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Dissertação de mestrado em Bioquímica (Biologia), apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa, 2014 Maria João Silva, Investigadora no Departamento de Genética Humana do INSA [ENG] Polymeric particulate-systems are of great relevance due to their possible biomedical applications, among them as carriers for the nano- or microencapsulation of drugs. However, due to their unique specific properties, namely small size range, toxicity issues must be discarded before allowing its use on health-related applications. Several polymers, as poly(methylmethacrylate) (PMMA), have proved to be suitable for the preparation of particulate-systems. However, a major drawback of its use refers to incomplete drug release from particles matrix. Recent strategies to improve PMMA release properties mention the inclusion of other acrylic polymers as Eudragit (EUD) on particles formulation. Though PMMA and EUD are accepted by the FDA as biocompatible, their safety on particle composition lacks sufficient toxicological data. The main objective of this thesis was to evaluate the biological effects of engineered acrylic particulate-systems. Preparation, physicochemical characterization and in vitro toxicity evaluation were assessed on PMMA and PMMA-EUD (50:50) particles. The emulsification-solvent evaporation methodology allowed the preparation of particles with spherical and smooth surfaces within the micrometer range (±500 nm), opposing surface charges and different levels of hydrophobicity. It was observed that particles physicochemical properties (size and charge) were influenced by biological media composition, such as serum concentration, ionic strength or pH. In what concerns to the in vitro toxicological studies, particle cellular uptake was observed on different cell lines (macrophages, osteoblasts and fibroblasts). Cytotoxicity effects were only found after 72 h of cells exposure to the particles, while no oxidative damage was observed neither on osteoblasts nor fibroblasts. Also, no genotoxicity was found in fibroblast using the comet assay to assess DNA damage. This observation should be further confirmed with other validated genotoxicity assays (e.g. Micronucleus Assay). The present study suggests that the evaluated acrylic particles are biocompatible, showing promising biological properties for potential use as carriers in drug-delivery systems. [PT] Os sistemas de partículas poliméricas têm adquirido uma grande relevância devido às suas possíveis aplicações biomédicas, entre elas para nano- ou microencapsulação de fármacos. No entanto, as propriedades específicas destas partículas, designadamente o reduzido tamanho, tornam necessário a avaliação da sua toxicidade de modo a garantir a sua utilização segura. Muitos polímeros têm demonstrado potencial para este tipo de aplicações, designadamente o poli(metil metacrilato) (PMMA). Contudo, a sua aplicação é muitas vezes limitada pela libertação incompleta dos fármacos através da matriz polimérica. De modo a aumentar a permeabilidade das partículas de PMMA, estratégias recentes têm vindo a incluir outros polímeros acrílicos na formulação, designadamente o Eudragit (EUD), visando melhorar a libertação dos fármacos. Apesar dos polímeros referidos serem aceites pela FDA como biocompatíveis, não existem estudos suficientes relacionados com a sua toxicidade na forma de partículas. O principal objectivo desta tese foi avaliar os efeitos biológicos de partículas acrílicas. Em particular, realizou-se a preparação, caracterização físico-química e a avaliação de efeitos tóxicos em culturas celulares de partículas de PMMA e de PMMA-EUD (50:50). As partículas, obtidas pelo método de emulsão-simples por evaporação de solvente, demonstraram uma distribuição de tamanhos semelhantes (±500 nm), cargas de sinal contrário e diferentes níveis de hidrofobicidade. Foi também observado que o tamanho e a carga das partículas eram influenciados pela composição do meio biológico (concentração do soro, força iónica e o pH). Relativamente aos ensaios de toxicidade, a internalização das partículas foi confirmada em várias linhas celulares (macrófagos, osteoblastos e fibroblastos). Só foram observados efeitos citotóxicos após 72 h de exposição às partículas. Não foi detetada a produção de espécies reativas de oxigénio em osteoblastos nem em fibroblastos. Também não foram observados quaisquer efeitos genotóxicos através da avaliação de lesões no ADN de fibroblastos através do ensaio do cometa. Estes resultados devem ser confirmados através de ensaios já validados para avaliação de genotoxicidade (ex: Ensaio dos Micronúcleos). O presente estudo sugere que as partículas acrílicas avaliadas são biocompatíveis, tendo sido demonstrado que apresentam propriedades biológicas interessantes para uma possível aplicação em veiculação de fármacos. Colaboração no Projecto da Fundação para a Ciência e Tecnologia EXCL/CTM-NAN/0166/2012

O gênero Drimys é o de maior área de distribuição geográfica da família (Winteraceae), que compreende sete gêneros e cerca de 120 espécies. No Brasil, encontra-se desde a Bahia até o Rio Grande do Sul e ocorre em duas espécies, Drimys angustifolia Miers. e Drimys brasiliensis Miers, conhecidas popularmente como “casca-de-anta”. As folhas e cascas são usadas na medicina popular como antiescorbútico, estimulante, antiespasmódica, antidiarreica, antifebril, contra hemorragia uterina, antibacteriana, no tratamento de asma, bronquite, certas afecções do trato digestivo e, algumas vezes no tratamento do câncer e inseticidas. Ambas são caracterizadas pela presença de flavonóides e sesquiterpenoides. O objetivo deste trabalho foi o de avaliar a composição química, o potencial antioxidante, antiviral, inseticida, antitumoral, antifúngico, avaliação tóxica aguda e, também, formular e