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Submitted by MARIANA MOLINA QUINTERO (molinaqm@gmail.com) on 2019-05-21T23:15:05Z No. of bitstreams: 1 Tese Mariana.pdf: 1637969 bytes, checksum: 1f5040f5d4f538157e5f3aa3ae13b468 (MD5) Approved for entry into archive by Elza Mitiko Sato null (elzasato@ibilce.unesp.br) on 2019-05-22T19:39:57Z (GMT) No. of bitstreams: 1 quintero_mm_dr_sjrp_par.pdf: 322031 bytes, checksum: 8d226f24ca056b221a7702769461323a (MD5) Made available in DSpace on 2019-05-22T19:39:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 quintero_mm_dr_sjrp_par.pdf: 322031 bytes, checksum: 8d226f24ca056b221a7702769461323a (MD5) Previous issue date: 2019-04-26 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) A digestão anaeróbia é empregada para o tratamento de poluentes orgânicos mediante a biodegradabilidade para a geração de biogás e economia de recursos. Por outro lado, o processo de fermentação com uso de leveduras tem sido muito estudado para a geração de álcool e biomassa, sem considerar que durante o mesmo as leveduras também realizam a degradação da matéria orgânica. A junção de ambos processos (fermentação - digestão anaeróbia) possibilitará obter remoções a partir de altas concentrações de substrato. O presente projeto é baseado no tratamento de efluentes da indústria de laticínios com a combinação do processo fermentativo da levedura Kluyveromyces marxianus e a digestão anaeróbia por manta de lodo. Fez-se um teste parcial de atividade lipolítica para a produção de lipase com a finalidade de degradar a fase lipídica formada pela gordura dos laticínios no reator anaeróbio compartimentado-RAC. Para o tratamento com levedura foi utilizado um reator de bolhas e um reator aeróbio-anaeróbio compartimentado – RAAC, com volume total de 3,8 L, com conexão a um sedimentador de 2 L com tempo de retenção hidráulico - TRH de 1 dia. Para o tratamento com digestão anaeróbia, foi usado um RAC de 35,7 L e um RAC de 5 L, sendo este ultimo usado para os ensaios nos sistemas concomitantes. Os resultados parciais da atividade lipolítica obtiveram até 4,55 μmol.mL-1. Obteve-se uma remoção de 98% com uma alimentação de entrada de 9.000 mg DQO.L-1 para o RAAC. No reator de bolhas a remoção foi de 63,3% para a concentração de 3.000 mg DQO.L-1. O RAC de 5 L do sistema integrado alcançou uma remoção de 89,9%. Para o tratamento anaeróbio, os resultados dos 2 ensaios no RAC de 5 L foram de 10,5% no ensaio 1 e 71% no ensaio 2. A maior remoção obtida no RAC de 35,7 L foi para 1.190 mg DQO.L-1 com remoção de 90,8% de DQO. Anaerobic digestion is used for the treatment of organic pollutants through biodegradability for generation of biogas and resource savings. On the other hand, yeast fermentation process has been studied for generation of alcohol and biomass, without consider that, during the same yeasts also carry out the degradation of organic matter. The combination of both processes (fermentation - anaerobic digestion) will allow to obtain removals from high substrate concentrations. The present project was based on treatment of effluents from dairy industry with combination of the fermentative process of yeast Kluyveromyces marxianus and anaerobic digestion by sludge blanket. A partial lipolytic activity test was performed for lipase production in order to degrade the lipid phase formed by milk fat in the compartmentalized anaerobic reactor-CAR. For yeast treatment, a blast reactor and a compartmentalized aerobic-anaerobic reactor - CAAR, with a total volume of 3.8 L were used, with connection to a 2 L settler with hydraulic retention time - HRT of 1 day. For treatment with anaerobic digestion, a CAR of 35.7 L and a CAR of 5 L was used, latter being used for assays in concomitant systems. The partial results of lipolytic activity obtained up to 4.55 μmol.mL-1. A 98% removal was achieved with an inlet feed of 9,000 mg COD.L-1 for CAAR. In bubble reactor, removal was 63.3% for concentration of 3,000 mg COD.L-1. The CAR of 5 L of integrated system achieved a 89.9% removal. For anaerobic treatment, the results of 2 trials in the 5 L RAC were 10.5% in assay 1 and 71% in assay 2. The highest removal obtained in RAC of 35.7 L was 1,190 mg COD. L- 1 with removal of 90.8% COD.

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior A β-galactosidase é uma hidrolase que catalisa a reação de hidrólise da lactose. Essa enzima tem se destacado cada vez mais no âmbito industrial, apresenta grande potencial para aplicação na indústria de laticínios, pela sua ação é possível elaborar produtos isentos de lactose, voltados para intolerantes, além de aumentar a digestibilidade de lácteos e melhorar as características dos mesmos. Além disso, a β-galactosidase atua na produção de galacto-oligossacarídeos, que possuem efeitos prebióticos e ajudam na manutenção da flora intestinal. A lactose, principal carboidrato do leite, está presente em alta quantidade no soro de leite, designado como subproduto da indústria de laticínios, nesse sentindo a β-galactosidase apresenta potencial significativo para hidrólise da lactose do soro de leite com possibilidade de desenvolvimentos de novos produtos e tecnologias. A enzima β-galactosidase têm sido imobilizada com intuito de expandir e melhorar sua aplicação nos processos. Assim, vários métodos de imobilização vêm sendo aplicados, um deles é a adsorção física, método simples que envolve apenas ligações fracas. Dentre os suportes utilizados as resinas de troca iônica apresentam grande potencial. Neste trabalho a β-galactosidase foi produzida a partir da levedura Kluyveromyces marxianus e imobilizada em resina de troca iônica Duolite® A-568. A produção foi realizada por fermentação submersa, utilizando como fonte de carbono a lactose presente no permeado do soro de leite. Em seguida, a enzima foi caracterizada quanto sua estabilidade térmica, ao pH e ao armazenamento. Após a caracterização da enzima livre, esta foi imobilizada em resina Duolite® A-568. Realizaram-se testes preliminares variando tempo, concentração de enzima e utilização de enzima liofilizada na imobilização. Na sequência foi realizado uma otimização das condições por meio de um Planejamento Composto Central com as variáveis pH, concentração do tampão e atividade ofertada na imobilização. Para todas as imobilizações definiu-se a atividade recuperada. Foram realizados testes de reticulação com glutaraldeído em diferentes concentrações. A enzima também passou por um processo com duas imobilizações, visando aumentar a atividade recuperada. Como resultados obtidos, a enzima livre apresentou maior estabilidade térmica a 30 °C e estabilidade ao pH 7,3, além de reter 80% da atividade inicial durante sete semanas de armazenamento sob refrigeração, tanto em sua forma solúvel como liofilizada. Os testes preliminares de imobilização definiram a atividade ofertada como 27 U e o tempo de uma hora de imobilização, a atividade recuperada da imobilização com a enzima não liofilizada e liofilizada não apresentou diferenças. Na otimização as faixas ótimas obtidas no planejamento foram de 6,9 a 7,3 para o pH, 0,4 a 0,8 M para concentração do tampão e 24 a 31 U para atividade ofertada. Os testes de reticulação mostraram que o aumento da concentração da solução de glutaraldeído implicou em uma redução da atividade do biocatalisador imobilizado. A imobilização em série foi importante para aumentar a atividade do biocatalisador imobilizado. De forma geral a enzima produzida se apresentou eficiente para imobilização em resina de troca iônica Duolite® A-568, levando em consideração que mais variáveis devem ser otimizadas para melhora da imobilização. β-galactosidase is a hydrolase that catalyzes the hydrolysis reaction of lactose. This enzyme has been increasingly highlighted in the industrial field, presents great potential for application in the dairy industry, by its action it is possible to produce lactose-free products, aimed at intolerants, in addition to increasing the digestibility of dairy products and improving their characteristics. In addition, β-galactosidase acts in the production of galacto-oligosaccharides, which have prebiotic effects and help in maintaining the intestinal flora. Lactose, the main carbohydrate in milk, is present in high amounts in whey, designated as a by-product of the dairy industry, in which β-galactosidase presents significant potential for hydrolysis of whey lactose with the possibility of new product developments and technologies. The β-galactosidase enzyme has been immobilized in order to expand and improve its application in the processes. Thus, several methods of immobilization have been applied, one of them is the physical adsorption, simple method involving only weak links. Among the substrates used ion exchange resins have great potential In this work β-galactosidase was produced from yeast Kluyveromyces marxianus and immobilized on Duolite® A-568 ion exchange resin. The production was carried out by submerged fermentation, using lactose present in the permeate of the whey as the carbon source. The enzyme was then characterized as to its thermal stability, pH and storage. After characterization of the free enzyme, it was immobilized on Duolite® A-568 resin. Preliminary tests were performed varying time, enzyme concentration and use of lyophilized enzyme in the immobilization. In the sequence an optimization of the conditions was carried out by means of a Central Composite Planning with the variables pH, buffer concentration and activity offered in the immobilization. For all immobilizations the recovered activity was defined. Glutaraldehyde crosslinking tests were performed at different concentrations. The enzyme also underwent a process with two immobilizations, aiming to increase the recovered activity. As results obtained, the free enzyme presented greater thermal stability at 30 ° C and stability at pH 7.3, besides retaining 80% of the initial activity during seven weeks of storage under refrigeration, both in its soluble and lyophilized form. Preliminary immobilization tests defined the activity offered as 27 U and the one-hour immobilization time, the activity recovered from immobilization with the non-lyophilized and lyophilized enzyme did not present differences. In the optimization, the optimum ranges obtained in the planning were 6.9 to 7.3 for the pH, 0.4 to 0.8 M for the buffer concentration and 24 to 31 U for the offered activity. Crosslinking tests showed that increasing the concentration of the glutaraldehyde solution implied a reduction in the activity of the immobilized biocatalyst. Serial immobilization was important to increase the activity of the immobilized biocatalyst. In general, the enzyme produced was efficient for immobilization in Duolite® A-568 ion exchange resin, taking into account that more variables should be optimized for immobilization improvement. Dissertação (Mestrado)

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior A conservação de frutos in natura com qualidade é primordial para reduzir as perdas no período após a colheita, devido à recorrente contaminação por fungos patogênicos. No entanto, a forma usual de controle por fungicidas e agentes químicos vem causando danos ao meio ambiente, à saúde humana e selecionando linhagens de patógenos resistentes. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito antagonista da levedura Kluyveromyces marxianus e seu mecanismo de ação contra o fitopatógeno Botrytis cinerea. Os resultados obtidos mostram que K. marxianus é capaz de secretar simultaneamente enzimas hidrolases envolvidas na degradação da ultra-estrutura da parede celular fúngica. O extrato protéico secretado foi testado contra os substratos Azocaseína e ρ-nitrofenil-β-D-glicopiranosídeo e apresentou atividades de glicosidase e proteásica para todas as linhagens testadas. O sequenciamento, por espectrometria de massas, das proteínas majoritárias que foram visualizadas em SDS-PAGE identificou vinte e sete proteínas, sendo 13 delas classificadas como hidrolases. Entre as hidrolases foram identificadas 4 β-glicanases, 4 glicosidases, uma protease aspártica, uma endoquitinase e uma inulinase. Quando se avaliou o efeito do extrato enzimático secretado por K. marxianus sobre a ultra-estrutura da parede celular de Saccharomyces cerevisiae foi observado um dano substancial, causando deformações celulares e redução da viabilidade da população de células. Neste trabalho foi observada a atividade de antagonismo da K. marxianus in vitro e in vivo utilizando conhecidos alvos do patógeno Botrytis cinerea: morangos e uvas de mesa. Os resultados obtidos dos testes de antagonismo in vitro mostram que em cultivo simultâneo K. marxianus inibe 88% a germinação de esporos de B. cinerea (p-valor 0,0003) nas primeiras 12h, sugerindo que, além da competição por nutrientes, a inibição do crescimento micelial esteja relacionada com a capacidade de secretar enzimas líticas exibidas pela levedura antagonista. Os resultados dos testes in vivo em uvas não mostraram atividade de antagonismo da K. marxianus contra B. cinerea. Os resultados dos testes in vivo em morangos sugerem que a habilidade de secretar enzimas líticas fazem da K. marxianus um agente potencial para o controle biológico de B. cinerea. The conservation of fresh fruits is essential to reduce losses in the post-harvest period due to recurrent pathogenic fungi contamination. However, the usual way of control, which is by using fungicide and chemical agents, has been causing damage to the environment, human health and selecting strains resistant to pathogens. Thus, the aim of this study was to evaluate the effects of the antagonist yeast Kluyveromyces marxianus and its mechanism of action against the phytopathogen fungus Botrytis cinerea. The results show that K. marxianus is able of simultaneously secreting hydrolyses enzymes, which are involved in the degradation of the ultra structure of the fungal cell wall. Recently, our group has identified a β-1-3(4)-glucanase secreted by K. marxianus and defined the best cultivation conditions for glucanases secretion. The secreted protein extract was tested against the substrates Azocasein and p-nitrophenyl-β- D-glucopyranoside, and it showed glycosidase and protease activities for all examined strains. The mass spectrometry sequencing of the major proteins that were visualized on the SDS- PAGE identified twenty seven proteins, thirteen of them being classified as hydrolases. Among the hydrolases, four β-glucanases, four glycosidases, one aspartic protease, one endoquitinase and one inulinase were identified. When the effect of the enzymatic extract secreted by K. marxianus was evaluated against the ultra structure of S. cerevisiae cell wall, a substantial damage was observed, which caused cell deformations and reduction of cell populations viability. In this study, it was observed the antagonist activity of K. marxianus in vitro and in vivo using known targets of the B cinerea: strawberries and table grapes. The results obtained from the in vitro antagonist testes show that the simultaneous cultivation of K. marxianus and spores of B. cinerea inhibit spores germination by 88% (p-valor 0,0003) during the first 12 hours. The simultaneous cultivation with fungal mycelium of B. cinerea suggests that, in addition to nutrient competition, the inhibition of mycelium growth may be related to the ability of the antagonist yeast to secrete lytic enzymes. The results of the in vivo tests on strawberries suggest that the ability of secreting lytic enzymes makes K. marxianus a potential agent for the biological control of B. cinerea.

