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Dissertação (mestrado) — Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2021. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). Como uma variável biológica, o sexo modula o sistema imunitário e pode estar envolvido nas diferenças observadas entre homens e mulheres de manifestação e desenvolvimento de doenças infecciosas, autoimunes e câncer. Os mecanismos responsáveis por tal disparidade não são suficientemente explorados e estão longe de serem completamente elucidados. Como células dominantes da resposta imune inata, os neutrófilos são leucócitos dinâmicos, efetores primários da defesa inata do organismo, moduladores da imunidade adaptativa e mantenedores da homeostasia de diferentes tecidos. Esses PMN participam da fisiopatologia de diversas doenças, incluindo aquelas que apresentam um significativo viés sexual, como sepse e as doenças autoimunes. A maioria dos estudos sobre o dimorfismo sexual é direcionada para características pontuais e evidencia diferenças marcantes, ressaltando a necessidade de uma compreensão abrangente da regulação da biologia dos neutrófilos pelo sexo. Assim sendo, este trabalho utilizou a proteômica label-free como ferramenta exploratória para identificar mediadores basilares do dimorfismo sexual, de neutrófilos quiescentes e ativados com fMLP, que foram então estudados em maiores detalhes através de testes funcionais. 1410 proteínas foram identificadas; 308 estavam diferencialmente abundantes entre as quatro condições e as 163 identificadas com mais de dois peptídeos únicos foram submetidas à análise ANOVA de duas vias para avaliação do efeito dos fatores e da interação sobre o perfil proteico. Entre os principais processos biológicos enriquecidos estavam aqueles relacionados à atividade antioxidante, exocitose/transporte de vesículas e adesão. A análise proteômica seguida por testes funcionais resultou na caracterização de neutrófilos femininos quiescentes com maiores quantidades de EROs, menores níveis das proteínas associadas à atividade antioxidante GR, ALB, HP e G6PDH, menor capacidade antioxidante total e menor atividade fagocitária. Dessa forma, este trabalho apresenta aspectos fundamentais para a funcionalidade de neutrófilos como sexo-específicos, o que pode ser fundamental para a compreensão do dimorfismo sexual imunitário observado em vários contextos fisiopatológicos. As a biological variable, sex contributes to shape immune responses and may be involved in the differences observed between men and women in the manifestation and development of cancer, infectious and autoimmune diseases. The mechanisms underlying such disparity are not sufficiently explored and are far from being fully elucidated. Neutrophils are dynamic leukocytes, primary effectors of the innate defense, modulators of adaptive immunity and maintainers of homeostasis of different tissues. PMNs participate in the pathophysiology of several diseases, including those that present a significant sexual bias, such as sepsis and autoimmune diseases. Most studies on sexual dimorphism focused on specific aspects and show marked differences, highlighting the need for a comprehensive understanding of the regulation of neutrophil sexual dimorphism. Therefore, we used label-free proteomics as an exploratory tool to identify basilar mediators ofsexual dimorphism of resting and fMLP-activated neutrophils, which led to follow-up functional tests. 1410 proteins were identified, 308 were differentially abundant among the four conditions and 163 presented more than two unique peptides and were submitted to two-way ANOVA analysis to assess the effect of the factors and of the interaction on the protein profile. Among the main enriched biological processes were those related to antioxidant activity, exocytosis/vesicle transport and adhesion. Proteomic analysis followed by functional tests resulted in the characterization of resting female neutrophils as containing higher amounts of ROS, decreased levels of the proteins GR, ALB, HP and G6PDH, decreased antioxidant proteins, total antioxidant capacity and phagocytosis. This work presents fundamental aspects for the functionality of neutrophils as sex-specific, which are relevant for the understanding of the immune sexual dimorphism observed in several pathophysiological contexts.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Pós-Graduação em Nanociência e Nanobiotecnologia, 2020. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES); Fundação de Apoio à Pesquisa do Distrito Federal (FAP/DF); Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico e Institutos Nacionais de Ciência e Tecnologia (INCTs). A aplicação da nanotecnologia na terapia do câncer tem sido promissora. Por ser uma tecnologia que fornece uma abordagem abrangente e única contra o câncer por meio do diagnóstico, prevenção, terapia e medicina personalizada. Com essa tecnologia, podem ser utilizadas diferentes estratégias para o tratamento do câncer como, por exemplo, o medicamento terapêutico sendo carreado por nanopartículas e com alvo específico, liberação controlada do agente terapêutico na região de interesse e métodos para o diagnóstico precoce. Embora nanopartículas geralmente se acumulem 10 vezes mais em tumores quando comparado com fármacos convencionais, menos de 1% da dose injetada atinge tipicamente o tumor, pois ficam retidas no fígado e baço. Os macrófagos específicos para o fígado, chamados de células de Kupffer e que constituem uma das principais barreiras no uso de nanopartículas para o tratamento do câncer, foram identificados pela primeira vez no fígado por von Kupffer e correspondem a maior população de macrófagos teciduais. Essas Células de Kupffer fazem parte do Sistema Fagocitário Mononuclear e são predominantemente distribuídas no lúmen dos sinusóides hepáticos, exibindo atividade endocítica contra os materiais que passam pelo sangue e entram no fígado. Por esse motivo, as células de Kupffer são centrais no processo de eliminação de nanopartículas que atravessam as barreiras epiteliais do corpo. Diante da problemática apresentada, este trabalho teve por objetivo modular a captação de uma nanoemulsão lipídica no sistema fagocitário mononuclear hepático pela ação da cloroquina para bloquear temporariamente a endocitose das nanopartículas pelas células de Kupffer. The application of nanotechnology in cancer therapy has been promising. It is a technology that provides a comprehensive and unique approach to cancer through diagnosis, prevention, therapy and personalized medicine. Different strategies for the treatment of cancer can be used, for example, the therapeutic drug being carried by nanoparticles and with a specific target, controlled release of the therapeutic agent in the region of interest and methods for early diagnosis. Although nanopharmaceuticals generally accumulate 10 times more in tumors when compared to conventional drugs, less than 1% of the injected dose typically reaches the tumor, because they get stuck in the liver and spleen. The liver-specific macrophages called Kupffer cells are one of the main barriers in the use of nanoparticles for the treatment of cancer. They were first identified in the liver by von Kupffer and correspond to the largest population of tissue macrophages. Kupffer cells are part of the Mononuclear Phagocyte System and are predominantly distributed in the lumen of hepatic sinusoids exhibiting endocytic activity against materials that pass through the blood and enter the liver. For this reason, Kupffer cells are central to the process of eliminating nanoparticles that cross the body's epithelial barriers. In view of the problem presented, this study aimed to modulate the capture of a lipid nanoemulsion in the hepatic mononuclear hepatic phagocytic system by the action of chloroquine to temporarily block an endocytosis of the nanoparticles by Kupffer cells.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2020. CNPq, FAP-DF e a CAPES O aumento no número de casos de aquisição de resistência de fungos e bactérias contra fármacos atuais, em associação com a diminuição no número de medicamentos aprovados que apresentem novos mecanismos de ação, vem estimulando a procura por tratamentos alternativos para doenças infecciosas. Os avanços tecnológicos na síntese de peptídeos, reduzindo os seus custos, renovaram o interesse da indústria farmacêutica sobre essas moléculas. Peptídeos antimicrobianos (AMP) são pequenas moléculas evolutivamente conservadas, presentes no sistema imune de todos os grupos de organismos, com atividade microbicida e imunomodulatória. Acredita-se que a regulação das respostas inflamatórias seja a principal função dessas moléculas em organismos vertebrados. Neste trabalho, foram avaliadas as propriedades imunomodulatórias de ToAP-2, um AMP catiônico sem pontes dissulfeto derivado da peçonha do escorpião Tityus obscurus, sobre macrófagos tipo M1 (BMM) e células dendríticas (BMDC) derivados da medula óssea de camundongos C57BL/6. Os ensaios realizados mostraram que ToAP-2 não alterou a fagocitose de leveduras de Cryptococcus neoformans por BMMs e BMDCs após 30 min ou 2 h de infecção. Da mesma maneira, ToAP-2 também não afetou a atividade fungicida de BMMs, determinada em ensaios de contagem de unidades formadoras de colônia. Também analisamos a secreção de MCP-1, IL-6 e TNF-α no sobrenadante de BMMs e BMDCs estimulados com apenas ToAP-2, ou com o peptídeo e o lipopolissacarídeo (LPS) de Escherichia coli por 6 h ou 24 h. ToAP-2 reduziu significativamente a secreção dessas citocinas, indicando uma possível interação, direta ou indiretamente, com LPS. Para investigar essa hipótese, células de E. coli e C. neoformans foram expostas à suas respectivas concentrações inibitórias mínimas de ToAP-2 na presença de diferentes concentrações de LPS em diluição seriada variando de 100 a 0,78 μg/mL. Observamos que ToAP-2 perdeu sua atividade antifúngica e antimicrobiana na presença de LPS (a 100 e 12.5 μg/mL, respectivamente), corroborando a hipótese de que ToAP-2 possa interagir diretamente com LPS. The rise in antimicrobial resistance by fungi and bacteria against current drugs, as well as the diminishing numbers of drugs with novel mechanisms being approved, has encouraged the search for alternative treatment options. The technological improvements on peptide synthesis reduced its costs and renewed the interest of pharmaceutical companies in these molecules. Antimicrobial peptides (AMP) are evolutionary conserved molecules in the immune system of all groups of organisms with both antimicrobial and immunomodulatory activities. It is thought that the primary role of AMPs in vertebrates is the regulation of inflammation. In this study, we evaluated the immunomodulatory properties of ToAP-2, a cationic non-disulfide-bridged peptide derived from the scorpion Tityus obscurus’ venom, on bone marrow derived M1-like macrophages/dendritic cells (BMM/BMDC) from C57BL/6 mice. The experiments revealed that ToAP-2 had no effect on the phagocytosis of the yeast Cryptococcus neoformans by neither BMM or BMDC after 30 min or 2 h of infection. Similarly, ToAP-2 had no effect on yeast killing by BMM, as determined by colony formation units experiments. We also evaluated the production of MCP- 1, IL-6 and TNF-α by BMMs or BMDCs after stimulation with ToAP-2 alone, or in combination with Escherichia coli lipopolysaccharide (LPS) for 6 h or 24 h. ToAP-2 significantly reduced these cytokine levels, suggesting a possible direct or indirect interaction with LPS. To address this hypothesis, we performed experiments where E. coli and C. neoformans were exposed to their respective minimum inhibitory concentration of ToAP-2 in presence of different concentrations of LPS (100 to 0,78 μg/mL). We observed that ToAP-2 lost its antifungal and antibacterial properties in the presence of LPS concentrations of 100 and 12,5 μg/mL, respectively. These results corroborate a possible physical interaction between both molecules.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Dermatofitoses são infecções fúngicas que afetam humanos e animais. Dentre os agentes etiológicos mais prevalentes nessas infecções está presente a espécie Trichophyton rubrum. As amebas do gênero Acanthamoeba apresentam ampla distribuição ambiental, se alimentando de bactérias, fungos, virus presentes no ambiente. Ambos os microrganismos podem conviver em um mesmo ambiente, sendo assim o objetivo desse trabalho foi avaliar a interação de A. castellanii sobre T. rubrum em diferentes condições (PYG, NA e ND). Para tanto, foi estudada a cinética de encistamento de A. castellanii na presença e na ausência de T. rubrum, além de ensaio de fagocitose para confirmar a interação ameba-fungo, avaliar a influência de diferentes condições nutricionais (meios PYG, NEFF). Os resultados demonstram um encistamento da ameba de aproximadamente 30% com presença de T. rubrum e 25% sem o fungo, e a interação foi confirmada por fagocitose, onde na condição NA (adição de NEFF antes da infecção pelo fungo) há uma maior internalização na primeira hora, decaindo com o tempo. Foi realizado também a adição ou subtração de íons Ca2+ e Mg2+, adição de manose e citocalasina D na fagocitose, atividade fungicida e liberação do fungo do interior da ameba. Os íons demonstraram-se importantes para a predação do fungo pela ameba e citocalasina D demonstrou a importância da actina no processo de liberação dos conídios, visto que houve uma diminuição na exocitose dos conídios. A manose diminuiu a fagocitose em PYG de forma dependente da concentração, não ocorrendo mesmo para NA. NA propiciou uma maior recuperação do fungo no interior da ameba e também uma menor liberação, concomitante a uma reduzida produção de espécies oxidativas, tendo também maior número de hifas no interior. Foram avaliadas também produção de espécies oxidativas, capacidade da ameba em inativar o fungo e a capacidade deste de sobreviver e ser liberado da ameba, e a produção de enzimas antioxidantes pelo fungo. O fungo recuperado da ameba foi testado frente ao itraconazol, cetoconazol e terbinafina, a fim de determinar a concentração inibitória mínima (CIM) destes antifúngicos. A presença de enzimas do complexo antioxidante demonstrou-se maior nas condições com passagens pela ameba do que o controle, mostrando uma adaptação para sobrevivência do fungo. A CIM de itraconazol apresentou variação significantes em PYG 1h e NA 24h e os demais antifúngicos não apresentaram alterações significativas. Assim, a ameba internaliza o fungo, independente da condição nutricional e esta internalização decresce com o tempo, sendo que esta predação pode ser aumentada n apresença de íons Ca2+ e Mg2+. Por outro lado, a ameba internaliza T. rubrum por mecanismo dependente de manose em trofozítos e não em cistos e A. castellanii produz ROS e PRN que influenciam a sua atividade fungicida, que é independente de manose e o fungo produz enzimas do complexo antioxidante para sobreviver no interior da ameba. Dermatophytoses are fungal infections that affect humans and animals. Among the most prevalent etiological agents in these infections are the Trichophyton rubrum species. The amoebas of the genus Acanthamoeba present wide environmental distribution, feeding on bacteria, fungi, viruses present in the environment. Both microorganisms can live in the same environment, so the objective of this work was to evaluate the interaction of A. castellanii on T. rubrum in different conditions (PYG, NA and ND). The kinetics of A. castellanii in the presence and absence of T. rubrum were studied, as well as the phagocytosis assay to confirm the ameba-fungus interaction, to evaluate the influence of different nutritional conditions (PYG media, NEFF). The results show an amoeba encroachment of approximately 30% with presence of T. rubrum and 25% without the fungus, and the interaction was confirmed by phagocytosis, where in the NA condition (addition of NEFF prior to fungus infection) there is a greater internalization in addition, the addition or subtraction of Ca2+ and Mg2+ ions, addition of mannose and cytochalasin D in phagocytosis, fungicide activity and release of the fungus from the amoeba interior were performed. The ions proved to be important for the predation of the fungus by amoeba and cytochalasin D demonstrated the importance of actin in the conidial release process, since there was a decrease in the exocytosis of conidia. Mannose decreased phagocytosis in PYG in a concentration-dependent manner, not occurring even for NA. NA provided a greater recovery of the fungus inside the amoeba and also a lower release, concomitant to a reduced production of oxidative species, also having a greater number of hyphae in the interior. The production of oxidative species, the capacity of amoeba to inactivate the fungus and its ability to survive and be released from the amoeba, and the production of antioxidant enzymes by the fungus were also evaluated. The fungus recovered from amoeba was tested against itraconazole, ketoconazole and terbinafine in order to determine the minimum inhibitory concentration (MIC) of these antifungals. The presence of enzymes of the antioxidant complex was shown to be greater in the conditions with passages through the amoeba than the control, showing an adaptation for survival of the fungus. The MIC of itraconazole presented significant variation in PYG 1h and NA 24h and the other antifungal drugs did not show significant alterations. Thus, the amoeba internalizes the fungus, independent of the nutritional condition and this internalization decreases over time, and this predation can be increased in the presence of Ca2+ and Mg2+ ions. On the other hand, the amoeba internalizes T. rubrum by mannose-dependent mechanism in trophozites and not in cysts and A. castellanii produces ROS and PRN that influence its fungicidal activity, which is independent of mannose and the fungus produces enzymes of the antioxidant complex for survive within the amoeba.

