Search

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES Nas últimas décadas o interesse biológico em compreender a regulação gênica, tem levado a descobertas de genes tumorais com expressões diferenciadas em subgrupos de pacientes. Estes genes possuem um perfil bimodal de distribuição dos valores de expressão, o que têm despertado a atenção para investigar os padrões de desenvolvimento e de sua funcionalidade. Para melhor compreender o padrão bimodal destes genes, o objetivo principal do trabalho foi identificar grupos distintos de pacientes em determinado tipo de tumor, que apresentassem níveis baixo e alto da expressão para o mesmo gene, associados a um melhor ou pior prognóstico de sobrevida do câncer. Desenvolvemos um método que seleciona genes candidatos ao padrão de bimodalidade a partir da função densidade de probabilidade dos valores de expressão. Analisamos 25 tipos de tumor disponíveis no The Cancer Genome Atlas (TCGA), à realizamos análise de sobrevivência usando informações clínicas extraídas do cBioPortal for Cancer Genomics. Utilizamos os dados de expressão em Fragments by Exon Kilobase per Millions of Mapped Fragments (FPKM) para 24.456 genes, e encontramos nos 25 tipos de tumores 554 genes bimodais únicos, dos quais 46 apresentaram expressão bimodal em mais de um tipo de câncer, com maior prevalência no cromossomo Y. Os tumores KIRC, KIRP, LGG, SKCM, THCA e THYM apresentaram amostras consistentes quanto ao prognóstico de sobrevida com p-valor ≤ 0,01. O método mostrou-se eficiente em reduzir os níveis de variabilidade interna dos grupos, principalmente quando analisamos os dados pelo subtipo de câncer. Como contribuição apresentamos um método com o código livre, que possibilita reduzir os níveis de variabilidade interna dos grupos e que relaciona o padrão de expressão bimodal com o prognóstico de sobrevida. Assim, acreditamos que a utilização do método poderá ser útil na avaliação do padrão bimodal de expressão gênica e na descoberta de novos biomarcadores clínicos para diferentes tipos de câncer. In the last decades the biological interest in understanding gene regulation has led to the discovery of tumor genes with differentiated expression in subgroups of patients. These genes have a bimodal profile of expression value distribution, which has raised attention to investigate the patterns of development and their functionality. To better understand the bimodal pattern of these genes, the main objective of the work was to identify distinct groups of patients in a given tumor type, who had low and high levels of expression for the same gene, associated with a better or worse cancer survival prognosis. We developed a method that selects candidate genes for the bimodality pattern from the probability density function of the expression values. We analyzed 25 tumor types available in The Cancer Genome Atlas (TCGA), à we performed survival analysis using clinical information extracted from cBioPortal for Cancer Genomics. We used Fragments by Exon Kilobase per Millions of Mapped Fragments (FPKM) expression data for 24,456 genes, and found in the 25 tumor types 554 unique bimodal genes, of which 46 showed bimodal expression in more than one cancer type, with higher prevalence on the Y chromosome. The tumors KIRC, KIRP, LGG, SKCM, THCA and THYM showed consistent samples regarding survival prognosis with p-value ≤ 0.01. The method proved efficient in reducing the levels of internal variability of the groups, especially when analyzing the data by cancer subtype. As a contribution, we present a method with a free code that makes it possible to reduce the levels of internal variability of the groups and that relates the bimodal expression pattern with the survival prognosis. Thus, we believe that the use of the method may be useful in the evaluation of the bimodal pattern of gene expression and in the discovery of new clinical biomarkers for different types of cancer.

Made available in DSpace on 2020-12-02T09:04:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 final9542.pdf: 110178 bytes, checksum: 716365c0f1d3224b011238cd740bc5df (MD5) Previous issue date: 2020

Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias, especialidade Produção Animal As alterações climáticas em curso têm induzido elevações globais de temperatura e uma escassez de recursos de água que tendem a atingir regiões tropicais e de clima temperado. Estas alterações ambientais têm um impacto significativo nas produções agrárias, em particular nas que exigem o consumo de volumes significativos de água e de energia, como a produção de leite. Estes factos têm induzido estudos genómicos da adaptação ao stress abiótico de plantas e animais nomeadamente relativos à produção de leite nas regiões temperadas (região Mediterrânea) e tropicais. No entanto poucos estudos têm sido feitos relativamente à adaptação genética e fisiológica da glândula mamária a condições de stress abiótico em ambientes tropicais. O nosso trabalho pretende estudar a eventual aclimatização de animais de raça Holstein ao ambiente tropical com particular incidência nos perfis genómicos da glândula mamária, comparando-os com animais de 2 grupos genéticos diferentes e com animais da raça Holstein submetidos a ambientes temperados. Para este objectivo identificamos expressões genéticas diferenciais, através de microarrays e PCR em tempo real, da glândula mamária dos animais em experiência. O trabalho foi dividido em dois estudos. No primeiro utilizaram-se vacas lactantes de três grupos genéticos (Holstein Brasil, Gyrolando e Gyr) submetidos a ambientes tropicais, e sob as mesmas condições de maneio e dieta. Foram identificados 14 genes com expressão diferencial na glândula mamária de pelo menos um dos três grupos associados a funções de desenvolvimento da glândula mamária, tolerância ao stress térmico e composição do leite. No segundo estudo foram utilizadas vacas Holstein em dois grupos experimentais, sendo um relativo a um ambiente tropical (Brasil) e outro a um ambiente temperado (Portugal). Os dois grupos em experiencia foram submetidos aos mesmos sistemas de maneio e dietas com mesmo nível nutricional. Identificaram-se neste estudo 12 genes com expressão diferencial nos dois grupos experimentais relativos à composição do leite, desenvolvimento da glândula mamária e tolerância ao stress térmico. Conclui-se dos dois estudos e sem prejuízo do seu aprofundamento, que o grupo Holstein mantidos em condições tropicais de exploração apresentaram perfis compatíveis com um processo de aclimatização a ambientes tropicais tendo sido identificados transcritos com função relevante neste processo. ABSTRACT - Ongoing climate change is inducing global temperature increases and a shortage of water resources which tends to reach temperate and tropical regions. These environmental changes have a significant impact on agricultural production, particularly the ones requiring the consumption of significant amounts of water and energy, as milk production does. These facts have induced genomic studies of adaptation to abiotic stress of plants and animals namely regarding increased of milk production in temperate (Mediterranean region) and tropical regions. However few studies have been made on the genetic and physiological adaptation of the mammary gland to abiotic stress conditions concerning tropical environment. Our study aims at studying the eventual acclimatization of Holstein animals to tropical environment with specific incidence of mammary gland genomic profile, comparing it with two different genetic groups and with Holstein bovines submitted to temperate environments. For this purpose we identified differential gene expressions, through microarray and real-time PCR, within the mammary gland of experimental animals. Our work was divided in two studies. On the first one three genetic groups (Holstein Brasil, Gyrolando and Gyr) lactating bovines submitted to tropical environment and to the same diet and managing conditions were used. We identified 14 genes with differential expression in the mammary gland in at least one of the three groups, associated with the function of mammary gland development, thermal stress tolerance and milk composition. In the second study, Holstein cows were used in two experimental groups, one concerning tropical environment, (Brazil), and the other regarding temperate climate (Portugal). All animal had same management system and nutritional levels. In this study we identified, within the two experimental groups, 12 genes with differential associated with milk composition, mammary gland development and heat stress tolerance. From these studies and without neglecting further work, we concluded that the Holstein breed animals kept in tropical conditions of production, presented profiles which are compatible with a acclimatization process to tropical environment. Transcripts that can have a relevant role in this process were identified.

