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As espécies de Hypericaceae são distribuídas em três tribos bem sustentadas, que são Hypericeae, Cratoxyleae e Vismieae. No Brasil, esta família é representada por dois gêneros: Hypericum L. (tribo Hypericeae), com 24 espécies, a maioria distribuída no sul do país, e Vismia Vand. (tribo Vismieae), com 30 espécies de árvores ou arbustos que ocorrem principalmente na região amazônica. Neste trabalho foram desenvolvidos estudos com espécies das tribos Hypericeae, constituída apenas pelo gênero Hypericum, e Vismieae, que inclui os gêneros Vismia, Psorospermum e Harungana. No primeiro capítulo da presente dissertação relata-se o isolamento de derivados de floroglucinol e a análise qualitativa e quantitativa de flavonoides presentes em extratos obtidos de diferentes espécies do gênero, nativas do Brasil. O isolamento foi realizado a partir do extrato hexano das partes aéreas de Hypericum pedersenii, através de técnicas cromatográficas e, como eluente, solventes em polaridade crescente. As frações obtidas foram reunidas por semelhança utilizando a cromatografia de camada delgada. Os compostos foram submetidos a análises espectroscópicas e espectrométricas para identificação. Para a análise de flavonoides, as partes aéreas de diferentes espécies de Hypericum foram submetidas à maceração estática com hexano seguida de diclorometano, para remoção da fração lipofílica, seguida de acetato de etila, e metanol, por períodos de 24 horas até o esgotamento do material vegetal. Os extratos acetato de etila e metanol foram analisados por cromatografia líquida de alta eficiência, com duas fases móveis e gradiente de eluição. Ao comparar os tempos de retenção de picos padrão com aqueles de amostra, a identidade de pico de flavonoides foi atribuída. Como resultados, foi possível realizar o isolamento de um acilfloroglucinol dimérico, identificado através de técnicas de RMN, como hiperbrasilol B, presente em outras espécies do gênero. Este foi o primeiro relato da identificação para H. pedersenii, sendo uma nova fonte de obtenção deste composto. Em relação aos flavonoides, grande parte das espécies analisadas apresentaram hiperosídeo como o componente majoritário, o que já se observou também em diversas espécies de Hypericum. Importante salientar a ausência deste flavonoide em H. teretiusculum. O segundo capítulo apresenta uma revisão da literatura sobre espécies da tribo Vismieae. Essa tribo é um grupo bem estabelecido, mas suas relações internas não, ou seja, a delimitação taxonômica dos gêneros permanece confusa e não resolvida. Segundo alguns autores, a tribo seria 10 constituida pelas especies de Vismia (americanas e africanas) e as espécies de Psorospermum deveriam ser incluidas no gênero Harungana. Outros reforçam a permanência do gênero Psorospermum, que deveria ainda incluir as espécies de Vismia africanas (Afrovismia). Analisando a tribo Vismieae do ponto de vista químico, os derivados antracênicos e as xantonas são as classes de compostos que estão presentes de forma mais expressiva, ocorrendo em todos os táxons, sendo observada uma certa uniformidade nos três gêneros de Vismieae (Harungana, Psorospermum e Vismia). Porém, diferenças também podem ser observadas. É possível supor que seria adequado preservar os três gêneros e manter Afrovismia como um gênero separado, ao invés de unir este grupo de plantas. Ainda é prematuro propor alguma mudança, já que um número realtivamente pequeno de espécies foi estudado quimicamente. Porém, no futuro, com mais informações disponíveis, seria útil incluir os dados químicos nas revisões taxonômicas deste grupo de plantas. Os resultados obtidos nesse estudo demonstram que a família Hypericaceae é uma rica fonte de compostos biologicamente ativos e merece estudos mais aprofundados. Hypericaceae species are distributed in three well-supported tribes, which are Hypericeae, Cratoxyleae and Vismieae. In Brazil, this family is represented by two genera: Hypericum L. (Hypericeae tribe), with 24 species, most of them distributed in the south of the country, and Vismia Vand. (Vismieae tribe), with 30 species of trees or shrubs that occur mainly in the Amazon region. In this work, studies were developed with species from the Hypericeae tribes, constituted only by the Hypericum genus, and Vismieae, which includes the genera Vismia, Psorospermum and Harungana. In the first chapter of this dissertation, we report the isolation of floroglucinol derivatives and the qualitative and quantitative analysis of flavonoids present in extracts obtained from different species of the genus, native to Brazil. The isolation was carried out from the hexane extract of the aerial parts of Hypericum pedersenii, using chromatographic techniques and, as an eluent, solvents in increasing polarity. The fractions obtained were pooled according to similarity, determined by thin layer chromatography. The compounds were subjected to spectroscopic and spectrometric analysis for identification. For the analysis of flavonoids, the aerial parts of different Hypericum species were subjected to static maceration with hexane followed by dichloromethane, to remove the lipophilic fraction, followed by ethyl acetate, and methanol, for periods of 24 hours until exhaustion of the plant material. The ethyl acetate and methanol extracts were analyzed by high performance liquid chromatography, with two mobile phases and elution gradient. When comparing the retention times of standard peaks with sample peaks, the peak identity of flavonoids was assigned. As a result, it was possible to isolate a dimeric acylfloroglucinol, identified through NMR techniques, as hyperbrasilol B, present in other species of the genus. This was the first identification report for H. pedersenii, being a new source for obtaining this compound. Regarding flavonoids, most of the analyzed species present hyperoside as the major component, which has also been observed in several species of Hypericum. It is important to note the absence of this flavonoid in H. teretiusculum. The second chapter presents a review of the literature on species from the Vismieae tribe. This tribe is a well-established group, but their internal relations are not, that is, the taxonomic delimitation of the genera remains confused and unresolved. According to some authors, the tribe would be constituted by the species of Vismia (American and African) and the species of Psorospermum should 12 be included in the genus Harungana. Others reinforce the permanence of the genus Psorospermum, which should also include the African Vismia species (Afrovismia). Analyzing the Vismieae tribe from a chemical point of view, anthracenic derivatives and xanthones are the classes of compounds that are most significantly present, occurring in all taxa, with a certain uniformity being observed in the three genera of Vismieae (Harungana, Psorospermum and Vismia). However, differences can also be observed. It is possible to suppose that it would be appropriate to preserve the three genera and to maintain Afrovismia as a separate genus, instead of uniting this group of plants. It is still too early to propose any changes, since a small number of species have been studied chemically. However, in the future, with more information available, it would be useful to include chemical data in the taxonomic reviews of this group of plants. The results obtained in this study demonstrate that the Hypericaceae family is a rich source of biologically active compounds and deserves further studies.

As espécies Hypericum cavernicolaL. B. SM e Hypericum teretiusculumA.St.-Hil. estão inseridas na família botânica Hypericaceae que possui distribuição cosmopolita, incluindo sete gêneros e aproximadamente 700 espécies. Essas espécies são valorizadas por apresentar uso popular medicinal. A cultura de tecido que consiste no cultivo asséptico in vitrode células, tecidos, órgãos ou plantas inteiras sob controle nutricional e condições ambientais possibilita a multiplicação de genótipos superiores em larga escala, o melhoramento genético e a conservação do germoplasma em meioa outras aplicabilidades. O objetivo do trabalho foi avaliar o efeito das diferentes concentrações dos compostos minerais nitrato de amônio e nitrato de potássio na micropropagação das duas espécies de Hypericum L.,visando à redução de custos do meio de cultura MS. O experimento consistiu em diferentes concentrações e fontes de nitratos na composição do meio MS (MS com ½ NH4NO3, MS com ½ KNO3, MS com ¼ NH4NO3, MS com ¼ KNO3e MS completo) totalizando cinco tratamentos, com quatro repetições composta pordois frascos contendo três explantes cada. Após 60 dias da inoculação avaliou peso médio de massa fresca e massa seca. Não ocorreu diferença significativa entre as diferentes concentrações e as fontes de nitrato na composição do meio de cultura MS para asvariáveis avaliadas na micropropagação das espécies em estudo. O meio de cultura MS completo apresentou os maiores valores médios de peso de massa fresca e peso de massa seca. As fontes de nitratos e as diferentes concentrações não contribuíram para uma possível redução de custos do meio de cultura MS. Made available in DSpace on 2021-04-20T12:36:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Efeitos-de-diferentes-concentracoes-de-nitrato-de-amonio.pdf: 556867 bytes, checksum: 824feb2773b60771f03752f573f2e074 (MD5) Previous issue date: 2020

O vírus da imunodeficiência felina (FIV), do gênero Lentivirus, foi descoberto em 1986 e, desde então, tem sido um modelo experimental promissor para o vírus da imunodeficiência humana (HIV) devido à similaridade estrutural, genômica e patogênica entre os vírus, já demonstrada por diversos autores. O FIV torna-se uma ferramenta para a avaliação de novos fármacos antirretrovirais. A necessidade de encontrar terapias alternativas ao HIV direcionou diversos autores a buscar novas moléculas, em diferentes organismos vivos, principalmente em vegetais superiores. Diversos estudos demonstram atividades biológicas de espécies do gênero Hypericum, como por exemplo, a atividade antidepressiva e a antiviral. O objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade antirretroviral de extrato proveniente de H. connatum frente ao FIV e buscar a substância ativa responsável pela atividade. Para tanto, foram avaliados frente ao FIV: o extrato metanólico bruto, obtido das partes aéreas de H. connatum, frações obtidas por solventes de polaridade crescente e substâncias isoladas, majoritárias na fração de maior atividade antiviral. A composição química das frações foi determinada por HPLC e a fração acetato de etila foi submetida ao isolamento da substância quercitrina por coluna cromatográfica. A avaliação da atividade antiviral foi realizada pela quantificação do número de cópias de FIV no sobrenadante de cultivo celular infectado por PCR em tempo real (qPCR). O extrato metanólico bruto reduziu em 2431 × a carga viral de FIV em comparação ao controle viral. Das frações avaliadas, a fração acetato de etila foi a mais eficiente na inibição da replicação viral, tendo reduzido em 7809 × o número de cópias do vírus. A fração metanol também apresentou atividade antiviral (1466 ×). Os compostos majoritários encontrados em ambas frações por HPLC foram quercitrina e hiperosídeo, sendo a primeira a mais abundante na fração acetato de etila e isolada a partir dessa fração. Quercitrina e hiperosídeo foram testados frente ao FIV, e reduziram parcialmente a carga viral, apresentando resultado comparável ao fármaco Zidovudina (AZT). The feline immunodeficiency virus (FIV), from the Lentivirus genus, was discovered in 1986 and, since then, it has been a promising experimental model for the human immunodeficiency virus (HIV) due to the structural, genomic and pathogenic similarity between the viruses, already evidenced by many authors. FIV becomes a tool to evaluate new antiretrovirals drugs. The necessity of finding new therapies against HIV has influenced many researchers to search new molecules in different living organisms, mainly in superior plants. Several studies demonstrate biologicals activities of species from the Hypericum genus, for instance, antidepressant and antiviral activity. The aim of this study was to evaluate the antiretroviral activity of the extract from H. connatum against FIV and to search for the active substance responsible for the activity. Therefore, it was evaluated against FIV: the crude methanolic extract, obtained from the aerial parts of H. connatum, fractions of the extract obtained using increasing polarity solvents and major compounds isolated in the fraction with the best antiviral acitivity. The chemical composition was determined by HPLC and the ethyl acetate fraction was submitted to the isolation of the compound quercitrin by chromatographic column. The evaluation of the antiviral activity was performed by the quantification of viral particles by real time PCR (qPCR). The crude methanolic extract was able to reduce in 2431 × the viral load of FIV comparing to viral control. Of the evaluated fractions, the ethyl acetate fraction was the most efficient inhibiting the viral replication, reducing in 7809 × the number of viral copies. The methanolic fraction also showed antiviral activity (1466 ×). The major compounds found in both fractions were quercitrin and hyperoside, the former being the most abundant in the ethyl acetate and isolated from it. Quercitrin and hyperoside were tested against FIV, partially decreasing the viral load, showing comparable results to the zidovudine (AZT) drug.

