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Orientador: Rafael Elias Marques Pereira Silva Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Arbovírus (arthropod-borne virus) são organismos de grande importância médica que causaram impactos significativos à saúde humana no Brasil e no mundo nas últimas décadas. Entre eles, o gênero Flavivirus destaca-se por compreender importantes patógenos humanos, tais quais o vírus da Dengue, Febre Amarela e Zika. Além destes, há outros com potencial risco de emergência, como o vírus da encefalite de St. Louis (SLEV), capaz de causar neuropatias que podem levar a morte ou causar sequelas. Ainda não há vacinas ou tratamentos específicos para a encefalite causada por SLEV. Como o processo de desenvolvimento de novas drogas é demorado e oneroso, o reposicionamento de fármacos figura como uma boa estratégia para a descoberta de potenciais tratamentos contra SLEV visto que, com os testes toxicológicos dos compostos já realizados, o tempo e o custo das pesquisas é reduzido. A partir disso, foi padronizado e validado um ensaio fenotípico de High Throughput Screening através da biblioteca Covid Box para a triagem de compostos protetores contra a infecção por SLEV. Dos oitenta compostos triados em três concentrações diferentes, nove deles apresentaram efeito protetor contra a infecção, em diferentes níveis. Uma vez que a classe farmacológica dos hits foi distinta, o estudo sugere que pode haver diferentes vias moleculares relevantes na infecção e, portanto, possibilidade de diferentes alvos terapêuticos no desenvolvimento de tratamentos. Sendo assim, busca-se melhor compreender os mecanismos patogênicos do vírus para o desenvolvimento futuro de estratégias viáveis de tratamento desta e outras arboviroses relacionadas Abstract: Arthropod-borne viruses are organisms of great medical importance that have caused significant impacts on human health in the last decades. The Flavivirus genus stands out among them for comprising important human pathogens such as Dengue, Yellow fever, and Zika virus. In addition, there are others with the potential to emerge, such as St. Louis encephalitis virus (SLEV), which is present in the Americas and may cause a neurological disease that leads to death or sequelae. There is no specific treatment or vaccine against SLEV. As drug discovery is an expensive and time-consuming process that can take several years to be accomplished, drug repurposing figures as a viable strategy in the searching for new treatments for diseases once it requires less time and money because the compounds have already been tested and approved for human use. Hence, a phenotypic High-Throughput Screening assay was developed and validated using the MMV Covid-Box compound library. Of eighty compounds screened at three different concentrations, nine showed a protective effect against infection at different levels. Since they belong to distinct pharmacological classes, our study suggests there may be different relevant molecular pathways in SLEV infection, and thus multiple possibilities of therapeutic targets to be explored in the development of treatments. From this, we seek to have a deeper understanding of the virus and its pathogenic mechanisms for the future development of viable treatment strategies for this and other related arboviruses Mestrado Microbiologia Mestra em Genética e Biologia Molecular CAPES 88887.351846/2019-00

Oxidative stress biomarkers are powerful endpoints in toxicological research. Cellular reductive/oxidative balance affects numerous signaling pathways involving H2O2. Detoxification and control of H2O2 levels results mainly from catalase activity. The aim of this work was to develop a precise, simple, cost-effective microassay to measure catalase activity in small tissue samples and cell extracts. We developed a protocol that quantifies H2O2 decomposition by intrinsic catalase in biological samples. Catalase activity was calculated based on rate of decomposition of H2O2, following absorbance at 240 nm. We developed a multi-well spectroscopic approach, reducing sample quantity requirements and allowing simultaneous assessment of large number of samples. The protocol is sensitive across a wide range of catalase activity (11.5–7575 U). The assay presents a 95% confidence interval with an intra-assay coefficient of variation of 3.7%, an inter-assay coefficient of variation of 6.2% and good correlation with a commercial kit. The assay was established and validated for different biological samples, including sheep hepatic tissue and human tumor and non-tumor cell lines. This high-throughput method is robust, sensitive, time-saving and cost-effective, generating highly reproducible results with precision and good correlation with a commercial kit reinforcing the method's validity for research and toxicological applications.