Tese de doutoramento em Ciências da Saúde, na especialidade de Medicina Dentária, apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra A inflamação, ou processo inflamatório, é uma reação do organismo a uma infeção/corpo estranho, ou lesão dos tecidos. Em caso de doentes com defeitos ósseos importantes resultantes de doença ou traumatismo, nos quais pretendemos prevenir problemas funcionais e estéticos, aliados à ausência de osso no complexo maxilo-facial, usam-se materiais de substituição óssea. Assim como acontece com a generalidade dos biomateriais, sabe-se que há uma panóplia de acontecimentos que ocorrem em consequência da implantação dos materiais de enxerto num organismo vivo. De entre estes acontecimentos, destaca-se a inflamação aguda e a inflamação crónica. O objetivo deste trabalho consistiu em estudar a reação inflamatória pós implantação muscular de dois materiais de substituição óssea: um xeno-enxerto de origem porcina (nome comercial Osteobiol Gen-Os®) e uma hidroxiapatite sintética (nome comercial Bonelike®), usados normalmente na clínica dentária. Efetuou-se uma avaliação histológica e de expressão genética, esta relativa ao número de transcritos de cinco genes alvo distintos, importantes no processo inflamatório (IL-1β, IL-6, TNF-α, CCL2 e CCL3). Previamente ao estudo in vivo da reação inflamatória, caracterizaram-se os materiais em termos de propriedades físico-químicas, uma vez que se sabe que essas propriedades influenciam de forma muito relevante a reação do sistema imunitário. Os biomateriais referidos foram caracterizados sob diversos pontos de vista: morfologia e distribuição do tamanho de partículas, área de superfície específica, de porosidade e tamanho de poros e densidade. A composição química e estrutura dos materiais foram estudadas por espetroscopia de infravermelhos (FTIR) e difração de raios X (XRD). Os materiais foram implantados nos músculos lombares de ratos Wistar e a resposta inflamatória foi avaliada através de análise histológica, uma semana (8 dias) após a implantação. Quanto à avaliação da expressão genética sistémica, procedeu-se à colheita de sangue no início da experiência e no momento da necropsia para todos os ratos, com o objetivo de avaliar alguns mediadores envolvidos na resposta inflamatória, neste caso específico os cinco genes alvo já referidos. A avaliação da expressão genética local foi realizada a partir do processamento de fragmentos musculares implantados com ambos os materiais separadamente. Os resultados mostraram que os dois enxertos são muito diferentes em praticamente todas as propriedades avaliadas. Enquanto o material xenógeno apresenta uma estrutura e uma composição similar à do osso natural, o material sintético é constituído por uma fase cristalina principal de hidroxiapatite e duas fases secundárias de fosfato tricálcio α- e β-. Os grânulos do material xenógeno, além de serem maiores, são irregulares e apresentam extremidades afiadas, enquanto os do material sintético são aproximadamente cilíndricos, com contornos arredondados e mais uniformes em tamanho. A resposta in vivo foi avaliada a partir dos infiltrados inflamatórios produzidos pelos materiais e revelou que, apesar de ambos os materiais não causarem inflamação grave, os grânulos do material sintético provocam uma reação inflamatória consistentemente mais intensa do que a desencadeada pelos grânulos do material xenógeno, particularmente no que diz respeito à produção de colagénio e formação de cápsula fibrosa. Relativamente à expressão genética, verificámos que os níveis de CCL2 e IL-1β se encontravam significativamente aumentados no sangue dos ratos implantados com o material sintético e com o material xenógeno, respetivamente. Os resultados para os níveis de transcritos de CCL3, IL-6 e TNF-α não mostraram diferenças estatisticamente significativas na análise sistémica. Na análise local, apresentam-se apenas resultados preliminares, mas os dados obtidos sugerem que o desempenho de ambos os materiais é semelhante, havendo maior produção de transcritos do que a nível sistémico, facto este que já era esperado. Os nossos resultados sugerem que os materiais de enxerto ósseo desencadeiam uma resposta sistémica por parte do hospedeiro, facto que é comprovado pelo aumento de mediadores inflamatórios no sangue periférico. O material sintético despoletou a formação de níveis significativamente mais elevados da expressão de CCL2, a quimiocina que ativa os macrófagos e que provoca uma polarização do sistema imunitário para Th2. O material xenógeno despoletou a formação de níveis mais elevados de expressão de IL-1β, citocina que é responsável pela ativação dos linfócitos. Desta forma parece haver uma resposta imunitária distinta para os dois biomateriais, em que cada um deles desencadeia a ativação de células com funções diferentes na resposta inflamatória. O material xenógeno, aos 8 dias, parece estar ainda numa fase inflamatória mais precoce do que acontece com o material sintético, durante o mesmo período temporal. Apesar de ter algumas limitações, este estudo é original e inovador e representa uma contribuição científica relevante na Medicina Dentária. Estudos como este podem trazer alguma luz para a compreensão da complexidade biológica e comportamento clínico dos substitutos ósseos. Inflammation is a physiological reaction to an infection or tissue injury, that also occurs when biomaterials are implanted in a living host. In patients with significant bone loss resulting from trauma or disease, in which we want to recover function and aesthetics, biomaterials are often used as bone graft materials. As already mentioned, its implantation triggers a series of biological events. Among these events are included acute and chronic inflammations, whose effects are important to us in order to understand better the impact they have in the host, depending on the material’s origin. The aim of this work was to study the inflammatory reaction originated after intramuscular implantation of two bone graft materials: a xenograft of porcine origin (commercial name Osteobiol™ Gen-Os) and a hydroxyapatite based synthetic material (commercial name Bonelike™) commonly used in the daily clinic by histological evaluation and gene expression analysis based in the transcripts number of five distinct target genes, crucial to the inflammatory process (IL-1β, IL-6, TNF-α, CCL3 and CCL2). Prior to the in vivo study, both biomaterials were characterized in terms of physicochemical properties, as it is generally known that these properties influence the way the immune system reacts and therefore the inflammatory reaction. The xenogenous and the synthetic biomaterials were characterized in terms of morphology, particle size distribution, specific surface area, porosity and pore size and density. The chemical composition and structure of the materials were accessed by Fourier-Transform Infrared Spectroscopy (FTIR) and X-ray Diffraction (XRD). The graft materials were then implanted in the lumbar muscles of Wistar rats and the inflammatory response was evaluated through histological analysis, after one week of implantation. For systemic gene expression analysis, blood was collected from the rat’s tail vein at the beginning of the experiment and at the moment of sacrifice of all rats, with the aim of quantifying some inflammatory mediators namely the five target genes already mentioned above. The local gene expression analysis was performed by processing lumbar muscle fragments implanted with both materials. The results showed that both grafts have quite different characteristics in almost all the evaluated properties. While the xenogenous material exhibits a structure and composition similar to the natural bone, the synthetic one is constituted by a main crystalline phase of hydroxyapatite and two secondary phases of α- and β-tricalcium phosphate. The xenogenous material granules, besides being larger, are irregular, and exhibit sharp-edged tips, while those of the synthetic material are approximately cylindrical, with round contours, and more uniform in size. The in vivo response evaluated from the inflammatory infiltrates revealed that although both implants did not cause severe inflammation, the synthetic granules elicit a consistently more intense inflammatory reaction than that triggered by the granules of the xenogenous material, particularly in terms of collagen production and formation of fibrous capsule. We concluded that CCL2 and IL-1β were significantly elevated in blood of mice implanted with the synthetic material and the xenogenous one, respectively. The transcript levels of CCL3, IL-6 and TNF-α did not show statistically significant differences in the systemic evaluation performed. In the local analysis we concluded that both biomaterials behave similarly, with production of higher levels of transcripts when compared to the systemic analysis through blood assessment, fact that was already expected. Our results suggest that bone graft materials trigger a systemic response from the host, fact that is proven by the increase of inflammatory mediators in the blood. The synthetic bone graft showed a Th2 polarization, triggering significantly higher levels of CCL2 expression, the chemokine that activates macrophages. The xenogenous bone graft triggered higher levels of IL-1β, the cytokine that is responsible for lymphocyte activation. Taken together, the in vivo data demonstrate that the inflammatory response appears to be different for the two biomaterials evaluated, with each one triggering the activation of different cell types. The xenogenous material, for an implantation time of 8 days, seems to be in an earlier phase of the inflammatory reaction when compared to the synthetic material, during the same time period. Despite some limitations, this study is unique and innovative and represents a significant scientific contribution in dentistry. Studies like this can bring some light to the understanding of complex biological and clinical behavior of bone graft materials.