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) To attend the increase in Brazilian ethanol consumption and exportation, and also to comply with the goals established in the COP 21 and Quioto protocol, it will be necessary to increase the ethanol production in the next years. This purpouse can be achieved by using new yeast strains, new raw materials, and new extraction techniques. Thus, the objeticve of this work was evaluated the ethanol production by Kluyveromyces marxianus, a thermotolerant yeast, and its remotion by carbon dioxide stripping throughout the fermentation. In this work, fermentation experiments were carried out in agitated flasks in temperature range from 36 to 44 ºC using K. marxianus and in the range from 34 to 40 oC using Saccharomyces cereviae (commercial and industrial strains) to compare the performance of both yeasts. Thermotholerant yeast was evaluated using a medium composed by sweet sorghum and molasses in experiments carried out in agitated flasks at 40 oC. Assays with K. marxianus were carried out in a bioreactor (2 L) operated in batch mode and using carbon dioxide stripping (specific flow rates of 1.0, 1.5 and 2.5 vvm) . For all fermentation experiments the main kinetic parameters and yields were calculated. The fermentation process was modeled using Levenspiel kinetic. Stripping process was also modeled considering a first order kinetic. The model parameters were estimated by genetic optimization algorithm. Fermentations carried out at 40 oC with K. marxianus yeast exhibit a similar performance to that obtained in most Brazilian mills. Sweet sorghum demonstrated to be a promising raw material and the thermotolerant strain was able to consume all the sugars present in the broth. In the stripping experiments it was observed an increase in the value of the ethanol volumetric productivity. The higher value (9.02 gE/L∙h) was obtained in the experiment carried out at 1.0 vvm. The proposed mathematical model was able to adequately describe the fermentation processes. Para atender o crescimento do consumo, da exportação de etanol e cumprir com os compromissos estabelecidos na COP 21 (21ª Conferência do Clima) e no Protocolo de Quioto será necessário aumentar a produção de etanol nos próximos anos. Esse objetivo pode ser alcançado por meio do emprego de novas linhagens de levedura, de novas matérias-primas e de novas técnicas de extração. Assim, este trabalho teve como objetivo avaliar a produção de etanol por Kluyveromyces marxianus, uma levedura termotolerante, e sua remoção por arraste empregando dióxido de carbono durante a fermentação (stripping). Experimentos foram realizados em frascos agitados na faixa de temperatura entre 36 a 44 oC com a levedura K. marxianus e na faixa de 34 e 40 ºC com a levedura Saccharomyces cereviae (linhagem comercial e industrial) para comparar o desempenho de ambas leveduras. A levedura termotolerante foi avaliada em meio composto por caldo de sorgo sacaríneo e melaço em experimento em frascos agitados a 40 oC. Experimentos realizados em biorreator (volume 2L) operado em modo batelada sem arraste e empregando arraste com dióxido de carbono (vazões específicas de 1,0, 1,5 e 2,5 vvm) foram realizados com a levedura K. marxianus. Em todos os experimentos foram calculados os parâmetros cinéticos e de rendimento. Realizou-se a modelagem matemática do processo empregando cinética de Levenspiel. O processo de stripping também foi modelado utilizando cinética de primeira ordem. Os parâmetros do modelo foram estimados por algorítmo genético. As fermentações a 40 oC com a levedura K. marxianus alcançaram desempenho dentro da faixa observada nas usinas brasileiras. O sorgo sacarino mostrou ser uma matéria-prima promissora e a levedura termotolerante foi capaz de consumir todos os açúcares presentes no meio de cultivo. Nos experimentos com stripping houve o aumento da produtividade volumétrica, sendo o maior valor obtido no experimento realizado a 1,0 vvm (9,02 gE/L∙h). O modelo matemático proposto forneceu uma descrição adequada dos processos fermentativos realizados. FAPESP: 2012/50046-4

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior β-galactosidase has presented increased use in the dairy industry, since it can be used to produce a isomolecular mixture of glucose and galactose and also has wide application in biotechnological production of milk with a low-lactose content, in production of galacto-oligosaccharides from whey lactose and as a preliminary step to d-tagatose synthesis. Exist still a great interest in the optimization of fermentation conditions and of medium composition to increase the production of β-galactosidase in order to achieve a high yield of low cost production. The yeast Kluyveromyces marxianus is an important industrial yeast for fermentation of lactose, having classic applications in the production of biomass, ethanol and enzymes. In this work the production and characterization of β-galactosidase from K. marxianus ATCC 46537 produced by fermentation of whey permeate were studied. The fermentation medium used was based in permeate whey and analysis of sugars and ethanol were made by liquid chromatography. Enzymatic activity was determined by the initial rates and glucose formed was measured by glucose oxidase. The enzyme activity unit (U mL-1) was defined as μmol of glucose produced per minute per mL enzyme suspension at a temperature of 30 °C, pH 6.5, with an initial lactose concentration of 50 g L-1. The medium to obtain inoculum was the medium composed of yeast extract (6.0 g L-1), (NH4)2SO4 (6.0 g L-1), KH2PO4 (5,0 g L-1), MgSO4.7H2O (0.6 g L-1) permeate whey (lactose concentration of 50 g L-1) prepared in phosphate buffer 10-1 M pH 5.5. Was studied the growth kinetic of the yeast and was obtained the μmax of 0, 288 h-1 and generation time of 2.41 hours in this stage. Different methods of β-galactosidase extraction were evaluated and the extraction by vortex agitator and ultrasonic processor were who showed the best results. A Fractional Factorial Design was performed to study the influence of pH and medium composition on the production of β-galactosidase for which it was obtained that the maximum production of β-galactosidase was affected more significantly by lactose, followed by (NH4)2SO4, yeast extract and pH. The fermentative medium composition was evaluated using a Central Composite Design, the best results were obtained for lactose concentrations ranging from 100 to 150 g L-1, yeast extract lower than 6 g L-1 and (NH4)2SO4 between 2 and 8 g L-1. The simultaneous influence of agitation speed and aeration rate was evaluated by performing a Central Composite Design that resulted in enzymatic activity of 139.58 U mLfermented broth-1 at the central point (250 rpm and 0.75 vvm). Was evaluated the co-production of bioethanol by fermentation of whey permeate by using K. marxianus. The highest value observed for bioethanol concentration (36.94 g L-1) was obtained in the fermentation in which was used agitation speed of 427 rpm and aeration rate of 0.24 vvm, which implies a yield of 72.3 %. Was verified, by simultaneous analysis of the optimum regions for the answers of enzyme activity and bioethanol co-production, regions that imply high values for enzymatic activity and bioethanol, simultaneously, as follows: agitation speed 200-400 rpm with rate aeration of 0.4 to 1.2 vvm. These results indicate a promising alternative for the valorization of whey permeate in the simultaneous production of β-galactosidase and bioethanol. The enzyme extract produced were characterized and the kinetic constants obtained for Vmax and Km were respectively 11.01 U mL-1 and 3.62 g L-1. The produced enzyme was most active at a temperature of 45 °C and obtained high values of relative activity in lactic acid buffer at pH 5.5 to 7.3. The polyacrylamide gel electrophoresis the enzyme extract showed a subunit molecular mass of 52.3 kDa coincident with the reference sample (Lactozyme® 2600) indicating the presence of β-galactosidase subunits produced in the extract. A enzima β-galactosidase tem apresentado uso crescente na indústria de laticínios, visto que a mesma pode ser empregada na prodrução de uma mistura isomolecular de glicose e galactose, além de possuir uma grande aplicação biotecnológica na produção de leite com baixo teor de lactose, na produção de galacto-oligossacarídeos a partir da lactose do soro e como etapa preliminar para síntese de d-tagatose. Têm-se ainda um grande interesse na otimização das condições de fermentação e composição do meio para aumentar a produção de β-galactosidase, a fim de alcançar um elevado rendimento de produção de baixo custo. A levedura Kluyveromyces marxianus é uma importante levedura industrial para fermentação de lactose, tendo aplicações clássicas na produção de biomassa, etanol e enzimas. Neste trabalho foi estudada a produção e caracterização da enzima β-galactosidase de K. marxianus ATCC 46537 produzida por fermentação de permeado de soro de leite. As fermentações utilizaram meio à base de permeado de soro de leite e as análises de etanol e açúcares foram feitas por cromatografia líquida. A atividade enzimática foi determinada pelo método das taxas iniciais e a glicose formada era dosada por glicose-oxidase. A unidade de atividade enzimática U mL-1 foi definida como μmol de glicose produzida por minuto, por mL de suspensão enzimática, à temperatura de 30 °C, pH 6,5, com uma concentração inicial de lactose de 50 g L-1. O meio para obtenção do inóculo foi o meio composto por extrato de levedura (6,0 g L-1), (NH4)2SO4 (6,0 g L-1), KH2PO4 (5,0 g L-1), MgSO4.7H2O (0,6 g L-1) e permeado de soro de leite em pó (concentração de lactose 50 g L-1), preparado em tampão fosfato 10-1 M pH 5,5. Foi estudada a cinética de crescimento da levedura e obteve-se o valor da μmax de 0, 288 h-1 e tempo de geração nesta fase de 2,41 horas. Diferentes métodos de extração de β-galactosidase foram avaliados, sendo a extração em agitador tipo vórtex e em processador ultrassônico os que apresentaram os melhores resultados. Foi realizado um Planejamento Fatorial Fracionário para estudar a influência do pH e composição do meio na produção de β-galactosidase e obteve-se que, a produção de β-galactosidase foi afetada de modo mais significativo por lactose, seguido de (NH4)2SO4, extrato de levedura e pH. A composição do meio fermentativo foi avaliada por um Delineamento Composto Central para a síntese de β-galactosidase e os melhores resultados foram alcançados para as concentrações de lactose variando de 100 a 150 g L-1, extrato de levedura inferior a 6 g L-1 e (NH4)2SO4 entre 2 e 8 g L-1. A influência conjunta da velocidade de agitação e taxa de aeração foi avaliada pela realização de Delineamento Composto Central que obteve atividade enzimática de 139,58 U mLcaldo-1 no ponto central (250 rpm e 0,75 vvm). Avaliou-se a co-produção de bioetanol por fermentação do permeado de soro de leite usando K. marxianus. O maior valor observado para concentração de bioetanol (36,94 g L-1) foi obtido na fermentação em que utilizou-se da velocidade de agitação de 427 rpm e taxa de aeração de 0,24 vvm, o que implica em um rendimento de 72,3%. Verifica-se, pela análise conjunta das regiões ótimas para as respostas atividade enzimática e co-produção de bioetanol, que há faixas das regiões que implicam em altos valores de atividade enzimática e bioetanol simultaneamente, sendo elas: agitação de 200 a 400 rpm com aeração entre 0,4 a 1,2 vvm. Estes resultados indicam uma alternativa promissora para a valorização do permeado de soro de leite na produção conjunta de β-galactosidase e bioetanol. O extrato enzimático produzido foi caracterizado e as constantes cinéticas obtidas para Vmáx e Km foram, respectivamente, 11,01 U mL-1 e 3,62 g L-1. A enzima produzida apresentou maior atividade a uma temperatura de 45 °C e obteve-se altos valores de atividade relativa em tampão lático na faixa de pH de 5,5 a 7,3. A eletroforese em gel de poliacrilamida do extrato enzimático apresentou uma subunidade de massa molecular 52,3 kDa coincidente com a amostra de referência (Lactozyme® 2600) indicando a presença de subunidades de β-galactosidase no extrato produzido. Doutor em Engenharia Química