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Trabalhos recentes demonstram que a vitamina D age não somente na homeostase do cálcio, mas também na regulação do sistema imune. Diante da multiplicidade de funções dessa vitamina, sua deficiência tem sido associada ao risco de desenvolvimento de uma série de doenças, entre elas doenças infecciosas como as causadas por S. aureus. As infecções por essa bactéria têm trazido expressiva preocupação para a população humana em decorrência do aumento da prevalência de cepas resistentes aos fármacos antibacterianos, dificultando, dessa maneira, o tratamento e contribuindo para a busca de métodos alternativos para combater esse tipo de infecção. Além disso, o S. aureus conta com um potente arsenal de fatores de virulência que contribuem para a evasão da resposta imune do hospedeiro. Nesse contexto, torna-se importante avaliar se a vitamina D pode modular os efeitos bactericidas de neutrófilos humanos através de mecanismos intra e extracelulares, favorecendo, portanto, o combate a infecções, especialmente aquelas causadas por microrganismos resistentes aos principais tratamentos. Dessa maneira, nós demonstramos que neutrófilos tratados com vitamina D e desafiados com duas cepas de S. aureus tiveram um aumento nas taxas de fagocitose e atividade bactericida dependentes da cepa estudada, contribuindo para as propriedades antimicrobianas dos neutrófilos. Além disso, identificamos que indivíduos com níveis séricos de vitamina D deficientes/insuficientes estavam correlacionados com menor liberação de NETs e taxa de fagocitose; enquanto indivíduos com níveis séricos de vitamina D suficientes foram correlacionados com maior liberação de NETs, taxa de fagocitose intermediária e atividade bactericida. Portanto, a vitamina D pode modular a resposta imune inata contra S. aureus principalmente por aumento de taxas fagocíticas e atividade bactericida. In the last years, vitamin D deficiency has become a worldwide problem due to routine population habits, such as prolonged work indoors and increased use of sunscreen/decreased sun exposure in attempt to avoid high rates of skin cancer. Recent studies demonstrated that vitamin D acts not only on calcium homeostasis, but also on the regulation and function of the immune system. Facing the countless functions of vitamin D, its deficiency has been associated with the risk of development of many diseases, including infectious diseases such as those caused by S. aureus. Infections caused by these bacteria have brought significant concern to the human population due to the increased prevalence of strains resistant to antibiotics, thus making it difficult to treat and contributing to the search for alternative methods to combat this type of infection. In addition, S. aureus have a variety of virulence factors, which confer the ability to evade host immune responses. In this context, it is important to evaluate whether vitamin D can modulate the bactericidal effects of human neutrophils through intra- and extracellular mechanisms, such as phagocytosis, bacterial killing and release of Neutrophil Extracellular Traps (NETs), thus contributing to the response against infections, especially those caused by microorganisms resistant to the main treatments. Thus, we demonstrated that neutrophils treated with Vitamin D and challenged with two strains of S. aureus had an increase in phagocytic rates and bactericidal activity in a dependence of the strain, contributing to neutrophil antimicrobial properties. Besides, we identified that individuals with deficient/insufficient vitamin D serum levels were correlated with lower NETs release and phagocytosis rate; while individuals with sufficient vitamin D serum levels were correlated with higher NETs release, intermediate phagocytosis rate and bactericidal activity. Then, Vitamin D could modulate the innate immune response against S. aureus mainly by phagocytic rates and bactericidal activity. Further studies are needed to better understand the complex capacity of Vitamin D on modulation of the innate immune response. CNPq: 140332/2015-4

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Microbiana, 2018. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e Fundação de Apoio à Pesquisa do Distrito Federal (FAPDF). Cryptococcus neoformans é uma levedura encapsulada capaz de causar doença principalmente em hospedeiros imunocomprometidos. É considerada um patógeno intracelular facultativo por causa de sua capacidade de sobreviver e se replicar no interior de fagócitos, especialmente macrófagos. Esta capacidade é extremamente dependente de vários fatores de virulência expressos pelo fungo, que tornam o macrófago não ativado ou fracamente ativado ineficaz no combate a levedura fagocitada. Estratégias utilizadas pelo macrófago visando prevenir este cenário incluem a piroptose (uma morte celular programada, rápida e altamente inflamatória) e a vomocitose (expulsão não lítica do patógeno do meio intracelular). A ativação do inflamassoma em fagócitos é geralmente protetiva no combate a infecções fúngicas, incluindo na criptococose. Ainda assim, o reconhecimento do C. neoformans por receptores associados ao inflamassoma requer mudanças específicas em sua morfologia ou opsonização da levedura, dificultando assim o funcionamento apropriado desta via durante a infecção. Neste contexto, analisamos o impacto de moléculas secretadas pela cepa selvagem B3501 e o mutante acapsular Δcap67 em um modelo in vitro de ativação canônica do inflamassoma. Nossos resultados mostraram que o meio condicionado derivado de B3501 (CM35) era capaz de inibir a ativação do inflamassoma e eventos dependentes (por exemplo, secreção de IL-1β) de maneira mais robusta que o meio condicionado derivado de Δcap67 (CMCAP), mesmo este efeito sendo independente da presença de GXM. Também demonstramos que macrófagos tratados com meio condicionado se encontravam menos responsivos contra a infecção com a cepa virulenta H99, exibindo menor capacidade fagocítica, aumento em carga fúngica intracelular e na promoção da vomocitose. Adicionalmente, demonstramos que o metabólito Ácido 3-indol lático (ILA) está presente no CM35 e apresenta inibição contra a ativação do inflamassoma NLRP3. Também analisamos o papel de vesículas extracelulares secretadas pelo fungo na inibição da via do inflamassoma. De forma geral, os resultados apresentados mostram que o meio condicionado de uma cepa selvagem de C. neoformans é capaz de inibir uma importante via de reconhecimento e consequentemente inibir funções fungicidas de macrófagos, contribuindo para a sobrevivência fúngica em modelos in vitro, indicando um possível papel importante destas moléculas secretadas durante a infecção criptococócica. Cryptococcus neoformans is an encapsulated yeast capable of causing disease mainly in immunosuppressed hosts. It is considered a facultative intracellular pathogen because of its capacity to survive and replicate inside phagocytes, especially macrophages. This capacity is heavily dependent on various virulence factors that render the non or poorly activated macrophage ineffective against the phagocyted yeast. Strategies utilized by macrophages to prevent this scenario includes pyroptosis (a rapid highly inflammatory cell death) and vomocytosis (the expulsion of the pathogen from the intracellular environment without lysis). Inflammasome activation in phagocytes is usually protective against fungal infections, including cryptococcosis. Nevertheless, recognition of C. neoformans by inflammasome receptors requires specific changes in morphology or the opsonization of the yeast, impairing a proper inflammasome function. In this context, we analysed the impact of molecules secreted by B3501 strain and its nonencapsulated mutant Δcap67 in an inflammasome canonical activation in vitro model. Our results showed that conditioned media derived from B3501 (CM35) was capable of inhibiting inflammasome dependent events (i.e. IL-1β secretion) strongly than conditioned media from Δcap67 (CMCAP), regardless of GXM presence. We also demonstrated that macrophages treated with conditioned media were less responsive against infections with the virulent strain H99, exhibiting less phagocytosis capacity, increased fungal burden and vomocytosis. Moreover, we showed that the aromatic metabolite DL-Indole-3-lactic acid (ILA) was present in CM35 and have impact in NLRP3 inflammasome activation. We also analysed the role of extracellular vesicles regarding inhibition of inflammasome. Overall the results presented show that conditioned media from a C. neoformans wild-type strain can inhibit an important recognition pathway and subsequently fungicidal functions in macrophages, contributing to fungal survival in vitro, indicating an important role of secreted molecules during cryptococcal infections in the host.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Pós-graduação em Medicina Tropical, 2018. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e Fundação de Apoio à Pesquisa do Distrito Federal (FAP-DF). A criptococose é uma micose sistêmica causada por fungos do gênero Cryptococcus que acomete principalmente pessoas com Aids. A principal manifestação clínica da doença é uma meningoencefalite severa. O tratamento desta doença é baseado atualmente em drogas intravenosas bastante tóxicas ou caras, que necessitam de internação hospitalar para administração e requerem acompanhamento laboratorial constante para manejo dos efeitos colaterais. Apesar da existência deste tratamento, se estima que aproximadamente 80% dos 223 mil casos anuais da doença levem à morte. Há evidências de que a infecção pelo fungo ocorra em todas as pessoas durante a infância; o que parece determinar a doença, portanto, é o surgimento de imunossupressão da resposta imunitária celular, o que indica que novas terapias possam ser criadas com alvo na resposta imunitária do hospedeiro. Um dos mecanismos possíveis para manipulação com fins terapêuticos da resposta do hospedeiro é a autofagia, um processo de reciclagem de material intracelular que tem sido demonstrado em experimentos in vitro e em modelos animais como importante também na resposta imunitária a fungos. Tendo em vista essa possibilidade de manipulação da autofagia, é necessário determinar se a autofagia é importante também na resposta imunitária humana, assim como os mecanismos pelos quais a autofagia exerce atividade antifúngica e como Cryptococcus evade da resposta autofágica. Para estudar o papel da autofagia na interação patógeno-hospedeiro da criptococose, nós utilizamos uma coleção de isolados clínicos de C. neoformans obtidos como parte do trabalho da Rede Criptococose Brasil no DF (RCB-DF). Esses isolados foram utilizados em testes in vitro para determinação de sua capacidade de evasão da autofagia do hospedeiro. Os resultados foram correlacionados com dados clínicos dos pacientes dos quais os isolados foram obtidos. Devido possivelmente ao grande número de isolados que seriam necessários para detectar diferenças, não conseguimos observar nenhuma. No entanto, correlações com outros fenótipos desses isolados trouxeram dados muito importantes sobre como C. neoformans causa doenças. Entre eles, o mais importante é a relação direta entre a capacidade de melanização de um isolado e sua capacidade de evadir da autofagia do hospedeiro, o que sugere um novo papel para a melnanina de C. neoformans: evadir da resposta autofágica. Cryptococcosis is a systemic mycosis caused by fungi of the genus Cryptococcus that mainly affects people with AIDS. The main clinical manifestation of the disease is a severe meningoencephalitis. The treatment is currently based on very toxic or expensive intravenous drugs that require hospital admission for administration and constant laboratory monitoring to manage side effects. Despite the existence of this treatment, it is estimated that approximately 80% of the 223,000 annual cases of the disease lead to death. There is evidence that fungal infection occurs in all people during childhood; what appears to determine the disease, therefore, is the emergence of immunosuppression of the cellular immune response, which indicates that novel therapies can be created targeting the immune response of the host. One of the possible mechanisms for therapeutic manipulation of host response is autophagy, an intracellular material recycling process that has been demonstrated in in vitro experiments and in animal models as a relevant tool in the immune response to fungi. In view of this possibility to manipulate the autophagy process, it is necessary to determine whether this is equally significant in the human immune response, as well as the mechanisms by which autophagy exerts antifungal activity and how Cryptococcus evades the autophagic response.