caracterizar duas nanoemulsões dos óleos voláteis das duas espécies do estudo. Por meio da hidrodestilação, foi possível realizar a extração dos óleos essenciais e determinar seus rendimentos que variaram entre 0,3 e 0,5% de folhas. A identificação dos componentes foi realizada utilizando a Cromatrografia Gasosa acoplada ao espectrofotômetro de massas (CG-EM), as quais apresentaram como componentes majoritários em todas as análises, o biciclogermacreno para a espécie Drimys angustifolia e a ciclocolorenona para a espécie Drimys brasiliensis. A formulação e caracterização da nanoemulsão foi realizada dentro dos parâmetros estabelecidos (tamanho de partícula, índice de polidispersão, pH) e através da microscopia eletrônica de transmissão foi confirmado o tamanho na escala nano. No que tange a atividade inseticida, ambas as espécies mostraram-se promissoras repelindo o cupim da espécie Cryptotermes brevis com índices de repelência negativos. Para avaliação inicial do potencial larvicida de Aedes aegypti, os óleos das duas espécies não foram eficientes. No entanto, a nanoemulsão de Drimys brasiliensis levou a 69% e 89% de mortalidade, correspondendo às concentrações de 0,5 μg/mL e 0,83 μg/mL, respectivamente. Com relação a atividade antioxidante, os óleos das duas espécies não foram capazes de reduzir o radical (2,2-difenil-1-picril-hidrazil) DPPH . Já na atividade antiviral frente ao VHS-1, as duas espécies mostraram-se promissoras inibindo a replicação viral. Na atividade antitumoral nas linhagens de glioma (U-138 MG) e de bexiga (T24), somente o óleo de Drimys brasiliensis reduziu a viabilidade celular das duas linhagens pelo ensaio do MTT, com resultados similares na contagem celular. Na análise da citometria pela incorporação da Anexina-V/Iodeto de propídio caracterizou-se indução de apoptose tardia. Na atividade antifúngica, as duas espécies foram eficazes contra o fungo oportunista Acremonium, presente em diversas infecções em transplantados e imunocomprometidos. Quanto à avaliação da toxicidade aguda, as duas espécies mostraram importantes sinais de toxicidade em ratos Wistar como ptose, tremor, redução da atividade motora, exolftamia, aumento da freqüência respiratória. Os animais tratados com espécie D. brasiliensis ainda apresentaram aumento na micção e diarréia. Desta maneira, é importante ressaltar que todos os ensaios biológicos, o estudo toxicológico, e a elaboração e caracterização das nanoemulsões dos óleos essenciais foram realizados pela primeira vez para as duas espécies vegetais, destacando a importância e ineditismo do presente trabalho. The genus Drimys presents the largest geographical distribution of the family (Winteraceae), which comprises seven genera and about 120 species. In Brazil, is found from Bahia to Rio Grande do Sul and occurs in two species, Drimys angustifolia L. and Drimys brasiliensis Miers, popularly known as "Casca-de-anta". The leaves and barks are used in folk medicine as antiscorbutic, stimulant, antispasmodic, anti-diarrheal, antipyretic, against uterine bleeding, antibacterial, to treat asthma, bronchitis, certain disorders of the digestive tract and sometimes in the treatment of cancer and insecticides. Both are characterized by the presence of flavonoids and sesquiterpenoids. The objective of this study was to evaluate the chemical composition, the antioxidant, antiviral, insecticidal, antitumor, antifungal, acute toxicological evaluation and also to formulate and characterize two nanoemulsions of the volatile oils of two species of the study. By steam distillation was possible to perform the extraction of essential oils and to determine their yields ranging between 0.3 and 0.5% of leaves. The identification of components was performed using the Gas Cromatography coupled to mass spectrometer (GC-MS), which presented as major components in all analyzis bicyclogermacrene for the Drimys angustifolia species and ciclocolorenona for the Drimys brasiliensis. The formulation and characterization of nanoemulsion was performed within the established parameters (particle size, polydispersity, pH) and by transmission electron microscopy confirming the size at the nanoscale. Regarding the insecticidal activity, both species were promising repelling termites Cryptotermes brevis with negative index of repellency. To evaluate initial potential larvicidal Aedes aegypti, the oils of the two species were not efficient, however, of the Drimys brasiliensis nanoemulsion the larvae mortality of the 69% and 89%, corresponding to concentrations of 0.5 μg/mL and 0.83 μg/mL, respectively. With respect to antioxidant activity, the oils of the two species have not been able to reduce the (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) DPPH radical. In the antiviral activity against the HSV-1, the two species were promising inhibiting viral replication. In antitumor activity in glioma cell lines (U-138 MG) and bladder (T24), only the oil Drimys brasiliensis reduced cell viability of two strains by the MTT assay, with similar results in cell counts and flow cytometry analysis of the incorporation of Anexinn-V/Propidium Iodide characterized as late apoptosis. In the antifungal activity, the two species were effective against the opportunistic fungus Acremonium, present in various infections in transplant and immunocompromised. Regarding the evaluation of acute toxicity, the two species showed significant signs of toxicity in rats as ptosis, tremor, decreased motor activity, exolftamia, shortness of breath. Animals treated with species Drimys brasiliensis also showed an increase in urination and diarrhea. Thus, it is important that all biological assays, the toxicity study, and preparation and characterization of nanoemulsions of essential oils were first performed for the two species, highlighting the importance and originality of this work.