Made available in DSpace on 2017-05-12T14:47:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Danielle_ Camargo.pdf: 2743019 bytes, checksum: bb99b3949e2803b846be4f0bae327172 (MD5) Previous issue date: 2016-02-12 Ethanol is considered a promising alternative to fossil fuels and causes less environmental impact, which implies an increase in the consumption of biofuel. To meet this demand, research has been conducted with alternative raw materials to complement the production of first generation ethanol. In Brazil, sweet sorghum is being studied for the expansion of sugarcane industry due to its rapid growth and the possibility of cultivating it during the season-cropping of sugarcane. However, during processing of sweet sorghum for ethanol production, generation of bagasse occurs, a material composed primarily of cellulose and hemicellulose, which can be considered a potential source of feedstock for bioprocesses. Therefore, the purpose of this study was the use of the sugars from the hemicellulose and the cellulosic fractions of the sweet sorghum bagasse, for the production of second generation ethanol by pentoses and hexoses fermentation yeasts, respectively. After chemical characterization of sorghum bagasse of six cultivars, they were subjected to mild acid hydrolysis with variations in temperature (111; 115 °C and 121), time (40, 50, and 60 min) and concentration of sulfuric acid (075; 1.25 and 1.75% w/v) using a central composite design (DCC) and response surface to find the condition that is conducive to high concentrations of sugars and less toxic compounds in the hemicellulosic hydrolysate. After the hydrolysate was concentrated and detoxified, it was submitted to fermentation by the yeast Schefferosomyces stipitis in a bioreactor at 30 °C, with kLa 4.9 h-1, pH 5.5 and volume of 4.5 liters. The solid biomass (cellulignin) that resulted from the acid treatment was submitted to evaluation of the percentage of cellulose, hemicellulose and lignin and then to studies with variation in the concentration of NaOH (1; 2.5 to 4%) and time (20, 40 and 60 min). After the treatment with the best condition of removal of lignin, cellulosic biomass was subjected to enzymatic hydrolysis with variation in the concentration of cellulase NS22086 (15, 20 and 25 FPU/g) and β-glucosidase NS22118 (1/3 to 2/3) and temperature of 38; 41 to 44 °C, in order to obtain the best saccharification rates and high glucose concentrations. The production of ethanol from the cellulosic fraction was then carried out with Kluyveromyces marxianus, during simultaneous saccharification and fermentation (SSF) at three different temperatures (38, 41 and 44 °C) for fermentation. The chemical composition between different varieties studied was similar and varied from 22-26% of lignin, from 30-32% of hemicellulose and 32-37% of cellulose. In the study of the hydrolysis conditions of hemicellulose, it was found that the acid concentration was the most important factor, and the condition that resulted in the highest concentration of sugars (14.22 g/L xylose and 2.42 g/L glucose) was 1.75% H2SO4, 40 minutes and 121 °C. This same condition showed low quantities of toxic compounds (1.34 g/L of acetic acid, 0.90 g/L of phenol; 124.54 mg/L of hydroxymethylfurfural and 978 mg/L furfural). The production of ethanol by S. stiptis in the hemicellulosic hydrolysate resulted in a concentration of 22 g/L ethanol, Yp/s of 0.40 g/g; Yx/s 0.28 g/g and Qp of 0.34 g/L.h-1. For the study of cellulignin delignification it was found that 2.5% NaOH for 60 minutes was the best condition for the removal of lignin (68%). During the enzymatic hydrolysis of the cellulosic portion, it was verified that the increase of cellulase from15 to 25 FPU/g resulted in higher concentration of glucose. In addition, the increase of β-glucosidase also resulted in the largest amount of glucose in a shorter time. The temperature also increased and accelerated the process of saccharification of cellulose. The simultaneous saccharification fermentation with K. marxianus was shown to be affected by the temperature studied, and the maximum ethanol concentration was reached (9.41 g/L) after 72 hours at 41 °C. With these results, it was possible to consider that the bagasse of sweet sorghum is a promising material in the field of second generation ethanol production both from hemicellulose and cellulose. O etanol é considerado uma alternativa promissora aos combustíveis fósseis, o que implica no aumento do consumo deste biocombustível. Para suprir essa demanda, pesquisas têm sido realizadas com matérias primas alternativas para complementar a produção de etanol de primeira geração. No Brasil, o sorgo sacarino está sendo estudado para ampliação do setor sucroenergético por ter crescimento rápido e possibilidade de cultivo na entressafra da cana-de-açúcar. Porém, durante o processamento do sorgo sacarino ocorre a geração do bagaço como material excedente, que é constituído principalmente por celulose e hemicelulose, e que pode ser considerado matéria-prima em potencial para bioprocessos. Portanto, o objetivo deste trabalho foi estudar o aproveitamento dos açúcares das frações hemicelulósica e celulósica do bagaço de sorgo sacarino para produção de etanol de segunda geração por leveduras fermentadoras de pentoses e hexoses, respectivamente. Após a caracterização química do bagaço de sorgo, este foi avaliado através de estudo de delineamento composto central (DCC) e superfície de resposta à hidrólise ácida branda com variações na temperatura (111; 115 e 121 °C), tempo (40; 50 e 60 min) e concentração de ácido sulfúrico (0,75; 1,25 e 1,75% m/v) a fim de encontrar a condição que propiciasse altas concentrações de açúcares e menores de compostos tóxicos no hidrolisado hemicelulósico. Após o hidrolisado ser concentrado e destoxificado, seguiu para fermentação pela levedura Schefferosomyces stipitis em biorreator a 30 °C, com kLa de 4,9 h-1, pH 5,5 e volume de 4,5 litros. A biomassa sólida (celulignina) resultante do tratamento ácido foi submetida à avaliação da porcentagem de celulose, hemicelulose e lignina e seguiu para estudo da deslignificação com variação na concentração de NaOH (1; 2,5 e 4%) e tempo (20, 40 e 60 min). Após tratamento com a melhor condição de remoção da lignina, a biomassa foi submetida à hidrólise enzimática com variação na concentração de celulase NS22086 (15; 20 e 25 FPU/g) e de β-glicosidase NS22118 (1/3 a 2/3) e temperatura (38; 41 e 44 °C), a fim de obter as melhores taxas de sacarificação e altas concentrações de glicose. A produção de etanol a partir da fração celulósica foi então realizada com Kluyveromyces marxianus durante sacarificação simultânea à fermentação (SSF) em três diferentes temperaturas (38; 41 e 44 °C) de incubação. A composição química do bagaço variou entre 22-26% de lignina, 30-32% de hemicelulose e 32-37% de celulose. A concentração de ácido sulfúrico foi o fator que teve maior influência na formação de açúcares e hidrólise da hemicelulose e a condição que resultou na maior concentração de açúcares (14,22 g/L de xilose e 2,42 g/L de glicose) foi 1,75% de H2SO4, 40 minutos a 121 °C. Essa mesma condição apresentou baixas quantidades de compostos tóxicos (1,34 g/L de ácido acético, 0,90 g/L de fenólicos; 124,54 mg/L de hidroximetilfurfural e 978 mg/L de furfural). A produção de etanol por S. stiptis no hidrolisado hemicelulósico resultou em uma concentração de 22 g/L de etanol, Yp/s de 0,40 g/g; Yx/s de 0,28 g/g e Qp de 0,34 g/L.h-1. No estudo de deslignificação da celulignina foi verificado que 2,5% de NaOH, 121 0C por 60 minutos foi a melhor condição na remoção de lignina (68%). Durante a hidrólise enzimática da porção celulósica foi verificado que o aumento da concentração da celulase de 15 para 25 FPU/g resultou na maior concentração de glicose. Além disso, o aumento da β-glicosidase diminui o tempo de hidrólise e o aumento da temperatura favoreceu o processo de sacarificação da celulose. A sacarificação simultânea à fermentação com K. marxianus demonstrou ser afetada pela temperatura estudada e a máxima concentração de etanol foi alcançada (9,41 g/L) com 72 horas a 41 °C. Com esses resultados, é possível considerar que o bagaço do sorgo sacarino é uma matéria prima promissora na produção de etanol de segunda geração tanto a partir da hemicelulose como de celulose.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico A produção de etanol combustível pode ser aumentada pelo estabelecimento de novas tecnologias que utilizam subprodutos agroindustriais como matéria-prima. O soro de queijo é um subproduto que pode ser utilizado como substrato para a produção de etanol. A levedura Kluyveromyces marxianus CCT 7735 é capaz de produzir etanol da lactose do soro de queijo, contudo concentrações de etanol superiores a 6% (v/v) afetam o crescimento dessa levedura. Apesar de esse ser o principal entrave para a utilização de Kluyveromyces marxianus em processos de produção de etanol, existem poucas informações sobre os efeitos e respostas adaptativas ao etanol nessa levedura. Recentemente, o transcriptoma dessa levedura cultivada sob estresse por etanol foi obtido, todavia os dados ainda não foram confirmados. Neste trabalho, o transcriptoma foi validado por meio da análise da expressão dos genes que codificam as enzimas transcetolase, hexoquinase, succinato desidrogenase e isocitrato lisase, respectivamente, por PCR em tempo real (qPCR). No intuito de compreender as respostas adaptativas de Kluyveromyces marxianus ao etanol, foi analisado o perfil metabólico desta levedura sob estresse por esse biocombustível. Os metabólitos intracelulares foram analisados por um sistema de cromatografia a gás (GC) acoplado a um espectrômetro de massa (MS). Posteriormente, os metabólitos identificados foram correlacionados com os dados do transcriptoma, também obtido sob estresse por etanol. A análise dos componentes principais indicou que o etanol provocou alterações no perfil metabólico da levedura. O aumento da abundância relativa dos metabólitos ácido nicotínico, alanina, valina, prolina, inositol, gentibiose, melibiose e lactulose parece estar associado às respostas adaptativas ao etanol em Kluyveromyces marxianus CCT 7735. Além disso, a análise do perfil metabólico, juntamente com as informações do transcriptoma, evidenciou que a via glicolítica é inibida pelo etanol e a via das pentoses fosfato e o ciclo do glioxilato são importantes no período de 4 h sob estresse por etanol. The production of ethanol may be enhanced by setting up new technologies that use agroindustrial by-products as raw material. Cheese whey is a by-product that can be used as a substrate for the production of ethanol. The yeast Kluyveromyces marxianus CCT 7735 is able of producing ethanol from the lactose present in the cheese whey, concentrations higher than 6% (v/v) affect the growth of such yeast, however. Although being the main obstacle for using Kluyveromyces marxianus in ethanol production processes, there is little information on the effects and the adaptive responses to the ethanol on such yeast. Recently, the transcriptome of that yeast, cultivated under stress in the ethanol, has been obtained. Nevertheless, the data have not been confirmed yet. In this work, the transcriptome was validated by analysis of gene expression that encodes the enzym estransketolase, hexokinase, succinato desidrogenase and isocitratolisase, respectively by PCR in real time (qPCR). In order to understand the adaptive responses of Kluyveromyces marxianus to the ethanol, the metabolic profile of this yeast under ethanol stress was analysed. The intracellular metabolites were analysed by a gas chromatography system (GC) coupled with a mass spectrometer (MS). After that, the identified metabolites were correlated to data of transcriptome, which was also obtained under ethanol stress. The analysis of the principal components revealed that ethanol promoted changes in the metabolic profile of this yeast. The increase in the relative abundance of nicotinic acid, alanine, valine, proline, inositol, gentibiose, melibiose and lactulose may be associated with adaptive responses to ethanol in Kluyveromyces marxianus CCT 7735. In addition, the analysis of the metabolic profile together with information of transcriptome revealed that the glycolytic pathway is inhibited by the ethanol, and the phosphate pentose pathway and the glyoxylate pathway are important in the 4-hour period under ethanol stress.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior O capim-elefante é uma gramínea de elevada produtividade, que apresenta grande potencial para ser utilizado como biomassa lignocelulósica para a produção de etanol de segunda geração. A levedura Kluyveromyces marxianus vem se destacando na produção de etanol celulósico em processos de sacarificação e fermentação simultâneas (SSF) por ser termotolerante, além de produzir outros metabólitos de interesse industrial. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi estabelecer as condições ótimas de produção de etanol por Kluyveromyces marxianus CCT 7735 por meio do processo SSF. O capim- elefante foi pré-tratado com ácido diluído e com solução alcalina e, em seguida, o resíduo celulósico obtido foi submetido a uma pré-sacarificação durante 72 horas, seguido por 120 horas de SSF. Foram avaliados o efeito de cinco variáveis: temperatura, pH, agitação, concentrações de enzimas e de resíduo celulósico de capim-elefante (biomassa) durante 120 horas de SSF. Os resultados mostraram que a levedura termotolerante K. marxianus CCT 7735 produziu etanol nos tratamentos realizados a 45 °C, temperatura próxima à ótima para a atividade das enzimas celulolíticas. A concentração de biomassa, temperatura e concentração do complexo enzimático tiveram efeito significativo (p valor < 0,05) no processo. A maior concentração de etanol, 45,3 g/L foi obtida com base nas condições sugeridas pelo modelo estatístico proposto. Essas condições foram temperatura de 38 °C, 16% (p/v) de resíduo celulósico de capim- elefante, 22,5 FPU do complexo enzimático Celluclast ® 1.5L/g de resíduo celulósico, agitação de 50 rpm e valor de pH de 4,8. The elephant grass is a grass high productivity that has great potential to be used as lignocellulosic biomass for second generation ethanol. The yeast Kluyveromyces marxianus has been outstanding in the production of cellulosic ethanol in simultaneous saccharification and fermentation process (SSF) to be thermotolerant, as well as producing other metabolites of industrial interest. In this context, the aim of this study was to establish the optimal conditions of ethanol production by Kluyveromyces marxianus CCT 7735 through the SSF process. The elephant grass was pretreated with dilute acid and alkaline solution, then, the obtained cellulosic residue was subjected to a pre-saccharification for 72 hours, followed by 120 hours of SSF. We evaluated the effect of five variables: temperature, pH, agitation, concentrations of enzymes and cellulosic residue of elephant grass (biomass) for 120 hours of SSF. The results showed that the thermotolerant yeast K. marxianus CCT 7735 produced ethanol in the treatments performed at 45 °C, the optimum temperature for the activity of cellulolytic enzymes. The biomass concentration, temperature and concentration of enzyme complex had a significant effect (p-value < 0.05) in the process. The highest concentration of ethanol, 45.3 g/L was obtained based on the conditions suggested by the statistical model proposed. These conditions were temperature 38 °C, 16% (w/v) cellulose residue elephant grass, 22.5 FPU enzyme complex Celluclast ® 1.5L/g cellulose residue, agitation of 50 rpm, and pH of 4.8.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Simultaneous saccharification and fermentation (SSF) of biomass in high concentrations of solids is promising to increase the concentration of ethanol in the end of the process. However, lignocellulosic biomass is a heterogeneous and water-insoluble material and increase its concentration in the reaction medium may negatively influence the rate of conversion of biomass to ethanol. Objectives of the study were to evaluate how the increasing of solids concentration and the reactor feed mode with enzymes and biomass, have an effect on ethanol yield of a SSF process. The results show an increase of ethanol concentration with increasing of biomass concentration in all conditions evaluated. When assessing the effect of the gradual addition of enzymes, similar concentrations of ethanol were obtained, suggesting that enzymes do not significantly lose their activity during the process. The results obtained with the physico-chemical analyzes of the bagasse before and after the fermentation process suggest that the main factors influencing the enzymatic hydrolysis of biomass are lignin and cellulose crystallinity index, factors that increase throughout the process decreasing ethanol yield. Recently our research group identified a new enzyme secreted by Kluyveromyces marxianus with hydrolytic activity on cellobiose and p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside (PNPG). In this study the specificity of the enzyme was assessed using the substrates cellobiose (β-1, 4), CMC (β-1, 4), β-glucan (β-1, 4: β-1, 4), and PNPG. The results show a higher activity for the hydrolysis of β-glucan substrate identified indicating that the enzyme has specificity for β-1, 3 and β-1, 4 glycosidic linkages. For a better characterization of the identified enzyme protein sequencing by mass spectrometry was performed. Analyses of the sequences obtained showed high similarity to β-1, 3 glucanases from yeast. Furthermore, we measured the hydrolytic activity of this enzyme on the yeast cell wall. The results show that the enzyme has a potential application in the production of soluble β-glucan or yeast protoplast preparation. The enzyme activity of β-1, 3 ixbonds explains their activity on the cell wall of Saccharomyces cerevisiae. The amino acid sequence and specificity for β-glucans substrates suggest that the enzyme is secreted by K. marxianus one β-1-3 (4)-glucanase. A sacarificação e fermentação simultânea (SSF) de biomassa em altas concentrações de sólidos é um método promissor para aumentar a concentração de etanol no final do processo. No entanto, a biomassa lignocelulósica é um material heterogêneo e insolúvel em água e o aumento da sua concentração no meio reacional pode influenciar negativamente a taxa de conversão de biomassa em álcool. Assim um dos objetivos desse trabalho foi avaliar o efeito do aumento da concentração de sólidos e a forma de alimentação do reator, com enzimas e biomassa, sobre a produção de etanol em um processo SSF. Os resultados obtidos mostram um aumento da concentração de etanol com o aumento da concentração de biomassa em todas as condições testadas. Quando se avaliou o efeito da adição gradual de enzimas, concentrações semelhantes de etanol foram obtidas, sugerindo que as enzimas não perdem, significativamente, sua atividade ao longo do processo. Os resultados obtidos com as análises físico-químicas do bagaço antes e após o processo fermentativo sugerem que os principais fatores que estão influenciando a hidrólise enzimática da biomassa são o conteúdo de lignina e o índice de cristalinidade da celulose, fatores esses que aumentam ao longo do processo diminuindo o rendimento em etanol. Recentemente nosso grupo de pesquisa identificou uma nova enzima secretada por Kluyveromyces marxianus com atividade hidrolítica sobre celobiose e p-nitrofenil-β-D- glicopiranosideo (pNpG). Neste trabalho a especificidade da enzima foi avaliada utilizando os substratos celobiose (β-1,4), CMC (β-1,4), β-glucano (β- 1,3: β-1,4), e pNpG. Os resultados obtidos mostram uma atividade de hidrólise maior para o substrato β-glucano indicando que a enzima identificada possui especificidade para ligações glicosídicas β-1,3 e β-1,4. Para uma melhor caracterização da enzima identificada foi realizado seu sequênciamento da proteína por espectrometria de massas. As análises das sequências obtidas viimostraram alta similaridade com β-1,3 glucanases fúngicas. Além disto, foi medida a atividade hidrolitica desta enzima sobre a parede celular de leveduras. Os resultados mostram que a enzima possui um potencial para aplicação na produção de β-glucanos solúveis ou para preparação de protoplastos de leveduras. A atividade da enzima sobre ligações β-1,3 explica a sua atividade sobre a parede celular de Saccharomyces cerevisiae. A sequência de aminoácidos e a especificidade pelos substratos β-glucanos sugerem que a enzima secretada por K. marxianus seja uma β-1-3(4)- glucanase.