Hypericaceae é uma família da ordem Malpighiales, composta por seis gêneros e cerca de 620 espécies, das quais mais de 80% pertencem ao gênero Hypericum. Com distribuição quase cosmopolita, Hypericum possui dois importantes centros de diversidade na América do Sul: os Páramos andinos (seção Brathys) e os campos do sudeste da América do Sul (seção Trigynobrathys). Estudos filogenéticos recentes têm demonstrado que essas duas maiores seções do gênero, Brathys and Trigynobrathys, são não monofiléticas. De acordo com a compreensão atual, todas as espécies sul-americanas de Hypericum, juntamente com espécies Africanas, Asiáticas e Norte Americanas são acomodadas em um clado que reúne 30% das espécies do gênero e que tem sido informalmente denominado Brathys s.l. ou grupo Brathys. Na presente tese utilizamos análises Bayesianas e de Máxima Verossimilhança a partir de sequências de DNA nuclear e do cloroplasto (ITS + At1G13040 + petD + trnL) para inferir as relações evolutivas entre as espécies de Hypericum sul-americanas. Nessa etapa consideramos uma estratégia de amostragem robusta para as espécies sul-americanas não andinas, as quais eram previamente subamostradas em reconstruções filogenéticas. Também investimos em um bom conhecimento taxonômico e de campo para auxiliar na resolução de dificuldades taxonômicas e nomenclaturais acerca de espécies de Hypericum da região não andina da América do Sul, além de fornecer a primeira avaliação global do risco de extinção para 22 espécies de Hypericum e assim prover informações que subsidiem ações de conservação para as espécies e seus ecossistemas. Com o uso dessas abordagens, melhoramos nosso entendimento sobre a taxonomia e a história evolutiva de representantes sul-americanos do gênero Hypericum. Ou seja, na tese demonstramos que as espécies sul-americanas não andinas de Hypericum formam um grupo monofilético que é fortemente sustentado em nossas análises e que a espécie morfologicamente distinta, H. piriai, fica posicionada separada do clado andino e do clado do sudeste sul-americano, representando uma terceira linhagem que colonizou a América do Sul. Nossos estudos também resultaram em nove novos registros para os territórios argentino, brasileiro e uruguaio, na sinonimização de seis nomes, no restabelecimento da prioridade nomenclatual de Hypericum cordiforme sobre H. cordatum, na indicação de seis lectótipos e 21 casos envolvendo segundo passo de lectotipificação, quatro indicações de neótipos, um epítipo, além da identificação de dois nomes supérfluos e um nome não validamente publicado. Do ponto de vista da conservação, foi possível identificar onze espécies ameaçadas globalmente, sendo seis classificadas na categoria Em Perigo (EN) e cinco como Criticamente em Perigo (CR). Hypericaceae is a family of the order Malpighiales, composed of six genera and about 620 species, of which more than 80% belong to the genus Hypericum. With almost cosmopolitan distribution, Hypericum has two important centers of diversity in South America: the Andean Páramos (Brathys section) and the southeastern South America grasslands (Trigynobrathys section). Recent phylogenetic studies have shown that these two major sections of the genus, Brathys and Trigynobrathys, are not monophyletic. Indeed, all South American species of Hypericum along with African, Asian and North American species are accommodated in a clade that accounts for 30% of the species of the genus and which has been informally termed Brathys s.l. or Brathys group. In the present thesis, we used Bayesian and Maximum Likelihood analyzes from nuclear and chloroplast DNA sequences (ITS + At1G13040 + petD + trnL) to infer the evolutionary relationships between the South American Hypericum species. In this step, we considered a robust sampling strategy for the non-Andean South American species, which were previously under-sampled in phylogenetic reconstructions. We also invested efforts in a substantial taxonomic and field knowledge to improve the resolution of taxonomic and nomenclatural difficulties regarding Hypericum species in the non-Andean South America, as well as to provide the first global extinction risk assessment for 22 Hypericum species and to provide information that subsidize conservation actions for species and their ecosystems. Using these approaches, we improved our understanding of the taxonomy and evolutionary history of South American representatives of the Hypericum genus. That is, in the thesis we demonstrated that the non-Andean South American species of Hypericum form a monophyletic group that is strongly supported in our analyzes and that the morphologically distinct species, H. piriai, is separated from the Andean clade and also from the southeast South American clade, representing a third lineage that colonized South America. Our studies also resulted in nine new records for the Argentinean, Brazilian and Uruguayan territories, synonymization of six names, the restoration of the nomenclatural priority of Hypericum cordiforme over H. cordatum, the indication of six lectotypes and 21 cases involving second-step lectotypes, four indications of neotypes, one epitype, besides the identification of two superfluous names and an name not validly published. From the conservation framework, it was possible to identify eleven endangered species globally; six classified in the category Endangered (EN) and five in the Critically Endangered (CR).

Submitted by Paula Delello Macedo (paula_mac2@yahoo.com.br) on 2018-10-09T13:31:25Z No. of bitstreams: 1 Paula Macedo_Tese Doutorado_08_12_17.pdf: 2504204 bytes, checksum: dfcb5d01e1f9a7ab2e20c470ae6574ba (MD5) Approved for entry into archive by Marley Cristina Chiusoli Montagnoli (marley@foar.unesp.br) on 2018-10-11T17:32:58Z (GMT) No. of bitstreams: 1 macedo_pd_dr.arafor.pdf.pdf: 755800 bytes, checksum: fe73d84056f96eb44de4bccbea155ff0 (MD5) Made available in DSpace on 2018-10-11T17:32:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 macedo_pd_dr.arafor.pdf.pdf: 755800 bytes, checksum: fe73d84056f96eb44de4bccbea155ff0 (MD5) Previous issue date: 2017-12-08 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos da aPDT (antimicrobial photodynamic therapy), com o fotossensibilizador Hipericina-glucamina (Hy-g), ativado por LED âmbar (34,10 J/cm2), no tratamento e progressão da doença periodontal (DP) induzida experimentalmente em ratos. Dois estudos distintos foram conduzidos. No Estudo 1, foi avaliada a fetividade da aPDT como tratamento adjuvante à raspagem e alisamento radicular. Em um período de 15 dias, 60 ratos permaneceram com ligadura ao redor do segundo molar superior para indução da DP. No dia seguinte a sua remoção, os animais foram distribuídos entre 4 grupos experimentais (n =5): IDP (Indução da Doença Periodontal); RAR (Raspagem e Alisamento Radicular); aPDT e RAR+aPDT. Em 7, 15 ou 30 dias após a aplicação dos tratamentos os animais foram eutanasiados. Análises: histológica, histométrica, microtomográfica e estereométrica. No Estudo 2, após 7 dias de indução da DP, 30 ratos foram divididos em 3 grupos experimentais (n=5): Hy-g; LED e aPDT. Os animais foram eutanasiados em 7 ou 15 dias após a aplicação dos tratamentos. Análises: microtomográfica, histométrica, e imuno-histoquimica para Fosfatase Ácida Tartarato Resistente. Os dados foram submetidos a análise estatística (α=0,05). Como resultados, observamos que no Estudo 1 o grupo IDP apresentou alterações morfológicas mais severas do que os demais grupos devido ao processo inflamatório propagado pela DP. No período de 7 dias após os tratamentos, a análise estereométrica mostrou uma proporção significativamente maior de fibroblastos nos animais dos grupos RAR e RAR+aPDT, com relação aos animais do grupoIDP. Entretanto, as demais análises não demonstraram diferenças significativas entre os grupos experimentais. No Estudo 2, a microtomografia computadorizada mostrou que em 7 dias o grupo aPDT apresentou porcentagem de tecido ósseo significativamente maior do que os demais grupos, assim como na avaliação histométrica em área de furca. No período de 15 dias, o grupo tratado com LED apresentou as maiores porcentagens de volume ósseo, sendo significativamente superior aos grupos tratados com Hy-g e aPDT. Na análise histométrica, os grupos controle (hemimaxila contra-lateral), mostraram perda significativamente maior de nível ósseo nas regiões proximais com relação aos grupos tratados. Em 7 e 15 dias, o tratamento com aPDT resultou em menor atividade osteoclática. Concluímos que a aPDT tem efeitos positivos no tratamento da DP, promovendo condições favoráveis ao reparo do periodonto. This research aims at evaluating the effect of aPDT (antimicrobial photodynamic therapy) using the Hypericin-glucamine (Hy-g) as photosensitizer, activated by LED amber (34.10 J/cm2), on the treatment of experimental induced periodontal disease (PD) in rats. Two different studies were conducted. In the Study 1, we assessed the effectiveness of aPDT as an adjunctive treatment to root scaling and straightening. The PD was induced in the second upper molar of 60 rats using ligature for 15 days. In the day after removing the ligature, the animals were divided randomly in 4 experimental groups (n=5): IPD (Induced Periodontal Disease); RAR (Root Scaling and Smoothing); aPDT; and RAR+aPDT. At 7, 15 or 30 days after applying the treatments, the animals were euthanized. Analyses: histological, histometric, microtomographic and stereometric. In the Study 2, after 7 days of inducting the PD, 30 rats were distributed into 3 experimental groups (n=5): Hy-g; LED e aPDT. The animals were euthanized after 7 or 15 days from the treatments. Analyses: microtomographic, histometric, and immunohistochemical for Resistant Tartarate Acid Phosphatase. All data was submitted to statistical analysis (α=0,05). The results from Study 1 indicated that the IPD group had more severe morphological changes than the other groups due to the inflammatory process disseminated by the PD. The stereometric analysis showed a significantly higher proportion of fibroblasts in the animals from the 7-days-after-treatment groups RAR and RAR+aPDT than the group IPD. However, the other analyses did not demonstrate significantly differences among the experimental groups. In the Study 2, the computerized microtomography for the 7-days-after-treatment group aPDT had percentage of bone tissue significantly higher than the other groups, as well as observed in the histometric evaluation in the furcation areas. For the 15 days after treatment, the group treated with LED had the highest percentages of bone volume, which were significantly higher than the groups treated with Hy-g e aPDT. The histometric analysis exhibit that the control groups had a significantly higher loss of bone levels in the proximal regions when compared to the treated groups. In the 7 and 15 days, the treatment with aPDT resulted with less activity of osteoclastic. We concluded that the aPDT has positive effects on the treatment of PD by promoting favorable repairs in the periodontium. AUXPG 655/2014