Mestrado em Biologia Molecular e Celular A epigenética é um conjunto de processos hereditários e reversíveis que não alteram a sequência do DNA, alterando, no entanto a sua expressão. De entre os vários processos epigenéticos existentes destacam-se a metilação e a modificação de histonas. A metilação é um processo estável e que pode ser usado em diversos estudos, no âmbito forense, como a identificação de fluidos/tecidos, paternidade, estimativa de idade, discriminação de gémeos monozigóticos, identificação de causa e circunstâncias de morte e estudos neuropsiquiátricos. Em relação às metodologias usadas no estudo da metilação, destanca-se o método baseado na conversão por bissulfito. A epigenética ainda é um campo muito recente, por isso outros estudos devem ser desenvolvidos para que se tenha uma melhor caracterização do padrão de metilação humana, melhorar metodologias e controlar variáveis importantes, como fator ambiental. Conclui-se com base nos estudos observados que as técnicas baseadas em eventos de metilação do DNA, devem ser vistas como potenciais ferramentas em genética forense, destacando-se a previsão de idade como um bom exemplo desse mesmo potencial. The epigenetic is a group of heritable and reversible processes which do not alter the DNA sequence, altering, however its expression. Among the various epigenetic processes existing stand out methylation and histone modification. The methylation process is stable and that can be used in several studies under forensic such as identification of fluids/tissues, parenthood, age estimation, discrimination of monozygotic twins, identifying the cause and circumstances of death and neuropsychiatric studies. In relation to methods used to study the methylation destanca the method based on the conversion of bisulfite. The epigenetic field is still very new, so further studies should be developed in order to have a better characterization of the human methylation pattern, improving methodologies and control important variables such as environmental factor. The conclusion is based on studies observed that the techniques based on DNA methylation events should be seen potential valuable tools in forensic genetics, especially the prediction of age as a good example of this same potential.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-02-25Bitstream added on 2014-06-13T18:43:21Z : No. of bitstreams: 1 oliveira_jg_dr_sjrp.pdf: 1922822 bytes, checksum: 9be7ec21e759c3921cff2ec05792fab4 (MD5) O câncer gástrico é uma doença caracterizada como multifatorial associada a fatores ambientais e genéticos. A carcinogênese do estômago pode progredir de uma inflamação crônica da mucosa gástrica, resultante da infecção pela bactéria Helicobacter pylori que ativa a resposta inflamatória do hospedeiro. Portanto, selecionamos um grupo de polimorfismos presentes em genes de citocinas pró-inflamatórias (IL8, TNFA e TNFB), anti-inflamatórias (IL10 e IL-1RN) e receptores de reconhecimento de padrões moleculares associados aos microorganismos, denominados toll like receptor (TLR). Considerando a escassez e controvérsia de estudos de polimorfismos desses genes em câncer gástrico e seu envolvimento na carcinogênese de estômago, propôs-se avaliar, pelas técnicas de PCR- alelo específico ou PCR-RFLP, a associação dos polimorfismos TLR2 -196 a –174 del, TLR4 (+896 A/G rs4986790 e +1196 C/T rs4986791), IL-1RN VNTR, TNFB 252A/G (rs909253), TNFA (-308 G/A rs1800629 e –857 C/T rs1799724), IL8 (-251 T/A rs4073 e –845 T/C rs2227532) e IL10 (-592 C/A rs1800872) com risco de câncer gástrico, gastrite crônica e fatores de risco ambientais. Também, procurou-se associar, pela técnica de qPCR em tempo real, os polimorfismos com os níveis de expressão dos genes das citocinas, cujas variantes ocorrem em regiões promotoras (TNFA, IL8 e IL10). De modo geral, a genotipagem dos referidos genes foi realizada em amostras de DNA de 723 indivíduos (207 de câncer gástrico-CG; 276 de gastrite crônica-GC e 246 controles saudáveis-C), enquanto que nas análises de expressão gênica foi utilizado o cDNA de tecido gástrico proveniente de 45 pacientes com CG e 47 com GC. Observou-se que, os SNPs TLR4+1196C/T, TNFB+252A/G, TNFA-308G/A e IL8-251T/A não foram associados com o risco de gastrite crônica e câncer gástrico. Contudo, as freqüências dos genótipos TLR2 ins/del +del/... Gastric cancer is a multifactorial disease characterized as associated with environmental and genetic factors. The carcinogenesis of the stomach can progress to a chronic inflammation of the gastric mucosa, resulting from infection by the bacterium Helicobacter pylori that activates the inflammatory response of the host. Therefore, we selected a group of polymorphisms in genes of pro-inflammatory cytokines (IL8, TNFA and TNFB), anti-inflammatory (IL10 and IL-1RN) and receptor recognition of molecular patterns associated with microorganisms, the toll like receptors (TLR). Considering the scarcity and controversy of these polymorphisms studies in gastric cancer and their involvement in carcinogenesis of the stomach, this study proposed to evaluate, by PCR allele-specific or PCR-RFLP the association of polymorphisms TLR2 -196 to -174 del , TLR4 (rs4986790 and rs4986791), IL-1RN VNTR, TNFB 252A/G (rs909253), TNFA (rs1800629 and rs1799724), IL8 (rs4073 and rs2227532) and IL10 (rs1800872) with risk of gastric cancer, chronic gastritis and environmental risk factors. Also, we tried to associate, for the technique of real-time qPCR, polymorphisms with levels of expression of cytokine genes whose variations occur in the promoter region (TNFA, IL8 and IL10). Overall, the genotyping of these genes was performed on DNA samples from 723 individuals (207 gastric cancer-GC, 276 chronic gastritis-CG, and 246 healthy controls-C), whereas in the analysis of gene expression was used cDNA of gastric tissue from 45 patients with GC and 47 CG. It was observed that TLR4 SNPs +1196C/T, TNFB +252A/G, TNFA-308G/A and IL8-251 T/A were not associated with risk of chronic gastritis and gastric cancer. In the analysis of polymorphisms of toll like receptor, the frequencies of genotypes TLR2 ins / del + del / del and TLR4 +896 AG were significantly higher (p