Submitted by Sara Ribeiro (sara.ribeiro@ucb.br) on 2018-07-27T15:19:25Z No. of bitstreams: 1 Jo??oBartholomeuNetoTese2018.pdf: 1992204 bytes, checksum: c127f6e78b3371ee05b0b87f14163392 (MD5) Approved for entry into archive by Sara Ribeiro (sara.ribeiro@ucb.br) on 2018-07-27T15:19:43Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Jo??oBartholomeuNetoTese2018.pdf: 1992204 bytes, checksum: c127f6e78b3371ee05b0b87f14163392 (MD5) Made available in DSpace on 2018-07-27T15:19:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Jo??oBartholomeuNetoTese2018.pdf: 1992204 bytes, checksum: c127f6e78b3371ee05b0b87f14163392 (MD5) Previous issue date: 2018-06-14 Projections of the increase in absolute and relative numbers of elderly represent new challenges for public health. Aging is accompanied by gradual decline of physiological functions, immune function and muscle strength. In this way, the elderly is more susceptible to sarcopenia, osteoporosis, cancer and cardiovascular, metabolic and neurodegenerative diseases. Resistance Training (RT) has been shown to be an important intervention for increased muscle strength and decreased chronic inflammation in the elderly. However, little is known about the influence of RT on the functional response of cells that constitute the first line of defense during immunosenescence. In this sense, the present study aimed to investigate an association between RT adaptations induced by a program and a functional response of circulating phagocytes in elderly. The present cross-sectional study was composed of 54 elderly women, 71.3 ?? 6.3 years, apparently healthy, non-institutionalized and divided into two distinct groups: Trained (n = 28) and Sedentary (n = 26). The elderly of the Trained group were participants of a RT program for 8.6 ?? 0.3 months and performed a training consisting of 12 exercises, 3 sessions weekly, with intensity of 70% of a maximum repetition, while the Sedentary group did not participate of any physical activity program during the same period. Body mass, height, body mass index, waisthip ratio, fat free mass and fat mass were evaluated. The total energy intake and macronutrients in the usual diet were assessed. TNF-a, IL-6 and IGF-1 analyzes, total and differential leukocyte count, monocyte or neutrophil phagocytosis test, phagocytosis index (IF) and microbicidal activity of phagocytes were performed. Data analysis was performed using the Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) program and considered statistically significant P

Submitted by Laura Andrea Gonzalez-Maldonado (laugonzalez90@hotmail.com) on 2018-05-18T01:20:27Z No. of bitstreams: 1 Dissertaçao Laura Gonzalez-Maldonado_LG2_fin.pdf: 8483888 bytes, checksum: ffea6b6cbe7a6c21c147efa90fb259bb (MD5) Rejected by Ana Cristina Jorge null (anacris@fclar.unesp.br), reason: Solicitamos que realize correções na submissão seguindo orientações abaixo: - Acrescente o nome da Coorientadora na sua folha de rosto; - Preencha corretamente seu nome nos metadados, conforme orientação do próprio sistema (EX: González Maldonado, Laura Andrea) Atenciosamente, on 2018-05-18T13:58:37Z (GMT) Submitted by Laura Andrea Gonzalez-Maldonado (laugonzalez90@hotmail.com) on 2018-05-18T15:42:50Z No. of bitstreams: 1 Dissertaçao Laura Gonzalez-Maldonado_LG2_fin.pdf: 8483979 bytes, checksum: b389c37fbb6f4e0e2220e37358f500f0 (MD5) Rejected by Ana Cristina Jorge null (anacris@fclar.unesp.br), reason: Solicitamos que realize correções na submissão seguindo as orientações abaixo: No preenchimento dos metadados você informou que recebeu auxílio pesquisa da CAPES. Se realmente recebeu deverá inserir uma folha de agradecimentos na sua dissertação e mencionar essa agência. Verifique no Guia de Normas de sua Biblioteca como e onde deverá colocar a folha de agradecimentos. Atenciosamente, on 2018-05-18T18:46:55Z (GMT) Submitted by Laura Andrea Gonzalez-Maldonado (laugonzalez90@hotmail.com) on 2018-05-22T00:16:23Z No. of bitstreams: 1 Dissertaçao Laura Gonzalez-Maldonado_LG2_fin.pdf: 8536159 bytes, checksum: d12bbe89b4178e0610b148bd65e320c3 (MD5) Approved for entry into archive by Ana Cristina Jorge null (anacris@fclar.unesp.br) on 2018-05-22T13:56:44Z (GMT) No. of bitstreams: 1 gonzalez maldonado_la_me-arafo-par.pdf: 8360176 bytes, checksum: 6f8fef05bcedc9c3bc269daf6b5dca75 (MD5) Made available in DSpace on 2018-05-22T13:56:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 gonzalez maldonado_la_me-arafo-par.pdf: 8360176 bytes, checksum: 6f8fef05bcedc9c3bc269daf6b5dca75 (MD5) Previous issue date: 2018-03-28 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Os macrófagos representam uma das principais pontes entre imunidade inata e adaptativa e estão presentes em grande número tanto no estroma circundando tumores sólidos quanto no interior da massa tumoral (TAMs, tumor-associated macrophages), onde podem representar até 50% da massa da lesão. Nos carcinomas espinocelulares de cabeça e pescoço (HNSCC), TAMs apresentam predominantemente o perfil M2 (pró-tumoral), e a quantidade de TAMs é inversamente relacionada ao prognóstico. A efetividade do tratamento não-cirúrgico (quimio/radioterapia ou imunoterapia) dos tumores sólidos é diretamente relacionada à indução de morte das células neoplásicas. No processo de reparo, as células apoptóticas são removidas por fagocitose por outros tipos celulares, num processo denominado eferocitose. Embora seja um processo importante para o reparo e homeostasia tecidual, a eferocitose pode afetar o fenótipo dos macrófagos, favorecendo a polarização para o perfil M2, associado à progressão de HNSCC. A galanina é um peptídeo de 29 aminoácidos amplamente distribuída no organismo e com amplo espectro de efeitos biológicos. A expressão constitutiva de galanina por células de OSCC está associada à maior agressividade do tumor e tem sido estudado como marcador prognóstico de agressividade do tumor e também como um possível alvo terapêutico de HNSCC. O objetivo do presente trabalho é determinar a influência dos produtos secretados pelas células de carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço, bem como da galanina isoladamente, no fenótipo de macrófagos e atividade de eferocitose. Para determinar a influência dos produtos secretados no perfil fenotípico dos macrófagos por células tumorais (independentemente do contato direto célula:célula) e da galanina, as células foram tratadas com meio condicionado (CM) contendo os produtos secretados das linhagens tumorais UM-SCC-1 e UM-SCC-22B. Adicionalmente, para avaliar efeito do contato célula:célula e dos produtos secretados sobre a expressão gênica e na eferocitose dos macrófagos ‘pré-polarizados’ em M1 ou M2, foi realizada a co-cultura com as linhagens celulares tumorais apoptóticas UM-SCC-1 e UM-SCC-22B. O perfil fenotípico (M1/M2) foi determinado por RT-qPCR e a modulação na eferocitose dos macrófagos pela citometria de fluxo e microscopia de fluorescência. Os produtos secretados pelas células tumorais, assim como o contato direto célula:célula influenciam a expressão de TNF e IL10 em macrófagos, com aumento significativo da expressão global de TNF e IL10 em co-culturas de macrófagos com as linhagens tumorais UM-SCC-1 e UM-SCC-22B (P

A esporotricose é uma micose subcutânea zoonótica de distribuição mundial, causada por espécies fúngicas do complexo Sporothrix schenckii. Os protozoários do gênero Acanthamoeba constituem um grupo amplamente distribuído no ambiente (solo, água e ar) e algumas espécies podem ser patogênicas e/ou oportunistas. Estes organismos coexistem no mesmo ambiente, podendo resultar em algumas alterações interespecíficas. O objetivo do estudo foi verificar o perfil da interação entre S. schenckii sensu stricto e S. brasiliensis e A. castellanii, através de um modelo in vitro de cocultivo como fator modulador de características intrínsecas de ambos microrganismos. Para isso, foram avaliados o índice de fagocitose de S. schenckii sensu stricto e S. brasiliensis por A. castellanii; a viabilidade de S. schenckii sensu stricto e S. brasiliensis após contato com A. castellanii; a viabilidade das amebas após contato com os fungos; e a influência de S. schenckii sensu stricto e S. brasiliensis no processo de encistamento de A. castellanii. As análises indicaram que S. schenckii e S. brasiliensis sofreram eventos fagocíticos por A. castellanii. Os resultados não demonstraram aumento significativo da replicação fúngica na presença da ameba e nem diminuição da viabilidade amebiana em cocultura com os fungos. Porém, os resultados foram obtidos através de testes in vitro, sendo necessários estudos com a coinfecção in vivo para confirmação desta hipótese. Sporotrichosis is a worldwide zoonotic subcutaneous mycoses, caused by species of the fungal Sporothrix schenckii complex. The protozoa from genus Acanthamoeba are widely distributed in the environment (soil, water and air), and some species may be pathogenic and/or opportunistic. These organisms coexist in the same environment, which may result in some interspecific changes. The aim of our study was to verify the profile of interaction between S. schenckii sensu stricto and S. brasiliensis and A. castellanii, by an in vitro model of co-culture as a modulator factor of both microorganisms intrinsic characteristics. In order to do so, we evaluated the phagocytosis index of S. schenckii sensu stricto and S. brasiliensis by A. castellanii; S. schenckii sensu stricto and S. brasiliensis viability after contact with A. castellanii; amoeba viability after contact with the fungus; and the influence of S. schenckii sensu stricto and S. brasiliensis in encystment process of A. castellanii. Our analyses indicated that S. schenkki and S. brasiliensis have suffered phagocytic events by A. castellanii. Results also showed that there was no significant increase in fungal replication in the presence of amoebae and there was no change in the viability of amoebas in co-culture with fungi. Our results were obtained through in vitro assays, which make possible the absence of these results in vivo, so there is a need for studies with co-infection in vivo in order to have a thorough understanding of this relationship. Our results were obtained through in vitro assays, which make possible the absence of these results in vivo, so there is a need for studies with co-infection in vivo in order to have a thorough understanding of this relationship.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Pós-graduação em Medicina Tropical, 2017. Texto parcialmente liberado pelo autor. Conteúdo restrito: Capítulos 5,6,7 e 8. Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). O fungo Cryptococcus neoformans é um agente causador da micose sistêmica criptococose, que tem levado a óbito cerca de 181 mil pessoas por ano ao redor do mundo. A doença atinge principalmente pessoas imunodeprimidas e adquiriu maior importância clínica a partir da década de 1980, com o aparecimento da AIDS. Como em outras doenças fúngicas, o diagnóstico e o tratamento dessa doença ainda não são ideais, reforçando a necessidade de estudar-se melhor a relação parasito-hospedeiro na busca por melhores estratégias para reverter esses problemas. Nos últimos anos tem se mostrado que pequenos metabólitos podem ter um importante papel na interação parasita-hospedeiro. Demonstrou-se previamente, que moléculas de baixo peso molecular (menor que 1 KDa) presentes no meio condicionado (CM) de culturas estacionários de C. neoformans da linhagem H99, afetavam o crescimento planctônico e em biofilmes desse fungo, bem como a produção de melanina e a secreção de polissacarídeos capsulares por esse fungo. Em continuidade a esses estudos, no presente trabalho analisou-se a influência dessas mesmas moléculas secretadas pelo fungo na sua interação com macrófagos murinos primários. Fungos e macrófagos foram co-incubados por períodos de 2h ou 24h em uma razão de infecção de 2:1 na presença ou não do CM e foram analisados os possíveis efeitos na fagocitose dos fungos, na sobrevivência fúngica pós-interação e na produção de citocinas por esses macrófagos (TNF-α, IL-12, IL-1β, IL-6 e MCP-1, e IL-10). Observou-se uma potencial atividade antifagocítica de metabólitos presentes no CM, uma vez que na presença do CM houve um menor percentual de fagocitose dos fungos. Além disso, o CM produziu um aumento significativo no número de unidades formadoras de colônia do fungo após a interação com os macrófagos por 24h, sugerindo, portanto, a possibilidade de existir nessas amostras, moléculas capazes de estimular o crescimento extra e/ou intracelular do fungo. Interessantemente, após 24 h de fagocitose, observa-se um número bem menor de fungos intracelulares nos macrófagos contendo fungo, do que nas amostras controle sem CM. A produção de citocinas só foi avaliada no período de 2h de interação e não foram observadas diferenças significativas na produção de TNF-α, IL-1β, IL-6, apenas uma diminuição da produção de MCP-1 na presença de CM indicando um potencial papel anti-inflamatório de moléculas presentes nessa amostra. Em resumo, foi possível constatar que os pequenos metabólitos presentes no CM podem afetar a viabilidade e/ou crescimento fúngico na sua interação com macrófagos, possivelmente inibindo a sua internalização por fagócitos e inibindo a produção de citocinas pró-inflamatórias. Dessa maneira, um maior conhecimento das moléculas presentes no CM bem com o melhor detalhamento de suas atividades podem ajudar no melhor entendimento das interações fungo-hospedeiro na criptococcose. The fungus Cryptococcus neoformans is a causative agent of the systemic mycosis cryptococcosis, a disease leading to about 181 thousand deaths per year worldwide. The disease affects mainly immunocompromised individuals and gained greater clinical importance from the 1980s, with the onset of AIDS. As in other fungal diseases, the diagnosis and treatment of this pathology is still far from ideal, reinforcing the need to better study the host-parasite interaction in the seek for best strategies to revert these problems. In the recent years, small metabolites were shown to play important roles in host-parasite interactions. It was previously demonstrated that low molecular weight molecules (lower than 1 KDa), present in conditioned medium (CM) from stationary cultures of C. neoformans strain H99, affected the planktonic and biofilm growth of this fungus, as well the production of melanin and secretion of capsular polysaccharides by this fungus. To further study the role of those molecules, in the present work we analyzed the influence of these secreted molecules, during fungal interaction with primary murine macrophages. Fungal cells and macrophages were co-incubated for periods of 2h or 24h in an infection ratio of 2:1, in the presence or absence of CM. Then we analyzed the possible effects of these molecules on fungal phagocytosis by macrophages, fungal survival, and macrophage cytokine production (TNF-α, IL-12, IL-1β, IL-6, MCP-1, and IL-10). We observed a potential anti-phagocytic activity of metabolites present in CM, which samples showed a lower percentage of fungal internalization. In addition, the CM produced a significant increase in the number of colony forming units of the fungus, obtained after 24h interaction with macrophages. This suggests that molecules capable to stimulate the extra and/or intracellular growth of the fungus might exist in these samples. Interestingly, after 24h phagocytosis, a significantly lower number of intracellular fungi were observed in fungus-containing macrophages when compared to control samples without CM. The production of cytokines was evaluated only within a period of 2h interaction and no significant differences were observed in the production of TNF-α, IL-1β, IL-6. Only a decrease in the production of MCP-1 in the presence of CM was detected, suggesting a potential anti-inflammatory role of the molecules present in this sample. In summary, it was possible to confirm that small metabolites present in CM might affect fungal viability and/or growth while interacting with macrophages, possibly inhibiting their internalization by these phagocytes and the production of pro-inflammatory cytokines. Thus, a better characterization of the molecules present in CM and of their activities could improve the understanding of fungus-host interactions in cryptococcosis.