Plantas do gênero Hypericum (Hypericaceae) são reconhecidas fontes de moléculas com fins terapêuticos. Para espécies nativas do sul do Brasil, atividades como antifúngica e antinociceptiva já foram relatadas, atribuídas principalmente a compostos extraídos em suas frações lipofílicas como derivados de floroglucinol, benzopiranos e benzofenonas. Neste estudo, o potencial sinérgico entre frações lipofílicas de H. carinatum e o fármaco fluconazol, frente a fungos leveduriformes emergentes, foi avaliado por duas metodologias distintas: checkerboard e isobolograma. Para isolados de Candida krusei e C. famata o efeito da associação foi superior ao do fármaco isolado. Dessa forma, o perfil de suscetibilidade observado sugere que a fração esteja auxiliando a ação do fármaco. Ainda abordando o potencial terapêutico de espécies de Hypericum, a investigação da atividade antinociceptiva (via oral) do benzopirano HP1 de H. polyanthemum, quando incorporado em nanoemulsões, foi avaliada. Os resultados demonstraram que HP1 pode ser adequadamente incorporado em nanoemulsões, dada sua solubilidade no núcleo oleoso. Em relação ao efeito antinociceptivo, nanoemulsões contendo HP1 demonstraram o mesmo efeito do composto livre, em magnitude, porém em dose inferior. A redução da dose ativa sugere que uma melhor solubilização do composto possa ter ocorrido quando o mesmo está inserido em nanoemulsões. Nesse contexto, estudos de permeabilidade intestinal ex vivo (Ussing chambers) de HP1, na sua forma livre e incorporado em nanoemulsões, foram realizados. Os resultados demonstraram que a permeabilidade intestinal do benzopirano HP1, quando incorporado em nanoemulsões, foi cerca de 4 vezes maior em relação a forma livre. Além disso, experimentos de lipólise in vitro mostraram que enzimas presentes no trato gastrointestinal são hábeis em hidrolisar nanoemulsões a espécies coloidais, mais solúveis e facilmente absorvíveis pelas células intestinais. Ainda, a permeabilidade intestinal do benzopirano HP1, na sua forma livre, no sentido absortivo foi maior que no sentido secretório indicando que transportadores ativos estão, ao menos em parte, auxiliando a absorção deste composto pelas células intestinais. Dessa forma, com vistas a elucidar o provável transportador ativo de HP1, dada a semelhança estrutural deste benzopirano com moléculas canabinoides e a relação existente entre os sistemas opioide e canabinoide, a influência deste último na absorção de HP1 foi investigada. Os resultados demonstraram que o benzopirano HP1 pode estar relacionado ao sistema canabinoide, mas a natureza dessa ligação, seja de transporte, agonismo/antagonismo ou físico-química, não foi possível de ser elucidada. Os resultados obtidos nesta tese são relevantes à medida que espécies de fungos leveduriformes emergentes se mostram cada vez mais resistentes aos fármacos comumente utilizados. Além disso, a importância destes resultados se dá pela viabilidade de incorporação do benzopirano HP1 em nanoemulsões e a capacidade desses sistemas em reduzir a dose ativa no benzopirano HP1 por uma maior solubilização do composto e assim, melhor absorção. Dessa maneira, os resultados deste trabalho representam o alto potencial biológico de espécies de Hypericum e abrem possibilidade para mais estudos utilizando estas plantas. Plants from genus Hypericum (Hypericaceae) are recognized as a source of therapeutical agents. To south Brazil species, acitivities like antifungal and antinociceptive had already been demonstrated, attributed mainly to compounds from lipophilic fractions as phloroglucinol derivatives, benzophenones and benzopyrans. In this study, antifungal potential of lipophilic fractions of H. carinatum and fluconazole against emerging yeasts was evaluated by two methodologies for multiple dose-response analyzes: checkerboard and isobologram. To Candida krusei and C. famata isolates the effect of association was higher than the effect of fluconazole alone. Thus, the susceptibility profile observed for these species suggests that, somehow, the fractions are facilitating the action of drug. Still on therapeutical potential of Hypericum species, the antinociceptive study of a benzopyran (HP1) isolated from H. polyanthemum, incorporate in nanoemulsions, was evaluated. The results demonstrated that HP1 could be incorporated in a nanoemulsion system, given the high solubility in the oil core. Regarding the antinociceptive effect, HP1 loaded in nanoemulsions showed the same effect of free form, in magnitude, at lower doses. These results suggest a better solubilization of HP1 when loaded in nanoemulsions, and, thus, better absorption by organism. In this context, ex vivo intestinal permeability studies (Ussing chambers) of HP1 free form and loaded in nanoemulsions were performed. The results showed that the intestinal permeability of HP1 loaded in nanoemulsions were about 4 times higher than HP1 free form. Besides, the intestinal permeability of HP1 free form in absorptive direction was higher than secretory direction indicating that active transporters are, at least in part, involved in HP1 intestinal absorption. Thus, in order to elucidate the probable active transporter of HP1 and since its structure looks like a cannabinoid molecule and there is a relation between the opioid and cannabinoid pathways, the influence of intestinal cannabinoid system in HP1 absorption was investigated. The results indicated that the benzopyran HP1 may be related to cannabinoid system, but the nature of this interaction: transport, agonism/antagonism or physico-chemical is still unknown. The outcomes obtained are relevant since the resistance of emerging yeast species to available drugs, used for a variety of fungal infections, is increasing. The importance of these findings lies also in the feasibility of incorporating HP1 into nanoemulsions, and the capacity of these systems in reduce the antinociceptive active doses, by higher solubilization, and thus, absorption. Then, together the results represent the high biological potential of Hypericum species and open new possibilities to further studies with these plants.

Produtos naturais são uma importante fonte de fármacos e muitos vegetais têm sido explorados na busca de substâncias potencialmente ativas. Dentre estas, destacam-se as espécies do gênero Hypericum, principalmente H. perforatum, utilizado há séculos com diversos fins terapêuticos, principalmente no tratamento de feridas. Mais recentemente, a planta está em evidência devido à comprovada atividade antidepressiva, sendo extensamente utilizada em várias partes do mundo no tratamento de depressões leve a moderada. Ambas as atividades citadas se devem a presença de derivados do floroglucinol. As espécies de Hypericum encontradas no sul do Brasil são fonte de floroglucinóis com diversas atividades biológicas descritas. Um dos objetivos deste estudo foi investigar a atividade proliferativa de frações enriquecidas em floroglucinóis de H. caprifoliatum, H carinatum, H. connatum, H. myrianthum e H. polyanthemum, visando indicar possível atividade cicatrizante. Outro objetivo foi ampliar o conhecimento fitoquímico acerca das frações lipofílicas de H. austrobrasiliense e H. caprifoliatum. As partes aéreas, coletadas na época de floração, foram secas, moídas e extraídas com n-hexano. Para os ensaios de proliferação celular foi utilizada uma linhagem de queratinócitos (HaCaT) cultivada in vitro. Os extratos n-hexano das espécies de Hypericum foram caracterizados por CLAE, mostrando a presença majoritária de floroglucinóis. Entre as amostras testadas, as frações de H. carinatum e H. polyanthemum foram as mais promissoras, promovendo uma proliferação 20 a 40% superior àquela obtida com o controle, indicando uma indução no processo de crescimento celular. Os processos cromatográficos realizados com os extratos n-hexano de H. austrobrasiliense levaram ao isolamento de austrobrasilol A, austrobrasilol B e isoaustrobrasilol B, derivados de floroglucinol com estruturas inéditas, do extrato n-hexano de H. caprifoliatum foram obtidos hiperbrasilol B e iso-hiperbrasilol B. Os novos derivados de floroglucinol foram submetidos ao teste da placa aquecida e rotarod, onde demonstraram serem efetivos, provocando uma redução na percepção da dor nos mesmos níveis apresentados pelo floroglucinol dimérico uliginosina B, e não provocaram prejuízo motor. Os resultados obtidos reforçam a importância de vegetais deste gênero como fontes potenciais de compostos biologicamente ativos; neste caso, induzindo a proliferação de células envolvidas na cicatrização e reduzindo a nocicepção, podendo futuramente servir como protótipos de novos agentes cicatrizantes e analgésicos. Natural products are an important source of vegetable drugs and have been explored in the search for potentially active substances. Among these, there are the species of the genus Hypericum, especially H. perforatum, used for centuries for various therapeutic purposes, highlighting the use in the treatment of wounds. More recently, the plant has received high attention due to the antidepressant activity and is widely used all over the world to treat mild to moderate depression. Both activities could be attributed to the presence of phloroglucinol derivatives. The species of Hypericum native to southern Brazil are a source of phloroglucinols with diverse biological activities. One goal of this study was to investigate the proliferative activity of phloroglucinol enriched fractions of H. caprifoliatum, H carinatum, H. connatum, H. myrianthum and H. polyanthemum, aiming to indicate possible wound healing activity. Another objective was to expand the phytochemical knowledge of lipophilic fractions of H. austrobrasiliense and H. caprifoliatum. The aerial parts collected at flowering time were dried, ground and extracted with n-hexane. For cell proliferation assays, keratinocyte cells (HaCaT) were used, grown in vitro. The n-hexane extract of Hypericum species were characterized by HPLC, showing predominant presence of phloroglucinols. Among the tested samples, the fractions of H. carinatum and H. polyanthemum were the most promising, promoving a proliferation 20 to 40% higher than that obtained with the control, indicating the induction of cell growth. The chromatographic process carried out the n-hexane extracts of H. austrobrasiliense led to the isolation of austrobrasilol A, austrobrasilol B and isoaustrobrasilol B, new phloroglucinol derivatives, and to the n-hexane extract of H. caprifoliatum were obtained hyperbrasilol B and isohyperbrasilol B. The new phloroglucinol derivatives were tested in hot plate and rotarod tests, proving to be effective, causing a reduction in pain perception at the same levels provided by dimeric phloroglucinol uliginosin B and did not cause motor impairment. The results emphasize the importance of this kind of plants as potential sources of biologically active compounds; in this case inducing the proliferation of keratinocyte cells and reducing the nociception, and may eventually serve as prototypes of new wound healing and analgesic agents.

Brathys e Trigynobrathys (88 e 59 representantes, respectivamente) são as duas maiores seções do gênero Hypericum que são distribuídos principalmente na América Central e América do Sul. Das mais de 100 espécies sul-americanas de Hypericum quase 65 são endêmicas dos Páramos, ecossistemas de alta altitude, caracterizados por uma vegetação composta principalmente de plantas de roseta gigantes, arbustos e gramíneas, nos quais Hypericum é um componente importante. Tendo em vista o escasso conhecimento da fitoquímica destas espécies de Hypericum, o presente estudo teve como objetivo estudar a composição fitoquímica e algumas bioatividades de seis espécies de Hypericum nativas do Peru (H. aciculare, H. andinum, H. brevistylum, H. decandrum, H. laricifolium e H. silenoides). O material vegetal, seco ao ar, das seis espécies (partes aéreas, caules, folhas e flores), e material vegetal subterrâneo de H. andinum (raízes e caules), foram moídas e extraídas por maceração à temperatura ambiente com n-hexano. Além disso, foram obtidos extrato etanólicos a partir de quatro espécies (H. andinum, H. brevistylum, H. laricifolium e H. silenoides). Os extratos n-hexano foram fracionados e as frações foram sometidas a processos cromatográficos obtendo-se cinco derivados de floroglucinol diméricos conhecidos, uliginosina A, uliginosina B, isouliginosina B, hiperbrasilol B e isohiperbrasilol B. Além disso, foram identificadas duas estruturas monoméricas e duas diméricas inéditas em H. andinum (raízes) e em H. laricifolium, andinina A, hiperlaricifolina A, laricifolina A e laricifolina B. Andinina A mostrou potencial atividade antidepressiva no teste de natação forçada. Do mesmo modo, a atividade antidepressiva dos extratos etanólicos foi avaliada. Estes quatro extratos apresentaram potencial atividade antidepressiva. As análises fitoquímicas por TLC, HPLC-DAD e UPLC-DAD/Q-TOF-MS revelaram que estes extratos são ricos em flavonoides, principalmente hiperosídeo. Os extratos n-hexano foram também analisados por um novo método de HPLC-DAD associado a LC-MS e UPLC-Q-TOF-MS . A presença de homólogos superiores M + 14 e regioisómeros foi determinada. A ocorrência natural destes cinco floroglucinois homólogos superiores M + 14 é descrita e a presença de outros compostos identificados pelo padrão de fragmentação MS é apresentada. Estes extratos e o seu principal componente foram capazes de inibir potencialmente a quimiotaxia induzida por LPS. Estes resultados sugerem que os extratos de espécies de Hypericum das seções Brathys e Trigynobrathys são fontes potenciais de novos anti-inflamatórios e antidepressivos. Brathys and Trigynobrathys (88 and 59 representatives, respectively) are the two largest sections of the genus Hypericum that are principally distributed in Central and South America. Of the more than 100 South American species of Hypericum almost 65 are endemic to the Páramos, high-altitude grassland ecosystems characterized by vegetation composed mainly of giant rosette plants, shrubs and grasses, in which Hypericum is a prominent component. In view of the scare knowledge on the phytochemistry of these Hypericum species, the present research aimed to study the phytochemical composition and some bioactivities of six Peruvian Hypericum species (H. aciculare, H. andinum, H. brevistylum, H. decandrum, H. laricifolium and H. silenoides). The air-dried aerial plant material of those six species (stems, leaves and flowers), and underground plant material of H. andinum (roots and stems), were ground and extracted by maceration at room temperature with n-hexane. Additionally crude ethanolic extracts were obtained from four species (H. andinum, H. brevistylum, H. laricifolium and H. silenoides). The n-hexane extracts were fractionated, and fractions were further processed by chromatographic procedures to yield five known dimeric acylphloroglucinol derivatives uliginosin A, uliginosin B, isouliginosin B, hyperbrasilol B and isohyperbrasilol B. In addition, two monomeric and two dimeric acylphloroglucinol structures were identified in H. andinum (roots extract) and H. laricifolium for the first time, andinin A, hyperlaricifolin A, laricifolin A and laricifolin B. Andinin A showed potential antidepressant-like activity in the forced swimming test. Similarly, the antidepressant-like activity of the crude ethanolic extracts was assessed. These four extracts possessed a potential antidepressant-like activity. The phytochemical analyses by TLC, HPLC-DAD and UPLCDAD/Q-TOF-MS revealed that the extracts were rich in flavonoids, principally hyperoside. The n-hexane extracts were also analyzed by a new HPLC-DAD fingerprint method associated with LC-MS and UPLC-Q-TOF-MS. The presence of M + 14 higher homologues and regioisomers could be distinguished. The natural occurrence of these five M + 14 higher homologues is described and the presence of other compounds identified by their MS fragmentation pattern is presented. These extracts and their main dimeric acylphloroglucinol component were able to potently inhibit the LPS-induced chemotaxis on rat PMN. These results suggest that extracts of Hypericum species from sections Brathys and Trigynobrathys are potential sources of new anti-inflammatory and antidepressant molecules.