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:03Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-12-17Bitstream added on 2014-06-13T20:14:35Z : No. of bitstreams: 1 jorge_yc_me_sjrp.pdf: 4700733 bytes, checksum: 1fa001424eaf0ffba4a8cdeb55c5fce5 (MD5) Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) No presente estudo foram investigados os níveis de expressão gênica e protéica da anexina-1 (ANXA1/AnxA1) e galectina-1 (LGALS1/Gal-1) na carcinogênese do estômago e associações com infecção pela Helicobacter pylori e o genótipo de virulência bacteriano cagA+. A análise foi realizada em 40 biópsias de mucosa gástrica com gastrite crônica (CG), 20 de câncer gástrico (GA) e 10 de mucosa normal (C), pelas técnicas de qPCR para quantificar os níveis de RNAm; imuno-histoquímica para caracterizar a expressão protéica na mucosa gástrica, e PCR para diagnóstico molecular da H. pylori e cepa cagA+. O estudo mostrou resultados inéditos quanto à expressão desses genes em gastrite crônica, ainda sem descrições na literatura. Foi demonstrada expressão relativa elevada do mRNA de ANXA1 em 80% dos casos de GA (média de 4,38 + 4,77) e em 90% dos casos de CG (média de 4,26 + 2,03), sem diferença significante entre os grupos (p = 0,33). O gene LGALS1 apresentou expressão elevada em 60% dos casos GA (média de 2,44 + 3,26) e, expressão constitutiva na CG (média de 0,43 + 3,13), mostrando, portanto, diferença significante entre os grupos (p < 0,01). A imuno-histoquímica revelou que as proteínas AnxA1 e Gal-1 não são expressas na mucosa normal. Ao contrário, durante o processo inflamatório de CG, imunomarcação citoplasmática positiva para a AnxA1 foi observada na porção basal do epitélio e estroma e, para Gal-1 a expressão foi constatada na porção apical e borda estriada do epitélio além do estroma. No adenocarcinoma tipo intestinal foi observada expressão citoplasmática em toda extensão epitelial e estroma tanto para a AnxA1 quanto para a Gal-1. Por outro lado, no tipo difuso imunomarcação positiva também foi observada no núcleo e membrana plasmática... In this study we investigated the levels of gene and protein expression of annexin-1 (ANXA1/Anxa1) and galectin-1 (LGALS1/Gal-1) in gastric carcinogenesis and associations with Helicobacter pylori infection and bacterial virulence genotype cagA+. The analysis was performed in 40 biopsies of gastric mucosa with chronic gastritis (CG), 20 with gastric cancer (GA) and 10 of normal mucosa (C), by the techniques of qPCR to quantify mRNA levels, immunohistochemistry to characterize the protein expression in gastric mucosa, and PCR for molecular diagnosis of H. pylori cagA+ strains. This is the first study regarding the expression of these genes in chronic gastritis. High ANXA1expression levels were demonstrated in 80% of GA cases (mean 4.38 + 4.77) and in 90% of GC cases (mean 4.26 + 2.03), with no significant difference between groups (p = 0.33). High LGALS1 gene expression was found in 60% of GA cases (average 2.44 + 3.26), and constitutive expression was found in CG (mean 0.43 + 3.13), showing therefore a significant difference between groups (p