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Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Kluyveromyces marxianus UFV-3 is yeast that has respirofermentative metabolism, i.e., respiration and fermentation coexists, however fermentative or respiratory pathway can be favored depending on the oxygen and carbohydrate concentration in the culture medium. Considering this characteristic of yeasts of the genus Kluyveromyces the objective of this study was to optimize the production of ethanol from cheese whey permeate (CWP) and characterize the secretome of K. marxianus UFV-3 in view of the use of this yeast as a host for producing heterologous proteins. To optimize the production of ethanol we used the response surface method (RSM) with a central composite rotational design (CCRD) to evaluate the effects of pH (4.5-6.5), temperature (30-45 ºC), lactose concentration (50-250 g L-1), and dry cell mass concentration (1-2 g L-1). We performed 29 fermentations under hypoxia in CWP and 7 fermentations for the validation of the equation obtained via RSM. Temperature was the most significant factor in optimizing ethanol production, followed by pH, cell biomass concentration, and lactose concentration. The conditions for producing ethanol at yields above 90% were as follows: temperature between 33.3-38.5 ºC, pH between 4.7-5.7, dry cell mass concentration between 1.26-1.68 g L-1, and lactose concentration between 50-108 g L-1. The equation generated from the optimization process was validated and exhibited excellent bias and accuracy values for the future use of this model in scaling up the fermentation process. To analyze how culture conditions influencing protein secretion in K. marxianus UFV-3, this yeast was cultivated in five different conditions: batch, fed-batch (initial feed rate of 0.05 and 0.1 h-1) and continuous culture (0.3 and 0.1 h-1) in medium containing lactose. The supernatant of the cultures were analyzed on SDSPAGE and all the samples had low diversity of proteins. However, in continuous cultures with dilution of 0.1 h-1 and in fed batch 0.05 h-1 detected a higher concentration and diversity of proteins in other cultures, and in both cultures, we obtained a protein secreted in greater proportion than the others. To identify proteins secretome of K. marxianus was cultivated in continuous culture because it has more reproducible results and control of fermentation parameters when compared with fed batch. Samples of the continuous culture supernatant were subjected to protein size fractioning and in-gel digestion, followed by reversed-phase peptide separation in the nano-LC system and subsequent peptide identification by MALDI-TOF/TOF. Eight proteins were identified as structural proteins or membrane proteins, and the protein was secreted differentially was identified as an endopolygalacturonase - endoPG - (EC 3.2.1.15). EndoPG was characterized with optimum activity enzymatic at a temperature of 59.5 ºC and pH 5.1. Furthermore, it was found that apparently is repressed by glucose and shows intense secretion in batch cultures in medium containing glycerol as the carbon source, and cultures on lactose and galactose. Kluyveromyces marxianus UFV-3 é uma levedura que possui metabolismo respiro-fermentativo, ou seja, a fermentação e respiração coexistem, contudo a via fermentativa ou respiratória pode ser favorecida dependendo da concentração de oxigênio e carboidrato no meio de cultivo. Considerando esta característica das leveduras do gênero Kluyveromyces o objetivo deste trabalho foi otimizar a produção de etanol a partir de permeado de soro de queijo (PSQ) e caracterizar o secretoma de Kluyveromyces marxianus UFV-3, tendo em vista o uso desta levedura como uma hospedeira para produção de proteínas heterólogas. Para otimizar a produção de etanol em PSQ foi utilizada a metodologia de superfície resposta (MSR) com delineamento composto central rotacionado (DCCR) avaliando os efeitos de pH (4,5-6,5), temperatura (30-45 ºC), concentração de lactose (50-250 g L-1) e biomassa celular seca (1-2 g L-1). Foram realizadas 29 fermentações em hipoxia além de 7 fermentações para validar a equação obtida na MSR. Temperatura foi o fator mais significante na produção de etanol, seguido de pH, biomassa celular e concentração de lactose. As condições para produção de etanol com rendimentos superiores a 90% foram: temperatura entre 33,3-38,3 ºC, pH entre 4,7-5,7, biomassa celular entre 1,26-1,68 g L-1 e concentração de lactose entre 50-108 g L-1. A equação gerada no processo de otimização foi validada podendo, deste modo, ser utilizada para futuros processos de escalonamento da produção de etanol utilizando K. marxianus UFV-3. Para analisar como as condições de cultivo influenciam a secreção de proteínas de K. marxianus UFV-3, esta levedura foi cultivada em batelada, batelada alimentada (taxa de alimentação inicial Do - 0.05 e 0.1 h-1) e cultura contínua (diluição - D - 0.1 e 0.3 h-1). Os sobrenadantes dos cultivos foram analisados em SDS-PAGE e em todos os cultivos observou-se baixa diversidade de proteínas secretadas. Entretanto nos cultivos em batelada alimentada (Do=0.05 h-1) e cultivo contínuo (D=0.1 h-1) detectou-se uma maior concentração e diversidade de proteínas que nos demais cultivos, além de, em ambos os cultivos, obtivemos uma proteína secretada em maior proporção que as demais. Para identificar as proteínas do secretoma K. marxianus UFV-3 foi cultivada em cultura contínua (D=0.1 h-1) devido à reprodutibilidade deste método, além de, maior controle e homogeneidade dos cultivos. As amostras dos cultivos contínuos foram fracionadas por tamanho em um gel de digestão seguido de separação reversa dos peptídeos em um sistema de nano-LC e posterior identificação dos peptídeos em MALDI-TOF/TOF. De um total de nove proteínas, oito proteínas foram identificadas como sendo estruturais ou de membrana e a proteína que foi diferencialmente secretada no meio foi identificada como endopoligalacturonase endoPG (EC: 3.2.1.15). EndoPG é uma proteína de interesse biotecnológico e foi caracterizada com atividade ótima na temperatura de 59,5 ºC e no pH 5,1. Além disso, verificou-se que esta enzima não é secretada em meio contendo glicose, por outro lado endoPG é secretada em meio contendo lactose, galactose e principalmente em meio contendo glicerol.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior A levedura Kluyveromyces marxianus tem sido considerada uma candidata hospedeira para a síntese industrial de biomoléculas. Apesar de seu potencial, são poucos os estudos que relatam a expressão de proteínas heterólogas utilizando esta levedura. Neste trabalho, foi relatado pela primeira vez, a expressão da proteína do vírus da dengue em K. marxianus. O gene que codifica a proteína não estrutural (NS1) do vírus da dengue-1 foi integrado no genoma da levedura K. marxianus UFV-3 no locus LAC4, utilizando um vetor integrativo adaptado projetado para expressão de proteínas recombinantes em Kluyveromyces lactis. O gene de dengue-1 NS1 foi otimizado utilizando os códons preferenciais para aumentar os níveis de expressão de proteínas em leveduras. O gene sintético foi clonado “in frame” com o peptídeo sinal (mating-α-factor) de K. lactis e o plasmídeo recombinante obtido foi utilizado para transformar K. marxianus UFV-3 por eletroporação. As células transformantes selecionadas em YPD (yeast extract peptone dextrose) contendo 200 ug mL-1 de geneticina foram mitoticamente estáveis. A análise das linhagens recombinantes por meio de RT-PCR e a detecção da proteína utilizando Dot-blot confirmou a transcrição e a expressão dos peptídeos extracelulares. Após a indução com galactose, a proteína NS1 foi analisada por SDS-PAGE e Western blot. A produção da proteína foi investigada sob duas condições: com pulso de galactose e biotina com intervalos de 24 horas durante 96 horas após a indução e sem pulso de galactose e biotina. A atividade proteolítica não foi detectada no sobrenadante das culturas. Nossos resultados indicam que células recombinantes de K. marxianus podem ser consideradas boas hospedeiras para a produção de proteínas do vírus de dengue, que têm um potencial para aplicações em diagnósticos. The yeast Kluyveromyces marxianus has been considered a candidate host for industrial synthesis of biomolecules. Despite its potential, there are few studies reporting the expression of heterologous proteins using this yeast. Here, it was reported for the first time a dengue viral protein expression in K. marxianus. The dengue virus type 1 nonstructural protein 1 (NS1) was integrated into the K. marxianus UFV-3 genome at the LAC4 locus using adapted integrative vector designed for high-level expression of recombinant protein in Kluyveromyces lactis. The gene of dengue-1 NS1 was optimized using preferential codons to increase the levels of proteins expression in yeast. The synthetic gene was cloned in frame with K. lactis mating-α-factor signal peptide and the recombinant plasmid obtained was used to transform K. marxianus UFV-3 by electroporation. The transformants cells selected in Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) containing 200 μg mL-1 Geneticin were mitotically stable. The analysis of recombinant strains by RT-PCR technique and the protein detection using blot analysis have confirmed both transcription and expression of the extracellular peptides. After induction with galactose, the NS1 protein was analyzed by SDS-PAGE and immunogenic detection. The protein production was investigated under two conditions: with galactose and biotin pulse at 24 hours intervals during 96 hours of induction and without galactose and biotin pulse. Protease activity was not detected into the medium. Our results indicate that the constructed recombinant K. marxianus can be considered good host for the production of dengue virus proteins, which have a potential for diagnostic applications.

A fermentação sourdough para a produção de pães é fortemente motivada por seus efeitos benéfi cos quanto ao sabor, textura, vida de prateleira e pelas propriedades nutricionais dos produtos obtidos. Nesta pesquisa, estudou-se a aplicação dos micro-organismos Kluyveromyces marxianus, Dekkera bruxellensis e Lactobacillus plantarum como culturas starters alternativas na produção de pães. A partir de sete ensaios resultantes de um delineamento de mistura simplexcentroide, foram realizadas nos pães análises sensorial e instrumental. Observou-se que pães produzidos com L. plantarum apresentaram menor volume específi co, enquanto que a mistura entre K. marxianus e L. plantarum exerceu infl uência positiva, possibilitando obter produtos de maior volume específi co. A análise sensorial demonstrou a boa aceitabilidade para os pães produzidos com a mistura entre D. bruxellensis e K. marxianus e para a mistura entre os três micro-organismos. Os resultados deste trabalho demonstram a possibilidade do uso de culturas starters defi nidas para a fermentação sourdough, que é tradicionalmente obtida sem controle de processo. The sourdough fermentation in bread making is strongly motivated due to its benefi cial aspects on fl avor, texture, shelf life, and the nutritional properties of the obtained products. In this research, the yeasts Kluyveromyces marxianus and Dekkera bruxellensis, and the bacterium Lactobacillus plantarum were used as alternative starter cultures in bread making. Experimental designs generated from simplex-centroid mixture were used in the sensorial analyses of breads. Results have shown that bread obtained with pure cultures of L. plantarum presented the smallest specifi c volume, while the mixture of K. marxianus and L. plantarum positively infl uenced the formation of good specifi c volume of products. Sensorial analysis showed good acceptability for breads obtained with D. bruxellensis and K. marxianus mixture, as well as for the mixture of the three microorganisms. The results obtained in this research suggest the possibility of using defi ned starter cultures for sourdough fermentation, which is traditionally carried out without any process controls.

