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CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico A utilização de xenoenxertos derivados de osso bovino tem se configurado como uma alternativa aos autoenxertos na substituição de perdas óssea. Entretanto, sua propriedade de osteoindução e potencial osteogênico ainda são limitados. Por essa razão, algumas estratégias como a desmineralização de fragmentos ósseos, bem como a utilização de células tronco mesenquimais tem sido proposta para a otimização do reparo ósseo. Nesse contexto, este estudo avaliou os efeitos da associação de uma matriz óssea de origem bovina, marca comercial- Criteria®, desmineralizada em EDTA 10%, às CTPD’s (modificadas para eGFP - enhancedgreenfluorescentprotein) no reparo de um defeito ósseo intrabucal em ratos. Os defeitos foram preenchidos por: 1. Matriz óssea desmineralizada (MOD); 2. CTPD’s em suspensão; 3. CTPD+MOD; 4. Coágulo sanguíneo (controle). Os animais foram sacrificados após 7, 14 e 49 dias para avaliações histomorfométricas e imunohistoquímica para GFP (visando o monitoramento das células tronco transplantadas); e após 3 e 7 dias para análise de expressão de genes indicativos de diferenciação osteoblástica (Runx2, Osx e iBSP) por RT-PCRq. Aos 7 dias, o fechamento epitelial foi incompleto em todos os grupos. A morfometria demonstrou que a deposição óssea na área do defeito cirúrgico foi maior no grupo que recebeu a associação proposta, seguido pela enxertia com as CTPD’s isoladas. Este resultado está em concordância com a análise molecular, que demonstrou a expressão do marcador de diferenciação osteoblástica iBSP, 64 vezes maior no mesmo período. Esse padrão de deposição óssea na análise morfométrica se manteve nos períodos de 14 e 49 dias, evidenciando a associação benéfica entre CTPD+MOD para terapias de regeneração tecidual óssea. O nível de maturação da matriz foi avaliado por coloração de PicroSirius Red e revelou a maior maturação no grupo CTPD+MOD. Resumidamente, os resultados demonstraram otimização do processo de regeneração óssea com a associação CTPD+MOD em todos os períodos. O estudo traz esclarecimentos sobre o xenoenxerto de fabricação nacional e apresenta uma proposta de otimização para o seu uso no desenvolvimento de terapias de regeneração tecidual. The use of xenografts derived from bovine bone has been configured as an alternative to autografts in the replacement of bone loss. However, its property of osteoinduction and osteogenic potential are still limited. For this reason, some strategies such as demineralization of bone fragments as well as the use of mesenchymal stem cells have been proposed for the optimization of bone repair. In this context, this study evaluated the effects of the association of a bone matrix of bovine origin, commercial brand - Criteria ®, demineralized in EDTA 10%, to the CTPDs (modified for eGFP - enhancedgreenfluorescentprotein) in the repair of an intrabuccal bone defect in rats. The defects were filled by: 1. Demineralized bone matrix (MOD); 2. TDPs in suspension; 3. CTPD + MOD; 4. Blood clot (control). The animals were sacrificed after 7, 14 and 49 days for histomorphometric and immunohistochemical evaluations for GFP (aiming at the monitoring of transplanted stem cells); and after 3 and 7 days for expression analysis of genes indicative of osteoblastic differentiation (Runx2, Osx and iBSP) by RT-PCRq. At 7 days, epithelial closure was incomplete in all groups. Morphometry demonstrated that bone deposition in the area of the surgical defect was higher in the group that received the proposed association, followed by grafting with the isolated TCDC's. This result is in agreement with the molecular analysis, which demonstrated the expression of the osteoblast differentiation marker iBSP, 64 times higher in the same period. This pattern of bone deposition in the morphometric analysis was maintained in the periods of 14 and 49 days, evidencing the beneficial association between CTPD + MOD for tissue regeneration therapies. The maturation level of the matrix was evaluated by staining of PicroSirius Red and revealed the highest maturation in the CTPD + MOD group. Briefly, the results demonstrated optimization of the bone regeneration process with the association CTPD + MOD in all periods. The study brings clarifications about the xenograft of national manufacture and presents an optimization proposal for its use in the development of tissue regeneration therapies.