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:14Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-10-05Bitstream added on 2014-06-13T19:21:42Z : No. of bitstreams: 1 mendiburu_cf_dr_sjrp.pdf: 1598889 bytes, checksum: aabab02662f822fd33d6f9740c1b5a84 (MD5) Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Famerp - Pab O subtipo Anemia Refrataria com Excesso de Blastos (AREB) representa cerca de 30% dos casos de Síndromes Mielodisplásicas (SMD). Os pacientes apresentam uma sobrevida media de poucos meses e risco alto de progressão para Leucemia Mielóide Aguda. As bases moleculares da doença não estão elucidadas. O objetivo do presente trabalho foi investigar a expressão gênica das células da medula óssea (MO) de pacientes com AREB. Foi gerada a primeira biblioteca SAGE de AREB, ao diagnostico, a partir de amostras de MO de seis pacientes. A comparação entre as bibliotecas AREB e normal evidenciou genes diferencialmente expressos. Cinco genes hipo-expressos, TXNIP, SGPL1, NUMB, FOXO e MSH2, e outros cinco hiper-expressos, MIF, RHOG, ICAM3, CHI3L1 e NOTCH1 foram selecionados para validação nas amostras coletadas ao diagnostico e dos mesmos pacientes após seis meses do diagnóstico, por PCR em tempo real. O padrão de expressão dos cinco genes hipo-expressos e dois hiper-expressos, MIF e RHOG foi confirmado, ao diagnostico, em 60% dos pacientes. Os genes NUMB e RHOG mostraram o mesmo padrão de expressão após seis meses de evoluçlão da doença, enquanto o gene. NOTCH1 apresentou hiper-expressão em duas amostras. Os dados aqui obtidos mostram que a criação da biblioteca SAGE de AREB permite o estudo de genes possivelemente envolvidos na origem e evolução da doença. As células da MO de pacientes com AREB apresentam um perfil de expressão gênica diferente das celulas de MO normal. Os genes TXNIP, SGPL1, NUM e, FOXO3, e MSH2, MIF e RHOG, estão hipo e hiper-expressos, respectivamente, ao diagnóstico. NUMB e RHOG mantêm seu padrão de expressão após seis meses, mas NOTCH1 parece aumentar sua expressão após este período.,Estes resultados devem ser confirmados em um número maior de amostras, no entanto, demonstram que a expressão alterada dos genes FOXO3, NUMB, SGPL1, TXNIP, MSH2... The refractory anemia with excess blast (RAEB) subtype represents approximately 30% of Myelodysplastic Syndrome (MDS) cases. Patients with RABE have survival rates of a few months and a high risk for progression to acute myeloid leukemia. The molecular basis of the disease is not elucidated yet. This study aimed at analyzing the gene expression profile of bone marrow (BM) cells in patients with RAEB. We created the first SAGE library of RAEB at diagnosis using the BM cells of six patients. A comparison between RAEB and normal SAGE libraries show differentially expressed genes. Five under-expressed genes, TXNIP, SGPL1, NUMB, FOXO3 and MSH2 and five over-expressed genes, MIF, RHOG, ICAM3, CHI3L1 and NOTCH1, were selected for validation using real time PCR with samples collected at diagnosis and samples from the same patients collected six months after diagnosis. The pattern of expression of the five under-expressed genes and two overexpressed genes (MIF and RHOG) was validated at diagnosis in 60% of the patients. The NUMB and RHOG genes show the same expression pattern six months after diagnosis. NOTCH1 continued over-expressed in two samples six months after diagnosis. Our results show that the creation of the RAEB SAGE library allowed an analysis of genes passively involved in the genesis and progression of disease. BM cells from patients with REAB show a different gene expression profile to normal BM. The TXNIP, SGPL1, NUMB, FOXO3, and MSH2 genes are under-expressed and MIF and RHOG are over-expressed at diagnosis. NUMB and RHOG conserved their expression pattern six months after diagnosis and NOTHC1 gene increase its expression in this period. However, the results should be confirmed in studies with a larger number of cases with abnormal expressions for the FOXO3, NUMB, SGPL1, TXNIP, MSH2, MIF, RHOG and NOTCH1 genes. As these genes may play a role in the pathogenesis and progression... (Complete abstract click electronic access below)

Doutoramento em Engenharia Informática O projecto de sequenciação do genoma humano veio abrir caminho para o surgimento de novas áreas transdisciplinares de investigação, como a biologia computacional, a bioinformática e a bioestatística. Um dos resultados emergentes desde advento foi a tecnologia de DNA microarrays, que permite o estudo do perfil da expressão de milhares de genes, quando sujeitos a perturbações externas. Apesar de ser uma tecnologia relativamente consolidada, continua a apresentar um conjunto vasto de desafios, nomeadamente do ponto de vista computacional e dos sistemas de informação. São exemplos a optimização dos procedimentos de tratamento de dados bem como o desenvolvimento de metodologias de interpretação semi-automática dos resultados. O principal objectivo deste trabalho consistiu em explorar novas soluções técnicas para agilizar os procedimentos de armazenamento, partilha e análise de dados de experiências de microarrays. Com esta finalidade, realizou-se uma análise de requisitos associados às principais etapas da execução de uma experiência, tendo sido identificados os principais défices, propostas estratégias de melhoramento e apresentadas novas soluções. Ao nível da gestão de dados laboratoriais, é proposto um LIMS (Laboratory Information Management System) que possibilita a gestão de todos os dados gerados e dos procedimentos realizados. Este sistema integra ainda uma solução que permite a partilha de experiências, de forma a promover a participação colaborativa de vários investigadores num mesmo projecto, mesmo usando LIMS distintos. No contexto da análise de dados, é apresentado um modelo que facilita a integração de algoritmos de processamento e de análise de experiências no sistema desenvolvido. Por fim, é proposta uma solução para facilitar a interpretação biológica de um conjunto de genes diferencialmente expressos, através de ferramentas que integram informação existente em diversas bases de dados biomédicas. The sequencing of the human genome paved the way for the emergence of new transdisciplinary research areas, such as computational biology, bioinformatics and biostatistics. One example of such is the advent of DNA microarray technology, which allows the study of the expression of thousands of genes when subjected to an external disturbance. Despite being a well-established technology, it continues to present a wide range of challenges, particularly in terms of computing and information systems. Examples include the optimization of procedures for processing data as well as the development of methodologies for semi-automated interpretation of results. The main objective of this study was to explore new technical solutions to streamline the procedures for storing, sharing and analyzing the data from microarray experiments. To this end, it was performed an analysis of the key steps from the experiment, having been identified the major deficits, proposed strategies for improving and presented new solutions. Regarding the management of laboratory data we propose a LIMS (Laboratory Information Management System) that allows the storage of all data generated and procedures performed in the laboratory. This system also includes a solution that enables the sharing of experiments in order to promote collaborative participation of several researchers in the same project, even using different LIMS. In the context of data analysis, it is presented a model that allows the simplified integration of processing and analysis algorithms in the developed system. Finally, it is proposed a solution to facilitate the biological interpretation of a set of differentially expressed genes, using tools that integrate information from several public biomedical databases.