Orientador: Lucio Holanda Gondim de Freitas Junior Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O protozoário Trypanosoma cruzi é o agente etiológico da doença de Chagas, infecção crônica que afeta mais de oito milhões de pessoas na América Latina. A evolução da doença de Chagas leva usualmente a uma fase aguda assintomática, podendo desenvolver complicações severas na fase crônica. Não há vacinas e limitadas opções de quimioterapia para a doença de Chagas, que são o benznidazol e o nifurtimox. Ambos apresentam diversos efeitos colaterais graves nos pacientes, sendo urgente o desenvolvimento de novas terapias para a doença. As diferentes cepas de T. cruzi apresentam variados níveis de susceptibilidade ou resistência aos fármacos referências no tratamento da doença de Chagas. O presente trabalho teve como objetivo quantificar o ciclo intracelular de dois clones in vitro (Y-cH10 e Sylvio X10/1) e desenvolver um ensaio fenotípico para essa finalidade. O estudo foi avaliado por ensaio de alto conteúdo para triagem fenotípica (High Content Screening assay) da infecção de T. cruzi em linhagem celular humana, U2OS. Foi desenvolvida um protocolo de análise no software comercial Harmony (PerkinElmer) sensível para a identificação individual das formas intracelulares do parasita T. cruzi. A quantificação do tempo de duplicação dos dois clones, Y cH10 e Sylvio X10/1, demonstrou que não houve diferenças significativas entre ambos com relação ao tempo de duplicação da população. Entretanto, o ciclo intracelular do clone Sylvio X10/1 é mais longo quando comparado ao clone Y cH10. A metodologia de análise também foi validada com sucesso na infecção em linhagem monocítica THP-1, com características fenotípicas bastante diferentes da linhagem U2OS. O tempo de duplicação do clone do clone Y cH10 não apresentou diferenças significativas nas duas linhagens celulares diferentes, U2OS e THP-1, que estavam em condições de cultivo diferentes. Desenvolveu-se nesse estudo, um método de análise de imagens mais sensível para a identificação das formas intracelulares do parasita, que poderá ser aplicado em estudos da relação do tempo de duplicação de cada clone com a atividade de compostos antichagásicos Abstract: The protozoan Trypanosoma cruzi is the etiologic agent of Chagas disease, a chronic infection that affects more than eight million people in Latin America. The evolution of Chagas disease usually leads to an asymptomatic acute phase and may result in severe complications in the chronic phase. There are no vaccines and limited chemotherapy options for Chagas disease, which are benznidazole and nifurtimox. Both have several serious side effects in patients, and the development of new therapies for the disease is urgent. The different strains of T. cruzi present varying levels of susceptibility or resistance to references drugs. The present work aimed at quantifying the intracellular cycle of two clones in vitro (Y-cH10 and Sylvio X10 / 1) and develop a phenotypic assay for this purpose. The study was evaluated by high content screening assay analysis of the T. cruzi infection of human cell line, U2OS. The analysis developed in a commercial software, Harmony (PerkinElmer), was sensitive in the identification of the intracellular forms of T. cruzi parasite. The quantification of the doubling time of the two clones was performed and no significant differences were observed between them. However, the Sylvio X10/1 intracellular clone cycle is longer compared to the Y cH10 clone. The analysis methodology was also successfully evaluated in the infection of a monocyte cell line, THP-1, with very different phenotypic characteristics of the U2OS cell line. The duplication time of the Y strain clone did not show significant difference in the two different cell lines, U2OS and THP-1, which were under different culture conditions. In this study, a method of image analysis more sensitive for the identification of intracellular forms of the parasite was developed, and this methodology could be applied in studies of the relation of the doubling time of each clone with the activity of antichagasic compounds Mestrado Microbiologia Mestra em Genética e Biologia Molecular CNPQ 132049/2016-3 CAPES