Made available in DSpace on 2017-05-12T14:48:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Danielle.pdf: 2045477 bytes, checksum: e87013d4e9e85c9f4d8686bbb3c0dd6e (MD5) Previous issue date: 2012-02-16 The researches on second generation ethanol, produced by agroindustrial wastes, have demanded special attention as a possible solution that can contribute to energy sustainability. Such production is based on lignocellulosic fiber conversion (cellulose and hemicellulose), which generates fermentable sugars that are biotransformed in bioethanol after some specific pretreatment and hydrolysis. The industries of extracting oil from sunflower seeds have also generated lignocellulosic residues known as sunflower cake and bran. They can be sources for recycling and profitable alternatives on converting biotechnological products with some trading interest. Thus, this trial aimed at evaluating ethanol production from cellulose and hemicellulose fractions of cake and bran, from the processing of sunflower seeds (Hellianhus annuus). After the description concerning contents of cellulose, hemicellulose and lignin, the residues were submitted to a mild acid hydrolysis with sulfuric acid, whose concentration of H2SO4 varied in 1, 2, 4 and 6% v/v, while times of hydrolysis in autoclave were (20, 40 and 60 minutes). After choosing the best of sunflower residue and treatment to obtain a hemicellulosic hydrolysate with high content of xylose and low content of inhibiting compounds, the detoxified hydrolyzate was fermented by the yeast Pichia stipitis ATCC 58376 at 30 °C with some stirring variations (100, 150 and 200 rpm). In order to obtain ethanol from cellulosic fraction, the remaining solid biomass from acid hydrolysis treatment was delignified at 1% NaOH and submitted to simultaneous saccharification and fermentation process (SSF) by yeast Kluyveromyces marxianus ATCC 36907, at 38 °C and 150 rpm. The enzymes concentrations varied at 10, 15 and 20 FPU/g of Cellulase complex NS22086 and 1/3, 1.5/3 and 2/3 of β-glucosidase in relation to NS22118 cellulase, both ones from "Novozymes Cellulosic Ethanol Enzyme Kit ". Regarding chemical composition, the cake has shown the following answers: 27.5, 33.16 and 32.18% of cellulose, hemicellulose and lignin, respectively, while for bran, the answers were: 32.93, 30.90 and 26.62% cellulose, hemicellulose and lignin, respectively. Treatment of sunflower bran with 6% H2SO4 and 20 minutes of hydrolysis resulted in a hemicellulosic hydrolysate with high concentrations of sugars (24.88 g/L xylose, 22.33 g/L glucose, 8.9 g/L arabinose and lower amounts of toxic compounds (1.59 g/L phenol, 1.93 g/L acetic acid, 0.0182 g/L furfural and 0.0514 g/L hydroxymethylfurfural). The stirring influenced the process of ethanol production by P. stipitis in hemicellulosic hydrolyzate, whose best results (ethanol 8.8 g/L, yield 0.23 g/g and productivity 0.12 g/Lh) were with 200 rpm stirring. In relation to the SSF process, the best conditions for ethanol production were 20 FPU/g cellulase and 15 CBU β-glucosidase. This resulted in 27.88 g/L ethanol, 0.35 g/g yield and 0.38 g/Lh productivity. In the same condition, the best efficiency of enzymatic conversion (EEC) was 21.95%. These are promising results since sunflower bran is available to produce second generation ethanol from both xylose and cellulose Pesquisas sobre o etanol de segunda geração, produzido a partir dos resíduos agroindustriais, têm recebido atenção especial como possível solução para contribuir na sustentabilidade energética. Tal obtenção consiste na conversão das fibras lignocelulósicas (celulose e hemicelulose) que, após passarem por pré-tratamento específico e hidrólise, originam açúcares fermentescíveis, que são biotransformados a etanol de segunda geração. Por sua vez, o setor de extração de óleo, a partir da semente de girassol, gera resíduos lignocelulósicos, conhecidos como torta e farelo de girassol, que podem ser fontes para a reciclagem e alternativa de lucro a partir da conversão biotecnológica em produtos de interesse comercial. Nesse sentido, este trabalho teve como objetivo avaliar a produção de etanol a partir das frações hemicelulósica e celulósica da torta ou farelo, provenientes do processamento das sementes de girassol (Hellianhus annuus). Após a caracterização da quantidade de celulose, hemicelulose e lignina dos resíduos, os mesmos foram submetidos à hidrólise ácida branda com ácido sulfúrico, com variações na concentração de H2SO4 (1; 2; 4; 6 % v/v) e tempo de hidrólise em autoclave (20, 40 e 60 minutos). Após a escolha do farelo de girassol como melhor resíduo e do melhor tratamento para obtenção do hidrolisado hemicelulósico com alto teor de xilose e baixo teor de compostos inibidores, o hidrolisado foi destoxificado e fermentado pela levedura Pichia stipitis ATCC 58376 a 30 oC com variações na agitação (100, 150 e 200 rpm). Para obtenção do etanol proveniente da fração celulósica, a biomassa sólida restante do tratamento de hidrólise ácida foi deslignificada com 1% NaOH e submetida ao processo de sacarificação simultânea à fermentação (SSF) pela levedura Kluyveromyces marxianus ATCC 36907 a 38 oC, 150 rpm, com variações na concentração das enzimas (10; 15 e 20 FPU/g de Cellulase complex NS22086 e 1/3; 1,5/3 e 2/3 de β - glicosidase NS22118 em relação à celulase), ambas do Novozymes Cellulosic Ethanol Enzyme Kit. A torta apresentou 27,5; 33,16 e 32,18% de celulose, hemicelulose e lignina respectivamente, enquanto o farelo apresentou 32,93; 30,90 e 26,62% celulose, hemicelulose e lignina, respectivamente. O tratamento do farelo de girassol com 6% de H2SO4 e 20 minutos de hidrólise resultou em um hidrolisado hemicelulósico com elevadas concentrações de açúcares (24,88 g/L xilose; 22,33 g/L glicose e 8,9 g/L arabinose) e menores quantidades de compostos tóxicos (1,59 g/L fenóis; 1,93 g/L ácido acético, 0,0182 g/L furfural e 0,0514 g/L hidroximetilfurfural). A agitação influenciou no processo de produção de etanol por P. stipitis no hidrolisado hemicelulósico, cujos melhores resultados (etanol 8,8 g/L; rendimento 0,23 g/g e produtividade 0,12 g/L.h) foram encontrados com a agitação de 200 rpm. No processo SSF, as melhores condições para produção de etanol foram 20 FPU/g de celulase e 15 CBU β-glicosidase, resultando em 27,88 g/L etanol, rendimento 0,35 g/g e produtividade 0,38 g/L.h. Nessa mesma condição, foi verificada a melhor porcentagem na eficiência de conversão enzimática - ECC (21,95%). Os resultados são promissores e demonstram que o farelo de girassol é adequado para a produção de etanol de segunda geração tanto a partir da hemicelulose como de celulose

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico Selection of the most suitable yeast host for heterologous protein expression is important for the success of a biotechnological process. However despite the diversity of works with protein expression in yeasts the secretion level in these organisms are still low when compared with filamentous fungi. The yeast Kluyveromyces marxianus has a great potential for fermentation and protein production. Although, there are few studies reporting heterologous expression in this yeast. It shows the need for more studies to develop an efficient system for the recombinant protein production in this yeast. The aim of this work was the construction of linear cassettes for expression heterologous proteins in K. marxianus. The cassettes were constructed by fusion PCR. For this purpose we performed a first reaction cycle in which each fragment was amplified individually (the promoter, the gene of interest and the selection mark). The promoters (ScHXT1p, ScPGKp, ScTDH3p, KmINU1p and KmPCPL3p) were amplified from the genome of S. cerevisiae and K. marxianus. The endoglucanase and celobiohidrolase genes from A. niger (eng1 and cbhA) were cloned in pKLAC1 vector that was then used as template to amplify the sequence of genes flanked by the sequences of the Kluyveromyces lactis signal peptide α-mating factor and LAC4 gene terminator. The gene KanMX, which confers resistance to geneticin (G418) in eukaryotes, was amplified from genome of a S. cerevisiae mutant. The second step was a fusion PCR reaction of the fragments: the promoter desired, α-MF-gene of interest-TT and the KanMX. This construction was efficient, reproducible and capable of being held in a shorter time than tradicional cloning methods. The constructions were used in K. marxianus UFV-3 transformation by two different methods, the lithium acetate and electroporation. The lithium acetate protocol was more efficient and the transformants were selected by resistance to increased G418 concentrations. A escolha da levedura hospedeira para produção de uma proteína heteróloga é fundamental para o sucesso de um processo biotecnológico, porém, apesar da diversidade de trabalhos com expressão de proteínas em leveduras, os níveis de secreção nesses organismos ainda são considerados baixos quando comparadas aos fungos filamentosos. A levedura K. marxianus possui grande potencial biotecnológico para fermentação e produção de proteínas. Apesar desse potencial existem poucos trabalhos relatando a expressão heteróloga de proteínas nessa levedura. Este quadro demonstra a necessidade de mais estudos para padronização de um sistema fácil e eficiente para obtenção de K. marxianus recombinantes para produção de proteínas de interesse. O objetivo deste trabalho foi padronizar a construção de cassetes lineares para expressão de proteínas heterólogas em K. marxianus. Os cassetes de expressão foram construídos pela técnica de PCR de fusão. Para tanto foi realizado um primeiro ciclo de reação na qual foi amplificado individualmente cada fragmento integrante do cassete (o promotor, o gene de interesse e a marca de seleção). Os promotores escolhidos, ScHXT1p, ScPGKp, ScTDH3p, KmINU1p e KmPCPL3p, foram amplificados do genoma de S. cerevisiae ou K. marxianus. Os genes das enzimas endoglucanase e celobiohidrolase de Aspergillus níger (eng1e cbhA) foram clonados no vetor KLAC1 e este foi utilizado como molde para amplificação da sequência dos genes flanqueados pelas sequências do peptídeo sinal α-mating factor de Kluyveromyces lactis e do terminador do gene lac4 de Kluyveromyces lactis. A sequência codificadora do gene KanMX, marca de seleção que confere resistência em eucariotos para o antibiótico geneticina (G418), foi amplificado do DNA genômico de uma linhagem mutante de S. cerevisiae. O segundo passo consistiu da reação de fusão dos fragmentos de cada promotor com os fragmentos αMF-gene-TT e KanMX por PCR. Esse tipo de construção se mostrou eficiente, reprodutível e passível de ser realizada em tempo muito inferior àquele de métodos de clonagem tradicionais. Os cassetes construídos foram utilizados na transformação de leveduras Kluyveromyces marxianus UFV-3 por dois métodos, acetato de lítio e eletroporação. O protocolo de acetato de lítio foi mais eficiente e as colônias obtidas foram selecionadas por resistência às concentrações crescentes de G418.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico The high cost of cellulase is one of the main barriers for the bioconversion of lignocellulose to ethanol, and the coupling of cellulase production and the simultaneous saccharification and fermentation of bagasse, in the Consolidated Bioprocessing, can contribute to the viability of this process. This strategy requires a biocatalyst agent, or a consortium of micro-organisms, able to secrete cellulolytic enzymes and ferment the resulting sugars to ethanol. The yeast Kluyveromyces marxianus emerges in the biotechnological scenario of ethanol production by presenting key features - such as thermotolerance, production capacity of ethanol in aerated environment and high potential for protein secretion - for use in Consolidated Bioprocessing. In this work, K. marxianus UFV-3 were transformed with expression cassettes containing the cbhA or eng1 A. niger genes, which respectively encode an endoglucanase and a cellobiohydrolase, with secretion directed by the K. lactis α-MF signal peptide, under control of the S. cerevisiae PGK promoter, and the selection mark kanMX. cbhA clones were obtained with differential expression and secretion of cellobiohydrolase, in relation to non-transformed strain, suggesting that the S. cerevisiae PGK promoter, and the K. lactis α-MF signal peptide are recognized by the machinery of expression and secretion of K. marxianus UFV-3. The characterization of a cbhA clone, with increased secretion of recombinant cellobiohydrolase, suggests that the heterologous expression of recombinant proteins leads to changes in metabolic profile and secretion in the cells. The Response Surface Methodology was used to study and optimization of culture conditions that favor the secretion of endogenous and heterologous proteins in K. marxianus UFV-3. Our results indicate that the mycelial growth of K. marxianus, observed in limiting conditions of growth, is closely related to increased secretion of proteins in these conditions. The results presented here about genetic manipulation and culture conditions that promote protein secretion in K. marxianus UFV-3 open perspectives for obtaining a consortium of yeast, with recombinant and wild strains, - with ability to secrete cellulases, to hydrolyze cellulose and to ferment derived sugars - for use in Consolidated Bioprocessing on cellulosic ethanol production. O alto custo de celulases constitui uma das principais barreiras para a bioconversão de lignocelulose em etanol, e o acoplamento da produção de celulases à sacarificação e fermentação simultânea do bagaço, em Bioprocesso Consolidado, pode contribuir para a viabilização deste processo. Para tanto, seria necessário um agente biocatalizador, ou um consórcio de micro-organismos, capaz de secretar enzimas celulolíticas e fermentar os açúcares resultantes a etanol. A levedura Kluyveromyces marxianus desponta no cenário biotecnológico de produção de etanol por apresentar características chave - como termotolerância, capacidade de produção de etanol em ambiente aerado e alto potencial para secreção de proteínas - para uso em Bioprocesso Consolidado. Neste trabalho, K. marxianus UFV-3 foram transformadas com cassetes de expressão contendo os genes eng1 ou cbhA de A. niger, que codificam respectivamente uma endoglucanase e uma celobiohidrolase, com secreção dirigida pelo peptídeo sinal α-MF de K. lactis, sob controle do promotor PGK de S. cerevisiae, e a marca de seleção kanMX. Foram obtidos clones cbhA com expressão e secreção diferencial, em relação à cepa não transformada, sugerindo que o promotor PGK, de S. cerevisiae, e o peptídeo sinal α-MF, de K. lactis, são reconhecidos pela maquinaria de expressão e secreção de K. marxianus UFV-3. A caracterização de um clone cbhA, com maior secreção de celobiohidrolase recombinante, sugere que a expressão heteróloga leva a mudanças metabólicas e no perfil de secreção de proteínas nas células recombinantes. A Metodologia de Superfície de Resposta foi utilizada para estudo e otimização das condições de cultivo que favorecem a secreção de proteínas endógenas e heteróloga em K. marxianus UFV-3. Nossos resultados indicam que o crescimento micelial de K. marxianus, observado em condições limitantes de crescimento, está altamente relacionado ao aumento da secreção de proteínas nestas condições. Os resultados apresentados sobre a manipulação genética e condições que favorecem a secreção de proteínas em K. marxianus UFV-3 abrem perspectiva para a obtenção de um consórcio de leveduras recombinantes e selvagens - com capacidade de secreção de celulases, hidrólise da celulose e fermentação dos açúcares resultantes - para aplicação em Bioprocesso Consolidado na produção de etanol celulósico.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico Kluyveromyces marxianus são leveduras promissoras para a fermentação de glicose e xilose, os principais açúcares presente no hidrolisado de bagaço de cana. No presente trabalho, foi investigado o consumo de xilose em presença de glicose bem como a capacidade de K. marxianus em fermentar várias combinações desses dois açúcares. Células de K. marxianus UFV-3 cultivadas em 20 gL-1 glicose e 20 gL-1 xilose apresentaram um período de adaptação de 30h para o início do consumo da xilose, após a glicose ter sido totalmente consumida. Entretanto, esse período de adaptação não foi observado quando as células foram cultivadas em 5 gL-1 glicose e 20 gL-1 xilose. Nessas condições, as células começaram a consumir xilose logo após a glicose ter sido exaurida do meio. Além disso, foi demonstrado que glicose e xilose podem ser consumidas simultaneamente, quando a respiração é bloqueada. A produção de etanol foi maior quando em mistura de glicose e xilose comparado à glicose sozinha. Por outro lado, K. marxianus UFV-3 não foi capaz de produzir etanol a partir de xilose nas condições avaliadas. Visando selecionar uma linhagem capaz de fermentar xilose, células de K. marxianus UFV-3 foram submetidas à engenharia evolutiva. Mutagênese foi aplicada com o intuito de aumentar a variabilidade genética da população e diminuir o tempo de seleção. Duas técnicas para inserção de mutações aleatórias foram utilizadas: REMI (Integração Mediada por Enzima de Restrição) e radiação ultravioleta (UV). Populações mutantes foram submetidas à seleção em quimiostatos e em bateladas sequenciais. Em quimiostato conduzido sob hipoxia, com uma taxa de diluição de 0.15 h-1 e uma mistura de 5 gL-1 glicose e 10 gL-1 xilose, isolou- se um mutante da população de células submetidas à REMI (KmRhyp). Este isolado produziu 12% mais etanol que a linhagem selvagem, mas com dobro de xilitol. Em batelada sequencial foi isolado um mutante da população irradiada por UV (KmUVsb) capaz de formar etanol de xilose e produzir menor quantidade de xilitol que a linhagem selvagem. Diferenças entre a linhagem selvagem e KmUVsb foram relacionadas a diferenças observadas na atividade de algumas enzimas. A razão entre as atividades específicas da xilitol desidrogenase e da xilose redutase foi maior para a linhagem mutante. As atividades específicas das enzimas da via fermentativa: piruvato descarboxilase e álcool desidrogenase também foram maiores em KmUVsb. Culturas conduzidas em quimiostato limitado por xilose sob condições de aerobiose foram submetidas a um pulso de glicose (50 mmoles.L-1). Nem a linhagem selvagem nem a mutante produziram etanol instantaneamente, confirmando efeito Crabtree-negativo. Etanol foi detectado no sobrenadante após 60 minutos, e a produção deste metabólito foi duas vezes maior na linhagem mutante. Além disso, KmUVsb foi capaz de crescer em anaerobiose estrita na presença de xilose como única fonte de carbono. Kluyveromyces marxianus strains are promising candidates to ferment glucose and xylose, the main sugars in hydrolyzed sugarcane bagasse. In this work, it was investigated the xylose consumption in the presence of glucose and the K. marxianus UFV-3 ability to ferment various combinations of these two sugars. K. marxianus UFV-3 cultured on 20 gL-1 glucose and 20 gL-1 xylose presented a lag phase of 30h to start xylose consumption after glucose depletion. However, this period of adaptation was not observed when cells were grown on 5 gL -1 glucose and 20 gL-1 xylose. Under these conditions, the cells began to consume xylose after glucose had been exhausted. Furthermore, it was demonstrated that glucose and xylose can be consumed simultaneously, when respiratory chain is blocked. The ethanol production was higher in a glucose/ xylose mixture compared to glucose alone. K. marxianus UFV-3 was not able to produce ethanol from xylose. In order to select a strain able to ferment xylose, K. marxianus UFV-3 were subjected to evolutionary engineering. Mutagenesis was applied to increase the genetic variability of the population and to reduce the selection time. Two methods for random mutations were used: REMI (Restriction Enzyme Mediated Integration) and ultraviolet irradiation (UV). Mutant populations were subjected to selection in chemostats and sequential batches. In chemostats conducted under hypoxia, with a dilution rate of 0.15 h -1 in a 5 gL-1 glucose and 10 gL-1 xylose mixture, a mutant from REMI population was isolated (KmRhyp). The isolate produced 12% more ethanol but with twice xylitol compared to the wild type. In sequential batches, it was isolated a mutant from the UV irradiated population (KmUVsb) which was able to form ethanol from xylose with 2-times less xylitol than wild type strain. The differences between wild type and KmUVsb were related to differences in the activity of some enzymes. The ratio of xylitol dehydrogenase specific activity to xylose reductase specific activity was higher in the mutant strain. The specific activities of fermentative pathway enzymes: pyruvate decarboxylase and alcohol dehydrogenase were also higher in KmUVsb. Cultures conducted in xylose- limited chemostats under aerobiosis were subjected to glucose pulse (50 mmoles/L). Neither the wild type nor the mutant strain formed ethanol instantly, confirming Crabtree-negative effect. Ethanol was detected on the supernatant after 60 minutes and it was twice as high as for mutant strain. In addition, KmUVsb was able to grow under strict anaerobiosis in the presence of xylose as the only carbon source.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico Kluyveromyces marxianus is a yeast with many beneficial properties for the development an efficient process for producing ethanol from simultaneous saccharification and fermentation of biomass: a high growth rate, the utilization of a wide range of sugar types, a efficient system for protein secretion and fermentation capacity at temperatures around 42 ºC. The heterologous expression of thermostable cellulases in K. marxianus have been the focus of many researches. The vector pKLAC1-adh2p, for constitutive expression of cellulases in K. marxianus, was constructed at Laboratory of Molecular Biotechnology (LBM/UFV). In this study, the gene of a β-glucosidase from Aspegillus niger was cloned and inserted into pKLAC1-adh2p. The expression cassette, pKLAC1-adh2p-bgl1 was used for transformation of K. marxianus UFV-3, but the selection process was not efficient, and during screening of transformants yeasts, we observed the ability of the yeast K. marxianus to secrete a β-glucosidase. Thus, while works on standardization of an efficient system for heterologous expression in K. marxianus have been developed in laboratory (LBM/UFV), this β-glucosidase extracellular from K. marxianus was characterized. Theresponse surface methodology was used to optimize the production process and determine the parameters pH and temperature for enzyme activity. The best conditions for production were glucose 4%, pH 5.5 and incubation at 35°C. The highest activity was obtained at pH 5.5 and 55°C. Thermostability tests determined a half-life of 4 hours for the enzyme, when incubated at 60 ° C. Analysis of substrate specificity showed that the enzyme was able to hydrolyze cellobiose, p-nitrophenyl-β-Dglucopyranoside, o-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside, p-nitrophenyl-β-cellobioside and p-nitrophenyl-β-D-xylopyranoside. The enzyme was purified by non-denaturing electrophoresis in polyacrylamide gel (PAGE) and zymogram analysis. The SDS-PAGE analysis revealed two major bands around 45 KDa, which were submitted at in-gel trypsin digestions and analyzed by mass spectrometry (MS/MS). The protein was identified as a β-glucosidase. To finish this work, the β-glucosidase was purified by ultrafiltration and anion exchange chromatography. The purification process was monitored by enzymatic assay using p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside as substrate and SDS-PAGE. These results show for the first time a β-glucosidase secreted in a fermentative yeast, this opens the possibility to use this yeast for cellulosic ethanol production, since the costs with the use of cellulases makes the process uneconomical. Kluyveromyces marxianus é uma levedura com muitas características desejáveis para o desenvolvimento de um eficiente processo de produção de etanol a partir da sacarificação e fermentação simultâneas de biomassas: elevada taxa de crescimento, utilização de uma ampla variedade de açúcares, eficiente sistema de secreção de proteínas e a capacidade de fermentação em temperaturas próximas a 42ºC. A expressão heteróloga de celulases termoestáveis em K. marxianus têm sido o foco de várias pesquisas. O vetor pKLAC1-adh2p, para expressão constitutiva de celulases em K. marxianus, foi construído no Laboratório de Biotecnologia Molecular (LBM/UFV). Neste trabalho o gene de uma β-glicosidase de Aspegillus niger foi clonado e inserido no pKLAC1-adh2p. O cassete de expressão, pKLAC1-adh2p-bgl1, foi utilizado para transformação de K. marxianus UFV-3, porém o processo de seleção não foi eficiente e, durante a triagem por leveduras transformantes, foi observada a capacidade da levedura K. marxianus de secretar uma β-glicosidase. Dessa forma, enquanto trabalhos de padronização de um eficiente sistema de expressão heteróloga em K. marxianus vêm sendo desenvolvidos no laboratório (LBM/UFV), esta β-glicosidase extracelular de K. marxianus foi caracterizada. A metodologia de superfície de resposta foi utilizada para otimizar o processo de produção e determinar os parâmetros pH e temperatura ótimos para a atividade da β-glicosidase extracelular. As melhores condições do meio para produção foram 4% de glicose, pH 5,5 e incubação a 35°C. A maior atividade enzimática foi obtida em pH 5,5 e 55°C. Ensaios de termoestabilidade determinaram uma meia-vida de 4 horas para a enzima, quando incubada a 60°C. A análise de especificidade por substratos mostrou que a enzima foi capaz de hidrolisar celobiose, p-nitrofenil-β-D-glicopiranosídeo, o-nitrofenil-β-Dglicopiranosídeo, p-nitrofenil-β-cellobiosídeo e p-nitrofenil-β-D-xilopiranosídeo. A enzima foi purificada por eletroforese não desnaturante em gel de poliacrilamida (PAGE) e análise de zimograma. A análise por SDS-PAGE revelou duas bandas majoritárias em torno de 45 KDa, que foram submetidas à digestão tríptica em gel e analisadas por espectrometria de massas (MS/MS). A proteína foi identificada como uma β-glicosidase. Para finalizar este trabalho, a β-glicosidase foi purificada por ultrafiltração e cromatografia de troca aniônica. O processo de purificação foi acompanhado por ensaio enzimático utilizando p-nitrofenil-β-D-glicopiranosídeo como substrato e SDS-PAGE. Estes resultados mostram pela primeira vez uma β- glicosidase secretada por uma levedura fermentadora, isto abre a possibilidade para o uso de desta levedura para produção de etanol celulósico, já que os custos com a utilização de celulases ainda inviabilizam economicamente o processo.