Mestrado em Métodos Biomoleculares Este estudo teve como objectivo caracterizar as alterações do proteoma nuclear da linha celular HC11, um modelo utilizado no estudo do cancro da mama, durante o seu processo de diferenciação. No sentido de avaliar a variação do perfil de modificações pós-traducionais em histonas com o processo de diferenciação, procedeu-se à purificação de núcleos e isolamento de histonas de células HC11 stem-cell like e diferenciadas. O perfil de modificações pós-traducionais em histonas foi analisado com recurso a HPLC-ESI-MS/MS e nanoLC-MALDIMS/MS, após digestão com tripsina e Glu-C, tendo-se identificado um total 36 variantes de histonas e 2659 modificações, 99% das quais com um espectrómetro de massa do tipo trapa linear com fonte de electrospray. A diminuição do grau de acetilação nas classes de histonas H3 e H4, detectada por AUT-PAGE, a diminuição do número de resíduos de aminoácidos acetilados e o aumento dos metilados em H3 e H4, a presença do resíduo trimetilado H3K27 apenas nas células diferenciadas, a identificação da H3K9 acetilada e de H3K4 dimetilada apenas nas células estaminais suportam a noção de que o grau de diferenciação celular traduz-se por uma diminuição da capacidade de expressão génica. No entanto, o número mais elevado de PTMs diferentes observado no N-terminal da H4 sugere uma importante, e ainda desconhecida, contribuição desta classe de histonas na regulação epigenética. O proteoma nuclear foi analisado por electroforese bidimensional e identificaram-se, usando um MALDI-TOF/TOF, 100 proteínas distintas, 48% das quais referentes à classe da “biossíntese de DNA/RNA/Proteínas”. De entre as 5 proteínas diferentemente expressas entre as células estaminais e diferenciadas, é de salientar a maior expressão nas células diferenciadas das hnRNPs associadas ao processo de apoptose e proliferação celular. A identificação de diferenças de expressão de proteínas relacionadas com o cancro, em conjunto com modificações pós-traducionais identificadas, nomeadamente a presença de H3K9ac apenas nas células estaminais, corrobora o uso das células HC11 como modelo para o estudo do cancro da mama. ABSTRACT: The aim of the present work was to characterize the changes in the nuclear proteome of the cell line HC11, a model used in the study of breast cancer during their differentiation process. To assess the alterations in the post-translational modifications’ profile in histones with the differentiation process, we performed the purification of nuclei and isolation of histones from HC11 stem-cell like and differentiated cells. The profile of post-translational modifications in histones was analyzed by HPLC-ESIMS/ MS and nanoLC-MALDI-MS/MS, after digestion with trypsin and Glu-C, being identified a total of 36 variants of histones and 2659 PTMs, 99% of which with a linear ion trap mass spectrometer with an electrospray source. The decrease in the degree of histone acetylation in H3 and H4 classes, analysed by AUT-PAGE, the diminished number of amino acid residues, the increase of acetylated H3 and methylated H4, the presence of trimethylated H3K27 in differentiated cells, the identification of acetylated H3K9 and dimethylated H3K4 in stem cell like support the notion that cellular differentiation is reflected by a decreased ability to gene expression. However, the highest number of PTMs observed in the N-terminal of H4 from differentiated cells suggests an important, yet unknown, contribution of this class of histone in epigenetic regulation. The nuclear proteome was analyzed by twodimensional electrophoresis and 100 distinct proteins were identified using a MALDI-TOF/TOF, 48% of which were related with “biosynthesis of DNA/RNA/Protein”. Among the five proteins differentially expressed between stem-cell like and differentiated cells, it is worth of note the higher levels of hnRNPs associated with apoptosis and cell proliferation, in differentiated cells. The identification of expression differences in proteins related with cancer, together with the post-translational modifications identified, which includes the presence of H3K9ac in stem cell like, supports the use of HC11 cells as a model for the study of breast cancer.

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Humana e Ambiente). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010 Submitted by Lurdes Saramago (lurdes.saramago@fc.ul.pt) on 2013-05-13T14:22:30Z No. of bitstreams: 1 ulfc080773_tm_pedro_antas.pdf: 2236487 bytes, checksum: 0db76bf4e1badcfb83892a2a4daafce6 (MD5) Made available in DSpace on 2013-05-13T14:22:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ulfc080773_tm_pedro_antas.pdf: 2236487 bytes, checksum: 0db76bf4e1badcfb83892a2a4daafce6 (MD5) Previous issue date: 2010