Orientador: Daniela Barretto Barbosa Trivella Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O proteassomo é um complexo enzimático responsável pela degradação proteica programada, sendo crítico para a regulação da homeostase celular estando associado a diversas patologias incluindo câncer. Em 2003, bortezomib (Velcade® - Takeda Inc.) foi o primeiro inibidor de proteassomo aprovado pelo FDA, atualmente sendo o fármaco de primeira escolha para tratamento de mieloma múltiplo. Porém, o uso clínico mostrou que inibidores de proteassomo enfrentam diversos problemas como toxicidade, baixa distribuição e desenvolvimento de resistência. Assim, a busca de novos inibidores do proteassomo, especialmente do proteassomo resistente, torna-se importante. Recentemente foi descrito na actinobactéria Salinispora tropica a presença de duas isoformas de proteassomo, sendo uma delas resistente a inibidores conhecidos do proteassomo humano e de levedura. Esta isoforma resistente carrega as mesmas mutações encontradas em células humanas resistentes a bortezomib. Estudos in vitro com o proteassomo humano são bastante limitados. Sendo assim, neste projeto de mestrado, propomos a realização de estudos bioquímicos e estruturais com os proteassomos humano (comercial), de levedura e de actinobactéria (selvagem e resistente), visando a busca de novas classes de inibidores do proteassomo. Durante este trabalho, estabelecemos os protocolos de expressão, purificação e cristalização do proteassmo de levedura e de bactéria (selvagem), e reportamos a primeira estrutura atômica deste último. Além disto, protocolos foram também implementados para a expressão e purificação do proteassomo de bactéria resistente. Em paralelo, estabelecemos um ensaio high-throughput screening (HTS) para análise de bibliotecas de produtos naturais com o proteassomo humano e de levedura. Utilizando este ensaio fomos capazes de triar cerca de 1200 amostras de produtos naturais (frações, extratos brutos e substâncias isoladas) identificando novos hits. Três hits foram priorizados em nossos estudos, sendo que um representa uma nova estrutura para inibição do proteassomo e outro foi cristalizado com o proteassomo utilizando uma nova abordagem. Assim, almejamos que os resultados obtidos contribuam para a descoberta de novos inibidores do proteassomo visando o desenvolvimento de uma nova geração de inibidores para esse alvo contra o câncer Abstract: The proteasome is an enzymatic complex responsible for the programmed degradation of proteins, being critical for the cellular homeostasis regulation and associated to several diseases including cancer. In 2003 Bortezomib (Velcade® - Takeda Inc.) was the first proteasome inhibitor to be approved by the FDA and has become the first choice for multiple myeloma treatment. However, the clinical usage of proteasome inhibitors showed that they face several problems such as toxicity, low distribution and development of resistance. Thereby the search for new proteasome inhibitors, especially for the resistant form, becomes an important matter. Recently, it was described the presence of two isoforms of the proteasome in the actinobacteria Salinispora tropica, being one of these resistant to human and yeast proteasome inhibitors. This isoform has the same mutations found in human cells resistant to bortezomib. In vitro studies with the human proteasome are limited. Therefore, we proposed the performance of biochemical and structural studies using the commercial human proteasome, yeast and actinobacteria (wild and resistant types) proteasomes, aiming the discovery of new classes of proteasome inhibitors. During this work we established the protocols for expression, purification and crystallization of the yeast and bacterial proteasomes (wild type), and will report the first crystal structure of the later. Furthermore, protocols were further implemented for the expression and purification of resistant bacterial proteasome. In parallel, we also established a high-throughput screening (HTS) assay to evaluate natural products libraries using the human and the yeast proteasomes. With those assays, we were able to screen about 1,200 samples of natural products (whole extracts, fractions and isolated substances) identifying new hits. Three out the hits were prioritized in our studies, being one a new proteasome inhibitor structure and other was crystallized using a new approach. Overall, we seek that the results herein obtained will contribute to the discovery of new proteasome inhibitors aiming the development of next generation inhibitors for this target against cancer Mestrado Fármacos, Medicamentos e Insumos para Saúde Mestre em Ciências CAPES 1419094 FAPESP 2014/10753-9

