-Libshuff and by the Principal Coordenates Analysis graphic (PCA).

Dissertação (mestrado)-Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2010. Embora as Escherichia coli de adesão difusa (DAEC) sejam classificadas como um dos seis grupos de E. coli diarreiogênicas, sua patogenicidade ainda é controversa. Diversas linhagens de bactérias intestinais, incluindo Escherichia coli, Yersinia enterocolitica, Shigella flexneri e Salmonella enterica, possuem em seu genoma uma ilha de patogenicidade (PAI) contendo genes que codificam um Sistema de Secreção do Tipo III (TTSS), responsável pela transferência de proteínas efetoras do citoplasma da bactéria diretamente para o citoplasma da célula hospedeira. A presença de genes TTSS é, portanto, um forte indicativo de virulência. Tendo em vista tais informações, este trabalho teve como objetivos a identificação e caracterização de potenciais genes TTSS de isolados de DAEC recuperados de crianças diarréicas. Experimentos de PCR utilizando iniciadores direcionados aos genes TTSS escD, espA, espD, espB e escF resultaram na detecção de sete prováveis genes em três isolados de DAEC. Dentre as sequências obtidas, detectou-se a presença dos genes espA, espB e escF completos em dois desses isolados de DAEC. Análises de identidade desses genes em relação aos homólogos de diversas linhagens de enteropatógenos sugerem que os isolados de DAEC são bastante heterogêneos. Além disso, as identidades dos genes TTSS de DAEC em relação aos homólogos de diferentes linhagens de E. coli enteropatogênicas e enterohemorrágicas são bastante elevadas, podendo atingir 100%. A construção de árvores filogenéticas empregando as sequências desses genes confirmou tais resultados e demonstrou que os isolados C39 e C74 são evolutivamente mais próximos entre si que em relação à DAEC C40, agrupada no mesmo clado da EPEC prototípica E2348/69. Ensaios de transcrição reversa utilizando RNA dos isolados C39 e C74 revelaram ainda que alguns dos possíveis genes consistem em genes de fato, uma vez que são transcritos sob indução. Com a finalidade de verificar a expressão dos genes TTSS de DAEC foram também realizados experimentos de microscopia eletrônica e de microscopia de força atômica, porém, as imagens obtidas por meio dessas técnicas foram inconclusivas. Conjuntamente, os resultados apresentados neste trabalho sugerem fortemente a presença de uma PAI contendo genes TTSS em DAEC, e constituem evidências a favor da patogenicidade desse grupo de E. coli. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT Although diffusely adhering Escherichia coli (DAEC) are classified as one of the six pathotypes of diarrheiogenic E. coli, their pathogenicity is still controversial. Several strains of bacteria, including Escherichia coli, Yersinia enterocolitica, Shigella flexneri and Salmonella enterica, possess a pathogenicity island (PAI), containing genes that code for a Type III Secretion System (TTSS), dedicated to inject effector proteins directly from the bacterial cytoplasm into the host cell cytoplasm. Therefore, the presence of TTSS genes is considered a strong evidence of virulence of a given microorganism. This work describes the identification and characterization of potential TTSS genes in DAEC isolates recovered from diarrheic children. PCR experiments using primers targeted to the TTSS genes escD, espA, espD, espB and escF resulted in the detection of seven putative genes in three isolates of DAEC. Among the sequences obtained, it was possible to detect the presence of the complete espA, espB and escF genes in two of the DAEC isolates. Identity analyses of these genes with different strains suggest that DAEC isolates are quite heterogeneous. Moreover, the identities of TTSS genes of DAEC compared to enteropathogenic and enterohaemorrhagic E. coli are very high, sometimes reaching 100%. The construction of phylogenetic trees using the sequences of these genes confirmed these findings and showed that the isolates C39 and C74 are evolutionarily closer to each other than to the C40 DAEC isolate, which was grouped in the same clade of the prototypical EPEC E2348/69. Tests using reverse transcription of RNA isolated from C39 and C74 also revealed that some of the putative genes consist of true genes, since they were transcribed under induction conditions. In order to analyze the expression of TTSS genes in DAEC, electron microscopy and atomic force microscopy experiments were also carried out, however, the images obtained by these techniques were inconclusive. Together, the results obtained in this work strongly suggest the presence of a PAI containing TTSS genes in DAEC, and constitute evidence for the pathogenicity of this group of E. coli.