Metabólitos secundários produzidos por espécies vegetais são, há tempos, reconhecidos como moléculas capazes de desempenhar ações farmacológicas. Entre as plantas medicinais mais utilizadas estão espécies do gênero Hypericum, pertencente à família Guttiferae, e que possui 494 espécies. Destas, aproximadamente 20 estão distribuídas no sul e sudeste do Brasil e apresentam o acúmulo de compostos fenólicos como flavonoides, xantonas, benzopiranos e floroglucinois. Como forma de garantia da qualidade e quantidade de plantas medicinais para consumo da indústria farmacêutica, bem como uma alternativa para preservação das espécies, o estabelecimento de protocolos de cultivo apresenta-se como uma opção vantajosa frente ao uso de plantas coletadas diretamente de seus locais de crescimento. Por este motivo, espécies nativas do sul do Brasil como H. polyanthemum, H. ternum, H. myrianthum, H. carinatum e H. campestre tiveram seus protocolos de cultivo in vitro e ex vitro (aclimatização) estabelecidos, verificando-se a possibilidade da produção de biomassa vegetal uniforme e de maneira otimizada, com a manutenção da síntese dos metabólitos de interesse. H. teretiusculum, espécie recém identificada na região central do estado, apresenta o acúmulo de metabólitos secundários e escassos relatos na literatura, focados em seus aspectos botânicos. Estes fatos levaram ao estabelecimento do protocolo de cultivo in vitro e aclimatização da espécie. As plântulas apresentaram crescimento satisfatório quando cultivadas in vitro em meio MΔ apenas ou suplementado com ácido indol butírico. Após 18 semanas de aclimatização, verificou-se o aumento da biomassa e o acúmulo dos derivados do floroglucinol uliginosina B e isohyperbrasilol B, verificados em traços na planta in natura, bem como hiperbrasilol B e japonicina A, não detectados nos extratos das plantas coletadas de seu habitat natural. Este resultado evidencia a relevância do cultivo in vitro como forma de otimização da produção de moléculas bioativas. Entre as espécies nativas estudadas, H. polyanthemum destaca-se por ser a única, até o momento, produtora dos três benzopiranos, HP1, HP2 e HP3. Além deles, a planta também produz o derivado do floroglucinol uliginosina B. A presença de HP1, com atividades analgésica e antidepressiva bem como de uliginosina B, que se classifica como novo protótipo para moléculas antidepressivas, levou ao desenvolvimento de um depósito de patente para o extrato n-hexano da espécie e requer estudos para a investigação da otimização em sua biossíntese. Neste sentido, a influência da imposição de estresse abiótico (ácido salicílico e dano mecânico, sozinhos ou combinados, fertilização e seca, sozinhos ou combinados) em plantas aclimatizadas de H. polyanthemum foi investigada na décima oitava semana de aclimatização. Embora HP2 não tenha apresentado aumento em nenhum dos tratamentos aplicados, o aumento de 40 e 6 vezes na produção de uliginosina B nas folhas e flores, respectivamente, destaca-se entre os resultados obtidos, bem como aumento significativo na síntese de HP1 nas folhas e flores e HP3 nas folhas após a aplicação de seca e seca com fertilização, respectivamente. Os resultados sugerem que a biossíntese dos principais metabólitos de H. polyanthemum pode ser consideravelmente incrementada com a exploração do recurso da imposição de estresse hídrico no mesmo. O estabelecimento do cultivo in vitro de raízes adventícias de H. polyanthemum foi realizado como alternativa de produção rápida e “limpa” dos metabólitos secundários de interesse. No entanto, embora apresentando crescimento satisfatório em meio líquido, a síntese de benzopiranos e floroglucinois não foi verificada, mas a produção de diversas xantonas. Interessante é ressaltar que apenas traços de uma xantona é relatado para plantas in natura da espécie, não sendo detectada em plântulas cultivadas in vitro. Com o objetivo de compreender a produção e regulação na síntese destes compostos, realizou-se a investigação de enzimas poliacetídeo sintases (PKS) do tipo III nos tecidos da espécie, com o objetivo principal da obtenção de uma isobutirofenona sintase, envolvida com a biossíntese de floroglucinois e benzopiranos. Dos screenings realizados com primers de expressão de algumas PKS do tipo III foi possível isolar uma benzofenona sintase (BPS) das culturas de células em suspensão e um fragmento 3’-terminal de uma ORF específica para PKS do tipo III, sem apresentar enzimas funcionalmente relacionadas à BPSs. Estes achados concordam com o perfil fitoquímico das culturas de células em suspensão, que apresentam no mínimo duas xantonas como componentes majoritários, e das plântulas in vitro, que apresentam majoritariamente benzopiranos e derivados do floroglucinol em seus extratos, sem detecção de estruturas relacionadas à xantonas. Considerados em seu conjunto, os resultados do presente trabalho contribuem para a preservação e manutenção da qualidade do material vegetal das espécies de Hypericum com potencial uso na terapêutica, bem como contribui para o entendimento da biosíntese dos principais metabólitos de H. polyanthemum que demonstram variar de acordo com o tecido vegetal. Plant secondary metabolites are long ago known to be able to perform pharmacological effects. Hypericum genus possesses 494 species distributed around the world and approximately 20 grow in south Brazil and accumulate phenolic compounds such as flavonoids, xanthones, benzopyrans and phloroglucinol derivatives. Aiming plant quantity and quality for pharmaceutical industry purposes, as well as to avoid natural resource exploitation, in vitro and ex vitro (acclimatization) protocols were established for H. polyanthemum, H. ternum, H. myrianthum, H. carinatum e H. campestre, affording uniform and increased vegetal biomass. H. teretiusculum is a species recently found in the state center, demonstrating secondary metabolite accumulation and only few information in literature, most of them directed to botanical aspects. These data leaded to the establishment of in vitro and ex vitro propagation protocols for the species. Plants were successfully micropropagated in MΔ medium with or without IBA supplementation. After 18 weeks of field growth, vegetal biomass increase and phloroglucinol derivatives accumulation was verified, with uliginosin B and isohyperbrasilol B, just found as traces in in natura plants as well as hyperbrasilol B and japonicin A, not detected in plants harvested directly from the wild. These results attest the relevance of cultivation protocols establishment aiming to optimize bioactive molecules obtainment. Among the native studied species, H. polyanthemum is highlighted for HP1, HP2 and HP3 benzopyrans productions, described just for the species until now. Besides, the phloroglucinol uliginosin B is also produced. The presence of HP1, with antinociceptive and antidepressant activities and uliginosin B, classified as a novel prototype for antidepressant-like molecules, a patent was deposited for n-hexanic extract of the species, claiming for investigations focusing on biosynthesis increment. Guided for this objective, abiotic stresses (SA application and mechanical damage, alone or combined, mild fertilization and drough, alone or combined) was imposed to acclimatized plants of H. polyanthemum on eighteenth week of field growth. Although HP2 was not increased with any of the applied treatments, a 40-fold and 6-fold increase on uliginosin B production in leaves and reproductive parts, respectively are highlighted among the obtained results, as well as significant increase in HP1 in leaves and HP3 in reproductive parts after drought and drought + fertilization treatment, respectively. The data suggest that main H. polyanthemum metabolites might be strongly induced by drought stress modulation. The establishment of in vitro adventitious root cultures of H. polyanthemum was described as alternative for rapid and “clean” secondary metabolites obtainment. Nevertheless, even demonstrating ability for stable in vitro growth, benzopyrans and phloroglucinol derivatives were not detected in this tissue, but a wide array of xanthones was detected instead. It is interesting to point out that only traces of xanthone is related for in natura plants and such class of compounds was not detected in in vitro plants. Aiming to understand biosynthesis of these compound, type III polyketide synthases (type III PKS) were investigated in H. polyanthemum tissue, focusing mainly on BUS discovery, involved in benzopyrans and phloroglucinol biosynthesis. After screening cell suspension cultures cDNA, a benzophenone synthase (BPS) enzyme was isolated and biochemically characterized, while in vitro plants afforded a 3’-end fragment of a type III PKS specific ORF and neither other enzymes related with xanthone biosynthesis. These data are in accordance with phytochemical profile displayed by cells suspensions, presenting at least two xanthones as majoritarian compounds in the extracts, and plants, which just accumulate benzopyrans and uliginosin B. Considered compiled data, the present work direct medicinal plant studies into increment of valuable secondary metabolites.