Orientador: Lucio Holanda Gondim de Freitas Junior Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: As leishmanioses são doenças negligenciadas causadas por protozoários do gênero Leishmania, que provocam grande impacto na saúde pública de países em desenvolvimento. A quimioterapia disponível ainda é limitada e apresenta importantes limitações; portanto, é prioritária a pesquisa e descoberta de novos fármacos com potencial leishmanicida. Nesse contexto, os ensaios de alto conteúdo (HCS) vem sendo empregados eficientemente nas fases iniciais do desenvolvimento de fármacos, para identificação de moléculas candidatas com atividade anti-Leishmania. Apesar das vantagens, essa metodologia ainda apresenta baixas taxas de hits e de confirmação, quando comparada a modelos de outras doenças, e alta taxa de falhas quando os compostos são testados em modelos in vivo. Além disso, os protocolos de HCS vem sendo empregados para um número limitado de cepas de Leishmania, geralmente L. donovani, embora espécies/cepas possam diferir drasticamente em termos de infecção e suscetibilidade aos fármacos. Dessa forma, focado em protocolos de HCS previamente publicados, um ensaio baseado em imagem foi desenvolvido e otimizado, para a triagem de compostos contra amastigotas intracelulares de diferentes cepas/espécies viscerais de Leishmania. Para cada espécie/cepa, estabeleceu-se o modelo biológico, determinando-se as melhores condições de cultivo para célula hospedeira e parasita, infecção e período de exposição aos compostos, e padronizou-se o método de análise de imagem através do software comercial. Entre as cepas/espécies estabelecidas, houve diferenças no perfil de infecção, em termos de taxa de infecção, número de parasitas intracelulares e taxa de multiplicação celular; bem como na atividade de compostos referência: enquanto a anfotericina B apresentou atividade consistente contra as cepas, a miltefosina mostrou atividade dependente da cepa, com valores de EC50 entre 0,4 e 7,6 µM. O mesmo perfil de variação dependente da cepa ocorreu na dinâmica de atividade dos compostos referência, na triagem de bibliotecas e na atividade dos hits selecionados; evidenciando, assim, a importância da expansão do portfólio de ensaios in vitro para Leishmania. Através da metodologia estabelecida, a prospecção de candidatos a fármacos foi realizada, utilizando diferentes abordagens: triagem de bibliotecas de extratos naturais e compostos sintéticos, reposicionamento de fármacos e combinação terapêutica. Destacam-se os resultados obtidos através: (i) da biblioteca Hypha Mycodiverse, da qual foram identificados cinco compostos purificados com atividade anti-Leishmania promissora (EC50 ? 1,3 µM), (ii) das coleções de compostos/extratos de diferentes colaboradores, com classes terapêuticas e químicas inéditas ou pouco exploradas, tais como marinoquinolinas, chalconas e belzil-farnesil aminas, e candidatos potenciais (EC50 < 10 µM), representando moléculas e scaffolds iniciais para otimização química, (iii) da biblioteca comercial LOPAC, da qual o composto nitro CB1954 apresentou atividade de amplo espectro: contra as diferentes cepas e formas do ciclo de vida do parasita e contra outros tripanossomatídeos, com valores de EC50 na grandeza de nano e micro molar, e (iv) da combinação terapêutica, na qual o inibidor de calpaína MDL28170 apresentou perfil sinérgico em associação com anfotericina e miltefosina. Conclui-se que a metodologia estabelecida representa uma importante contribuição para os processos iniciais do desenvolvimento de fármacos, sendo que os candidatos identificados nesse trabalho poderão ser explorados futuramente como alternativa de terapia para leishmanioses Abstract: Leishmaniasis are neglected diseases caused by protozoan parasites of genus Leishmania, which lead to severe impact in public health of developing countries. The available chemotherapy is still inadequate and presents important limitations; therefore, the research and the discovery of new leishmanicidal drugs must be prioritized. In this context, the high content screenings (HCS) have been applied efficiently in the early drug development, for identification of candidate molecules with anti-Leishmania activity. Despite the advances, the methodology still has several drawbacks such as low ratio of hits and confirmation, compared to others diseases models, and high number of failures, when compounds are assessed in in vivo assays. Additionally, HCS protocols have been developed, to the date, for a limited number of Leishmania species, mostly L. donovani, although different species/strains may diverge dramatically in regard to drug susceptibility. Therefore, focused on HCS protocols previously published, an image-based assay was developed and optimized, in order to screen compounds against intracellular amastigotes of distinct Leishmania species and strains. For each species/strains, the biological model was established by determining the best conditions of host cell and parasite culture, infection and period of drug exposition; and an image analysis method was standardized using a commercial software. Among the strains/species established, differences were observed in the general infection parameters, in terms of infection ratio, intracellular amastigotes number and multiplying amastigotes ratio; also, diverging results were verified for reference compounds activity: while amphotericin B presented consistent activity against strains, miltefosine showed strain-dependent activity, with EC50 values from 0.4 to 7.6 µM. The strain-specific profile also occurred in the activity dynamics of reference compounds, in libraries screening and in the activity of selected hits, confirming the importance of expanding the in vitro Leishmania portfolio. Throughout this methodology, candidates¿ prospections were performed within different screening approaches: triage of libraries containing natural products and synthetic compounds, drugs repurposing and drugs combination. Among the results, we highlight: (i) Hypha Mycodiverse library, from which we identified five purified compounds with promising anti-Leishmania activity (EC50 ? 