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2009. As Escherichia coli de adesão difusa (DAEC) correspondem a um grupo heterogêneo e pouco caracterizado quando comparado aos demais patotipos de E. coli. O fato de algumas linhagens descritas serem patogênicas e outras não geram dúvidas sobre a classificação precisa deste grupo. Contribui para isso, o fato de ainda não existir qualquer marcador molecular específico para genes de virulência de DAEC. Alguns patógenos da mucosa intestinal fazem uso do Sistema de Secreção Tipo Três (TTSS) para a injeção de proteínas efetoras em células alvo. Neste trabalho, utilizando linhagens de DAEC isoladas de crianças diarréicas do DF, realizamos experimentos de PCR com iniciadores definidos a partir de genes do TTSS da linhagem E23468/69 de EPEC. Assim, foram sintetizados iniciadores dirigidos às seqüências rorf1, cesAB, escR, escT e sepQ. Análises de similaridade revelaram escores de até 100% entre alguns dos produtos obtidos e linhagens de EPEC, EHEC, STEC. Foi possível identificar o fragmento de DNA referente ao provável gene escR completo, bem como de seqüências de DNA extremamente conservadas da rorf1, cesAB, escT e sepQ. Os produtos das amplificações correspondentes aos prováveis genes do TTSS foram clonados, para a criação de um banco de seqüências, visando futuras análises. Devido ao êxito na detecção de alguns prováveis genes do TTSS em nossas amostras e, uma vez que a expressão de genes do TTSS ainda não foi relatada em DAEC, experimentos visando analisar a expressão desses prováveis genes foram realizados por meio de RT-PCR, empregando RNA isolado de linhagens de DAEC em culturas submetidas a condições de indução dos genes do TTSS. Tal abordagem nos permitiu demonstrar que houve transcrição dos prováveis genes escN, escR e escT, apesar dos resultados divergirem um pouco em relação às amostras e genes testados. Nossas análises indicaram claramente a presença e a expressão dos prováveis genes do TTSS em duas das amostras de DAEC analisadas. Estudos complementares deverão ser realizados a fim de avaliarmos a funcionalidade deste sistema de secreção e os resultados obtidos certamente contribuirão na elucidação dos mecanismos de virulência deste ainda controverso patotipo. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT The diffusely adhering Escherichia coli (DAEC) is a heterogeneous group and less characterized when compared to other pathotypes of E. coli. The fact that some strains are pathogenic and others not, creates doubts about the exact classification of this group. Contributes to it, the lack of molecular markers corresponding to the virulence genes of DAEC. Some intestinal pathogens use the Type Three Secretion System (TTSS) to inject effector proteins into target cells. In this study, using strains of DAEC originated from diarrheic children of DF, we performed PCR experiments employing primers based on genes of the TTSS of EPEC strain E23468/69, directed to the sequences rorf1, cesAB, escR, escT and sepQ. DNA analyses revealed similarity scores of 100% between some of the products and EPEC, EHEC and STEC strains. It was possible to detect the presence of a DNA fragment corresponding to the complete escR gene, as well as highly conserved DNA sequences homologous to rorf1, cesAB, escT, and sepQ. The amplification products corresponding to the probable TTSS genes were cloned in order to create a database of sequences, to be submitted to further analyses. The success obtained in detecting probable TTSS genes in our samples and, since the expression of genes of the TTSS has not yet been reported in DAEC, experiments were performed in order to examine the expression of these candidate genes by means of RNA extraction and reverse transcription procedures of cultures grown under TTSS genes induction conditions. This approach allowed us to conclude that the escN, escR and escT genes were transcribed, although the results differ somewhat among the samples and genes tested. Our analyses clearly showed the presence and expression of TTSS genes in two samples of DAEC. Additional studies should be conducted to assess the functionality of this secretion system, and the results certainly help in elucidating the mechanisms of virulence of this still controversial pathotype.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2008. Staphylococcus aureus é um patógeno associado a altas taxas de mortalidade e morbidade, capaz de produzir infecções em diversos tecidos do corpo humano. Sua capacidade em adquirir resistência à antibióticos e de sobreviver em diferentes condições ambientais o torna um perigoso agente infeccioso no ambiente hospitalar. O objetivo deste estudo foi realizar um levantamento da ocorrência de indivíduos portadores assintomáticos de S. aureus suscetíveis (MSSA) ou resistente a meticilina (MRSA) no âmbito do Hospital Universitário de Brasília (HUB) e na comunidade e, o desenvolvimento de procedimentos moleculares para identificação de MSSA e de MRSA. No total foram coletadas 327 amostras nasais e sub-ungueais de profissionais e alunos vinculados ao HUB. Essas amostras foram divididas em três grupos: Alunos (medicina, enfermagem e odontologia), Equipe Médica (enfermeiros, auxiliares e técnicos de enfermagem e médicos) e Técnicos (funcionários que não possuem contato com pacientes). Também foram coletadas 48 amostras de pacientes previamente identificadas como MRSA pelo HUB e 136 amostras de indivíduos sem contato com o ambiente hospitalar (comunidade). Todas as amostras foram submetidas a crescimento em meios de cultura seletivos e diferenciais e testadas quanto a produção de coagulase para a identificação de S. aureus. Os isolados foram então submetidos ao teste de susceptibilidade à oxacilina e vancomicina. Os isolados de comunidade e de pacientes foram submetidos a ensaios de PCR para confirmação dos resultados bioquímicos através de iniciadores específicos para os genes que codificam proteína A, coagulase e nuclease termoestável, específicos de S. aureus, e mecA, presente em MRSA. A porcentagem de portadores de S. aureus encontrada na comunidade foi de 17,64%, e nos grupos relacionados ao ambiente hospitalar de 56,02%, sendo que: Alunos 69,64%; Equipe Médica 47,54% e Técnicos 51,02%. A diferença de portadores de cada grupo e o grupo comunidade