Mestrado em Matemática e Aplicações A tecnologia de microarrays de DNA permite monitorizar a expressão de milhares de genes em simultâneo, constituindo um instrumento de grande apoia a investigação de grandes questões nas áreas da Biologia Molecular, Genética, Medicina, entre outras. O uso de ferramentas estatisticas que permitam a deteção de genes diferencialmente expressos torna-se imprescindível no sentido de fornecer ao biólogo a identificação de diferenças entre as várias amostras comparadas durante a experiencia de microarrays. Nesta dissertação serão abordadas diferentes metodologias estatísticas com vista a deteção de genes que evidenciam diferenças significativas nos níveis de expressão sob duas condições distintas. Concretamente, estuda-se o procedimento estatístico de Analise de Significância de Mi- croarrays (SAM) e vários métodos de Bayes empíricos. A metodologia SAM permite estabelecer a partir do valor observado de uma estatística de teste para cada gene, usando o método das permutações e controlando a taxa de falsas descobertas, quais os genes com níveis de expressão ao significativamente diferentes. Os métodos de Bayes empíricos assumem o ajustamento dos níveis de expressão genética a um dado modelo probabilístico teórico o qual, por sua vez, depende de uma distribuição a priori para o modelo dos parâmetros, sendo que os parâmetros da distribuição a priori são estimados com base nos dados observados. No presente trabalho serão abordadas quatro metodologias inseridas nos métodos de Bayes empíricos: um modelo linear e os modelos Gamma-Gamma, Log-Normal-Normal e Log-Normal-Normal com Variância Modificada. Com o auxílio de packages do R obtidos do Bioconductor (nomeadamente, limma e EBarrays) e do package do R samr, aplicaram-se as metodologias referidas a duas bases de dados reais designadas por ApoAI e Fermentation. A ApoAI visa o estudo de ratos cujo gene ApoAI não esta funcional e a forma como a de ciência deste gene afeta o desempenho dos outros genes no fígado. A base de dados Fermentation resulta de uma experiencia de duas cores de microar- rays de DNA recentemente realizada no Laboratório de Microarrays da Universidade de Aveiro. A análise destes dados visa comparar os níveis de expressão genética de cinco leveduras vínicas e duas leveduras não vínicas e identificar genes que permitam distinguir estirpes com uma boa resistência ao stress imposto pelo processo de fermentação. Os resultados obtidos com cada uma das metodologias foram analisados e comparados obtendo-se uma lista de genes comuns identificados por todas as metodologias. The technology of DNA microarrays allows the monitoring of the expression levels of thousands of genes simultaneously in a single experiment. It has become a useful tool to support research in the elds of Molecular Biology, Genetics and Medicine, helping scientists to understand the patterns of gene activity in di erent cellular conditions. In the eld of Statistics, the large amount of complex data emerging from DNA microarray technologies has created new challenges and stimulated the development of new methods. In this dissertation, di erent statistical methodologies developed for the detection of di erentially expressed genes in microarray experiments were studied and applied on two experimental datasets. These methodologies were, speci cally, Signi cance Analysis of Microarrays (SAM) and various procedures based on empirical Bayes methods. The SAM procedure is a permutation-based statistical technique which considers gene speci c statistical tests and measures the strength of the relationship between gene expression and condition types in order to decide whether there are statistically signi cant di erences in gene expression levels, controlling the false discovery rate. Empirical Bayes procedures are bayesian methodologies in which the prior distribution for the model parameters is estimated from the data. Herein, four different theoretical models for the expression levels were included in the empirical Bayes approach: linear model, Log-Normal-Normal model, Gamma-Gamma model and, nally, the Log-Normal-Normal with modi ed variance model. Using R packages (namely, samr and both limma and EBarrays from Bioconductor), those methodologies were applied on two real databases designated ApoAI and Fermentation. The ApoAI database has been largely studied in the specialized literature and it is aimed at identifying genes with altered expression in mice whose Apo AI gene is not functional. The Fermentation database was recently obtained at the National Facility for DNA Microarray at the University of Aveiro, and it comes from two colour DNA microarray experiment carried out to distinguish yeast strains with good resistance to stress imposed by the fermentation process. The results generated with each methodology for each database were analyzed and compared to obtain a list of di erentially expressed genes commonly identi ed by methodologies applied.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:04Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-02-18Bitstream added on 2014-06-13T19:12:52Z : No. of bitstreams: 1 valsechi_mc_me_sjrp_parcial.pdf: 574533 bytes, checksum: a4733296b652ce8ac3b0aa3af78e4e48 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-01-16T10:37:46Z: valsechi_mc_me_sjrp_parcial.pdf,Bitstream added on 2015-01-16T10:38:34Z : No. of bitstreams: 1 000590383.pdf: 1465270 bytes, checksum: 6abb1c740c0eb28b1d1eb0e5696f75a3 (MD5) Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) O tumor renal é a mais letal das doenças urológicas. É uma doença histologicamente heterogênea, sendo o carcinoma renal de células claras o subtipo histológico mais comum. Embora a nefrectomia e imunoterapia sejam tratamentos bem estabelecidos, aproximadamente 30% dos pacientes tratados são acometidos por metástases. Alterações na expressão gênica e na inativação transcricional, devido ao mecanismo de metilação, são evidentes em células cancerosas. A metilação do DNA é um evento epigenético intimamente relacionado com o silenciamento da expressão gênica, e está envolvida em vários processos, dentre eles, a carcinogênese. Dessa forma, este trabalho teve como objetivos investigar se os genes selecionados, GPC3, CRABP2, KTN1 e ADAM23 apresentam expressão alterada nas amostras tumorais, verificar se a expressão gênica está associada com a progressão tumoral, e analisar o padrão de metilação de ilhas CpGs. Os quatro genes selecionados foram validados pela técnica de PCR em Tempo Real. Para validação desses genes foram utilizadas 35 amostras de carcinoma renal de células claras e 35 amostras de córtex renal normal. Os genes GPC3, CRABP2, KTN1 e ADAM23 apresentaram redução de expressão significativa em amostras de carcinoma renal de células claras quando comparadas ao pool de amostras de córtex renal normal. Observou-se que a redução da expressão do gene ADAM23 está diretamente relacionada com o avanço do estadiamento tumoral. Foi observada uma freqüência elevada de hipermetilação do gene ADAM23, entretanto, não houve associação do padrão de metilação com os dados clínicos. A análise da expressão gênica e dos mecanismos responsáveis pela inativação transcricional dos genes CRABP2, KTN1 e ADAM23, estudados pela primeira vez em carcinoma renal, e GPC3, podem fornecer informações relevantes para o conhecimento e desenvolvimento do carcinoma renal de células claras. The renal tumor, which is the most lethal of urological diseases, is a histologically heterogeneous disease, and the clear cell renal cell carcinoma the most common histological subtype. Although the treatment of nephrectomy and immunotherapy are established, approximately 30% of patients are affected by metastases. Changes in gene expression and transcriptional inactivation, due to the methylation mechanism are evident in cancer cells. The DNA methylation is an epigenetic event closely related to the silencing of gene expression, and is involved in several cases, including the carcinogenesis. The aim of this study was to investigate the gene expression of GPC3, CRABP2, KTN1 and ADAM23, check if gene expression was associated with tumor progression and analyze methylation pattern of CpG island. The four selected genes were validated by the quantitative RT-PCR. Thirty five samples of clear cell renal cell carcinoma and 35 samples of normal renal cortex were used for validation. The genes GPC3, CRABP2, KTN1 and ADAM23 showed significant reduction of expression in samples of clear cell renal cell carcinoma when compared to a pool of samples of normal renal cortex. It was observed that the lower expression of ADAM23 is directly related to the advancement of the tumor staging. Despite the high frequency of hypermethylation of ADAM23, there was no association with the methylation pattern of the clinical data. The analysis of gene expression and the mechanisms responsible for the transcriptional inactivation of genes CRABP2, KTN1 and ADAM23, first studied in clear cell renal cell carcinoma, and GPC3, may provide relevant information for the clear cell renal cell carcinoma understanding and development.