Submitted by Rosivalda Pereira (mrs.pereira@ufma.br) on 2018-02-26T17:36:58Z No. of bitstreams: 1 KellyPortela.pdf: 3821103 bytes, checksum: eab4919572cc12f16bf3e63453c6d850 (MD5) Made available in DSpace on 2018-02-26T17:36:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 KellyPortela.pdf: 3821103 bytes, checksum: eab4919572cc12f16bf3e63453c6d850 (MD5) Previous issue date: 2017-05-11 CAPES FAPEMA Macrophage activation by natural products has been studied in development or resolution of several pathological conditions, as an immunomodulatory therapeutic possibility. Since Tityus serrulatus scorpion venom (vTs) showed potential to activate and modulate these phagocytes response, this study aimed to evaluate murine macrophages polarization after treatment with vTs. For this, RAW 264.7 lineage cells were stimulated with vTs (0.1; 1; 10 μg / mL) and / or LPS (10 μg / mL) for 24 and 48 hours. After these treatments, we evaluated Zymosan particles (10: 1) and Escherichia coli-GFP (10: 1) phagocytosis, nitric oxide (NO), hydrogen peroxide (H2O2) and Cytokines (IL-6, TNF-α, MCP-1 and IL-12) production, and immunophenotypic characterization (CD80, CD86 and iNOS). Treatment with vTs was increased RAW cells phagocytic potential to Zymosan and E. coli. Although RAW cells increased microbicidal activity, vTs, alone, treatment did not induce NO production. However, groups stimulated with vTs plus LPS showed increased NO. Different from NO generation, all groups treated with vTs showed a stimulation of H2O2 production. The venom induced proinflammatory cytokines production, showing higher release of TNF-α and MCP-1. RAW cells stimulated with venom, or venom and LPS, showed an increase in CD86 and iNOS expression. Significantly, vTs treatment presented a response pattern similar or superior to that showed by M1 macrophages, in all evaluated parameters. Thus, our data allow us to affirm that T. serrulatus scorpion venom can activate RAW 264.7 macrophages. Furthermore, we suggest that treatment with T. serrulatus venom induces polarization for a M1 response profile. A ativação de macrófagos por produtos naturais vem sendo estudada no desenvolvimento ou resolução de diferentes condições patológicas, como uma possibilidade terapêutica imunomoduladora. Uma vez que o veneno do escorpião Tityus serrulatus (vTs) apresenta potencial ativador e modulador das repostas desses fagócitos, o objetivo deste estudo foi avaliar a polarização de macrófagos murinos tratados com vTs. Para tanto, células de linhagem RAW 264.7 foram estimuladas com vTs (0,1; 1; 10 µg/mL) e/ou LPS (10 µg/mL) por 24 e 48 horas. Após esses tratamentos, foi avaliada: a capacidade fagocítica dessas células frente a partículas de Zymosan (10:1) e Escherichia coli-GFP (10:1); a produção de óxido nítrico (NO), peróxido de hidrogênio (H2O2), e citocinas (IL-6, TNF-α, MCP-1 e IL12); e a caracterização imunofenotípica (CD80, CD86 e iNOS). O tratamento com o vTs aumentou o potencial fagocítico das células RAW em relação ao Zymosan e E. coli. Apesar de ter induzido maior atividade microbicida das células RAW, o tratamento com vTs não induziu, por si só, a produção de NO. No entanto, os grupos estimulados com vTs e LPS, mostraram aumento de NO. Diferente da geração de NO, a produção de H2O2 aumentou em todos os grupos de tratamento com o vTs. O veneno induziu a produção de citocinas pró-inflamatórias, mostrando maiores índices para TNF-α e MCP-1. As células estimuladas com veneno, ou veneno e LPS, exibiram um aumento na expressão de CD86 e iNOS. E, de forma significativa, os tratamentos com o vTs apresentaram padrão de resposta semelhante ou superior ao mostrado pelos macrófagos M1, em todos os parâmetros avaliados. Desse modo, nossos dados nos permitem afirmar que o veneno de T. serrulatus apresenta ação ativadora sobre os macrófagos RAW 264.7. Ainda, sugerimos que o tratamento com o veneno de T. serrulatus mostra potencial indutor de polarização para o perfil M1 de resposta.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Em certas circunstâncias, Candida albicans pode passar de colonizante para infectante e, como na candidíase oral. A morfogênese de C. albicans, bem como sua capacidade de combater o estresse oxidativo no interor de células fagocíticas, é um fator essencial para a invasão tecidual e estabelecimento da infecção. Devido ao baixo arsenal antifúngico disponível no mercado e o constante surgimento de cepas resistentes, faz-se necessária a pesquisa de novas fontes terapêuticas, principalmente oriundas de produtos naturais. No presente estudo foram selecionados 48 isolados clínicos de C. albicans oriundos da cavidade bucal de pacientes transplantados renais. A fração acetato de etila de Eugenia uniflora foi utilizada na concentração de 1000 μg/mL para avaliar a ação comparativa (tratada e não tratada com extrato) sobre a fagocitose e morfogênese de C. albicans. Foi realizado o ensaio de resistência ao ataque de neutrófilos polimorfonucleares. O isolado 111R, de alta capacidade filamentação foi utilizado para avaliação do perfil protéico por meio de análise proteômica, bem como da interação com proteínas diretamente associadas à morfogênese. A resposta à infecção foi observada em modelo murino de candidíase oral e a ação tóxica do extrato de E. uniflora foi observada em ensaio de MTT. O extrato de E. uniflora reduziu significativamente a capacidade de fagocitose de C. albicans (média total de 120.36 ± 36.71 vs. 44.68 ± 19.84). Trinta e nove proteínas foram identificadas na análise proteômica, relacionadas à geração de energia, metabolismo de proteínas e glicose, divisão celular, transporte citoplasmático, metabolismo de ácidos nucléicos, estrutura celular e resposta ao estresse. Importantes proteínas relacionadas com a formação do citoesqueleto foram reguladas negativamente nas células tratadas. Houve instalação de infecção na cavidade oral dos camundongos e a infecção foi atenuada quando C. albicans foi pré-incubada na presença do extrato de E. uniflora e quando o extrato foi aplicado na cavidade oral após a instalação da infecção. Este resultado foi condizente com a redução na contagem de UFC (2.36 vs. 1.85 Log10 CFU/ml) e a atenuação dos danos teciduais observados na análise histopatológica. O extrato de E. uniflora não foi tóxico para células humanas mesmo em concentrações 8x acima da utilizada nos experimentos. A fração acetato de etila de E. uniflora poderá causar danos à parede celular e proteínas essenciais ao metabolismo de C. albicans, afetando proteínas relacionadas à estrutura celular, reduzindo a capacidade plástica de filamentação, atenuando a ação invasiva em modelo animal, sem causar efeito tóxico em células humanas, podendo ser uma futura alternativa terapêutica para o tratamento de infecções por Candida. Under certain circumstances, Candida albicans may switch a colonizing to a infecting yeast, such as in oral candidiasis. Morphogenesis in C. albicans, besides its ability to combat the oxidative stress inside phagocytic cells is an essential step for tissue invasion and establishment of infection. Due to the reduced drug arsenal used for treatment of fungal infections and the constant emergence of resistant strains, it is mandatory to search for new therapeutic sources, mainly from natural products. In the present study, 48 clinical isolates of C. albicans from the oral cavity of renal transplant recipients were selected. In order to evaluate the comparative action (treated and untreated cellst) on phagocytosis and morphogenesis of C. albicans, the ethyl acetate fraction of Eugenia uniflora extract was used at a concentration of 1000 μg/mL. Resistance of C. albicans to polymorphonuclear neutrophils was carried out. The isolate 111R, a highly filamentous strain was used to evaluate protein profiling through proteomic analysis, as well as the interaction with proteins directly associated with morphogenesis. The in vivo response to infection was observed in murine model of oral candidiasis and the toxic action of E. uniflora extract was observed in the MTT assay. E. uniflora extract significantly reduced the phagocytosis of C. albicans (Mean 120.36 ± 36.71 vs. 44.68 ± 19.84). Thirty-nine proteins, related to energy generation, protein and glucose metabolism, cell division, cytoplasmic transport, nucleic acid metabolism, cell structure and stress response were identified with proteomics analysis. Important proteins directly related with cytoesqueleton formation were down regulated on treated cells. The infection in the oral cavity of the mice was established and it was attenuated when both C. albicans cells were either preincubated in the presence of E. uniflora extract or when the extract was applied to the surface of the oral cavity after infection. These results were consistent with the reduction in CFU countings (2.36 vs. 1.85 Log10 CFU/ml) and attenuation of tissue damages observed in the histopathologycal analysis. E. uniflora extract was non-toxic to human cells even at concentrations 8 fold hugher than the one used in the experiments. The ethyl acetate fraction of E. uniflora may act act damaging and metabolism essential proteinsmainly related to cellular structure, reducing the plastic capacity of filamentation and attenuating infection in a murine modell model, without causing any toxic effect on human cells, suggesting that it may be a future therapeutic alternative for the treatment of Candida infections.

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Outra Agência Nos últimos anos Acinetobacter baumannii tem se tornado um micro-organismo de grande importância clínica e epidemiológica. Isso se deve à sua usual resistência, intrínseca e adquirida, a vários antimicrobianos, além de sua habilidade de sobrevivência em diversos ambientes, por longos períodos de tempo. As habilidades de invasão, colonização e de destruição tecidual apresentada por linhagens desta espécie devem-se aos múltiplos fatores de patogenicidade encontrados neste micro-organismo durante a sua patogênese. O objetivo deste estudo foi avaliar fatores de patogenicidade presentes nesta espécie, por meio de análises fenotípicas e genotípicas. Foram incluídas 29 amostras de A. baumannii multirresistentes a antimicrobianos, obtidas de pacientes com infecções diversas, atendidos em um hospital universitário de Belo Horizonte no período de agosto de 2012 a maio de 2013, além da amostra de referência, A. baumannii ATCC 19606. A presença de genes associados à cápsula, biofilme, apoptose e quorum sensing (QS) foram pesquisados pela técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR). Para o ensaio de apoptose, fagocitose e de espécies reativas de oxigênio (ROS), utilizou-se Kits específicos e análises por citometria de fluxo. A avaliação do estresse oxidativo foi realizada pelo método de disco difusão com peróxido de hidrogênio. O teste de hemólise foi executado em 06 tipos sanguíneos diferentes (humano, carneiro e cavalo), sendo os de origem humana de fator Rh positivo. Todas as amostras positivas para gaiU e 76% para wzc. No que se refere a quorum sensing, 10% das amostras apresentaram o gene luxI e 7% luxR. Todas as amostras foram positivas para bap, relacionado à formação de biofilme. Em relação às porinas, 14% foram positivas para omp33 e 31% para ompA. 24% das amostras apresentaram todos os genes pesquisados relacionados à patogenicidade. Nos ensaios em citometria de fluxo, exceto uma amostra, todas induziram a formação de ROS por macrófagos em diferentes taxas. Na fagocitose, todas as amostras foram fagocitadas, porém também em diferentes taxas. Na indução de apoptose em macrófagos por linhagens de A. baumannii, foram 08 amostras cuja incubação resultou em significativa redução no número de macrófagos em relação ao controle, já em relação à amostra de referência, somente duas amostras. No que concerne estresse oxidativo por peróxido de hidrogênio, 20 amostras obtiveram significância estatística (p

A nanotecnologia envolve a criação e utilização de materiais, dispositivos e sistemas através do controle da matéria na escala manométrica. Apresenta impactos positivos na medicina que envolve desde o diagnóstico ao tratamento de doenças. Sistemas de entrega de fármacos apresentam a capacidade de superar barreiras biológicas e otimizar a liberação de um fármaco. No entanto, um dos principais desafios na utilização desses sistemas é a sua internalização pelos macrófagos. Esse estudo objetiva preparar e caracterizar nanopartículas poliméricas formadas por polímeros biodegradáveis e investigar o seu impacto na função dosmacrófagos in vitro através da observação da viabilidade celular, atividade fagocítica e produção de citocinas. Além do perfil de citocinas no soro e sobrenadante de cultura de esplenócitos provenientes de camundongos Balb/C que foram injetados com uma suspensão de nanopartículas de quitosana. As nanopartículas de quitosana e quitosana contendo magnéticas foram preparadas por gelificação iônica apresentando morfologia reticular e “quase esférica”, respectivamente, e potencial zeta positivo. As de PLGA preparadas por emulsificação e evaporação do solvente apresentaram morfologia esférica e potencial zeta negativo. Todas apresentaram diâmetro menor que 300 nanômetros e índice de polidispersão menor que 0,5. As nanopartículas de quitosana e de PLGA afetaram a viabilidade de macrófagos in vitro apenas na maior concentração testada (4mg/mL). As nanopartículas de quitosana contendo magnética foram internalizadas pelos macrófagos em 4h e 24h de incubação. As diferentes nanopartículas desencadearam a produção elevada de TNF- e baixa produção de IL12p40 e IL-10. No soro e no sobrenadante da cultura de esplenócitos foi observada tanto a produção de INF- quanto de IL-4. No entanto, a produção de IL-4 foi maior que a de IFN-. Nanotechnology involves the creation and use of materials, devices and systems through control of matter on the manometer scale. It has positive impact on medicine involving the treatment and diagnosis. Drug delivery systems prepared with nanostructures have the ability to overcome biological barriers and optimizing drug release. However, one of the main challenges in the use of these systems is their internalization by macrophages. This study aims to prepare and characterize polymer nanoparticles formed by biodegradable polymers and investigate its impact on the function of macrophages in vitro by the observation of cell viability, phagocytic activity and cytokine production. Also, was investigate the cytokine profile in serum and splenocytes culture supernatant from Balb/C mice injected with chitosan nanoparticles. The chitosan and chitosan-containing magnetic nanoparticles were prepared by ionic gelation crosslinking, resulting in a morphology "nearly spherical" and positive zeta potential. The PLGA prepared by emulsification and solvent evaporation method presented spherical morphology and negative zeta potential. All preparations had a diameter smaller than 300 nanometers and polydispersity index lower than 0.5. Nanoparticles of chitosan and PLGA affected the viability of macrophages in vitro only at the highest concentration tested (4 mg/mL). The chitosan nanoparticles containing magnetic nanoparticles were internalized by macrophages after 4h and 24h of incubation. Different nanoparticles triggered high production of TNF- and low IL12p40 production and IL-10. Serum and splenocytes culture supernatant was observed in both the production of IFN- as IL-4. However, IL-4 production was higher than that of IFN-. Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás - FAPEG

Esse estudo avaliou o extrato etanólico de Moquiniastrum polymorphum (EEMP) sobre a carcinogênese colorretal induzida por 1,2 dimetilhidrazina (DMH). Foram utilizados 42 camundongos machos swiss (Mus musculus) distribuídos em seis grupos experimentais (n=7/grupo): controle, DMH, EEMP, pré-tratamento, simultâneo e pós-tratamento. Os resultados indicaram que o EEMP é antigenotóxico, pois as porcentagens de redução de danos (% RD), no ensaio do cometa, tiveram valores acima de 81% nos grupos associados. Também demonstrou atividade antimutagênica, pois no teste do micronúcleo as % RD foram superiores à 77,09% nos grupos associados. O teste de focos de criptas aberrantes demonstrou o elevado potencial anticarcinogênico do EEMP, pois os grupos associados apresentaram % RD de 62,13%; 86,40% e 95,14% para o pré-tratamento, simultâneo e pós-tratamento, respectivamente. O estudo demonstra que EEMP não causa toxicidade e possui atividade quimiopreventiva e anticarcinogênica, sendo que pode vir a ser um promissor fitoterápico devido às propriedades demonstradas nesse trabalho. ABSTRACT - This study aimed to evaluate the effect of the Moquiniastrum polymorphum ethanol extract (MPEE) on 1.2 dimethylhydrazine (DMH)-induced colorectal carcinogenesis. Forty-two male Swiss mice (Mus musculus) were distributed into six groups (n=7/group): control, DMH, EEMP, pre-treatment, simultaneous and post-treatment. The findings indicated that the EEMP is antigenotoxic because the damage reduction percentages (DR%) through the comet assay were more than 81% in the associated groups. The agent also showed antimutagenic activity, because the micronucleus test found DR% higher than 77.09 in the associated groups. The aberrant crypts foci test demonstrated the high anticarcinogenic potential of the MPEE as the associated groups showed DR% 62.13, 86.40 and 95.14 for pretreatment, simultaneous and post-treatment groups, respectively. The study shows that the MPEE in nontoxic and has chemopreventive and anticarcinogenic activity, thus the agent may prove to be a promising herbal medicine in view of its demonstrated properties.