foi significativa (P 0,001), o que indica que indivíduos sem contato com o ambiente hospitalar possui menos tendência de estar colonizado por S. aureus. Em relação a MRSA, a porcentagem de portadores na comunidade foi de 1,47%, e entre os indivíduos relacionados ao ambiente hospitalar 37,95%. Nos alunos a freqüência foi de 53,57%, equipe médica 22,95% e técnicos 38,77%. Dentro do grupo técnicos destaca-se os funcionários da lavanderia, onde 52,2% foram caracterizados como portadores de MRSA. A diferença dos grupos associados ao hospital e o grupo comunidade foi significativa (P 0,001). Apenas dois isolados de pacientes não confirmaram a caracterização prévia, sendo considerados Staphylococcus coagulase negativo resistente à oxacilina. Todos os isolados de comunidade e pacientes identificadas como Staphylococcus aureus e como MRSA nos testes bioquímicos também foram positivos nos ensaios de PCR. Os três isolados de pacientes caracterizadas como Staphylococcus coagulase negativo resistente à oxacilina foram positivos apenas na amplificação do gene mecA, confirmando os resultados nos testes bioquímicos. Nenhuma amostra apresentou resistência à vancomicina. Nossos resultados sugerem uma alta freqüência de portadores de MRSA no ambiente hospitalar, contrariamente ao observado na comunidade. O número de portadores de MRSA entre alunos e funcionários da lavanderia levanta a questão do possível papel que estes indivíduos podem estar desempenhando na disseminação dessas cepas resistentes pelo hospital, no entanto essa pergunta só poderá ser respondida através de estudos específicos. Os ensaios moleculares demonstraram o potencial dessa metodologia no diagnóstico rápido de infecções por MRSA, o que possibilita não só um tratamento mais eficiente como uma redução na disseminação dessas cepas. _________________________________________________________________ ABSTRACT Staphylococcus aureus is a pathogen associated with high rates of mortality and morbidity, capable of producing infections in various tissues of the human body. His ability to acquire resistance to antibiotics makes it a dangerous infectious agent in the hospital environment. The purpose of this work was to survey the incidence of asymptomatic carriers of S. aureus resistant (MRSA) and susceptive (MSSA) to methicillin in the University Hospital of Brasília (HUB), and the development of procedures for molecular identification of MSSA and MSRA strains. In total 327 samples were collected nasal and sub-nail of individuals related to the HUB. These samples were divided into three groups: students (medicine, nursing and dentistry), medical staff (nurses, nursing assistants and doctors) and the Technical Group (employees who do not have contact with patients). Were also collected 48 samples from patients previously identified as MRSA by HUB and 136 samples from individuals without contact with the hospital environment (community). All samples were inoculated into the culture medium and Baird Parker, and colonies with phenotypic characteristics of S. aureus were tested for fermentation of mannitol and coagulation of rabbit’s plasma to confirm the identification. Samples confirmed as S. aureus were then subjected to the test of susceptibility to oxacillin and vancomycin. Samples from community and patients were also subjected to PCR confirmation of the biochemical results through DNA fragment amplification using specific primers for genes that encodes protein A, coagulase and the thermal-stable nuclease, all specific to S. aureus, and mecA, which is present in MRSA. The rate of S. aureus carriers found in the community was 17.64%, and the total of groups related to the hospital was 56.02%, of which: Students 69.64%; Technicians 51.02% and Medical Staff 47.54%. The difference in carriers of each group and in the community group was significant (P 0001), which indicates that individuals without contact with the hospital have fewer chances to be colonized by S. aureus. For MRSA, the rate of carriers in the community was 1.47%, and among individuals related to the hospital was 37.95%, while in the Students group the rate was 53.57%, in the Medical Staff group was 22.95% and in the Technicians group was 38.77%. Inside the Technicians group, 52,2% of the workers in hospital’s laundry were colonized with MRSA. The difference between the groups associated with the hospital and the community group was significant (P 0001). Only two samples of patients did not confirm the prior characterization made by HUB and was considered Staphylococcus coagulase negative oxacillin resistant. All samples of community and patients identified as Staphylococcus aureus and MRSA in biochemical tests were also positive in the PCR test. The three samples of patients characterized as Staphylococcus coagulase negative oxacillin resistant was positive only for the amplification of the mecA gene, confirming the results in biochemical tests. No sample proved resistant to vancomycin. Our results suggest a high rate of MRSA carriers among hospital workers and students. The number of MRSA carriers among students and worker of the laundry raise the question about the rule of these individuals over the dissemination of MRSA through the hospital wards. Further studies focused on that matter would be necessary to answer this question. The molecular experiments showed the potential of this methodology on a fast diagnosis of MRSA infections, what would not just help the treatment, but should avoid the disseminations of those clones.