O objetivo deste trabalho foi avaliar a composição do meio de cultura para a produção da enzima B-galactosidase de Kluyveromyces marxianus CCT 7082 utilizando a técnica de delineamento experimental. A produção da enzima foi realizada em meio composto por soro de queijo, água de maceração de milho (AMM) e hidrolisado de levedura Prodex-lac® e sais. Foi realizado um planejamento experimental fracionário (25-1) para determinar as variáveis significativas na produção da enzima. Foram testadas diferentes concentrações de lactose presente no soro de queijo (10 a 70 g L-1), AMM (10 a 100 g L-1), Prodex-lac (4 a 20 g L-1), (NH4)2SO4 (0 a 10 g L-1) e o pH (5 a 7). As variáveis concentração de lactose, AMM e o pH apresentaram efeito estatisticamente significativo na atividade enzimática dentro das faixas estudadas, sendo estas variáveis empregadas num delineamento composto central rotacional para otimizar a produção da enzima. As faixas testadas foram: concentração de lactose de 40 a 100 g L-1, AMM de 10 a 120 g L-1 e pH de 3,5 a 6,5. As condições que resultaram em maior atividade enzimática (1400 U g-1) foram 70 g L-1 de lactose, 65 g L-1 de AMM, 4 g L-1 de Prodex-lac e pH 5, obtendo uma produtividade de 61 U L-1 h-1. The objective of this work was to evaluate the composition of the culture medium for the production of the enzyme B-galactosidase from Kluyveromyces marxianus CCT 7082 using an experimental design. Enzyme production was carried out in a medium consisting of cheese whey, corn steep liquor (CSL) and Prodex-lac® yeast hydrolyzate. A factorial fractional design (25-1) was performed to determine the significant variables in the production of the enzyme. Different concentrations of lactose present in whey (10-70 g L-1), CSL (10-100 g L-1), Prodex-lac (40- 20 g L-1), (NH4)2SO4 (0-10 g L-1) and pH (5-7) were tested. Lactose concentration, CSL and pH were the variables that showed a statistically significant effect on enzyme activity within the ranges studied, and these variables were used in a central composite rotatable design to optimize production of the enzyme. The ranges used were: lactose concentration 40-100 g L-1, CSL 10-120 g L-1, and pH 3.5-6.5. The conditions that resulted in higher enzyme activity (1400 U g-1) were 70 g L-1 lactose, 65 g L-1 CSL, 4 g L-1 Prodex-lac and pH 5, yielding 61 U L-1 h-1.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico Recently, global demand for ethanol fuel has expanded very rapidly, and this should further increase in the near future, almost all ethanol fuel is produced by fermentation of sucrose or glucose in Brazil and produced by corn in the USA, but these raw materials will not be enough to satisfy international demand. The aim of this work was studied the ethanol production from cashew apple juice. A commercial strain of Saccharomyces cerevisiae was used for the production of ethanol by fermentation of cashew apple juice. Growth kinetics and ethanol productivity were calculated for batch fermentation with different initial sugar (glucose + fructose) concentration (from 24.4 to 103.1 g.L-1). Maximal ethanol, cell and glycerol concentrations (44.4 g.L-1, 17.17 g.L-1, 6.4 g.L-1, respectively) were obtained when 103.1 g.L-1 of initial sugar concentration were used, respectively. Ethanol yield (YP/S) was calculated as 0.49 g (g glucose + fructose)-1. Pretreatment of cashew apple bagasse (CAB) with dilute sulfuric acid was investigated and evaluated some factors such as sulfuric acid concentration, solid concentration and time of pretreatment at 121°C. The maximum glucose yield (162.9 mg/gCAB) was obtained by the hydrolysis with H2SO4 0.6 mol.L-1 at 121°C for 15 min. Hydrolysate, containing 16 ± 2.0 g.L-1 of glucose, was used as fermentation medium for ethanol production by S. cerevisiae and obtained a ethanol concentration of 10.0 g.L-1 after 4 with a yield and productivity of 0.48 g (g glucose)-1 and 1.43 g.L-1.h-1, respectively. The enzymatic hydrolysis of cashew apple bagasse treated with diluted acid (CAB-H) and alkali (CAB-OH) was studied and to evaluate its fermentation to ethanol using S. cerevisiae. Glucose conversion of 82 ± 2 mg per g CAB-H and 730 ± 20 mg per g CAB-OH was obtained when was used 2% (w/v) of solid and loading enzymatic of 30 FPU/g bagasse at 45 °C. Ethanol concentration and productivity was achieved of 20.0 ± 0.2 g.L-1 and 3.33 g.L-1.h-1, respectively when using CAB-OH hydrolyzate (initial glucose concentration of 52.4 g.L-1). For CAB-H hydrolyzate (initial glucose concentration of 17.4 g.L-1), ethanol concentration and productivity was 8.2 ± 0.1 g.L-1 and 2.7 g.L-1.h-1, respectively. Hydrolyzates fermentation resulted in an ethanol yield of 0.38 g/g glucose and 0.47 g/g glucose, with pretreated CABOH and CAB-H, respectively. The potential of cashew apple bagasse as a source of sugars for ethanol production by Kluyveromyces marxianus CE025 was evaluated too in this work. First, the yeast CE025 was preliminary cultivated in a synthetic medium containing glucose and xylose. Results showed that it was able to produce ethanol and xylitol at pH 4.5. Next, cashew apple bagasse hydrolysate (CABH) was prepared by a diluted sulfuric acid pre-treatment. The fermentation of CABH was conducted at pH 4.5 in a batch-reactor, and only ethanol was produced by K. marxianus CE025. The influence of the temperature in the kinetic parameters was evaluated and best results of ethanol production (12.36 ± 0.06 g.L-1) was achieved at 30 ºC, which is also the optimum temperature for the formation of biomass and the ethanol with a volumetric production rate of 0.25 ± 0.01 g.L-1.h-1 and an ethanol yield of 0.42 ± 0.01 g/g glucose. The results of this study point out the potential of the cashew apple bagasse hydrolysate as a new source of sugars to produce ethanol by S. cerevisiae and K. marxianus CE025. With these results, conclude that the use of cashew apple juice and cashew apple bagasse as substrate for ethanol production will bring economic benefits to the process, because it is a low cost substrate and also solve a disposal problem, adding value to the chain and cashew nut production Recentemente, a demanda mundial por etanol combustível tem se expandido de forma muito rápida, sendo quase todo etanol combustível é produzido por fermentação de sacarose no Brasil ou glicose de milho nos Estados Unidos, porém, estas matérias-primas não serão suficientes para satisfazer a demanda internacional. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi avaliar a produção de bioetanol a partir do pedúnculo de caju. Para tal fim, inicialmente, estudou-se a produção de etanol utilizando o suco de caju como fonte de carbono, avaliando a influência da concentração inicial de substrato por Saccharomyces cerevisiae. Nessa etapa, os melhores resultados foram utilizando uma concentração inicial de açúcar de 87,71 g.L-1 obtendo a concentração máxima de etanol de 42,8 ± 3 g.L-1 com uma produtividade de 9,71 g.L-1.h-1 e rendimento de etanol de 0,49 g etanol/g glicose + frutose. Posteriormente, estudou-se a produção de etanol utilizando como material lignocelulósico o bagaço de caju (CAB) que continha 20,9% celulose, 16,3% hemicelulose e 33,6% lignina + cinzas. Inicialmente estudou-se o pré-tratamento do CAB com ácido sulfúrico diluído avaliando-se diferentes parâmetros, obtendo as maiores concentrações dos açúcares glicose (22,8 ± 1,5 g.L-1) e xilarabin (arabinose + xilose plus, 29,2 ± 2,4 g.L-1), na fração líquida (CAB-H), no pré-tratamento conduzido em autoclave a 121°C por 15 min usando H2SO4 0,6 mol.L-1 e 30% m/v de CAB, com rendimentos de glicose, xilarabin e açúcares totais de 75,99 ± 5,0, 97,17 ± 8,1 e 173,16 ± 13,0 mg.(g de bagaço)-1, respectivamente. A conversão obtida nesse pré-tratamento com base na percentagem de celulose e hemicelulose do CAB foi 322,1 ± 20,1 mg glicose.(g celulose)-1 e 514,1 ± 43,1 mg xilarabin.(g hemicelulose)-1. Na fermentação do hidrolisado CAB-H por S. cerevisiae obteve-se 10 g.L-1 de etanol após 4 horas de cultivo, com rendimento de 0,48 g.(g glicose)-1 e produtividade de 2,62 g.L-1h-1. Após, estudou-se a hidrólise enzimática do CAB após pré-tratamento com H2SO4 diluído (CAB-H) e alcalino (CAB-OH) e a fermentação dos hidrolisados por S. cerevisiae para produzir etanol. Uma conversão de glicose de 82 ± 2 mg.(gCAB-H)-1 e 730 ± 20 mg.(gCAB-OH)-1 foi obtida utilizando 2% (m/v) de sólidos e carga enzimática de 30 FPU.(g bagaço)-1 a 45°C. Na fermentação conduzida com o hidrolisado obtido da hidrólise enzimática do CAB-OH, obteve-se uma concentração de etanol, produtividade e rendimento de 20,0 ± 0,2 g.L-1, 3,33 g.L-1.h-1 e 0,38 g.(g de glicose)-1, respectivamente. Para o hidrolisado da hidrólise do CAB-H, a concentração de etanol foi 8,2 ± 0,1 g.L-1 com 2,7 g.L-1.h-1 de produtividade e rendimento de 0,47 g.(g glicose)-1 em 3 h de ensaio. O potencial do bagaço de caju como fonte de açúcares para a produção de etanol por Kluyveromyces marxianus CE025 também foi avaliado e verificou-se a influência da temperatura nos parâmetros cinéticos, sendo os ensaios conduzidos em batelada a pH 4,5, utilizado o hidrolisado (CAB-H) como fonte de carbono. Os melhores resultados para a produção de etanol foram a 30°C, coincidindo com a temperatura ótima de crescimento, resultando em 12,36 ± 0,06 g.L-1 de etanol, com uma taxa volumétrica de produção de 0,26 ± 0,01 g.L-1.h-1 e rendimento de 0,42 ± 0,01 g.(g de glicose)- 1. Os resultados apresentados demonstram o potencial do pedúnculo de caju (suco e bagaço) como nova fonte de carbono para produzir etanol por S. cerevisiae e K. marxianus CE025