Resumo: As vitaminas são compostos orgânicos necessários em poucas quantidades no organismo, todavia indispensáveis para as funções metabólicas. Elas se inserem em inúmeras reações metabólicas, fisiológicas e imunes das células, necessárias para a manutenção da saúde animal, além de atuarem como imunoestimulante. Embora a dieta rica em folhagens verdes frescas forneça quantidades suficientes de vitaminas A, D e E a suplementação intensiva com alimentos conservados na forma de feno ou silagem pode reduzir em até 50 % dos teores destas vitaminas no alimento. Diante disso, a proposta do trabalho foi verificar se a administração parenteral de vitaminas A, D e E age como imunoestimulante em garrotes estabulados e alimentados exclusivamente com feno de tifton. Para tanto 14 bovinos foram divididos em dois grupos homogêneos, sendo o grupo S, suplementado com vitamina A, D e E em dose única de 30 mL por via intramuscular; e o grupo C, sem suplementação. Ambos os grupos foram alojados em baias parcialmente privadas de sol, e alimentados com feno por um período de três meses. A avaliação imune foi realizada por hemogramas e ensaio de função leucocitária (metabolismo oxidativo e fagocitose) nos momentos antes do tratamento, três e dez dias após os tratamentos. Tendo em vista que a suplementação com polivitamínicos A, D e E aumentou a porcentagem da atividade de células granulocítica e a intensidade da atividade de células mononucleares, além de intensificar o efeito antioxidante prolongando a sobrevida de hemácias e neutrófilos, conclui-se que esta suplementação promoveu efeito benéfico na resposta imune de bezerros da Raça Holandesa, apesar dos efeitos deletérios da alimentação exclusiva com feno e da privação parcial da incidência solar direta. Abstract: Vitamins are organic compounds which are required in small quantities in the body, however essential for the metabolic functions. They participate in numerous metabolic reactions, physiological and immune cells, needed to maintain animal health, as well as act as immunostimulants. Although the diet rich in fresh green foliage provides sufficient amounts of vitamin A, D and E, intensive supplementation with food stored in the form of hay or silage can reduce up to 50% of the levels of these vitamins in food. Given this, the proposal of this study was to verify how the parenteral administration of vitamins ADE acts as immunostimulant in steers fed exclusively with hay of tifton. For that, 14 cattle were divided into two homogeneous groups: Group S, supplemented with vitamin A, D e E given in a single intramuscular dose of 30mL, and Group C without supplementation. Both groups were housed in private stalls and fed with hay for a period of three months. Immune evaluation was performed by blood count and testing of leukocyte function (oxidative metabolism and phagocytosis) in the moments before treatment, three and ten days after the treatments. Considering that supplementation with vitamin A, D e E increased the percentage of granulocytic cell activity and the intensity of the activity of mononuclear cells, as well as intensified the antioxidant effect prolonging the survival of red blood cells and neutrophils, it can be concluded that this treatment had a beneficial effect on the immune response of Holstein calves, despite the damaging effects of exclusive feeding hay, and the partially deprivation of solar incidence.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Pós-graduação em Medicina Tropical, 2015. As parasitoses intestinais apresentam uma alta prevalência no mundo. Estudos revelam o aumento das doenças alérgicas e da asma e concomitantemente redução das doenças infectoparasitárias em crianças. A existência de uma correlação é estudada demonstrando a ação imunossupressora dos parasitos intestinais sobre a resposta imunitária sistêmica. Os objetivos do presente trabalho foram avaliar o estado de ativação dos eosinófilos e as funções dos fagócitos comparativamente em crianças com asma, com parasitoses intestinais e na associação de ambas. Foi realizado estudo transversal com 68 crianças residentes no Riacho Fundo II e na Cidade Estrutural, em Brasília/Distrito Federal. Os pacientes foram separados nos grupos: A) crianças com parasitoses intestinais; B) crianças asmáticas sem parasitoses intestinais; C) crianças com parasitoses intestinais e asma e D) grupo controle. Após técnica de aderência em lâmina, foram avaliados: o estado de ativação dos eosinófilos do sangue periférico por parâmetros morfológicos; a fagocitose pelos monócitos (MON) e neutrófilos (NEU) por receptores para padrões moleculares de patógenos (rPMP) e para opsoninas (rOps), como também a produção de ânions superóxido (O-) pelo teste do nitroblue tetrazolium (NBT). As análises estatísticas foram realizadas pelos testes de ANOVA ou Kruskal-Wallis. Observamos, além da baixa renda familiar e reduzidas condições de escolaridade, a prática de evacuações no peridomicílio pelas crianças e a ausência de tratamento domiciliar da água de beber. Os parasitos intestinais mais prevalentes foram Ascaris lumbricoides e Giardia lamblia, seguida por Hymenolepis nana e houve associação de parasitos intestinais em 38% dos pacientes parasitados. A ativação dos eosinófilos foi menor nas crianças com enteroparasitoses, quando analisados o percentual de eosinófilos normais, espraiamento, liberação de pequenas quantidades de grânulos e emissão de pseudópode único, comparativamente às crianças asmáticas. A capacidade fagocitária pelos rPMP dos NEU das crianças parasitadas exclusivamente por protozoários foi menor do que a das crianças asmáticas. Quando a fagocitose foi avaliada pelos rOps, a capacidade fagocitária dos MON das crianças asmáticas e também parasitadas foi maior do que a das crianças controle, pela maior ingestão de leveduras pelos MON. A produção de O- pelos fagócitos foi menor nas crianças parasitadas por protozoários do que nas crianças asmáticas e parasitadas por protozoários. Contudo, a produção dos O- foi maior nas crianças parasitadas por helmintos do que nas crianças asmáticas. Em conclusão, a infecção parasitária e o quadro de asma tiveram efeitos opostos sobre as diversas funções da imunidade inata estudada. O tipo de resposta dependeu do tipo de parasito e helmintos e protozoários determinaram repostas opostas: enquanto os protozoários, particularmente a Giardia intestinalis, diminuíram a capacidade fagocitária dos NEU pelos rPMP, os helmintos estimularam a fagocitose pelos MON pelos rOps. Em adição, enquanto no quadro de asma observamos certo grau de ativação dos eosinófilos, nas crianças parasitadas, essa ativação dos eosinófilos no sangue periférico não ocorreu, possivelmente por fatores supressores produzidos pelos parasitos. Tais achados podem contribuir para o esclarecimento sobre a resposta imune inata aos parasitos e suas repercussões no indivíduo, auxiliando na abordagem das parasitoses e no desenvolvimento de novas terapêuticas para a asma e atopias. Intestinal parasites have a high prevalence worldwide, mainly in developing countries in places showing poor sanitary and socio-economic conditions. Several studies point to an increase in allergic diseases and asthma over the years, and show a concomitant reduction in infectious and parasitic diseases in children. The existence of such a correlation or causal factor has been investigated in experimental models with animal and human beings, leading to findings that demonstrate the immunosuppressive action of the parasites on the systemic immune response. Factors depending on the host, such as genotype, immune competence and nutritional status; and factors depending on the parasite, as the parasite load and the pathogenicity and virulence of helminths or protozoans, will determine the type of immune response triggered in infected individuals. In this context, this work aimed to evaluate eosinophil activation status and phagocytes' functions comparatively in children with asthma, intestinal parasites and in combination of both. A cross-sectional study was done in 68 children living in Riacho Fundo II and Chácara Santa Luzia in Cidade Estrutural, in Brasilia/Federal District, Brazil. The socio-economic-cultural evaluation of the families, and clinical, laboratory and stool testing of each child were made. Four groups were studied: A) Helminths or/and protozooan parasitized children; B) asthmatic children; C) asthmatic and parasitized children; and D) control group. The blood eosinophil activation status was assessed by morphologic parameters after adherence to glass. The phagocytic capacity of monocytes and neutrophils was evaluated by pathogen-associated molecular pattern receptors (PAMPr) and the opsonin receptors, as well as superoxide anions production by nitroblue tetrazolium test (NBT). Statistic analyses were performed by ANOVA or Kruskal-Wallis test. Eosinophils were lower activated in children with intestinal parasites than in asmathic children, by percentage of normal eosinophils, spreading, releasing of small quantities of granules and emission of a single pseudopod. The phagocytic capacity of neutrophils of children exclusively parasitized by protozoan was lower than that of asthmatic children, by pathogen-associated molecular pattern receptors. When the phagocytosis was evaluated by opsonin receptors, phagocytic capacity of monocytes in asthmatic children concomitantly parasitized was higher than that of controls. Superoxide anions production was lower in children parasitized by protozoan than in children with asthma plus protozoan. However, superoxide anions production was higher in children who were parasitized by helminths than in asthmatic children. In conclusion, our data showed that parasitic infection and asthma had opposite effects on several immune innate functions. Furthermore, immune response depended on the type of parasite, and helminths and protozoa determined opposite responses: whereas protozoan, mainly Giardia intestinalis, decreased phagocytic capacity by neutrophils by PAMPr, helminths stimulated phagocytosis by monocytes by opsonin receptors. In addition, whereas in asthmatic children there were some eosinophil activation, in parasitized children there was no blood eosinophil activation possibly determined by suppressive factors produced by parasites. These findings may contribute to make clear the innate immune response to parasites and their impact on individual, assisting to understand parasites and in development of new therapies for treatment of asthma and atopies.

Made available in DSpace on 2016-12-09T13:52:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-12-04. Added 1 bitstream(s) on 2016-12-09T13:55:19Z : No. of bitstreams: 1 000867906.pdf: 965887 bytes, checksum: d1a5b342453f51ebb99b6d2d7f7d7ecf (MD5) A esporotricose é uma micose de distribuição universal causada por fungos termodimórficos do complexo de espécies de Sporothrix schenckii. A forma mais comum da doença é a linfocutânea que compromete pele, tecido subcutâneo e gânglios linfáticos regionais. Células do sistema imune inato reconhecem patógenos por meio de receptores de reconhecimento de padrão (PRRs). Dentre esses, podemos destacar a família dos receptores do tipo Toll-like (TLRs) e dos receptores de lectina do tipo C (CLRs), os quais possuem membros capazes de reconhecer antígenos fúngicos. A interação entre os PRRs e os padrões moleculares associados aos patógenos (PAMPs) desencadeia uma série de vias de sinalização envolvidas na modulação da resposta adaptativa subsequente e na potencialização da capacidade fagocítica e microbicida dos macrófagos e de outros fagócitos. A Dectina-1 é um CLR amplamente expresso em macrófagos, células dendríticas e neutrófilos, sendo um receptor para β-glucana implicado no processo de fagocitose, no burst oxidativo e na produção de fatores solúveis, tais como citocinas e quimiocinas. O objetivo do presente estudo foi avaliar o papel das β-glucanas, reconhecidas ligantes de Dectina-1, na fagocitose e na produção de intermediários do oxigênio (H2O2) e nitrogênio (NO) e de mediadores solúveis por macrófagos peritoneais de camundongos Balb/c durante a infecção por S. schenckii ATCC 16345. Para tanto, os macrófagos foram desafiados com a fração álcali-insolúvel (F1) extraída da parede celular de S. schenckii, composta principalmente de β-glucanas, com uma β-1,3-glucana pura comercial ou com o fungo íntegro termo-inativado. Nossos resultados mostraram que tanto a fagocitose das leveduras de S. schenckii, como a produção de NO, H2O2 e das citocinas IL-10, TNF-α e IL-1β se dá pelo reconhecimento tanto das β-glucanas... Sporotrichosis is a worldwide distributed mycosis caused by thermodimorphic fungi from the Sporothrix schenckii species complex. The disease's most common form is the lymphocutaneous, which compromises the skin, subcutaneous tissue and regional lymphatic ganglia. Cells from the innate immune system recognize pathogens through pattern recognition receptors (PRRs). Among these, the toll-like (TLRs) and C-type lectin (CLRs) receptors can be highlighted for having members capable of recognizing fungal antigens. The interaction between PRRs and pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) triggers various signaling pathways involved in modulating the following adaptive response and in potentiating the phagocytic and microbicidal capabilities of macrophages and other phagocytes. Dectin-1 is a widely expressed CLR in macrophages, dendritic cells and neutrophils, being a receptor for β-glucan implicated in the phagocytic process, the oxidative burst, and in the production of soluble mediators such as cytokines and chemokines. The present study was aimed at assessing the role of β-glucans, known Dectin-1 ligands, in the phagocytosis and production of soluble mediators, oxygen (H2O2), and nitrogen (NO) intermediates by peritoneal macrophages from Balb/c mice during infection with S. schenckii ATCC 16345. In order to do that, the macrophages were challenged with the alkali-insoluble fraction (F1) extracted from the S. schenckii cell wall, which is mainly composed of β-glucans, with a purified commercial β-1,3-glucan, or with whole heat-killed S. schenckii yeasts. Our results showed that phagocytosis of the S. schenckii yeasts, as well as production of NO, H2O2, and the cytokines IL-10, TNF-α and IL-1β occur by the recognition of both the β-glucans and other additional components found in the F1 fraction. Furthermore, Dectin-1 expression was augmented on days 10 and 15 ...