Uliginosina B é um derivado acilfloroglucinol natural, isolado de espécies de Hypericum nativas da América do Sul. Estudos prévios demonstraram que a uliginosina B apresenta efeitos do tipo antidepressivo e antinociceptivo em baixas doses (até 15 mg/kg, i.p. ou v.o.) e, em doses elevadas (90 mg/kg, i.p.), prejudica a coordenação motora. A atividade antidepressiva depende da ativação da neurotransmissão monoaminérgica e envolve a regulação da homeostase através do balanço de Na+. A atividade antinociceptiva é mediada por receptores opioides e dopaminérgicos da família D2. O efeito atáxico depende da ativação de receptores opioides e dopaminérgicos. Os efeitos parecem ser decorrentes da sua capacidade de inibir a recaptação de monoaminas (especialmente dopamina) com consequente ativação de receptores opioides e monoaminérgicos. O objetivo deste estudo foi aprofundar o conhecimento sobre o mecanismo de ação antinociceptiva de uliginosina B, investigando o envolvimento da neurotransmissão monoaminérgica, glutamatérgica e purinérgica. O tratamento com uliginosina B aumentou a disponibilidade intersticial de dopamina e seu metabólito, ácido homovanílico (HVA), no estriado de ratos; dados que reforçam o papel da neurotransmissão dopaminérgica nos efeitos da uliginosina B. O papel das outras monoaminas e da neurotransmissão glutamatérgica foi investigado nos efeitos antinociceptivo e atáxico induzidos por uliginosina B. A ataxia (90 mg/kg, i.p.) foi completamente prevenida pelo tratamento prévio com pCPA (inibidor da síntese de serotonina) e MK-801 (antagonista do receptor glutamatérgico NMDA), mas não foi afetada pelo prétratamento com prazosina ou ioimbina (antagonistas de receptores adrenérgicos α1 e α2, respectivamente). A atividade antinociceptiva (15 e 90 mg/kg, i.p.) foi reduzida significativamente pelo pré-tratamento com pCPA e MK-801 e aumentada pelo prétratamento com prazosina e ioimbina, apenas na dose mais elevada (90 mg/kg, i.p.). A importância da neurotransmissão monoaminérgica para o efeito antinociceptivo da uliginosina B foi confirmada através da análise isobolar. A associação de uliginosina B com amitriptilina (inibidor da recaptação de monoaminas) ou clonidina (agonista adrenérgico α2) apresentou interação aditiva – dados sugestivos de substâncias com mecanismos de ação mediados pelas mesmas vias – enquanto a associação com morfina (agonista opioide) apresentou interação sinérgica – dados indicativos de um possível uso clínico, como adjuvante opioide na farmacoterapia da dor. O efeito antinociceptivo de uliginosina B (15 mg/kg, i.p.) também foi prevenido pelo tratamento prévio com DPCPX e ZM-241385 (antagonistas de receptores adenosinérgicos A1 e A2A, respectivamente). Este efeito esta relacionado, pelo menos em parte, com a capacidade da uliginosina B aumentar a hidrólise de AMP na medula espinhal e de ATP no córtex cerebral. A uliginosina B também inibiu in vitro a atividade da enzima Na+,K+-ATPase (isoformas α1 e α3). O conjunto de dados apresentados nesta tese evidencia a uliginosina B como um padrão estrutural multirreceptor promissor no desenvolvimento de fármacos com ação analgésica. Em suma, os efeitos antinociceptivo e atáxico induzidos pelo tratamento com uliginosina B são mediados pela ativação da neurotransmissão monoaminérgica, glutamatérgica, purinérgica e opióide, requisitadas com diferente grau de importância; e ainda envolvem o balaço iônico da Na+,K+-ATPase. Uliginosin B is a natural acylphloroglucinol derivative obtained from Hypericum species native to South America. Previous studies have shown that uliginosin B presents antidepressant-like and antinociceptive effects at low doses (up to 15 mg/kg, i.p. or p.o.), and at high doses (90 mg/kg, i.p.) it impairs the motor coordination. The antidepressant-like activity seems to depend on the activation of monoaminergic neurotransmission and ionic balance of Na+. The antinociceptive effect is mediated by opioid and D2 dopamine receptors. The ataxic effect involves opioid and dopaminergic receptors activation. The uliginosin B effects appear to be a consequence of their ability to inhibit reuptake of monoamines (especially dopamine) with subsequent activation of opioid and monoaminergic receptors. The aim of this study was to deepen our knowledge about the mechanism of antinociceptive action of uliginosin B, investigating the involvement of monoaminergic, glutamatergic and purinergic neurotransmissions. Treatment with uliginosin B increased the interstitial availability of dopamine and its metabolite, homovanillic acid (HVA), in the striatum of rats; these data underscore the role of dopaminergic neurotransmission in the effects of uliginosin B. The role of other monoamines as well as the glutamatergic neurotransmission, were investigated in the antinociceptive and ataxic effects induced by uliginosin B. The ataxic effect (90 mg/kg, i.p.) was completely prevented by pre-treatment with pCPA (a serotonin synthesis inhibitor) and MK-801 (a NMDA glutamatergic receptor antagonist), but was not affected by pretreatment with prazosin or yohimbine (α1 and α2 adrenoceptor antagonists, respectively). The antinociceptive activity (15 and 90 mg/kg, i.p.) was significantly reduced by pretreatment with pCPA and MK-801 and increased by pretreatment with yohimbine and prazosin only at the highest dose (90 mg/kg, i.p.). The importance of monoaminergic neurotransmission for the uliginosin B antinociceptive effect was confirmed by isobolar analysis. The association between uliginosin B with amitriptyline (monoamine reuptake inhibitor) or clonidine (α2 adrenergic agonist) showed additive interaction - findings suggestive of substances with mechanisms of action mediated by the same pathways - while the association with morphine (opioid agonist) showed synergistic interaction - indicative of a possible clinical use as adjuvant to opioid pharmacotherapy of pain relief. The antinociceptive effect of uliginosin B (15 mg/kg, i.p.) was also prevented by pretreatment with DPCPX and ZM-241385 (A1 and A2A adenosinergic receptor antagonists, respectively). This effect is related, at least in part, to its ability of increases the AMP and ATP hydrolysis in the spinal cord and cerebral cortex synaptosomes, respectively. Moreover, uliginosin B inhibited the Na+,K+-ATPase activity (α1 and α3 isoforms) in vitro. The data set presented in this thesis pointed uliginosin B as a promising multirreceptor molecular pattern in the analgesic drug development. In summary, the antinociceptive and ataxic effects induced by uliginosin B were mediated by the activation of monoaminergic, glutamatergic, purinérgico and opioid neurotransmission and involves the ionic balance, required with different degree of importance.

O gênero Hypericum (Guttiferae = Clusiaceae) compreende 494 espécies acomodadas em 36 seções taxonômicas. Os representantes americanos pertencem, sobretudo, às seções Brathys e Trigynobrathys, as duas maiores com 87 e 52 espécies, respectivamente. Popularmente, estas plantas são utilizadas como antissépticos, diuréticos, digestivos e agentes de cicatrização. Quimicamente, apresentam tendência em acumular floroglucinóis diméricos, além de benzofenonas, benzopiranos, flavonoides e ácidos fenólicos, metabólitos cuja atividade antidepressiva, antinociceptiva, antimicrobiana, antiproliferativa e antioxidante são descritas. Considerando o potencial terapêutico, este trabalho objetivou a determinação dos principais compostos fenólicos presente nas flores de espécies Hypericum nativas do Sul do Brasil (H. campestre, H. caprifoliatum, H. carinatum, H. connatum, H. linoides, H. myrianthum, H. polyanthemum e H. salvadorense) e dos Páramos peruanos (H. andinum e H. laricifolium); a extração e análise dos compostos fenólicos de H. carinatum obtidos com CO2 supercrítico e a investigação da atividade antifúngica e antiquimiotática dos extratos lipofílicos de H. caprifoliatum, H. carinatum, H. linoides, H. myrianthum e H. polyanthemum. Para os experimentos, foram coletadas (2008 - 2010) as partes aéreas das plantas em floração. Todas as coletas foram autorizadas pelos órgãos de proteção ambiental. Os métodos extrativos incluem maceração estática, ultrassom e CO2 supercrítico (temperatura = 40, 50 ou 60ºC; pressão = 90, 120, 150 ou 200 bar). As análises por CLAE foram realizadas em coluna de fase reversa (C18), sistemas isocráticos compostos por acetonitrila, água e ácido trifluroacético e detecção ultravioleta (220, 270 ou 254 nm); Os picos foram identificados pela comparação dos tempos de retenção/co-injeção com padrões e quantificados pela curva de calibração dos compostos. Os ensaios antifúngico e antiquimiotático foram realizados pelo método de microdiluição em caldo e inibição da migração de neutrófilos, respectivamente. O floroglucinol dimérico uliginosina B (0,008 – 0,188%) e o flavonoide hiperosídeo (0,057 – 5,987%) foram os principais metabólitos detectados nas flores das espécies investigadas. Hypericum caprifoliatum e H. andinum apresentaram o maior rendimento destes compostos, respectivamente. Sete espécies apresentaram japonicina A em concentrações de 0,003 a 0,087% (H. myrianthum). O rendimento de hiperbrasilol B variou de 0,006% em H. laricifolium a 0,011% em H. caprifoliatum. Os benzopiranos (HP1 = 0,200%, HP2 = 0,225% e HP3 = 0,327%) e as benzofenonas (carifenona A = 0,309% e carifenona B = 0,062%) ocorreram exclusivamente em H. polyanthemum e H. carinatum. As máximas quantidades de ácido clorogênico, isoquercitrina, quercitrina e guaijaverina foram observadas, respectivamente, em H. campestre (1,458%), H. andinum (1,161%), H. carinatum (0,231%) e H. laricifolium (0,404%). Tais resultados fornecem suporte adicional para o significado quimiotaxonômico dos derivados diméricos de floroglucinol. Temperatura (40°C = 3,04%, 50°C = 2,21% e 60°C = 1,05%) e pressão (90 bar = 0,95%, 150 bar = 0,97% e 200 bar = 1,89%) afetaram de modo distinto o rendimento do extrato supercrítico de H. carinatum. Apesar do menor rendimento em comparação ao extrato n-hexano (6,09%), a extração com CO2 supercrítico provou ser mais seletiva que a maceração. Nas condições ideais (40°C, 90 bar e 180 minutos), a máxima recuperação de uliginosina B, carifenona A e carifenona B foi, respectivamente, 162,83, 376,33 e 48,79%. O modelo matemático empregado para simular o processo de extração foi apropriadamente correlacionado aos dados experimentais. Considerando as atividades biológicas, todas as espécies investigadas apresentaram um amplo espectro de ação antifúngica, assim como reduziram a migração dos neutrófilos. Os extratos de H. carinatum, H. linoides e H. myrianthum apresentaram os mais baixos valores de concentração inibitória mínima contra Cryptococcus neoformans (CIM £ 15,6 μg/mL), Rhodotorula mucilaginosa (CIM £ 62,5 μg/mL), Candida glabrata e C. tropicalis (CIM = 1,9-250 μg/mL). Para estas plantas, o efeito antiquimiotático variou entre 60 - 100% nas concentrações de 0,31 a 10 μg/mL. Os extratos mais ativos apresentaram elevada concentração de uliginosina B, japonicina A e hiperbrasilol B. Assim, as espécies de Hypericum nativas do sul do Brasil apresentam potencial como fonte de novos antifúngicos e anti-inflamatórios. The genus Hypericum (Guttiferae = Clusiaceae) comprises 494 species placed in 36 taxonomic sections. The representatives of Central and South America belong primarily to sections Brathys and Trigynobrathys, the two largest sections with 87 and 52 species, respectively. In traditional medicine, these plants are used as antiseptic, diuretic, digestive and as healing agents. Such species have a strong tendency to accumulate dimeric phloroglucinol, besides benzophenones, benzopyrans, flavonoids and phenolic acids, metabolites whose antidepressant, antinociceptive, antimicrobial, antiproliferative and antioxidant activities are described. In view of the therapeutic potential, this work aimed to determine the main phenolic compounds present in flowers of Hypericum species native to southern Brazil (H. campestre, H. caprifoliatum, H. carinatum, H. connatum, H. linoides, H. myrianthum, H. polyanthemum and H. salvadorense) and to Peruvian Páramos (H. andinum and H. laricifolium); the supercritical CO2 extraction and analysis of the phenolic compounds of H. carinatum; the antifungal and antichemotactic activities of the lipophilic extracts from H. caprifoliatum, H. carinatum, H. linoides, H. myrianthum and H. polyanthemum. For the experiments, aerial parts in blossom were harvested (2008 - 2010). All collections were authorized by competent agencies of environmental protection. The extraction methods employed were static maceration, ultrasonic bath or supercritical CO2 (temperature = 40, 50 or 60ºC; pressure = 90, 120, 150 or 200 bar). HPLC analyses were carried out in reverse phase column (C18), isocratic system composed of acetonitrile, water and trifluoroacetic acid, and ultraviolet detection (220, 270 or 254 nm). Peaks were identified by comparison of retention times / co-injection with standards and quantified by calibration curve of the compounds. Antifungal and antichemotactic tests were performed using the broth microdilution assay and neutrophils migration inhibition method. The dimeric phloroglucinol uliginosin B (0.008 - 0.188%) and the flavonoid hyperoside (0.057 - 5.987%) were the main metabolite detected in flowers of the investigated species. Hypericum caprifoliatum and H. andinum displayed higher yields of these compounds, respectively. Japonicin A was found in seven species studied at concentrations that varied from 0.003 to 0.087% (H. myrianthum). The yield of hyperbrasilol B ranged from 0.006% in H. laricifolium to 0.011% in H. caprifoliatum. The benzopyrans (HP1 = 0.200%, HP2 = 0.225% and HP3 = 0.327%) and benzophenones (cariphenone A = 0.309% and cariphenone B = 0.062%) occurred exclusively in H. polyanthemum and H. carinatum. Maximum amounts of chlorogenic acid, isoquercitrin, quercitrin and guaijaverin were observed, respectively, in H. campestre (1.458%), H. andinum (1.161%), H. carinatum (0.231%) and H. laricifolium (0.404%). Such results provide a further support for the chemotaxonomic significance of the dimeric phloroglucinols. Temperature (40°C = 3.04%, 50°C = 2.21% and 60°C = 1.05%) and pressure (90 bar = 0.95%, 150 bar = 0.97% and 200 bar = 1.89%) critical did affect differently the yield of supercritical extract of H. carinatum. Despite lower yield in comparison to n-hexane extract (6.09%), supercritical CO2 extraction proved to be more selective than maceration. In optimal conditions (40°C, 90 bar and 180 minutes), the maximum amount of uliginosin B, cariphenone A and cariphenone B was, respectively, 162.83, 376.33 and 48.79%. Lastly, the mathematical model used in the process of supercritical extraction was properly correlated to the experimental data. Regarding the biological activities, all investigated species exhibited a broad spectrum of antifungal action as well as reduced neutrophils migration. Hypericum carinatum, H. linoides and H. myrianthum extracts presented the lowest value of minimum inhibitory concentration against Cryptococcus neoformans (MIC ≤ 15.6 μg/mL), Rhodotorula mucilaginosa (MIC ≤ 62.5 μg/mL), Candida glabrata and C. tropicalis (MIC range = 1.9 - 250 μg/mL). For these plants, the antichemotactic effect varied from 60-100% at concentrations of 0.31 to 10 μg/mL. The most active extracts were that presented high amounts of uliginosin B, japonicin A and hyperbrasilol B. Thus, the Hypericum species native to Southern Brazil show potential as source of new anti-infectives and anti-inflammatory drugs.