O presente trabalho visou a aplicação da β-1,3 glucanase lítica, obtida do microrganismo Cellulosimicrobium cellulans 191, na produção de protoplastos e na lise da parede celular de leveduras. A preparação bruta da enzima foi capaz de lisar as leveduras Kluyveromyces lodderi, Saccharomyces cerevisiae (Fleischmann e Itaiquara), S. cerevisiae KL-88, S. diastaticus NCYC 713, S. cerevisiae NCYC 1001, Candida glabrata NCYC 388, Kluyveromyces marxianus NCYC 587 e Hansenula mrakii NCYC 500. A β-1,3 glucanase purificada foi capaz de lisar as leveduras Saccharomyces cerevisiae KL-88, Saccharomyces capensis, Debaromyces vanriji, Pachysolen tannophillus, Kluyveromyces drosophilarum, Candida glabrata, Hansenula mrakii e Pichia membranaefaciens e formar protoplastos de Saccharomyces cerevisiae KL-88. The aim of this work was the application of lytic β-1,3 glucanase obtained from Cellulosimicrobium cellulans strain 191 in the production of protoplasts and lysis of yeast cell walls. The crude extract demonstrated lysis activity against the yeasts Kluyveromyces lodderi, Saccharomyces cerevisiae (Fleischmann and Itaiquara), S. cerevisiae KL-88, S. diastaticus NCYC 713, S. cerevisiae NCYC 1001, Candida glabrata NCYC 388, Kluyveromyces marxianus NCYC 587, and Hansenula mrakii NCYC 500. The purified β-1,3 glucanase demonstrated lysis activity against the yeasts Saccharomyces cerevisiae KL-88, Saccharomyces capensis, Debaromyces vanriji, Pachysolen tannophillus, Kluyveromyces drosophilarum, Candida glabrata, Hansenula mrakii, and Pichia membranaefaciens, and it was able to produce Saccharomyces cerevisiae KL-88 protoplasts.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:23Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-03-23Bitstream added on 2014-06-13T19:35:26Z : No. of bitstreams: 1 paula_fc_me_rcla.pdf: 631356 bytes, checksum: 37d2f07653025c4a4c953cfbd2fb8073 (MD5) Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) O interesse pela inulinase iniciou-se com a descoberta de sua habilidade de hidrolisar inulina, um polimero vegetal, em fmtose praticamente pura. A frutose é considerada uma alternativa segura como adoçante em relação à sacarose, sendo largamente utilizada na indústria de alimentos. As inulinases são geralmente tennoestáveis e comercialmente viáveis para aplicações industriais. Entretanto, uma produção contínua de frutose requer a utilização de uma inulinase imobilizada. Neste trabalho, o caldo fermentado, isento de células, de Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus foi imobilizado em vários suportes: carvão ativado, diatomito, casca de ovo, amberlite, sílica de porosidade controlada e gelatina. A mais alta taxa de imobilização foi obtida em gelatina (82,60%). Os métodos restantes avaliados não foram bem sucedidos, seja pela ausência de ligação protéica ou perda de atividade provocados pelo processo de imobilização. O pH ótimo da inulinase imobilizada foi o mesmo da enzima livre (3,5). As temperaturas ótimas foram 55 °C para a enzima livre e 60 °C para a inulinase imobilizada. O gráfico de Arrhenius apresentou-se linear e as energias de ativação foram 56,20 KJ/mol.°K (enzima livre) e 20,27 KJ/mol.°K (enzima imobilizada). Os parâmetros cinéticos foram calculados pelo gráfico de LineweaverBurk e os valores de Km e Vmax foram de 20,68 mg/mL e 37,73 UA/mg para a enzima livre; e 50,05 mg/mL e 31,64 UA!mg para a enzima imobilizada, respectivamente. A estabilidade operacional da inulinase imobilizada foi avaliada em reator tubular de leito fixo, durante 782 horas, apresentando 58,12% de atividade enzimática residual. Foi realizada uma cromatografia de camada delgada para uma análise qualitativa dos produtos da reação. The interest for inulinase began when it was discovered its ability to hydrolyse inulin, a vegetal polymer, in fructose practically pure. Fructose is considered as a safe altemative sweetener to sucrose, widely used in food industries. The inulinases are usually thermostable and cornmercially available for industrial applications. However, a continuous production of fructose requires the use of an immobilized inulinase. In this work, the crude enzyme broth free celis from Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus was imrnobilized on various supports: activated carbon, diatomite, hen egg shell, amberlite, porous silica and gelatin. The highest irnrnobilization yield was obtained in gelatin (82,60%). The remaining methods screened were not successful either because no protem binding occurred or irnmobilization process resulted in activity loss. The optimum pH of immobilized inulinase remained the sarne as that of free enzyme (3,5). The optimum temperatures were 55 °C for free enzyrne and 60 °C for the imrnobilized inulmase. The Arrhenius plot were linear and activation energies were 56,20 KJ/mol.°K (Free enzyme) and 20,27 KJ/rnol.°K (Immobilized enzyme). The kinetic parameters were calculated from Lineweaver-Burk plots and the values of Km and Vmax were 20,68 mg/mL and 37,73 UA/rng for free inulinase; and 50,05 rng/rnL and 31,64 UA/rng for immobilized enzyme, respectively. The operational stability of the immobilized inulinase was studied in continuous fixed bed colurnn reactor for 782 hours with 58,12% of residual activity. Thin layer chromatography was used for qualitative analysis of the reaction products.

Orientador: Francisco Maugeri Filho Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Doutorado Doutor em Engenharia de Alimentos

Dissertação de doutoramento em Engenharia Química e Biológica., Com o trabalho presente nesta dissertação pretendeu-se estabelecer procedimentos para a purificação da enzima endo-poligalacturonase, produzida pela levedura Kluyveromyces marxianus. Para tal foram usados os sistemas de duas fases aquosas. As estirpes provenientes da fermentação do cacau foram estudadas para encontrar a melhor produtora de enzima utilizando, como fonte de carbono, a glucose ou a sacarose. Foram seleccionadas as estirpes CH4-1, CH0-1 e CCT 3172. Para esta última estirpe, foram realizados ensaios em que se verificou que a produtividade da enzima era máxima quando somente era utilizada a agitação mecânica, sem introdução de ar. Para os ensaios de purificação foram determinados alguns diagramas de fases, cuja informação foi utilizada nos ensaios de partição e extracção. Foram realizados ensaios de partição para vários sistemas de duas fases aquosas. Verificou-se que os sistemas mais adequadas para a partição da enzima são os sistemas de composição 24 % PEG-5,6 % (NH4)2SO4 e 6,9 % PEG8000-8,7 % PVA (percentagens mássicas). Foram propostos 2 esquemas de separação. O primeiro, constituído por um sistema de composição 24 % PEG-5,6 % (NH4)2SO4, cujo objectivo foi a extracção da enzima, em série com um segundo que, por adição de mais sal, permitia a recuperação do PEG. O factor de purificação obtido foi de 1,25 e factor de concentração entre 5 e 8. Este esquema promovia a concentração da endo-PG. O segundo esquema tem como objectivo a purificação e a concentração. Para tal é utilizado um sistema de composição 6,9 % PEG8000-8,7 % PVA, seguido de outro de composição 24 % PEG-5,6 % (NH4)2SO4. Foram obtidos factores de purificação e concentração de 1,87 e 5,2, respectivamente. A recuperação da enzima foi de 91 %. Os polímeros termossensíveis foram também estudados. Foi proposto um esquema de separação, baseado no sistema 27 % Ucon – 2,2 % (NH4)2SO4 que permitia a purificação e concentração da enzima e, concomitantemente, a recuperação do Ucon, por aumento da temperatura. Foram alcançados factores de concentração de 10 com recuperação de enzima superiores a 95 %. Com este trabalho foram propostos 3 esquemas de extracção, que se verificaram adequados para a purificação da enzima endo-poligalacturonase. . The aim of the work presented in this thesis was the establishment of procedures for the purification of the enzyme endo-polygalacturonase, obtained by Kluyveromyces marxianus fermentation. For that purpose, the aqueous two-phase extraction was used. The strains, isolated from cocoa fermentation, were studied to find the best enzyme producer, using glucose or sucrose as carbon source. The strains CH4-1, CH0-1 e CCT 3172 were selected. For this last strain, some experiments were done, being possible to see that the enzyme productivity was higher when only mechanical stirring was used, without air injection. Partition experiments were done using various aqueous two-phase systems. It was possible to see that the more suitable systems for enzyme extraction were the ones with the following composition: 24 % PEG-5.6 % (NH4)2SO4 and 6.9 % PEG8000-8.7 % PVA. Two separation schemes were proposed. The first one, constructed for the system 24 % PEG-5.6 % (NH4)2SO4, which objective was the enzyme extraction, in series with a second one that, with more salt addition, allows to the PEG recuperation. The purification factor obtained was 1.25 and the concentração factor was between 5 and 8. This scheme allows endo-PG purification. The second scheme has the objective of purification and concentration. For that, a system with composition 6.9 % PEG8000-8.7 % PVA, followed by another of 24 % PEG-5.6 % (NH4)2SO4, was used. Purification and concentration factor of 1.87 and 5.2, respectively, were obtained. The enzyme yield was 91 %. The thermoseparating polymers were also studied. One separation scheme based on the system 27 % Ucon – 2.2 % (NH4)2SO4, was proposed. This scheme allows enzyme purification and concentration and at the same time Ucon recuperation, by temperature increasing. Concentration factor of 10 and enzyme recuperation higher than 95 % were obtained., The aim of the work presented in this thesis was the establishment of procedures for the purification of the enzyme endo-polygalacturonase, obtained by Kluyveromyces marxianus fermentation. For that purpose, the aqueous two-phase extraction was used. The strains, isolated from cocoa fermentation, were studied to find the best enzyme producer, using glucose or sucrose as carbon source. The strains CH4-1, CH0-1 e CCT 3172 were selected. For this last strain, some experiments were done, being possible to see that the enzyme productivity was higher when only mechanical stirring was used, without air injection. Partition experiments were done using various aqueous two-phase systems. It was possible to see that the more suitable systems for enzyme extraction were the ones with the following composition: 24 % PEG-5.6 % (NH4)2SO4 and 6.9 % PEG8000-8.7 % PVA. Two separation schemes were proposed. The first one, constructed for the system 24 % PEG-5.6 % (NH4)2SO4, which objective was the enzyme extraction, in series with a second one that, with more salt addition, allows to the PEG recuperation. The purification factor obtained was 1.25 and the concentração factor was between 5 and 8. This scheme allows endo-PG purification. The second scheme has the objective of purification and concentration. For that, a system with composition 6.9 % PEG8000-8.7 % PVA, followed by another of 24 % PEG-5.6 % (NH4)2SO4, was used. Purification and concentration factor of 1.87 and 5.2, respectively, were obtained. The enzyme yield was 91 %. The thermoseparating polymers were also studied. One separation scheme based on the system 27 % Ucon – 2.2 % (NH4)2SO4, was proposed. This scheme allows enzyme purification and concentration and at the same time Ucon recuperation, by temperature increasing. Concentration factor of 10 and enzyme recuperation higher than 95 % were obtained., Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) - Praxis XXI BD/18060/98., CEC - INCO-DC - contract number ERB IC18 CT97 0182., Fundação Calouste Gulbenkian (FCG).