Os receptores ativados por protease (PAR) pertencem à família dos receptores acoplados à proteína G e são alvos de serino proteases, sendo classificados de 1 a 4, em função da ordem de descoberta. Tanto PAR2 quanto PAR4 são expressos em leucócitos, e estão envolvidos no recrutamento e ativação dessas células. Embora seja caracterizado o papel do PAR em modelos de inflamação e ativação celular, pouco se sabe sobre a participação desses receptores na função efetora de macrófagos como, por exemplo, a fagocitose e a secreção de mediadores inflamatórios. Diante disso, o nosso objetivo foi avaliar o papel de PAR2 e PAR4 sobre a fagocitose de partículas de zimosano e liberação de mediadores inflamatórios em macrófagos peritoneais in vitro. Para isso, os macrófagos foram obtidos de camundongos C57BL/6, os quais foram injetados previamente com solução de tioglicolato 6 % por via intraperitoneal. Após três dias, foi feito a coleta do lavado peritoneal e essas células foram pré-incubadas com LPS (10 g/mL) 30 minutos antes da incubação com o agonista de PAR2 (SLIGRL-NH2, 30 M) ou agonista de PAR4 (AYPGKF-NH2 30 M) em presença ou não dos seus respectivos antagonistas seletivos (PAR2: ENMD 1068; PAR4: TcY-NH2); seguida pela adição de zimosano (10 g/mL). A avaliação da fagocitose foi expressa através do Índice de Fagocitose (IF), definido como a razão entre o somatório do total de partículas fagocitadas em 100 células contadas sobre a porcentagem de macrófagos fagocíticos. O sobrenadante da cultura foi utilizado para a dosagem de óxido nítrico (NO), espécies reativas de oxigênio (ROS) e produção de citocinas (TNF- e IL-10). A incubação dos macrófagos com o agonista de PAR2 (30 M) foi capaz de aumentar o IF, fato não encontrado quando houve incubação concomitante com seu antagonista. Em contrapartida a incubação com o agonista de PAR4 reduziu o IF. Essa redução não foi observada, quando administrado junto ao seu antagonista. A co-incubação de agonista de PAR2 (30 M) com o agonista de PAR4 (30 M) não alterou o IF. A ativação in vitro de PAR2 ou PAR4 foi capaz de aumentar a produção de NO após 24 horas de incubação. Porém, após 48 horas de incubação, houve uma redução na produção desse mediador. A ativação do PAR2 (30 M) não alterou os níveis de ROS 24 e 48 após a incubação. Porém, na presença do agonista de PAR4 (30 M) houve um aumento na produção de ROS foi observado nos dois tempos analisados. A incubação dos macrófagos com agonista de PAR2 (30 M) ou agonista de PAR4 (30 M) não alterou a produção de TNF-, porém o agonista de PAR2 (30 M) aumentou a produção de IL-10 no tempo de 24 horas, enquanto o agonista de PAR4 (30 M) reduziu a produção dessa citocina após 4 horas de incubação. Em conclusão, os dados sugerem um papel regulador de PAR2 e PAR4 no fenômeno fagocítico dos macrófagos e na produção de mediadores pró ou anti-inflamatório essenciais para o controle da resposta efetora dessas células. The protease activated receptors (PAR) belong to the family of G protein-coupled receptors and are targets of serine proteases, classified from 1 to 4 depending on the order of discovery. Both PAR2 and PAR4 are expressed in leukocytes, and are involved in the recruitment and activation of these cells. Although the role of the PAR is characterized in inflammation and cell activation models, little is known about the role of these receptors in macrophages during effector functions, for example, phagocytosis and the secretion of inflammatory mediators. Therefore, our objective was to evaluate the role of PAR2 and PAR4 on the phagocytosis of zymosan particles and release of inflammatory mediators in peritoneal macrophages in vitro. For that, macrophages were obtained from C57BL/6 mice, which were previously injected with 6% thioglycollate solution intraperitoneally. After three days, was made the collection of the peritoneal fluid and these cells were pre-incubated with LPS (10 g/ml) 30 minutes before the incubation with PAR2 agonist (SLIGRL-NH2,30 M) or PAR4 agonist (AYPGKF-NH2, 30 M in the absence or presence of the respective selective antagonists (PAR2: ENMD 1068, 30 M; PAR4: TCY-NH2, 30 M); followed by addition of zymosan (10 ug/ml). The evaluation was expressed by Phagocytosis Index (PI) defined as the ratio between the sum of the total particles engulfed in 100 cells counted on the percentage of phagocytic macrophages. The culture supernatant was used for the dosage of nitric oxide (NO), reactive oxygen species (ROS) and cytokine production (TNF- and IL-10). Incubation of macrophages with PAR2 agonist was able to increase the PI, which did not occur when there was a concomitant incubation with antagonist thereof. However, incubation with PAR4 agonist reduced the PI. This reduction was not observed when administered with his antagonist. The co-incubation of PAR2 agonist (30M) with PAR4 agonist (30M) did not alter the PI. The PAR2 activation in vitro or PAR4 was able to increase NO production after 24 hours of incubation. However, after 48 hours of incubation, there was a reduction in the production of this mediator. The PAR2 activation (30M) did not alter the levels of ROS 24 and 48 after incubation. Nevertheless, in the presence of PAR4 agonist (30 M) an increase in ROS production was observed in both times analyzed. Incubation of macrophages with SLIGRL-NH2 (30M) or AYPGKF-NH2 (30M) did not affect TNF- production, but PAR2 agonist increased IL-10 production in 24 hours, whereas the PAR4 agonist reduces the production of cytokine after 4 hours of incubation. In conclusion, the data suggest a regulatory role of PAR2 and PAR4 in the phagocytic phenomenon of macrophages and in the production of mediators pro and anti-inflammatory essential for controlling the effector response of these cells.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Pós-graduação em Medicina Tropical, 2015. A malária continua sendo um importante problema de saúde pública mundial acometendo milhões de pessoas principalmente nas regiões tropicais, e resulta em aproximadamente em 600 mil mortes por ano. As drogas antimaláricas influenciam indiretamente as respostas do sistema imunitário pela capacidade de diminuir a carga parasitária, diminuindo a quantidade de antígenos capazes de ativar o sistema imunitário. Entretanto, ainda está pouco esclarecida a ação das drogas antiplasmodiais sobre os mecanismos de defesa contra o plasmódio. A fagocitose encontra-se entre os principais mecanismos de eliminação do parasito, principalmente pela produção de radicais de oxigênio e nitrogênio pelos monócitos. A biogênese dos corpos lipídicos encontra-se aumentada na malária e pode estar envolvida na defesa e na fisiopatogenia da malária grave. O objetivo desse trabalho foi avaliar a influência do efeito imunomodulador do artemeter, lumefantrina e mefloquina na malária, pela avaliação da influência dessas drogas na fagocitose das formas eritrocitárias do plasmódio, na produção de óxido nítrico e peróxido de hidrogênio e na biogênese de corpos lipídicos. A influência do artemeter, da lumefantrina ou da mefloquina sobre a fagocitose por monócitos de indivíduos normais foia valiada in vitro utilizando 106 eritrócitos parasitados pelo Plasmodium falciparum, pelos receptores para padrões moleculares de patógenos (rPMP) e pelos receptores para opsoninas (rOps). Os monócitos e/ou os eritrócitos foram tratados previamente com as drogas por 60 min. O índice fagocitário foi determinado pela média de eritrócitos parasitados ingeridos por monócito multiplicado pela proporção de monócitos envolvidos na fagocitose. A produção de óxido nítrico foi avaliada pela reação de Griess e a produção de peróxido de hidrogênio foi avaliada pela oxidação do vermelho fenol na presença de peroxidase, sendo os monócitos estimulados pelos eritrócitos parasitados. Os corpúsculos lipídicos foram avaliados pela coloração com Oil Red O. As drogas foram utilizadas in vitro considerando os picos séricos observados quando do tratamento in vivo, sendo 360 ng/mL para o artemeter, 4,9g/mL para a lumefantrina e 687ng/mL para a mefloquina. Quando foi feito o tratamento dos monócitos e dos eritrócitos com o artemeter, observamos diminuição no IF quando avaliado pelos rOps (7,6x 5,2) (p= 0,02). A diminuição da fagocitose foi semelhante quando quantificada para hemozoína (p=0,036). Para a lumefantrina, houve diminuição do IF de 8,4 para 4,6 (p=0,02), quando apenas os monócitos foram tratados e a fagocitose avaliada pelos rPMP. Também houve diminuição do IF para esquizontes pelos rPMP, quando apenas os monócitos foram tratados (p=0,006). Quando os monócitos foram estimulados com os eritrócitos parasitados pelos rPMP, as três drogas diminuíram a expressão de corpúsculos lipídicos (p0,05). When monocytes were stimulated with Plasmodium falciparum-infected erythrocytes there was an increase in hydrogen peroxide production (p=0,009), whereas mefloquine treatment reduced the basal production of H2O2 by monocytes (p

Made available in DSpace on 2018-07-27T18:26:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-06-03. Added 1 bitstream(s) on 2018-07-27T18:30:37Z : No. of bitstreams: 1 000873683.pdf: 2162420 bytes, checksum: 8020e5fc7625f96c8be7397dc9a7ec86 (MD5) Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) A fagocitose, por células dendríticas (CD), de células apoptóticas (CA) infectadas induz a produção de TGF-β, IL-6 e IL-23, propiciando um microambiente com condições ideais para diferenciação de células Th17. Recentes resultados obtidos por nosso grupo demonstram que a fagocitose, por CD, de células apoptóticas infectadas resulta também na produção de altos IL- 1 e PGE2. A presença destes mediadores solúveis foi capaz de induzir a diferenciação de células Th17, in vitro, no entanto, a inibição da síntese de PGE2, pelo tratamento com inibidor não seletivo da COX (Indometacina), resultou no aumento da porcentagem destes linfócitos. Neste estudo foi avaliado o efeito da fagocitose de células apoptóticas infectadas com Escherichia coli (CA+Ec) na diferenciação de células Th17 in vivo e o efeito de PGE2 neste processo. A instilação de animais com CA+Ec, induziu a produção das citocinas IL-6, IL-1β e TGF-β no pulmão, o que sugere que a presença de CA+Ec é capaz de gerar um microambiente favorável para induzir a diferenciação Th17. A instilação de CA+Ec promoveu a diferenciação de células Th17, assim como a produção de IL-17. Porém, o tratamento com inibidor de COX resultou no aumento na porcentagem e no número de células Th17 no pulmão. A presença destas células resultou no aumento na porcentagem de neutrófilos no tecido pulmonar que parece refletir na diminuição da carga bacteriana recuperada do pulmão, quando comparado com animais que não receberam o tratamento. Assim, o conjunto destes resultados sugere que a fagocitose de CA+E. coli promove a diferenciação de células Th17. No entanto, a secreção de PGE2, pela fagocitose destas CA+Ec suprime a diferenciação e/ou migração de células Th17 para o pulmão, levando a inibição do recrutamento de neutrófilos e aumento da suscetibilidade às infecções pulmonares. The phagocytosis of infected-apoptotic cells (iAC) by dendritic cells (DC) induces the production of TGF-β, IL-6 and IL-23, providing a microenvironment to Th17 cell differentiation. Recent data obtained in our group showed that the phagocytosis of infected- apoptotic cells by CD also results in high levels of IL-1β and PGE2. The presence of these soluble mediators was able to induce the differentiation of Th17 cells, in vitro. However, the inhibition of PGE2 synthesis, by non-selective COX inhibitor (indomethacin), result the increase of percentage of Th17. In this study, it was evaluated the effect of phagocytosis of infected-apoptotic cells (AC+E. coli) during the Th17 cell differentiation, in vivo, and the effect of PGE2 in this process. The inoculation of AC+ Ec (in.) into lung induced the production of IL-6, IL-1β and TGF-β in lung, suggesting that the presence of AC+Ec is able to induce a microenvironment favorable to Th17 cell differentiation. The instillation of AC+Ec induced the differentiation of Th17 cells. However, the treatment of the animals with COX inhibitor resulted in an increase in the percentage, and number, of Th17 cells in the lung. The presence of these cells increased in the percentage of neutrophils in the lung and that apparently reflect in bacterial clearance from the lung, compared to animals that received no treatment. Taken all together, the phagocytosis of AC+Ec promotes the Th17 cell differentiation. However, the production of PGE2 by efferocytosis suppresses the differentiation and / or migration of Th17 cells to the lungs, impair the recruitment of neutrophils and increase the susceptibility to lung infections. FAPESP: 11/17611-7