Devido ao grande avanço na descoberta de novos fármacos a partir de compostos naturais, tornou-se interessante avaliar o potencial antiproliferativo de moléculas isoladas de extratos de plantas. Este trabalho prioriza o estudo da atividade antitumoral de benzofenonas (carifenona A e carifenona B) e floroglucionóis (japonicina A e uliginosina B), isolados das espécies nativas do sul do Brasil, Hypericum carinatum e Hypericum myrianthum, respectivamente, bem como a associação destes com quimioterápicos utilizados na clínica. Os experimentos propostos foram realizados em modelos in vitro, utilizando diferentes tipos de linhagens tumorais humanas comercialmente disponíveis. Foi avaliado o efeito de diferentes doses destes compostos através de experimentos de viabilidade e sobrevivência celular, análise morfométrica nuclear (NMA) e citometria de fluxo. Na análise estatística foi utilizada a variância de uma via (ANOVA) seguida de teste post-hoc (Tukey). Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média (SEM), sendo valores de P menores do que 0,05 considerados significativos. Verificamos que nas linhagens de adenocarcinoma de ovário e colorretal e de glioblastoma (OVCAR-3, HT-29 e U-251) ocorreu uma diminuição significativa na viabilidade celular quando tratadas com a dose de 100μg/mL tanto de carifenona A como de carifenona B, enquanto os compostos japonicina A (50μg/mL) e uliginosina B (20μg/mL) só foram ativos na linhagem OVCAR-3. Dentre as associações com quimioterápicos, a única que apresentou efeito sinérgico foi a combinação de japonicina A e paclitaxel na linhagem OVCAR-3. A partir deste momento selecionamos a japoncina A para dar continuidade aos estudos. Este composto foi avaliado frente a outros tipos de linhagens tumorais, sendo ativa somente em células de adenocarcinoma de ovário e próstata (OVCAR-3 e PC-3). Na linhagem PC-3, a análise do ciclo celular demonstrou decréscimo da fase G1 e indução ao arraste da fase G2, assim como, através da técnica de NMA, foi verificado um aumento de células apoptóticas, quando as células foram tratadas com japonicina A. Estudos moleculares devem ser realizados para melhor entendimento do mecanismo de ação da japonicina A, composto que pode servir de modelo para o desenho de fármacos mais específicos para este tipo de neoplasia. Due to the great progress in the discovery of new drugs from natural compounds, it has become interesting to evaluate the antiproliferative activity of molecules isolated from plant extracts. This work emphasizes the study of antitumor activity of benzophenones (cariphenone A and cariphenone B) and phloroglucionols (japonicin A and uliginosin B), isolated from Hypericum species native to southern Brazil, H. carinatum and H. myrianthum, respectively, as well as their association with chemotherapeutic drugs used in the clinic. The proposed experiments were performed in vitro using commercially available cell lines. The effect of different doses of these compounds were evaluated via cell viability and survival assay, nuclear morphometric analysis (NMA) and flow cytometry. One way analysis of variance (ANOVA) followed by post hoc tests (Tukey) were utilized for statistical analysis. Results were expressed as mean ± standard error of the mean (SEM), and P values less than 0.05 were considered significant. We found that in ovarian, colorectal (adenocarcinoma) and glioblastoma cell lines (OVCAR-3, HT-29 and U-251) a significant decrease in cell viability occurred when these were treated with a dose of 100μg/mL of cariphenone A and B, while compounds japonicin A (50μg/mL) and uliginosin B (20μg/mL) were active only in OVCAR- 3. Among the associations with chemotherapeutic agents, only japonicin A presented a synergistic effect with paclitaxel in the OVCAR-3 cell line. We then selected japonicin A for evaluation against other cell lines, but its effects were only observed in ovary and prostate adenocarcinoma cell lines (OVCAR-3 e PC-3). In PC-3, the cell cycle revealed a decreased in the G1 phase and induction of G2 arrest, the NMA showed an increase in apoptotic cells when cells were treated with japonicin A. More studies should be conducted to better understand the mechanisms of action of japonicin A, since this compound may serve as pharmacophore model for the design of more specific drugs to treat this tumor type.

A depressão, um transtorno de origem neurológica, atinge cerca de 21% da população mundial. Já a Doença de Alzheimer afeta 10% dos indivíduos com idade superior a 65 anos e 50% dos que possuem idade superior a 85 anos. A atividade do Hypericum perforatum, utilizada na medicina popular, deve-se principalmente à presença da hiperforina, um derivado acilfloroglucinol. Objetivou-se neste trabalho desenvolver compostos sintéticos, a partir da simplificação estrutural, a partir da molécula da uliginosina B, um derivado natural do floroglucinol que apresenta atividade do tipo antidepressiva. Dos compostos sintetizados utilizando a síntese clássica e a metodologia de microondas, dezenove tiveram sua estrutura química completamente elucidada. O grande desafio foi encontrar protocolos de síntese adequados para obter os produtos com bons rendimentos e menor formação de subprodutos. O uso de microondas foi uma ferramenta importante na síntese de alguns compostos isoprenilados. Dez compostos foram testados em dose equimolar à imipramina (20 mg/kg) no teste de suspensão pela cauda (TSC) e, destes, sete compostos diminuíram o tempo de imobilidade dos animais quando comparados aos controles positivos imipramina e fluoxetina, sem provocar qualquer alteração na locomoção no teste de campo aberto. Para avaliar o potencial terapêutico para a Doença de Alzheimer foram realizados ensaios de inibição da acetilcolinesterase e da butirilcolinesterase, nos quais a maioria dos compostos mostrou-se seletivo para a inibição da acetilcolinesterase, porém com atividade na faixa de micromolar. A atividade antioxidante também foi avaliada, na qual a maioria apresentou uma atividade menor que a do floroglucinol. Os compostos ativos no TSC foram avaliados frente à proteína GSK-3 e dois apresentaram uma atividade moderada ATP não competitiva. Foi realizado o docking destas duas moléculas sobre a proteína GSK-3 e pode-se constatar que existe uma ligação aos sítios do substrato (cavidade dois) e alostérico (cavidade sete), o que confirma o resultado obtido experimentalmente no ensaio de cinética com o substrato GS2. As atividades biológicas apresentadas pelos derivados sintéticos obtidos são inovadoras, já que até o momento estudos semelhantes a estes não são encontrados na literatura. Sendo assim, este trabalho se torna um ponto de partida para novos estudos com derivados do floroglucinol na busca de novos protótipos para as atividades antidepressiva e neuroprotetora. Depression, a neurological disorder, affects about 21% of the world population, and Alzheimer's Disease affects 10% of individuals aged 65 years and 50% of those with age above 85 years. The activity of Hypericum perforatum, used in folk medicine, is mainly due to the presence of hyperforin, an acylphloroglucinol. The aim of this work was to develop synthetic compounds using uliginosin B, a natural phloroglucinol derivative having antidepressant-like activity, as a prototype to the structural simplification strategy. Nineteen compounds were synthesized using classical synthesis and the microwave assisted organic synthesis, which structures were fully characterized. The challenge was to develop synthetic protocols to obtain compounds with good yields and few by-products. The microwave assisted organic synthesis was an important tool to obtain some isoprenylated compounds. Ten compounds were tested in equimolar dosis to imipramine (20 mg/kg) in the tail suspension test (TST), from which seven decreased the immobility time of the animals when compared to positive controls, imipramine and fluoxetine, without any change at the locomotion in the open field test. To evaluate the therapeutic potential for Alzheimer's Disease the inhibition assays of acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase were performed. The majority of compounds were selective for acetylcholinesterase inhibition in the range of micromolar. The antioxidant activity was also assessed for all compounds which presented lower activity than that of the phloroglucinol. The active compounds in the TSC were tested against the GSK-3 protein and two showed a moderate ATP noncompetitive activity. The docking of these molecules was performed on GSK-3 protein and showed a binding to the site of the substrate (cavity two) and to the allosteric one (cavity seven), which confirms the results obtained on the GS2 substrate kinetic assay. The biological activities demonstrated by the synthetic derivatives obtained herein are innovative since there are not similar studies in the literature. Thus, this work is a starting point for further studies with phloroglucinol derivatives in a search of new prototypes for antidepressant and neuroprotective activities.

Plantas do gênero Hypericum são bem conhecidas por sua utilização na medicina tradicional, sendo Hypericum perforatum a espécie mais estudada. No Sul do Brasil, esse gênero é representado por cerca de 20 espécies, entre elas, destaca-se H. polyanthemum, o qual apresenta em extrato lipofílico a presença de uliginosina B, um derivado de floroglucinol, e três benzopiranos: HP1, HP2 e HP3. Partes aéreas de H. polyanthemum foram submetidas à extração com fluido supercrítico (SFE), sendo realizadas extrações sucessivas com dióxido de carbono nas pressões de 90, 120, 150 e 200 bar, em diferentes temperaturas (40, 50 e 60 °C). Posteriormente, as frações obtidas foram comparadas com extrato n-hexano obtido por técnica convencional (ultra-som). SFE apresentou maior seletividade que a extração com nhexano, sendo a 50 °C a melhor condição para extrair os metabólitos bioativos. Para extração do composto com maior peso molecular, uliginosina B, pressões mais elevadas foram necessárias. Além disso, avaliou-se a atividade anti- Trichomonas vaginalis do extrato obtido por SFE a 50 °C/150 bar e dos compostos isolados. Os resultados indicam que todas as amostras testadas possuem atividade anti-T. vaginalis, porém, HP1 demonstrou melhor seletividade frente ao protozoário (isolado metronidazol-resistente e -suscetível), sem apresentar citotoxicidade contra células de mamíferos. Ainda, o HP1 apresentou satisfatória atividade contra isolado metronidazol-resistente (52% de trofozoítos viáveis), apresentando efeito sinérgico quando testado com baixa concentração de metronidazol (23% de trofozoítos viáveis). Todos os compostos isolados provocaram danos na membrana do parasito (liberação de LDH > 90%) e nenhuma das amostras apresentou efeito hemolítico importante, sendo que HP2 e uliginosina B apresentaram citotoxicidade frente a células de mamíferos. Portanto, benzopiranos e derivados de floroglucinol são moléculas promissoras como protótipos para novos fármacos tricomonicida, principalmente HP1, visto que corrobora com a ação do metronidazol em isolados de T. vaginalis resistentes. No entanto, mais estudos são necessários a fim de melhorar a atividade antiprotozoária das moléculas testadas, sem que as mesmas apresentem toxicidade para células de mamíferos. Plants of the genus Hypericum are well known for their use in traditional medicine, being H. perforatum the most important species. In South Brazil, this genus is represented by approximately 20 species and among them, H. polyanthemum showed in the lipophilic extract the presence of uliginosin B, a phloroglucinol derivative, and three benzopyrans: HP1, HP2 and HP3. Aerial parts of H. polyanthemum were submitted a supercritical fluid extraction (SFE), being successively extracted with supercritical carbon dioxide under pressures of 90, 120, 150 and 200 bar at different temperatures (40, 50 and 60 ºC), and compared with the n-hexane extract obtained by ultrasound-assisted extraction. SFE presented higher selectivity than the n-hexane extration. The best condition to extract the target metabolites has been determined to be at 50 °C, being that for the high molecularweight compound, uliginosin B, higher pressures was required. Moreover, the anti- Trichomonas vaginalis activity of the extract obtained by SFE at 50 °C/150 bar and the isolated compounds was evaluated. The results showed that all samples have anti-T. vaginalis activity; however, HP1 demonstrated the best selectivity against this protozoa (metronidazole-resistant and -susceptible isolates), with no cytotoxicity against mammalian cells. In addition, HP1 has good activity against metronidazoleresistant isolate (52% of viable trophozoites), presenting synergic effect when tested with low concentration of metronidazole (23% of viable trophozoites). All isolated compounds caused damage in the parasites membrane, revealed by more than 90% of LDH release. None of the samples presented important hemolytic effect, and HP2 and uliginosin B presented cytotoxicity against mammalian cells. Therefore, benzopyrans and phloroglucinol derivative are promising molecules as prototypes for new antiprotozoal drugs, especially HP1, which improve metronidazole action against a resistant T. vaginalis isolate. Nevertheless, more studies are necessary in order to enhance their in vitro antiprotozoal activity without toxicity for mammalian cells.