Apesar de sua capacidade de reparo, o tecido ósseo pode ser submetido a alguns tipos de fraturas, cirurgias ou patologias que podem levar a grandes defeitos ósseos. As principais estratégias de tratamento de defeitos ósseos são baseados em osteoindução ou osteocondução. Matriz dentinária desmineralizada humana (MDDH) é uma alternativa biocompatível para preencher defeitos ósseos, melhorando a qualidade e quantidade de osso produzido. 24 Ratos Wistar foram selecionados, submetidos à extração de ambos os segundos molares superiores (direito e esquerdo). Os alvéolos foram separados em dois grupos: controle (direita) preenchido com coágulo sanguíneo e experimental (esquerda) preenchido com MDDH. Os animais foram sacrificados aos 5, 10 e 21 dias. Foram realizadas análises histológicas, histomorfométricas (análise de variância - ANOVA e teste de Tukey) e imunohistoquímica para osteopontina (OPN) como indicador de osteogênese. Aos 5 dias MDDH foi incorporada pelas novas trabéculasósseas. Aos 10 dias observou-se organização do tecido conjuntivo etrabéculas no grupo experimental. Detectou-se coloração intensa para OPN em área adjacente à MDDH no grupo experimental. Aos 21 dias no grupo experimental verificou-se trabéculas maduras. Houve diferençaestatísticamente significatva (p

O processo de odontogênese é guiado por uma cascata de sinalização na qual inúmeras moléculas, como os fatores de crescimento fibroblástico 2, 3 e 4 (FGF2, FGF3 e FGF4), garantem o desenvolvimento dos grupos dentários. A maioria dos dados sobre a odontogênese advém de roedores, que não possuem todos os grupos dentários. O gambá Didelphis albiventris é um mamífero marsupial com dentição mais próxima à humana. Além disso, a odontogênese nesta espécie ocorre nos neonatos já no marsúpio, facilitando o acesso e a coleta de amostras para o estudo da formação dos dentes. O objetivo deste estudo foi determinar o padrão de expressão de FGF2, FGF3 e FGF4 durante a odontogênese de D. albiventris. Para isso, neonatos de D. albiventris foram coletados e processados para seguintes análises: (1) histológica, para caracterizar morfologicamente a odontogênese de molares de D. albiventris; (2) de imunolocalização, para caracterizar o padrão de expressão de FGF2, FGF3 e FGF4 durante a odontogênese nesta espécie de gambá; e (3) de expressão gênica, para clonar e sequenciar essas moléculas de interesse no gambá, além de permitir a caracterização do padrão de expressão dos RNAm para FGFs, por hibridização in situ. A análise histológica foi realizada por coloração HE; e a imunolocalização dos FGFs foi realizada por imunoperoxidase indireta. Para a análise de expressão gênica, oligonucleotídeos foram construídos com base na sequência conhecida de Monodelphis domestica, o marsupial mais próximo com genoma sequenciado. Oligos foram desenhados para amplificar fragmentos de FGF3 e FGF4 (uma vez que FGF2 já havia sido sequenciado anteriormente). A sonda de RNA antisenso foi sintetizada in vitro, com marcação para digoxigenina. A análise histológica das fases da odontogênese mostrou que o gambá D. albiventris possui as mesmas estruturas presentes em roedores, nos mesmos estágios da odontogênese, além de apresentar uma lâmina dentária secundária vestigial. A imunohistoquímica permitiu a observação de FGF2, FGF3 e FGF4 em um maior número de estruturas dentárias em relação à literatura referente a roedores, sugerindo um papel mais amplo dessas moléculas no gambá. Não foi possível amplificar FGF3 de D. albiventris, sugerindo diferenças nas sequências entre as espécies de gambás. O fragmento de FGF4 foi clonado e sequenciado. O clone também serviu como molde para a síntese da sonda de RNA antisenso, utilizada na hibridização in situ. O padrão de expressão indicou a presença de FGF4 no germe dentário, tecido conjuntivo, musculatura esquelética, cartilagem, epitélio, fígado e tecido nervoso. O conhecimento da sinalização que determina a odontogênese em um modelo animal com dentição completa pode contribuir para o desenvolvimento de terapias para a reposição de dentes perdidos. Este estudo ainda representa mais um passo no conhecimento dessa espécie de gambá e na sua implementação para estudos em Biologia do Desenvolvimento Odontogenesis is guided by a complex signaling cascade in which several molecules, including the fibroblastic growth factors 2, 3 and 4 (FGF2, FGF3 and FGF4), ensure dental groups development and specificity. Most of the data on odontogenesis derives from rodents, which does not have all dental groups. Didelphis albiventris is a marsupial mammal with the closest dentition to humans. Besides, odontogenesis in this species occurs when the newborns are already in the pouch, favouring samples harvesting for the study of tooth development. This study aimed to determinate the expression pattern of FGF2, FGF3 and FGF4 during the D. albiventris odontogenesis. For this, D. albiventris newborns were harvested and processed for the following analysis: (1) histological, to allow the morphological characterization of the D. albiventris molars odontogenesis; (2) immunolozalization, to establish FGF2, FGF3, and FGF4 expression pattern during odontogenesis; and (3) of gene expression, to allow the cloning and sequencing of these molecules in this opossum species, providing tools for the localtemporal characterization of the FGFs mRNA expression patterns, by in situ hybridization. Histological analysis was performed using HE; and FGFs immunolocalization was performed by indirect immunoperoxidase. For gene expression analysis, oligos were obtained based on sequences available for Monodelphis domestica, the closest marsupial with genome sequenced. Oligos were obtained to amplify D. albiventris FGF3 and FGF4 (as FGF2 was cloned and sequenced before). Antisense RNA probe were in vitro synthesized, using digoxigenin for labelling. Histological analysis of the odontogenesis stages showed similarity of dental structures between D. albiventris and rodents, at the same odontogenesis stages, in addition to the presence of a vestigial secondary dental lamina in opossum. Immunolocalization allowed the observation of FGF2, FGF3 and FGF4 in a larger number of dental structures than related data for rodents, suggesting broader functions for these molecules in this opossum species. It was not possible to amplify D. albiventris FGF3, suggesting differences in the sequence level between these two opossum species. A FGF4 fragment was cloned and sequenced. This clone was also used to allow the synthesis of an antisense RNA probe, for in situ hybridization. FGF4 trancripts were detected in the dental germ, connective tissue, skeletal muscle, cartilage, epithelium, liver, and nervous tissue. The knowledge of the signaling that determinates odontogenesis in an animal model with complete dentition may contribute to the development of therapies for the replacement of lost teeth. The present study represents one step further in knowing this opossum species and in its implementation for Developmental Biology studies.