A Giardia lamblia (G. lamblia ) é o agente causador da Giardíase, a qual é uma doença com alta prevalência no mundo, incluindo países desenvolvidos, constituindo a parasitose mais frequente. Por outro lado, as células fagocíticas e citocinas têm funções importantes na doença, mas os mecanismos de interação entre estes componentes durante infecções por protozoários ainda não estão totalmente elucidados. Desta forma o objetivo deste estudo foi analisar em sobrenadante de culturas de células mononucleares (MN) e G. lamblia: 1) os níveis das citocinas IFN- e TGF-, IL-4 e IL-17; 2) a atividade funcional de células MN tratadas por estas citocinas na presença do parasito. Foram coletadas amostras de sangue de 60 doadores voluntários sadios para obtenção das células MN. Foram avaliadas no sobrenadante de cultura de células MN e G. lamblia as concentrações de IFN-, TGF, IL-4 e IL-17, a liberação de ânion superóxido, fagocitose, atividade microbicida, a apoptose e a liberação de cálcio intracelular pelas células MN. Observou-se que no sobrenadante de cultura de células MN e G. lamblia todas as citocinas avaliadas foram detectadas. As células MN, independente do tipo de citocinas, na presença de G. lamblia aumentaram a liberação do ânion superóxido. Os índices de fagocitose, atividade microbicida e os índices de apoptose foram maiores quando as células MN foram tratadas pelas citocinas. Os maiores índices microbicidas e de morte por apoptose foram observados quando as células MN foram tratadas pelo TGF. As citocinas IFN- e IL-4 aumentaram a liberação de cálcio intracelular por parte dos fagócitos MN. Estes dados sugerem que as citocinas desempenham um papel benéfico para o hospedeiro, por ativação de células MN na presença de G.lamblia, e que ocorre a morte da mesma durante o processso de fagocitose. A modulação da atividade funcional de fagócitos MN por IFN-, TGF-, IL-4 e IL-17 pode ser fundamental no controle da Giardíase. G. lamblia is the agent that causes the giardiasis, which is a disease with significant prevalence in the world, including developed countries, and the most common parasitic disease. Phagocytic cells and cytokines appear to be important in giardiasis, but the IFNluence of these cells and cytokines in protozoan IFNections is not totally elucidated. The aim of this study was to analyze the supernatant of cultures of MN cells with G. lamblia to determine: 1) the levels of the cytokines IFN-, TGF, IL-4 and IL-17; 2) the functional activity of MN cells after incubation with cytokines. Blood samples were collected from 60 volunteer donors healthy to obtain leukocytes. The levels of IFN- , TGF - , IL-4 and IL-17 were quantified in cell culture supernatants -trophozoite. The superoxide release, phagocytosis, microbicide activity, apoptosis and intracellular calcium release were analyzed during interactions of MN phagocytes and G. lamblia. It was observed that in culture supernatant of MN cells and G. lamblia were detected all the cytokines evaluated. The MN cells, regardless of kind of cytokines, in the presence of G. lamblia increased superoxide release. The phagocytosis, microbicide activity and apoptosis rates were higher when the MN phagocytes were treated by cytokines. The highest microbicidal and apoptosis rates were observed when the MN cells were treated by TGF-. The cytokines IFN- and IL-4 increased the release of intracellular calcium by MN phagocytes. The results suggest that cytokines play a beneficial role to the host by activation of MN cells for G. lamblia. They also suggest that during phagocytosis is occur death of G. lamblia the modulating the functional activity of phagocytes MN IFN-, TGF-, IL-4 and IL-17 appear to be essential in controlling the Giardiasis.

Made available in DSpace on 2015-12-10T14:22:52Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-05-15. Added 1 bitstream(s) on 2015-12-10T14:29:05Z : No. of bitstreams: 1 000851662_20160515.pdf: 427931 bytes, checksum: 4ef8d142c5c5234191158ab7c2efea52 (MD5) Bitstreams deleted on 2016-05-16T14:18:42Z: 000851662_20160515.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-05-16T14:19:23Z : No. of bitstreams: 1 000851662.pdf: 1696866 bytes, checksum: d81719395199b25212968ab82e23a88e (MD5) Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) A fagocitose de células apoptóticas é um processo dinâmico importante para a homeostase dos tecidos após injúria. Os macrófagos além de atuarem na remoção de células apoptóticas, também colaboram na defesa contra microrganismos. Existem ao menos duas populações de macrófagos classificadas como macrófagos M1 (pró-inflamatórios) e macrófagos M2 (anti-inflamatórios). Estes leucócitos diferem quanto ao fenótipo e funções efetoras dependendo, primordialmente, do microambiente e dos microrganismos com que interagem no tecido. Em uma situação de injúria pulmonar estéril (inalação de agentes tóxicos), há acúmulo de células apoptóticas sem a presença de agente microbiano. Por outro lado, durante uma infecção pulmonar bacteriana, ocorre intensa migração de células para o local da infecção na tentativa de conter a proliferação bacteriana, resultando em intenso acúmulo de células apoptóticas infectadas neste tecido. Portanto, nesse trabalho foi avaliado, in vitro e in vivo, o efeito da fagocitose de células apoptóticas infectadas (AC-Sp) ou estéreis (AC) na polarização de macrófagos M1/M2, bem como suas funções efetoras, e o efeito da PGE2 nesse contexto de eferocitose. Macrófagos M0 co-cultivados com AC ou AC-Sp apresentam um fenótipo intermediário entre M1 e M2, com secreção de altos níveis de IL-6, TNF-α, PGE2, TGF-β e NO e a expressão de genes relacionados ao perfil M1, iNOS, e ao perfil M2, Arginase 1. Além disso, macrófagos M0 cultivados com AC ou AC-Sp, apresentam supressão da função microbicida quando desafiados com S. pneumoniae. A presença de PGE2 dirige a polarização de macrófagos M0 a um perfil M2 e a presença de inibidores de COX promove a reversão do fenótipo de polarização destes macrófagos. Os resultados in vivo demonstram que a instilação de AC ou AC-Sp promove distintos microambientes no pulmão destes animais, que influenciam na resolução da infecção..... The phagocytosis of apoptotic cells is dynamic and crucial for homeostasis after injury. Macrophages act on the clearance of apoptotic cells and collaborate with defense against microorganisms. There are at least two distinct macrophage populations classified as M1 macrophages (pro-inflammatory) and M2 macrophages (anti-inflammatory). Both cells differ on the state of polarization and effectors function depending primarily on the microenvironment and microorganisms that interact into the tissue. In a situation of sterile lung injury (inhalation of toxic agents), there are accumulation of apoptotic cells without the presence of pathogen. On the other hand, during a bacterial pulmonary infection there is intense cell migration to the infection site in an attempt to impair bacterial growth, resulting in a large accumulation of infected-apoptotic cells in the tissue. Therefore, this study has evaluated in vitro and in vivo, the effect of the phagocytosis of infected-apoptotic cells (AC-Sp) or sterile cells (AC) on the polarization of M1/M2 macrophages, as well as in their effector functions and the effect of PGE2 in the context of efferocytosis. M0 macrophages co-cultured with AC or AC-Sp show an intermediate phenotype between M1 and M2 with high secretion levels of IL-6, TNF-α, PGE2, NO and TGF-β, and gene expression profile related to M1, iNOS, and M2, arginase 1. Furthermore, M0 macrophages cultured with AC or AC-Sp show strong suppression of the macrophage microbicidal function when challenged with S. pneumonia. The presence of PGE2 drives the polarization of M0 macrophages to a M2 profile, and in the presence of COX inhibitors, it reverses the polarization of this macrophage phenotype. The in vivo results demonstrate that the instillation of AC or AC-Sp promotes distinct microenvironments in the lungs of these animals, which influence the resolution of the infection. All these results suggest that the presence of AC or AC-Sp promotes, ...

CNPQ O Rhipicephalus sanguineus (Acari: Ixodidae) é um ectoparasita de cães domésticos e possui grande importância médica e veterinária por está associado à transmissão de inúmeros patógenos, entre eles existe a suspeita do mesmo está associado à transmissão da Leishmania infantum. O objetivo do presente estudo foi avaliar a resposta imune inata celular e humoral através da caracterização morfológica e ultraestrutural de hemócitos, avaliação da dinâmica hemocitária no 1º, 2º e 5º dia após infecção (dpi) com L. infantum, fagocitose com 1º dpi, atividade da fenoloxidase no 1º, 2º e 5º dpi, produção de óxido nítrico no 1º, 2º e 5º dpi, expressão gênica da denfesina e Glutationa S-transferase em Rh. sanguineus no tempo 0 e no 1º, 2º, 5º e 7º dpi, além de avaliar a permanência do parasita no tempo 0 e nos dias 1, 2, 5 e 7 após a infecção com L. infantum (dpi). Foram identificados cinco tipos celulares, prohemócitos, plasmatócitos, granulócitos, esferulócitos e adipohemócitos na hemolinfa do Rh. sanguineus. A partir da contagem total e diferencial dos hemócitos circulantes na hemolinfa de fêmeas de Rh. sanguineus a média do número total de hemócitos no grupo inoculado com L. infantum apresentou-se significantemente elevado (P < 0.001), no 1° e 2° dpi em relação ao grupo controle. Na contagem diferencial de hemócitos observou-se que a percentagem de plasmatócitos e granulócitos no grupo infectado, aumentou significantemente no 1°, 2° e 5° dpi (P < 0.001). Nos ensaios de fagocitose observou-se que plasmatócitos e granulócitos foram capazes de realizar fagocitose de partículas de látex e promastigotas de L. infantum, no 1dpi. A produção de NO aumentou significativamente (P < 0.05) no 2° e 5° dpi e a atividade da PO apresentou aumento significativo (P < 0.05) no 5° dpi. A expressão do gene 18S ribossomal de L. infantum teve um aumento significativo (P < 0.05) no 2°, 5° e 7° após a infecção em relação ao tempo 0. A expressão da GST foi maior no 1º e 2º dpi e o gene defensina foi maior apenas no 5º dpi. Embora não existam estudos sobre a resposta do Rh. sanguineus frente a infecção com L. infatum, estes resultados sugerem, que após a infecção com L.infantum a resposta imune celular e humoral em Rh. sanguineus é ativada, porém mais estudos são necessários para avaliar o impacto dessa resposta no combate a infecção. The Rhipicephalus sanguineus (Acari: Ixodidae) is an ectoparasite of domestic dogs and has great medical and veterinary importance for being associated with the transmission of many pathogens, among them there is a suspicion of it is association with the transmission of Leishmania infantum. The aim of this study was to evaluate the innate cellular and humoral immune response by morphological and ultrastructural characterization of hemocytes, hemocyte dynamics evaluation, phagocytosis, phenoloxidase activity, nitric oxide production at the 1st, 2nd and 5th dpi, gene expression of denfesina and Glutathione S-transferase in Rh . sanguineus and on days 1, 2, 5 and 7 after infection with L. infantum and to evaluate the persistence of the parasite at time 0 and on days 1, 2, 5 and 7 after infection with L. infantum (dpi). Five cell types were identified, prohemocytes, plasmatocytes, granulocytes, and spherulocytes adipohemocytes in Rh. sanguineus hemolymph. From the total and differential counts of circulating hemocytes in the hemolymph of Rh. sanguineus females the average of total number of hemocytes in the group inoculated with L. infantum showed to be significantly higher (P

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Trypanosoma cruzi is the etiologic agent of Chagas disease. Due to its genetic diversity, species have been divided into six groups denominated Discrete Typing Units (DTU I to VI). The G strain belongs to T. cruzi I group and CL to T. cruzi VI. Extracellular amastigotes forms (EA) are considered important in maintaining the vertebrate host cycle. Studies concerning the difference of infectiveness and the characterization of immunologic susceptibility in parasites belonging to different groups are relevant so that therapies based upon immunological response may be efficient for all distinct phylogenetic groups. T. cruzi´s P21 protein has recently been characterized and its probable action in parasites internalization process into host cell was observed. To give continuity to the functional characterization of T. cruzi´s P21 employing its recombinant form (P21-His6) is of great relevance taking into account that these could in the future take part into the potential therapeutic goals. The objectives of this study were to analyze the immunological profile by T. cruzi infection, seeking to identify the differentiated performance of this response against G and CL strains and different forms of the parasite (metacyclic trypomastigotes or extracellular amastigotes); to analyze the differential tropism of CL and G strains during the acute and chronic infection; characterize the biological activity of P21 T. cruzi protein, trying to analyze its function to the parasite and performance in the host cell. We observed that extracellular amastigotes from G strain does not induce patent infection in vivo due to their high susceptibility to IFN-γ production early in infection; There were differences in tropism between the different strains, since during the kinetics infection, the CL strain was maintained preferably in the stomach, both in the acute and chronic phase and G strain remained in the stomach throughout the entire infection, but was also able to migrate into the heart tissue, particularly in chronic infection; The chemokine KC seems to play an important role in controlling the infection and may influence the course of infection, as well as the possible migration of parasites; the P21-His6 enhances phagocytosis and the remodeling of the actin cytoskeleton by binding to CXCR4 receptor and activate via PI3-k. Trypanosoma cruzi é o agente etiológico da doença de Chagas. Devido à ampla diversidade genética e fenotípica existente em T. cruzi, a espécie foi dividida em seis discretas unidades de tipagem (DTU), denominadas T.cruzi I a VI. A cepa G pertence ao grupo T.cruzi I e a CL a T.cruzi VI. Formas amastigotas extracelulares (AE) são consideradas importantes na manutenção do ciclo no hospedeiro vertebrado. Estudos quanto à diferença de infectividade e caracterização da suscetibilidade imunológica de parasitas pertencentes aos diferentes grupos mostram-se relevantes para que terapias baseadas na resposta imunológica sejam eficientes para todos os grupos filogeneticamente distintos. A proteína P21 de T. cruzi foi recentemente caracterizada e sua possível atuação no processo de internalização do parasito na célula hospedeira foi observada. Dar continuidade à caracterização funcional da P21 de T. cruzi por meio do emprego de sua forma recombinante (P21-His6) é de grande relevância, pois esta poderá futuramente figurar entre os potenciais alvos terapêuticos para o tratamento da doença de Chagas. Os objetivos desse trabalho foram analisar o perfil imunológico mediante a infecção por T. cruzi, buscando identificar a atuação diferenciada dessa resposta frente a duas cepas (G e CL) e formas distintas do parasito (tripomastigotas metacíclios ou amastigotas extracelulares); analisar o tropismo diferencial das cepas G e CL de T. cruzi durante a infecção aguda e crônica em camundongos; caracterizar a atividade biológica da proteína P21 de T. cruzi, buscando analisar sua função para o parasito e atuação na célula hospedeira. No presente trabalho mostra-se que amastigotas extracelulares da cepa G não induzem infecção patente in vivo devido a sua alta susceptibilidade à produção de IFN-γ no início da infecção. Houve diferença no tropismo entre as distintas cepas, durante a cinética de infecção, sendo que a cepa CL manteve-se preferencialmente no estômago, tanto na fase aguda quanto crônica, e a cepa G manteve-se no estômago no decorrer de toda a infecção, mas também foi capaz de migrar para o tecido cardíaco, principalmente no processo de cronificação. A quimiocina KC parece exercer um importante papel no controle da infecção, podendo interferir no curso da mesma, assim como na possível migração dos parasitos; a P21- His6 aumenta a fagocitose e a remodelação do citoesqueleto de actina, ao se ligar no receptor CXCR4 e ativar a via de PI3-k. Doutor em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