uliginosina B é um derivado floroglucinol dimérico identificado em espécies de Hypericum nativas do sul do Brasil, como H. polyanthemum e H. caprifoliatum. Extratos lipofílicos destas duas espécies apresentaram efeito antinociceptivo em roedores, este efeito foi bloqueado por naloxona. Além disso, estudos in vitro mostraram que a uliginosina B inibe a recaptação sinaptossomal de monoaminas, com maior potência para dopamina. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito antinociceptivo da uliginosina B na placa aquecida e no teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético em camundongos, bem como avaliar o envolvimento do sistema opioide e neurotransmissão dopaminérgica usando antagonismos farmacológicos in vivo e ensaios de radioligação. O tratamento com uliginosina B (90 mg/kg, p.o.) apresentou efeito antinociceptivo nos testes da placa aquecida e das contorções abdominais. O efeito da uliginosina B sobre a nocicepção térmica foi dosedependente (5-90 mg/kg, i.p.) e ocorreu em doses que não prejudicaram a coordenação motora (15 mg/kg, i.p.; 90 mg/kg, p.o.). A administração de uliginosina B em dose elevada (90 mg / kg, i.p.) apresentou efeito atáxico no rota-rod. Os efeitos antinociceptivo e atáxico parecem ser mediados por receptores distintos, pois o efeito na placa aquecida foi completamente abolido por naloxona (uliginosina B 15 mg/kg, i.p.) e sulpirida (uliginosina B 15 mg/kg i.p. e 90 mg/kg, i.p.), mas ele não foi alterado por SCH 23390, enquanto o déficit motor induzido por uliginosina B (90 mg/kg, i.p.) no rotarod foi completamente abolido por naloxona e parcialmente bloqueado por sulpirida e SCH 23390. Entretanto, a ativação destes receptores parece ser indireta, uma vez que in vitro a uliginosina B não alterou a ligação [35S]-GTPγS em membranas de tálamo e corpo estriado, nem afetou a ligação [3H]-naloxona, [3H]-SCH 23390 e [3H]-sulpirida aos seus receptores em preparados de membrana de prosencéfalo e corpo estriado, respectivamente. Assim, provavelmente, pelo menos parte dos efeitos observados para a uliginosina B são devido à sua capacidade de inibir a recaptação de monoaminas com conseqüente ativação de receptores dopaminérgicos e estimulação indireta do sistema opioide. Uliginosin B is the main phloroglucinol from Hypericum polyanthemum and H. caprifoliatum (vegetal species from South Brazil) that possess antinociceptive effect blocked by naloxone in rodents. Furthermore uliginosin B inhibits monoamine reuptake in rat brain, especially dopamine. The aim of this study was to assess the antinociceptive effect of uliginosin B in the hot-plate and acetic acid induced writhing, in mice, as well as to evaluate the involvement of opioid system and dopaminergic neurotransmission by using in vivo pharmacological antagonisms and bindings assays. Uliginosin B (90 mg/kg, p.o.) presented antinociceptive effect in hot-plate and abdominal writhing tests. The uliginosin B effect on thermal nociception was dosedependent (5-90 mg/kg, i.p.) and occurred at doses that did not impair the motor coordination (15 mg/kg, i.p.; 90 mg/kg, p.o.). At higher dose (90 mg/kg, i.p.) uliginosin B also presented ataxic effect in the rotarod apparatus. The antinociceptive and ataxic effects seem to be mediated by distinct receptors since the effect on the hot-plate was completely abolished by naloxone (uliginosin B 15 mg/kg, i.p.) and sulpiride (uliginosin B 15 mg/kg, i.p. and 90 mg/kg, i.p) but it was unaffected by SCH 23390, whereas the impairment induced by uliginosin B (90 mg/kg, i.p.) on the mice rotarod performance was completely prevented by naloxone and partially by sulpiride and SCH 23390. However, receptors activation seems to be indirect in any case because uliginosin B did not alter [35S]-GTPγS binding in the thalamus and striatum, nor affected [3H]-naloxone, [3H]-SCH 23390 and [3H]-sulpiride binding in rat forebrain and striata membranes. Thus, probably the effects of uliginosin B are at least in part due to its ability to inhibit monoamine reuptake with consequent activation of dopamine receptors and indirect stimulation of opioid system.

Mestrado em Engenharia Agronómica - Protecção das Plantas - Instituto Superior de Agronomia The aim of this work was the micromorphological and molecular characterization of some species of Hypericum. The morphological studies were accomplished on: H. calycinum, H. canariense, H. grandifolium, H. x inodorum and H. patulum. The molecular analysis was extended to two more species: H. androsaemum and H. perforatum ssp. perforatum. The morphological analysis were carried out by optical and scanning electron microscopy , and histochemical studies were done with reagents for the main groups of primary and secondary compounds. The epidermal characters such as size of epidermal cells, size and shape of stomata, stomatic index and presence of secretory cells are similar in all taxa. There were differences in the shape of the walls of epidermal cells, density of the cuticular waxes, index of glands and size of the mesophyll. The detected histochemical compounds are similar, except in the taxon H. patulum, which has steroids in glands (with antimony trichloride). In the study we used molecular markers ISSR and proceeded to the analysis of the sequences of the ITS region. The ISSR marker might have revealed a high degree of polymorphism and showed that the species H. inodorum and H. grandifolium are very close and the rate H. patulum and H. calycinum are species that are more remote, both morphological and molecular.

Espécies de Hypericum (Guttiferae) são mundialmente reconhecidas por seus efeitos farmacológicos, destacando-se H. perforatum pela atividade antidepressiva. O estudo com espécies brasileiras vem apresentando resultados promissores. Hypericum polyanthemum e H. caprifoliatum mostraram efeito antinociceptivo, enquanto H. caprifoliatum mostrou atividade do tipo antidepressiva. Além disso, verificou-se atividade de H. polyanthemum sobre o carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Para essas espécies, é descrita a presença de benzopiranos, derivados de floroglucinol e flavonóides. Objetivos: Isolar compostos fenólicos lipofílicos de H. polyanthemum e o flavonóide hiperosídeo de H. caprifoliatum, assim como avaliar atividades biológicas de algumas dessas substâncias. Materiais e Métodos: Realizou-se a análise química através de técnicas cromatográficas (CC, CCD) e espectroscópicas (1H e 13C RMN). Hiperosídeo foi avaliado nos seguintes modelos comportamentais: potenciação do sono barbitúrico, atividade locomotora espontânea, placa quente, contorções induzidas por ácido acético e natação forçada. O efeito antinociceptivo de isobutiril-5,7-dimetóxi-2,2-dimetilbenzopirano (HP1), 7-hidróxi-6-isobutiril-5-metóxi-2,2-dimetil-benzopirano (HP2) e 5-hidróxi-6-isobutiril-7-metóxi-2,2-dimetil-benzopirano (HP3), foi investigado, assim como sua atividade acaricida através do teste de imersão de larvas. Resultados e Conclusões: Além dos benzopiranos HP1, HP2 e HP3, dois compostos não relatados para a espécie H. polyanthemum, a xantona 6- desoxijacareubina e um benzopirano de estrutura similar ao ácido eriostemóico, foram isolados de extrato obtido por fluido supercrítico. Hiperosídeo mostrou efeito depressor sobre o SNC, e efeito antiimobilidade, que parece ser mediado pelo sistema dopaminérgico, em ratos. HP1 apresentou efeito antinociceptivo mediado pela neurotransmissão opióide. Nos experimentos para investigação da atividade acaricida, os benzopiranos mostraram ser, pelo menos em parte, responsáveis pela toxicidade dos extratos sobre os ácaros. The pharmacological effects of some Hypericum species are worldwide recognized, mostly by the comproved efficacy of H. perforatum as antidepressant. The south Brazilian species have been showing promissing results. Hypericum polyanthemum and H. caprifoliatum presented antinociceptive effect, while an antidepressant-like activity of H. caprifoliatum was reported. In addition, extracts from H. polyanthemum showed to be highly toxic to Rhipicephalus (Boophilus) microplus cattle tick. The chemical characterization reveals that these species are rich in benzopyrans, flavonoids and phloroglucinol derivatives. Objectives: To isolate lipophilic compounds from H. polyanthemum and the flavonoid hyperoside from H. caprifoliatum, as well as to carry out a biological evaluation of some of the isolated substances. Material and Methods: Chromatography and NMR spectroscopy techniques were performed for isolation and structure elucidation. Hyperoside was applied on behavior models, as the open field, pentobarbital sleeping potentiation, hot plate, acetic acid-induced writhing and the forced swimming test. The antinociceptive effect and the acaricide potential of 6-isobutyryl-5,7-dimethoxy- 2,2-dimethyl-benzopyran (HP1), 7-hydroxy-6-isobutyryl-5-methoxy-2,2-dimethylbenzopyran (HP2) and 5-hydroxy-6-isobutyryl-7-methoxy-2,2-dimethylbenzopyran (HP3) were also investigated. Results and conclusions: A benzopyran similar to the eriostemoic acid and the xanthone 6-deoxyjacareubin were isolated from the extract obtained by supercritical fluid. Hyperoside showed a central depressor effect and no toxicity signs. The present study provides evidences for the involvement of D2-like dopaminergic neurotransmission on the mechanism of hyperoside antidepressant-like action in rats. HP1 presented opioid-mediated antinociceptive effect. On larvae immersion test, the benzopyrans showed to account for the acaricide properties of H. polyanthemum extracts.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia Preparações comerciais de Hypericum perforatum (erva-de-São-João; ESJ) são bastante populares, de interesse comercial, e são estudadas cientificamente há muitos anos. Por outro lado, há um grande interesse em encontrar alternativas terapêuticas seguras e confiáveis para o tratamento da depressão e, neste contexto, a ESJ tem competido com sucesso pelo status de terapia antidepressiva padronizada. Na busca por um princípio ativo que possa ser responsabilizado pela atividade antidepressiva do Hypericum, vários compostos, principalmente os naftodiantronas (hipericina e pseudohipericina), o fluoroglicinol hiperforina (e seu derivado adhiperforina), além de diversos flavonóides (rutina, hiperosídeo, isoquercitrina, quercitrina, quercetina) têm sido extensivamente estudados. No entanto, não é possível, até o momento, atribuir a atividade antidepressiva da ESJ a somente um dos constituintes químicos presentes na planta. Na verdade, uma atuação sinérgica dos constituintes mencionados tem sido sugerida, embora os mecanismos de ação farmacológicos exatos ou as proporções ideais de constituintes permaneçam desconhecidos. Inúmeros estudos farmacológicos (pré-clínicos e clínicos) usando extratos totais da planta, assim como frações e constituintes isolados foram feitos nos últimos anos. O presente estudo difere destes estudos porque testa extratos comerciais de ESJ em modelos animais de atividade antidepressiva, em paralelo ao estudo dos constituintes químicos destes fitoterápicos, tentando correlacionar o efeito e os compostos dos produtos (quantitativa e qualitativamente). No estudo farmacológico foram usados dois modelos comportamentais validados para avaliar a atividade antidepressiva dos produtos comerciais, testes estes que predizem o efeito clínico de substâncias de diferentes grupos químicos: o teste da suspensão pela cauda (TSC) e o teste da natação forçada (TNF). Para a análise química e a avaliação quantitativa dos produtos comerciais de ESJ usamos um método de eletroforese capilar não aquoso. Nossos dados confirmam a atividade antidepressiva das quatro preparações comerciais de ESJ (pela redução do tempo de imobilidade em ambos os testes), assim como o perfil dos constituintes ativos de alguns extratos de Hypericum encontrados no mercado brasileiro (hiperforina e flavonóides - quercetina, rutina e isoquercitrina). Para verificar a especificidade do efeito observado, a atividade motora dos animais foi avaliada no teste do campo-aberto (CA) imediatamente antes de sua submissão ao TSC. Nenhuma diferença estatística foi encontrada entre o grupo controle e os experimentais em qualquer dos parâmetros observados no CA (locomoção horizontal e vertical), excluindo assim qualquer efeito estimulante (ou atividade sedativa) para os produtos testados. Não observamos diferenças significativas entre os diferentes produtos no que diz respeito à atividade antidepressiva, mas seu perfil fitoquímico é completamente diverso, o que indica que os diversos constituintes (hiperforina, flavonóides, etc) podem estar interagindo sinergisticamente para promoção da atividade antidepressiva.