1.3 µM), (ii) Compounds and extracts collections from collaborators, from which we discovered new chemical and therapeutic classes, such as marinoquinolines, chalcones and belzil-farnesil amines, and potential candidates (EC50 < 10 µM), representing molecules and scaffolds for chemical optimization, (iii) LOPAC library screening, from which we selected the nitro compound CB1954, that presented a broad-spectrum activity: against distinct strains and life cycle forms of Leishmania and others trypanosomatids, with EC50 values from nano to micro molar and (iv) drugs combination, in which the calpain inhibitor MDL28170 present synergic effect in association with amphotericin B and miltefosine. We concluded that this novel methodological approach represents an important contribution for early stage anti-Leishmania drug discovery and the candidates identified can be further explored as an alternative for leishmaniasis therapy Doutorado Imunologia Doutora em Genética e Biologia Molecular CNPQ 140907/2013-0

Orientador: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A produção fermentativa de etanol a partir de substratos chamados de "primeira geração", como cana-de-açúcar e amido de milho, já atingiu níveis muito elevados de eficiência. As linhagens industriais utilizadas nestes processos já são adaptadas ao ambiente industrial e possuem características que dificultam o melhoramento por engenharia genética tradicional. Duas abordagens inovadoras foram utilizadas para buscar processos fermentativos mais eficientes: o uso de reatores bioelétricos para alterar os produtos da fermentação e um ensaio de engenharia evolutiva para otimizar fenótipos heterólogos. Foram feitas fermentações bioelétricas com Saccharomyces cerevisiae, obtendo aumentos de produtividade de etanol, sem alterar o rendimento final, e também mudanças nas proporções dos subprodutos glicerol e acetato. Uma resposta distinta foi observada para uma linhagem industrial cultivada nas mesmas condições. Foram realizadas análises de expressão gênica global de linhagens de laboratório e industrial fermentando sob estímulo bioelétrico. Não foram observadas alterações na via fermentativa, mas houve variações grandes na expressão de genes relacionados a outros aspectos da fisiologia da levedura, como genes para síntese de lipídios de membrana e genes desconhecidos ou com funções aparentemente não-relacionadas ao processo fermentativo. Também foi evidente uma resposta global diferente entre as duas linhagens. Foi estabelecido um método automatizado para ensaios de engenharia evolutiva, que permitiu a seleção de linhagens por crescimento em celobiose. Utilizando apenas a variabilidade presente no genoma de uma linhagem industrial diplóide, foi possível obter linhagens haplóides com desempenho superior à linhagem parental. Portanto, esta estratégia pode ser viável para se obter fenótipos superiores utilizando linhagens distantes de S. cerevisiae Abstract: Fermentative ethanol production from substrates known as "first generation", such as sugar cane and corn starch, has reached very high levels of efficiency. The industrial strains used in these processes are already adapted to the industrial environment and possess characteristics that hinder further improvement by traditional genetic engineering. Two innovative approaches were used to seek more efficient fermentation processes: the use of bioelectric reactors to alter fermentation products and an evolutionary engineering assay to optimize heterologous phenotypes. Bioelectric fermentations were carried out with Saccharomyces cerevisiae, obtaining increases in ethanol productivity, without changing the final yield, and also changes in the proportions of byproducts glycerol and acetate. A distinct response was observed for an industrial strain cultivated under the same conditions. Global gene expression analyses were carried out for a laboratory and industrial strain under bioelectric stimulus. No changes were observed for the fermentative pathway, but there were large variations in expression for genes related to other aspects of yeast physiology, such as membrane lipid