O câncer de pulmão é o tipo de câncer mais letal em todo o mundo, contabilizando 1.3 milhões de mortes anualmente. O câncer de pulmão de não-pequenas células (CPNPC) representa aproximadamente 85% dos casos diagnosticados. Apesar de o conhecimento da biologia molecular destes tumores ter aumentado muito, o prognóstico do CPNPC continua desfavorável, com uma sobrevida média de 10 meses. Um dos motivos deste mau prognóstico é a dificuldade relacionada à detecção precoce, de modo que a maioria dos pacientes diagnosticados apresenta estágios avançados. A falta de avanço clínico se dá muitas vezes pela dificuldade de compreender o microambiente que circunda o tumor, o qual está relacionado, entre outros fatores, à capacidade metastática e a resistência à quimioterapia. Nesse contexto, o estabelecimento e o avanço do processo neoplásico resultam em uma estimulação da resposta imunológica do hospedeiro contra o avanço tumoral. Uma das células recrutadas são os macrófagos, os quais desempenham um papel fundamental tanto na resistência tumoral, quanto na progressão da neoplasia. Essas células apresentam uma plasticidade celular de amplo espectro – a qual dificulta a análise da influência dessas células em relação a determinadas patologias - podendo, de acordo com o estímulo ambiental, apresentarem propriedades anti ou pró-inflamatórias. Essa plasticidade confere ao macrófago uma característica que o faz ser central no estabelecimento do microambiente tumoral. Nesse contexto, sabe-se que os agentes quimioterápicos, e outras moléculas, induzem a morte celular, principalmente, pelo processo apoptótico, sendo que a remoção dessas células e dos corpos apoptóticos é realizada pelos fagócitos, ocorrendo, assim, uma modulação do sistema imune, principalmente em relação aos macrófagos. Portanto, o presente trabalho tem por objetivo analisar a influência dos macrófagos e da apoptose na sobrevida de pacientes com CPNPC, verificar se a fagocitose de células apoptóticas advindas de diferentes indutores apresentam diferentes capacidades imunomodulatórias sobre o macrófago e buscar ferramentas que auxiliem na caracterização dos fenótipos dos macrófagos. Para tanto, inicialmente, realizou-se uma meta-análise de dados clínicos correlacionando macrófagos e apoptose com o desfecho clínico de pacientes com CPNPC. Em seguida, induziu-se a apoptose na linhagem de CPNPC A549 com os indutores cisplatina (droga padrão-ouro na clínica), taurina cloramina (um oxidante biológico produzido por macrófagos e neutrófilos) e ácido bromopirúvico (um inibidor metabólico), sendo as células apoptóticas postas em contato com os macrófagos. Para verificar a modulação dos macrófagos, analisou-se as citocinas liberadas. Por fim, através de bioinformática e RT-PCR, criaram-se duas assinaturas gênicas de macrófagos. Nossos resultados mostraram que há discrepâncias quanto ao papel dos macrófagos e da apoptose no desfecho dos pacientes com CPNPC. Nas análises in vitro, observamos que existem diferenças entre a eficiência da fagocitose das células apoptóticas advindas do tratamento com taurina cloramina quando comparada aos demais tratamentos. Observou-se também que ocorre uma modulação diferencial nos macrófagos que fagocitaram as células apoptóticas advindas do tratamento com cisplatina e taurina cloramina. Por fim, as assinaturas gênicas criadas conseguiram caracterizar de forma robusta não somente os fenótipos dos macrófagos in vitro, mas também seus fenótipos em determinados contextos clínicos, além da capacidade de correlacionar genes com o desfecho de determinadas patologias. Lung cancer is the most lethal type of cancer in the world, and is responsible for 1.3 million deaths annually. Non small cell lung cancer represents approximately 85% of all cases diagnosed. Even though the knowledge of the molecular biology of these tumors has increased, the prognosis of NSCLC continues to be unfavorable, with an overall survival of 10 months. One reason for this difficulty is the poor prognosis associated with early detection, since most of the patients diagnosed with this pathology have advanced stages. The lack of clinical progress occurs often due to the difficulty of understanding the microenvironment surrounding the tumor, which is related with metastatic capacity and resistance to chemotherapy. In this context, the establishment and advancement of the neoplastic process result in a stimulation of the host immune response against tumor. One of recruited immune cells are the, which plays a key role in tumor resistance or progression. These cells exhibit a broad spectrum of cellular plasticity (which results in the difficulty to correlate these cells in human pathologies) may, depending on the environmental stimulus, presenting anti or pro-inflammatory properties. This plasticity confers to macrophage a key role in the establishment of tumor microenvironment. It is known that chemotherapy agents, and other molecules induce cell death mainly by apoptosis, and the removal of these cells and apoptotic bodies by phagocytes modulates the immune system, especially macrophages. Therefore, this study aims to analyze the influence of macrophages and apoptosis in patients’ outcome and survival in NSCLC, to verify whether the phagocytosis of apoptotic cells obtained from different inducers had to capacity to modulate differently the macrophages and lastly found tools that can help in the characterization of macrophges’ phenotypes. For that, firstly was made a meta-analysis of clinical data correlating macrophages and apoptosis with clinical outcome of patients with NSCLC. Further, apoptosis was induced in NSCLC cell line A549 with the inducers Cisplatin (gold standard in clinic), Taurine Chloramine (physiological oxidant) and Bromopyruvic Acid (metabolic inhibitor), and the apoptotic cells were putted in contact with macrophages. To verify the macrophages’ modulation, we analyzed the cytokines released. Lastly, using bioinformartics and RT-PCR, we constructed two gene signatures of macrophages. Our results showed discrepancies concerning the role of macrophages and apoptosis in NSCLC patients’ outcome. In in vitro analysis, we observed that the phagocytosis efficiency of apoptotic cells induced by Taurine Chloramine was different when compared to the others treatments. We also observed a differential modulation of macrophages that phagocytosed the apoptotic cells obtained from the treatment of Cisplatin and Taurine Chloramine. Finally, the gene signatures created were capable to characterize robustly not only the macrophages’ phenotypes in vitro, but also the phenotypes in clinical contexts, predicting the correlation between genes expression and diseases outcomes.

Submitted by Neusa Fagundes (neusa.fagundes@unioeste.br) on 2018-03-12T14:24:25Z No. of bitstreams: 2 Renan_Melo2014.pdf: 1848176 bytes, checksum: 102deb99625acf4c43610c22cb0234f3 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Made available in DSpace on 2018-03-12T14:24:25Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Renan_Melo2014.pdf: 1848176 bytes, checksum: 102deb99625acf4c43610c22cb0234f3 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2014-12-09 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES Ganoderma australe is a Basidiomycete species responsible for the delignification process of the organic matter known to cause "white rot" in certain species of trees. Cytochemical studies have shown that the cell wall of fungi polysaccharides has (13)- β-glucans, (16)-β-glucans type and other complex polysaccharides. Currently, it has been highlighted that the β-glucans are polysaccharides that produce higher effects as modulators of biological functions. In previous studies, the fungus G. australe has been studied regarding the composition of the cell wall polysaccharide. SK5 polysaccharide fraction was obtained after freeze-thawing of the aqueous extraction with KOH 5%. Monosaccharide composition of SK5 fraction revealed by Gas chromatography–mass spectrometry (GC-MS) showed glucose is predominant (81.3%), with presence of other sugars (mannose, arabinose, xylose, rhamnose, fucose and galactose) at concentration of less than about 3% each. The nuclear magnetic resonance of this fraction proved to be a β-glucan with glycosidic links (1→3)-β type and probably replaced in 4-O. In this study, the biological effect of SK5 polysaccharide fraction extracted from the fungus G. australe has been evaluated in vitro cell culture of peritoneal macrophages isolated from Swiss mice. The biological effect was assessed for toxicity and cell activation, nitric oxide, cytokines (TNF-α, IL-6), superoxide anion (production and scavenging capacity) and the ability to stimulate phagocytic activity. Cell viability was affected, with approximately 29% reduction with 1.0 mg / mL and 35.5% reduction with 2.5 μg/ml SK5. There was no change in nitric oxide production, TNF-α or superoxide anion concentrations between 0.1 μg/mL and 1.0 μg/mL. The scavenging ability of superoxide anion was also not detected. There was an increase in IL-6 by about 111% with 1.0 μg/mL. In regarding to phagocyte activity was increased in all concentrations examined obtaining 52.3% with 0.25 μg/mL of polysaccharide. The results indicate that (13)-β- glucan isolated from G.australe can be classified as biological response modifier (BRM). Ganoderma australe é uma das espécies de basidiomicetos responsáveis pelo processo de deslignificação da matéria orgânica, conhecido por causar a “podridão branca” em algumas espécies de árvores. Estudos citoquímicos demostraram que a parede celular dos fungos possui polissacarídeos do tipo β (13)-glucanas, β (16)-glucanas e outros polissacarídeos complexos. Atualmente, tem-se destacado que as β-glucanas são os polissacarídeos que produzem efeitos mais intensos como moduladores das funções biológicas. Em estudos anteriores desenvolvidos em nosso laboratório, o fungo G. australe foi estudado quanto à composição polissacarídica da parede celular. A fração polissacarídica SK5 foi obtida após gelo-degelo da extração aquosa com KOH 5%. A composição monossacarídica da fração SK5 revelada por Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massa (GC-MS) mostrou que glicose é predominante (81,3%), com a presença de outros açúcares (manose, arabinose, xilose, ramnose, fucose e galactose) em concentração inferior a cerca de 3% cada um. A ressonância magnética nuclear desta fração comprovou ser uma β-glucana, com ligações glicosídicas do tipo β- 1→3 e provavelmente substituídas em 4-O. Neste trabalho, o efeito biológico da fração polissacarídica SK5 extraída do fungo G. australe foi avaliado in vitro em cultura de células de macrófagos peritoneais isoladas de camundongos Swiss. Foi analisado o efeito biológico quanto à toxicidade e ativação celular, a produção de óxido nítrico, citocinas (TNF-α, IL-6), ânion superóxido (produção e capacidade sequestradora) e a capacidade de estimular a atividade fagocítica. A viabilidade celular foi significativamente afetada, com cerca de 29% de redução com 1,0 μg/mL e 35,5% de redução com 2,5 μg/mL de SK5. Não houve alteração na produção de óxido nítrico, TNF-α ou de ânion superóxido nas concentrações entre 0,1 μg/mL e 1,0 μg/mL. A capacidade sequestradora de ânion superóxido também não foi constatada. Houve aumento na produção de IL-6 em cerca de 111% com 1,0 μg/mL. Em relação à atividade fagocítica houve aumento em todas as concentrações analisadas, chegando a 52,3% com 0,25 μg/mL do polissacarídeo. Os resultados obtidos indicam que a β (13)-glucana isolada de Ganoderma australe pode ser classificada como modificadora de resposta biológica (MRB).

Made available in DSpace on 2015-04-09T12:28:17Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-03Bitstream added on 2015-04-09T12:47:49Z : No. of bitstreams: 1 000814427.pdf: 485988 bytes, checksum: 4d7a0c4b4d27bc7139fd4331cc293653 (MD5) Estudos sobre os possíveis efeitos de beta-glucanos sobre a resposta imune têm sido realizados há muito tempo, pois a imunomodulação que eles podem causar pode auxiliar na resistência a doenças e, até mesmo, tumores. Assim sendo, foram realizados dois experimentos para avaliar a ação de um beta-glucano derivado da parede celular de levedura sobre parâmetros imunológicos na espécie canina. O experimento 1 avaliou a ação ex vivo do composto, leucócitos caninos receberam 3 doses de beta-glucano e foi encontrado que a substância estimulou, de maneira dose-dependente, a produção de espécies reativas do oxigênio e nitrogênio, em neutrófilos e monócitos. O experimento 2 estudou a ação da substância sobre parâmetros imunes de cadelas submetidas a uma situação de imunossupressão: anestesia e cirurgia de castração. Foram utilizadas 28 cadelas adultas de diferentes raças e divididas em três grupos: controle (CT – n=10), suplementadas com 0,1% de beta-glucano na dieta extrusada (BG-E – n=9) e suplementadas com a mesma dose, mas administrada em cápsulas (BG-C – n=9). As avaliações foram realizadas em quatro períodos, 14 dias antes da cirurgia, pré-operatório imediato, pós-operatório imediato e 14 dias após a cirurgia. Os testes realizados para se investigar os efeitos deste nutracêutico foram avaliação hematológica, imunofenotipagem de leucócitos periféricos, avaliação de fagocitose de leucócitos periféricos, dosagem de citocinas em sobrenadante de cultura de células mononucleares, determinação da produção de intermediários reativos do oxigênio (H2O2) e nitrogênio (NO), e dosagem de proteína-C reativa sérica. O tratamento BG-C levou a uma maior porcentagem de fagocitose de monócitos. Apenas as cadelas do grupo controle tiveram uma tendência a aumento da concentração de proteína C-reativa após a cirurgia. O procedimento cirúrgico foi capaz de alterar o número de células e função ... Studies evaluating the effects of beta-glucans on the immune response have been made long ago; because of the immunemodulation that they cause can lead to increase resistance to infections and even to tumors. Thus, we conducted two experiments to evaluate the action of a yeast-derived beta-glucan in dogs. In the experiment 1 the ex vivo action was studied, canine leukocytes were treated with 3 different doses of beta-glucan and the results showed that the production of oxygen and nitrogen reactive species by neutrophils and monocytes was stimulated in a dose-dependent manner. In the experiment 2 the action of beta-glucan on immune parameters of bitches undergoing ovary-hysterectomy was evaluated, as a situation of immunosuppression. Twenty-eight bitches of different breeds were divided into three groups: control (CT – n=10), 0.1% beta-glucan in the extruded diet (BG-E – n=9) and supplemented with the same dose, but administered in capsules (BG-C – n=9). Evaluations were performed in four periods, 14 days before the surgery, immediate preoperative and postoperative and 14 days after the surgery. The tests performed included complete blood count, evaluation of leukocyte subsets, phagocytosis test, production of cytokines in supernatant of cell culture, production of oxygen and nitrogen reactive species and serum C-reactive protein. BG-C treatment lead to higher percentage of phagocytosis by monocytes. Only the control group tended to increase the concentration of C-reactive protein after the surgery. Surgical procedure was capable of changing the number of cells and their function. In conclusion, beta-glucan acted on the immunity considering the presented models