A hidrólise enzimática da lactose por beta-galactosidase desempenha importante papel no processamento de produtos lácteos, como na obtenção de leite com baixo teor de lactose para consumo por indivíduos intolerantes à mesma e na prevenção da cristalização em produtos de laticínio. Neste trabalho, a enzima beta-galactosidase foi produzida pelo cultivo do microrganismo Kluyveromyces marxianus, em meio de cultura à base de soro de queijo em diferentes concentrações iniciais de lactose e extrato de levedura, de acordo com um planejamento fatorial. As fermentações foram conduzidas em incubador rotativo a 150rpm, a 30°C e pH inicial 5,5. A concentração celular inicial foi de 10(7) células/mL. Para a extração da enzima beta-galactosidase, foi realizada autólise das células utilizando como solvente o clorofórmio em tampão fosfato. No meio de cultura enriquecido com (NH4)2SO4, KH2PO4 e MgSO4, nas concentrações iniciais de lactose e de extrato de levedura iguais a 50g/L e 12g/L, respectivamente, obteve-se uma atividade de 28,0UGl/mL e uma concentração celular máxima de 5,3g/L. The enzymatic hydrolysis of lactose by beta-galactosidase plays an important role in the processing of milky products such as the production of lactose-hydrolyzed milk for consumption by intolerant person to lactose and the prevention of the crystallization in dairy products. In this work, the influences of nutrient concentrations in the culture medium based on cheese whey were studied with the objective of producing beta-galactosidase from Kluyveromyces marxianus. The fermentations were carried out in a shaker at 30°C and initial pH 5.5 under agitation, starting with an initial cellular concentration of 10(7) cells/mL, varying the initial concentrations of lactose and yeast extract. For extraction of the enzyme of the cells it was used autolysis with chloroform in potassium phosphate buffer. In the medium with a initial lactose concentration of 50g/L, supplemented with salts, yeast extract 12g/L, the enzymatic activity and cellular concentration were 28 UGl/mL and 5.3g/L respectively.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Com o objetivo de estabelecer a condição fisiológica para a conversão máxima da lactose do permeado de soro de queijo em etanol, avaliaram-se os efeitos da concentração de substrato e do nível de oxigênio no direcionamento do fluxo metabólico para a via fermentativa da levedura K. marxianus UFV-3. Inicialmente, as fermentações foram conduzidas em meio YNB sintético com altas concentrações de lactose, em condições aeróbica e microaeróbica (injeção de nitrogênio gasoso por 12 minutos), em regime de batelada. Nas fermentações sob microaerobiose, os rendimentos máximos de etanol por substrato foram próximos a 85% do rendimento teórico, ou seja, superiores aos obtidos em aerobiose, por volta de 55% desse rendimento. O rendimento de etanol máximo por massa celular também foi maior em microaerobiose, sendo a produtividade volumétrica maior em microaerobiose apenas na fermentação, cuja concentração inicial de lactose foi de 67,0 g L -1 . As fermentações realizadas em permeado de soro de queijo com 10 diferentes concentrações de lactose, que variaram de 1,0 g L -1 a 240,0 g L -1 , em regime de batelada, sob condições aeróbica, microaeróbica e anaeróbica (injeção de nitrogênio gasoso por todo o tempo de fermentação), apresentaram rendimento máximo de etanol por substrato e por massa celular, bem como de produtividade máxima volumétrica, superior àqueles obtidos em YNB. Além disso, K. marxianus UFV- 3 exibiu maiores velocidades específicas de crescimento, maior produção de massa celular e maior produção de glicerol nas fermentações em permeado que naquelas em YNB. Os parâmetros fermentativos da produção de etanol em permeado foram maiores em microaerobiose e anaerobiose do que em aerobiose. As fermentações em permeado – cujas concentrações iniciais de lactose foram acima de 50 g L -1 – e o nível de oxigênio reduzido (microaerobiose e anaerobiose) apresentaram altos rendimentos máximos de etanol por substrato, correspondendo a quase 100% do teórico. A velocidade de consumo de lactose e de produção de etanol aumentou à medida que a concentração inicial de substrato também aumentou e o nível de oxigênio diminuiu. A tolerância do produto (etanol) foi verificada no permeado acrescido de etanol, em concentrações que variaram de 5 a 80 g L -1 . Em 50 gL -1 , K. marxianus UFV-3 manteve um crescimento próximo a 80% em relação ao controle em condição anaeróbica e perto de 60% sob condições microaeróbica e aeróbioca. To establish the physiological condition for maximum conversion of lactose from permeated of cheese whey in ethanol, the effects of substrate concentration and level of oxygen in the directioning of the metabolic flow for the fermentative pathway of the yeast K. marxianus UFV-3 were evaluated. Initially, fermentation was carried out in synthetic YNB medium with high lactose concentrations, in aerobic and microaerobic conditions (injection of nitrogen gas for 12 minutes), in batch culture. For fermentation under microaerobiosis, the maximum ethanol yield per substrate was close to 85% of the theoretical yield, in other words, superior to the obtained in aerobiosis, about 55% of that yield. The maximum ethanol yield per cellular mass was also higher in microaerobiosis, being the volumetric yield higher in microaerobiosis only in fermentation, with initial lactose concentration of 67,0 g L -1 . The fermentation performed in permeated of cheese whey with 10 different lactose concentrations which that varied from 1,0 g L -1 to 240,0 g L -1 , in batch regime, under aerobic, microaerobic and anaerobic conditions, (injection of nitrogen gas xifor the entire fermentation) presented maximum ethanol yield per substrate and per cellular mass, as well as maximum volumetric yield, higher than those obtained in YNB. Besides, K. marxianus UFV-3 gave greater specific growth rates, greater cellular mass production and greater glycerol production in fermentation in permeated than in YNB. The fermentative parameters of ethanol production in permeated were greater in microaerobiosis and anaerobiosis than in aerobiosis. The fermentation in permeated – with initial lactose concentrations above 50 g L -1 – and reduced oxygen level (microaerobiosis and anaerobiosis) gave high ethanol maximum yield per substrate, corresponding to almost 100% of the theoretical value. The lactose consumption rate and ethanol production rata increased with the increase in the initial substrate concentration and the oxygen level decreased. The tolerance of the product (ethanol) was verified in permeated added to ethanol, in concentrations ranging from 5 to 80 g L -1 . In 50 gL -1 , K. marxianus UFV-3 maintained a growth close to 80% in relation to the control in anaerobic conditions and close to 60% under microaerobic and aerobic conditions.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior A Kluyveromyces marxianus é uma levedura considerada não-convencional que produz 􀈕-galactosidase, enzima que hidrolisa a lactose em glicose e galactose, e que apresenta grande aplicabilidade industrial, sendo utilizada, principalmente, na redução do teor de lactose do leite e seus derivados destinados a pessoas portadoras de intolerância à lactose. A produção de biomassa e de 􀁅-galactosidase pela linhagem CBS 6556 de K. marxianus foi avaliada sob diferentes condições de cultivo. A atividade da enzima 􀁅- galactosidase não parece ser diretamente afetada pela taxa de oxigênio dissolvido, sendo mais importante a fonte de carbono utilizada. Em relação a fonte de nitrogênio, o aumento da atividade enzimática foi mais alta em meio contendo fosfato de amônia, a 34oC (4517,19 U/mg prot). Todavia, a velocidade específica de crescimento foi mais alta na temperatura de 30ºC nesta mesma fonte de nitrogênio (􀁐=40h-1). O coeficiente de partição da enzima 􀁅-galactosidase produzida em soro de queijo coalho foi avaliado em sistema bifásico aquoso (SBA) polietileno glicol(PEG)/Fosfato de potássio. A partição desta enzima foi afetado tanto pelo tamanho da cadeia do PEG quanto pela concentração dos componentes do sistema. O aumento da concentração do polímero (de 14% para 19,7%) demonstrou exercer grande influência na partição da enzima, resultando em inversão do coeficiente de partição (de K=0,008 para K=2,88) quando PEG 3350 foi utilizado para formar o SBA. A maior seletividade foi encontrada utilizando PEG 3350 (4,96); e a melhor recuperação da atividade enzimática foi obtida na fase superior do sistema PEG 8000/fosfato de potássio (76%).

Orientador: Maria Isabel Rodrigues Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Doutorado Engenharia de Alimentos Doutor em Engenharia de Alimentos

A levedura Kluyveromyces marxianus Hansen tem sido apontada como sistema biológico para estudos genéticos e biotecnológicos baseado nas suas vantagens fisiológicas e bioquímicas. Contudo, a ausência de plasmídios naturais e o pouco conhecimento sobre sua genética e comportamento têm sido os principais entraves para estudos mais aplicados. Sua capacidade de utilizar lactose como fonte de carbono possibilita o uso do soro de queijo, atualmente um importante poluente da indústria de laticínios, como matéria-prima para outros processos industriais. Buscou-se, portanto, construir vetores plasmidiais eficientes e compatíveis com a levedura K. marxianus para avaliar a capacidade de linhagens recombinantes utilizarem o soro de queijo como meio de crescimento de baixo custo no processo de expressão de genes de interesse industrial, tais como enzimas extracelulares ou peptídeos antimicrobianos. Este trabalho permitiu verificar que: um método simples e rápido de transformação mediado por acetato de lítio permitiu um aumento da eficiência de transformação de células de K. marxianus em 2,5 vezes em relação ao método convencional; o crescimento de células de leveduras recombinantes transformadas com pDblet ou seus derivados não foi afetado pela alta concentração de lactose no soro de queijo, apresentando perfil de crescimento similar ao de células parentais. Esses dados sugerem a possibilidade do uso de linhagens recombinantes de Kluyveromyces marxianus portadoras de plasmídios baseados no pDblet para processos biotecnológicos a partir do soro de queijo advindo das indústrias de laticínios

Este trabalho teve por objetivo estudar a produtividade do processo de produção de β-galactosidase de leveduras em biorreator utilizando soro de queijo como meio de cultura. Na primeira parte do estudo determinou-se a influência das velocidades de aeração e de agitação do biorreator na produção de β-galactosidase pela levedura Kluyveromyces marxianus. As condições de agitação e aeração testadas foram: 500rpm e 3L/min (condição I); 600rpm e 6L/min (condição II) e 700rpm e 9L/min (condição III). Os resultados mostraram que esta levedura, considerada Crabtree negativa, produz etanol, cuja concentração é maior nas condições de menor aeração. A produção de β-galactosidase mostrou-se dependente das velocidades de aeração, sendo menor na condição de maior aeração, e sendo que a maior produtividade da enzima foi atingida na condição intermediária de oxigenação (condição II). Após, estudou-se diferentes estratégias de alimentação objetivando culturas de alta concentração celular de K. marxianus em cultivos batelada alimentada. Foram testados dois perfis de alimentação (linear e exponencial), três tempos de alimentação (20, 25 e 35 horas) e três diferentes concentrações do meio de alimentação (soro de queijo concentrado duas, três ou quatro vezes). Os resultados mostraram que os cultivos em regime de batelada alimentada não geraram altas concentrações de biomassa. Contudo, a inserção contínua de lactose no meio de cultura induziu uma alta atividade específica de β-galactosidase, aumentando, conseqüentemente, a atividade volumétrica e a produtividade do processo. A melhor estratégia de alimentação, linear crescente durante 25 horas com soro de queijo três vezes concentrado, resultou em uma produtividade β-galactosidase de 291U/(L.h), 50% maior que a produtividade da cultura em batelada. Paralelamente a este estudo, construiu-se uma cepa recombinante de Saccharomyces cerevisiae produtora de β-galactosidase. A levedura S. cerevisiae W303 foi transformada com os plasmídeos integrativos LAC4 e LAC12, que codificam β-galactosidase e lactose-permease de Kluyveromyces lactis. A cepa transformante BLR030 foi escolhida entre as outras devido ao seu crescimento e produção de β-galactosidase. Um meio de cultura composto por soro de queijo desproteinizado suplementado por extrato de levedura (1%) e peptona (3%) foi escolhido, entre os meios testados, para os experimentos em biorreator. Foram realizados cultivos em regime de batelada e batelada alimentada com alimentação linear crescente durante 25 (FB25), 35 (FB35) e 50 (FB50) horas. Os cultivos FB35 e FB50 apresentaram as maiores atividades específicas da enzima (em torno de 1.800U/g) e também a maior produtividade de β-galactosidase (180U/(L.h)).

Neste trabalho foram desenvolvidos, em escala laboratorial, processos para o aproveitamento do soro de queijo como meio de cultura para as leveduras Kluyveromyces marxianus CBS 712 e Kluyveromyces marxianus CBS 6556 , objetivando a produção de lactase. A primeira etapa dos experimentos foi realizada em incubadora rotatória para determinar-se as condições ideais de crescimento microbiano (pH, meio de cultura e temperatura). Os resultados desta etapa definem que o pH e a temperatura ideais de crescimento são 5,5 e 37oC, respectivamente. Quanto ao meio de cultura, definiu-se soro de queijo in natura (7% w/v) para a cepa CBS 6556 e soro suplementado com extrato de levedura (1% w/v) para a cepa CBS 712. A segunda etapa dos experimentos foi realizada em biorreator aerado, utilizando-se as condições de crescimento determinadas na etapa anterior, com o objetivo de determinar a melhor cepa produtora de lactase. Ambas linhagens produziram quantidades equivalentes da enzima, sendo então escolhida, para os testes posteriores de otimização do processo e caracterização enzimática parcial, a levedura Kluyveromyces marxianus CBS 6556, por utilizar um meio de cultura mais simples e barato. Testou-se, então, o crescimento em soro de queijo concentrado (21% w/v), que resultou em uma maior produtividade específica de lactase pela levedura, contudo apresentou, também, maior produção de etanol, tóxico à célula. A caracterização enzimática mostrou que a lactase produzida possui atividade enzimática máxima em torno de 37oC e que possui pouca estabilidade à temperatura ambiente (30oC) e ao armazenamento à 4oC. Durante o armazenamento nas temperaturas de -4oC e -18oC a enzima conservou sua estabilidade durante as nove semanas.