synthesis and unknown genes or genes with functions that are apparently unrelated to the fermentation process. A difference in the global response for the two strains was also evident. An automated method for evolutionary engineering assays was established, which allowed the selection of strains by growth on cellobiose. Using only the genetic variability present within the genome of a diploid industrial strain, it was possible to obtain haploid strains with superior growth rate when compared to the parental strain. Therefore, this strategy may be viable for obtaining superior phenotypes using distant strains of S. cerevisiae Mestrado Genética de Microorganismos Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Com o aumento da busca por novas fontes renováveis para a substituição do petróleo fóssil como substrato de derivados petroquímicos, as indústrias de plásticos, atualmente um dos ramos mais dependentes da acessibilidade do petróleo, já alcançaram um nível alto de sustentabilidade em linhas de polímeros verdes. Porém, rotas verdes para a obtenção do produto final ainda não foram implantadas industrialmente, sendo que somente precursores dos monômeros desejados são produzidos. A partir desses precursores, o processo é continuado convencionalmente através de operações químicas até a obtenção do monômero. O desenvolvimento de uma rota enzimática para esses monômeros pode ser uma alternativa para os processos praticados na indústria. Enzimas são amplamente utilizadas para a bio-conversão industrial de compostos químicos e a busca por enzimas capazes de catalisar novas reações tem se intensificado, criando uma demanda maior por processos automatizados com aplicação de protocolos de rastreamento de alto desempenho. Para a realização da produção enzimática de alcenos de cadeia curta, uma enzima nativa, apresentando um mecanismo catalítico similar à reação desejada, foi modificada pela aplicação do conceito de "desenho de proteínas", que reúne técnicas de diversificação, recombinação, clonagem, expressão heteróloga e rastreamento, utilizando a "enzima molde" como ponto de partida. A enzima P450BS?, selecionada por apresentar os melhores pré-requisitos para modificações estruturais, foi submetida ao "desenho de proteínas", gerando 5.271 versões mutantes. O rastreamento de alto desempenho automatizado dessas proteínas alteradas, utilizando uma plataforma robótica, possibilitou a obtenção de uma enzima que apresenta a nova ação catalítica da conversão de 100 ?M de ácido octanóico para 2,6 ?M de 1-hepteno. Essa nova enzima abre o caminho para a produção industrial de "bio-alcenos" em micro-organismos, criando um sistema de fermentação que poderia sustentar uma rota verde para os monômeros necessários para a produção de plásticos. Abstract: With the increased search for renewable resources for substituting fossil petroleum as the raw material for petrochemical products, the plastics industry, currently being one of the branches with the highest dependency on petroleum availability, already reached a high level of sustainability in their green polymer lines. Still, green routes producing the final product have not been implemented industrially and only precursors of the desired are being produced. Using these precursors, the process is continued conventionally, using chemical operations for the production of the monomers. The development of an enzymatic route toward these monomers could be an alternative for current industrial processes. Enzymes are widely used in industrial bioconversion of chemicals and the search for enzymes with the potential of catalyzing new reactions has intensified, creating a higher demand for automatized processes for the application of high-throughput screening protocols. In order to realize the enzymatic production of short-chained alkenes, a native enzyme, presenting a catalytic mechanism similar to the target reaction, was modified, applying the concept of "protein design", which unites diversification, recombination, cloning, heterologous expression and screening techniques, utilizing the "template enzyme" as a starting point. The enzyme P450BS?, selected for possessing the best prerequisites for structural modifications, was submitted to "protein design", creating 5,271 mutant versions. Automatized high-throughput screening of these altered proteins, utilizing a liquid handling platform, enabled the discovery of an enzyme, which presents a new catalytic action: the conversion of 100 ?M butyric acid to 2.6 ?M 1-heptene. This new enzyme opens the way for the industrial production of "bio-alkenes" in microorganisms, creating a fermentation system, which would be able to sustain a green route toward the necessary monomers for the production of plastics. Doutorado Bioquímica Doutor em Biologia Funcional e Molecular