É apresentado o estudo taxonômico de Hypericum no Estado do Paraná. Este gênero inclui cerca de 350 espécies nas regiões temperadas e subtropicais de todo o mundo. No Brasil, ocorrem 17 espécies, 12 das quais confirmadas para o Estado do Paraná, além de três subespécies, distribuídas em todas as regiões fitogeográficas do Estado, principalmente na estepe gramíneo-lenhosa. Apresenta-se chave de identificação dos táxons, descrições, ilustrações, dados ecológicos e de distribuição geográfica. A taxonomic study of the genus Hypericum L. (Hypericaceae) in the state of Paraná was carried out. This genus includes about 350 species, mostly cosmopolitan, occurring in temperate and subtropical regions worldwide. Seventeen species are found in Brazil, with twelve species and three subspecies in Paraná, in all phytogeographic regions of the state, mainly in grasslands. An identification key for the taxa, descriptions, illustrations and data on geographic distribution and ecology are provided.

Aproximadamente vinte espécies do gênero Hypericum (Guttiferae) têm ocorrência natural no Brasil, e concentram-se principalmente na região Sul do País. Considerando a importância deste gênero como fonte de substâncias com variadas atividades biológicas, tais como analgésica, antidepressiva, antimicrobiana, antiviral, antiproliferativa, entre outras, o presente trabalho teve como objetivos analisar a constituição química e o potencial antioxidante de espécies de Hypericum, desenvolver protocolos para manutenção de algumas espécies nativas através de culturas de tecidos e células e validar metodologia para quantificação de benzopiranos em H. polyanthemum proveniente de cultivo a campo, in vitro e aclimatizado. Utilizando-se métodos cromatográficos e espectroscópicos, foram isolados e identificados o ácido fenólico ácido 5-O-cafeoil-1-metoxi-quínico e os flavonóides 3,7-dimetil-quercetina, 3-Ometil- quercetina, I3,II8-biapigenina, guaijaverina, isoquercitrina e hiperosídeo, todos derivados da quercetina e obtidos da fração acetato de etila das partes aéreas de H. ternum. Ainda desta espécie, porém da fração n-hexano das raízes, obteve-se o derivado de floroglucinol uliginosina B. De H. myrianthum foram isolados e identificados os flavonóides quercetina e hiperosídeo, da fração metanólica das partes aéres, bem como os derivados de floroglucinol japonicina A e uliginosina B, fração n-hexano das raízes. Através do método colorimétrico de Folin-Ciocalteau, foram quantificados os teores de fenólicos totais das espécies H. caprifoliatum, H. carinatum, H. myrianthum e H. polyanthemum, verificando-se teores variando entre 37,40 a 228,36 mg EQ/g de extrato seco. Utilizando as técnicas de TRAP (Total Radical-trapping Antioxidant Parameter), ORAC-PGV (Oxygen Radical Absorbance Capacity) e reação bioautográfica e espectrofotométrica com radicais DPPH• (2,2 difenil-1-picril-hidrazil) evidenciou-se que extratos brutos metanólicos, e frações metanólicas e n-hexânicas das espécies H. caprifoliatum, H. carinatum H. myrianthum e H. polyanthemum, bem como produtos isolados de espécies de Hypericum nativas do Estado apresentam potencial antioxidante. A regeneração in vitro foi obtida em meio Murashige & Skoog modificado (MΔ) para as espécies H. campestre, H. caprifoliatum, H. carinatum, H. myrianthum, H. polyanthemum e H. ternum utilizando diferentes combinações e concentrações dos reguladores de crescimento 6-benzilamino-purina (BAP), ácido naftaleno-acético (ANA) e ácido 2,4 dicloro-fenóxi-acético (2,4-D). Plântulas dessas espécies foram posteriormente aclimatizadas com sucesso, sendo cultivadas a campo. As espécies micropropagadas demonstraram perfis químicos qualitativamente similares aos apresentados pelas plantas desenvolvidas no campo, de modo que o cultivo in vitro apresenta-se como uma alternativa interessante aos métodos convencionais de produção de biomassa para extração de metabólitos secundários bioativos. Culturas de calos foram estabelecidas em meio MΔ para H. myrianthum, H. polyanthemum e H. ternum, utilizando diferentes combinações e concentrações dos reguladores de crescimento cinetina (CIN), BAP, ANA e 2,4-D. Considerando-se as importantes atividades biológicas de produtos obtidos de H. polyanthemum foi estabelecida uma metodologia para quantificação, através da técnica de CLAE, de benzopiranos no extrato apolar desta planta, espécie de ocorrência restrita. A validação analítica foi avaliada conforme o preconizado por normas reconhecidas internacionalmente, com análise dos parâmetros linearidade, seletividade, precisão (repetibilidade e precisão intermediária), exatidão e limites de detecção e quantificação, demonstrando resultados coerentes com os exigidos pela legislação vigente. Foram evidenciadas variações no teor de benzopiranos na planta micropropagada, aclimatizada e desenvolvida a campo, provavelmente devido a fatores, que vão desde a regulação endógena de processos fisiológicos até variações sazonais no cultivo. Approximately twenty species of Hypericum genus (Guttiferae) are native of Brazil, occurring mainly in the South region. Considering the importance of the genus as a source of compounds with different biological activities, such as analgesic, antidepressant, antimicrobial, antiviral, antiproliferative, among others, the objectives of this work were to evaluate the phytochemistry and antioxidant potential of some Hypericum species, to develop protocols for the maintenance of the species through in vitro cultures and to validate a technique to quantify the benzopyrans in H. polyanthemum grown in field, in vitro and acclimatized plants. Chromatographic and spectroscopic techniques were used for the isolation and identification of the phenolic acid 5-O-caffeoyl-1-methyl ester-quinic acid and the flavonoids quercetin 3,7-dimethyl ether, quercetin 3-methyl ether, I3,II8-biapigenin, guaijaverin, isoquercitrin and hyperoside, all of them quercetin derivatives and obtained from ethyl acetate fraction of H. ternum aerial parts. From n-hexane fraction of the roots of this species the phloroglucinol derivative uliginosin B was obtained. The flavonoids quercetin and hyperoside (from aerial parts of methanolic fraction), and the phloroglucinol derivatives japonicin A and uliginosin B (from n-hexane fraction of roots) were isolated from H. myrianthum. Total phenol concentration ranging from 37.40 to 228.36 mg QE/g dry extract (Folin–Ciocalteu colorimetric method) in H. caprifoliatum, H. carinatum, H. myrianthum and H. polyanthemum was measured. The antioxidant potential of the extracts obtained from H. caprifoliatum, H. carinatum, H. myrianthum and H. polyanthemum and isolated compounds was determined using TRAP (Total Radicaltrapping Antioxidant Parameter), ORAC-PGR (Oxygen Radical Absorbance Capacity) and bioautographic and spectrofotometric reaction with DPPH• (2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl radical techniques. In vitro regeneration of H. campestre, H. caprifoliatum, H. carinatum, H. myrianthum, H. polyanthemum and H. ternum was obtained in Murashige & Skoog modified medium (MΔ) supplemented with differents combinations and concentrations of the growth regulators 6-benzylaminopurine (BAP), α-naphthalene acetic acid (ANA) and 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D). Plantlets were acclimatizated and transferred to open field. The micropropagated species showed chemical pattern qualitatively similar to field grown plants, demonstrating that the in vitro cultures are an alternative to conventional methods for biomass production of bioactive secondary metabolites. Callus cultures of H. myrianthum, H. polyanthemum and H. ternum were established in MΔ medium using different combinations and concentrations of kinetin (CIN), BAP, ANA and 2,4-D. Considering the important biological activities of the benzopyrans isolated from H. polyanthemum, an HPLC quantification methodology was established. Analytical validation was performed according to international rules (linearity, selectivity, precision, accuracy, detection and quantitation limits) showing results coherent with those required by the current legislation. Variation of the benzopyrans concentration was observed among the micropropagated plantlet, acclimatizated and field grown plants, probably due to factors as endogenous regulation of physiological process and seasonal variation of the culture.

A comercialização de fitoterápicos obtidos a partir de extratos de H. perforatum para o tratamento de depressão em diversas partes do mundo despertou o interesse de investigadores no estudo de plantas do gênero Hypericum, tanto acerca da composição química quanto das propriedades biológicas destas espécies. Objetivos: Investigar a constituição química de espécies nativas do gênero Hypericum (H. caprifoliatum, H. polyanthemum, entre outras); realizar um estudo quimiotaxonômico de derivados de floroglucinol em espécies de Hypericum. Avaliar a atividade antiproliferativa de benzopiranos isolados de H. polyanthemum frente a células endoteliais. Métodos: Para o isolamento e análise dos compostos foram utilizadas técnicas cromatográficas (CC, CCD e CLAE). A elucidação estrutural foi realizada a partir de métodos espectrofotométrico (UV), espectroscópico (RMN1H e 13C) e espectrométrico. A relevância taxonômica de derivados de floroglucinol foi verificada a partir de revisão da literatura. A avaliação da atividade antiangiogênica foi efetuada pelas técnicas de sulfo-rodamina B e citometria de fluxo. Resultados e Conclusões: De H. caprifoliatum e H. polyanthemum foram isolados três derivados de floroglucinol diméricos. Estes produtos podem ser considerados marcadores quimiotaxonômicos das seções Brathys e Trigynobrathys do gênero Hypericum, as quais incluem todas as espécies nativas do sul do Brasil. Os flavonóides, quercetina e hiperosídeo foram isolados de H. caprifoliatum. Os três benzopiranos testados (Hp1, Hp2 e Hp3) demonstraram capacidade de inibir o crescimento de células endoteliais de forma dose-dependente. Os compostos Hp2 e Hp3 foram capazes de bloquear fases do ciclo celular. The use of St. John’s Wort extracts as a phytomedicine to treat depression in several countries around the world has stimulated investigators in order to study the chemical and biological properties of Hypericum species. Purpose: to investigate the chemical composition of native representants of Hypericum genus (H. caprifoliatum, H. polyanthemum, among others), to carry out a chemotaxonomic study about the significance of phloroglucinol derivatives in Hypericum species and to evaluate the antiproliferative activity of three benzopyrans isolated from H. polyanthemum against endothelial cells. Methods: for the isolation and identification of the compounds chromatographic techniques such as TLC, CC and HPLC were employed. The structures were determined through NMR spectroscopy, spectrometry and ultraviolet analyses. In order to study the significance of the phloroglucinol derivatives, data on the occurrence of these compounds was surveyed in the literature. The antiangiogenic activity was performed in both Sulforhodamine B and Flow Cytometry assays. Results and Conclusions: From H. caprifoliatum and H. polyanthemum three phloroglucinol derivatives with a dimeric structure were identified. These group of products could be considered as chemotaxonomic markers from species of the Hypericum genus belonging to the Brathys and Trigynobrathys sections, which include all the native representants. This work also presents the isolation and structural determination of two well known flavonoids, quercetin and hyperoside, from H. caprifoliatum. The three benzopyrans, Hp1, Hp2 and Hp3, showed a dose-dependant cytotoxic activity against endothelial cells. The isomers Hp2 and Hp3 were able to cause modifications on the normal cell cycle.

Submitted by Margarida Galamba (galamba@isa.utl.pt) on 2018-10-16T09:37:42Z No. of bitstreams: 1 REP-ANAIS-45-20093078458.pdf: 465780 bytes, checksum: 31701ff409b8e1b3712603e11395e7bb (MD5) Made available in DSpace on 2018-10-16T09:37:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 REP-ANAIS-45-20093078458.pdf: 465780 bytes, checksum: 31701ff409b8e1b3712603e11395e7bb (MD5) Previous issue date: 1994 info:eu-repo/semantics/publishedVersion