Mestrado em Matemática e Aplicações Esta dissertação surge no contexto da avaliação de metodologias de préprocessamento de dados de microarrays através do desempenho preditivo de modelos de classificação supervisionada. As experiências de microarrays envolvem muitos passos, desde a extracção do tecido em estudo, passando pela marcação do mesmo com compostos fluorescentes, scanning, processamento de imagem, entre outras. Cada uma dessas etapas pode introduzir variabilidade nos dados recolhidos e assim afectar a qualidade dos mesmos. Os métodos de pré-processamento de correcção de background (CB) e de normalização (NM) surgem da necessidade de remover as variações não desejadas mantendo as variações biológicas intrínsecas aos dados. Para o presente trabalho foi realizado um estudo experimental onde foram aplicados aos dados vários métodos de CB e de NM, individualmente ou em conjunto, com a finalidade de avaliar o contributo destas metodologias no melhoramento da qualidade dos dados. Apresenta-se aqui uma avaliação de 36 métodos pré-processamento (resultantes de combinações de métodos de CB e de NM) com base no desempenho preditivo de dois modelos de classificação, k-Vizinhos mais Próximos (k-NN) e Maquinas de Suporte Vectorial (MSV). Estes modelos são induzidos de três bases de dados públicas de microarrays de ADNcomplementar, onde um par de métodos de pré-processamento, constituído por um de CB e outro de NM, é aplicado. A capacidade preditiva dos dois modelos de classificação é medida em termos da taxa de erro obtida pelo método de validação cruzada leave-one-out. Em virtude da grande dimensão dos dados de microarrays, resultante de um elevado número de atributos (genes) envolvidos, o presente trabalho também inclui um estudo sobre o efeito da aplicação dos métodos de CB e de NM no desempenho preditivo de classificadores de MSV quando estes são induzidos de dados constituídos apenas por subconjuntos de genes altamente discriminativos. This dissertation addresses the problem of evaluating preprocessing methodologies in terms of the predictive performance of supervised classification models induced from microarray data. Microarray experiments involve many steps, from the extraction of the tissue in study, through its labeling with fluorescent dyes, scanning and image processing, among others. Each of these stages can introduce variability in the data collected and thus affect their quality. Preprocessing methods such as background correction (BC) techniques and normalization (NM) strategies have arisen from the need to remove the unnecessary variation while the intrinsic biological variations of the data are retained. In this work an experimental study has been carried out where various BC and NM methods have been employed on the data, individually or in combination, with the goal of assessing the contribution of these approaches to the improvement of the quality of the data. Herein is presented an evaluation of 36 preprocessing methods (resulting from combinations of BC and NM methods) in terms of the predictive performance of two classification models, k-Nearest Neighbours (k-NN) and Support Vector Machines (SVM). These models are induced from three publicly available cDNA microarray data sets, where a pair of preprocessing strategies, composed of a BC technique and a NM method, is employed. The predictive performance of both classifiers is measured on grounds of the error rate obtained by the leave-one-out cross validation method. Due to the high dimensionality of microarray data, resulting from a large number of attributes (genes) involved, this dissertation also includes a study about the effect of the application of BC and NM methods on the predictive performance of SVM classifiers when these are induced from data consisting of only subsets of highly discriminative genes.

O uso de pesticidas é objecto de controvérsia: são geralmente necessários para o sucesso da produção agrícola, mas a contaminação do solo e de sistemas aquáticos (e.g. lagos e rios) é prejudicial para muitas espécies. A utilização de insecticidas é particularmente preocupante porque grande parte da biomassa aquática é composta por artrópodes semelhantes aos organismos-alvo (pragas). A utilização das biomoléculas de ADN e dos seus mecanismos operativos (e.g. formação de ARN mensageiro durante a síntese proteica) é uma das mais recentes biotecnologias aplicadas à análise dos efeitos nefastos de compostos tóxicos. De uma forma simplificada, sabendo que, em condições controlo, um organismo aquático produz X moléculas de ARNm, ao observar que, após exposição a um insecticida, produz 2X ou -2X, pode concluir-se que o organismo foi afectado pela exposição. Posteriormente analisando a função dos genes envolvidos neste processo, pode concluir-se acerca dos mecanismos biológicos que foram inibidos ou estimulados, podendo estimar-se riscos do insecticida para o ecossistema. O objectivo deste estudo foi verificar as alterações na expressão genética de um zooplanctonte (Daphnia magna) após exposição a Metomil, um insecticida muito usado em Portugal. Para tal, utilizou-se um chip de ADN (microarray), que permite o estudo da expressão de milhares de genes numa só leitura., Revista Captar: Ciência e Ambiente para Todos, vol. 1 n.º 1 (2009)

Tese de mestrado, Biologia (Biologia Molecular humana), 2009, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências Nível de preservação: critical, Criado em: 2010-03-18 17:17:57, Criado por: creator:LSARAM, Alterado em: 2010-03-19 16:48:57, Modificado por: viewer:internal Made available in DSpace on 2010-07-28T16:13:15Z (GMT). No. of bitstreams: 2 21608_ulfc080710_tm.pdf: 689596 bytes, checksum: 735548826695e8825388b565c82e95e8 (MD5) 21608.xml: 9730 bytes, checksum: 365a6a9710234bc8bf8cbb8e8b917502 (MD5) Previous issue date: 2009

Tese de mestrado. Tecnologias de Informação aplicadas às Ciências Biológicas e Médicas. Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2009, A correcta compreensão de como funcionam os sistemas biológicos depende do estudo dos mecanismos que regulam a expressão genética. Estes mecanismos controlam em que momento e durante quanto tempo é utilizada a informação codificada num gene, e podem actuar em diversas etapas do processo de expressão genética. No presente trabalho, a etapa em análise é a transcrição, na qual a sequência de ADN de um gene é transformada numa sequência de ARN, que posteriormente dará origem a uma proteína. A regulação da transcrição centra-se na acção de uma classe de proteínas reguladoras denominadas factores de transcrição. Estes ligam-se à cadeia de ADN na região próxima do início de um gene (a região promotora), potenciando ou inibindo a ligação da proteína responsável pelo processo de transcrição. Os factores de transcrição têm especificidade para pequenas sequências de ADN (denominados motivos de ligação) que estão presentes nas regiões promotoras dos genes que regulam. Um gene pode ser regulado por diferentes factores de transcrição; um factor de transcrição pode regular diferentes genes; e dois factores de transcrição podem ter motivos de ligação iguais. A regulação dos genes que codificam factores de transcrição é ela própria regulada, podendo sê-lo por uma série de mecanismos que incluem a interacção com outros factores de transcrição. O conhecimento de como genes e proteínas interagem entre si permite a criação de modelos que representam o modo como o sistema em questão (seja um processo biológico ou uma célula) se comporta. Estes modelos podem ser representados como redes de regulação genética, que embora possam diferir estruturalmente, os seus componentes elementares podem ser descritos da seguinte forma: os vértices representam genes (ou as proteínas codificadas) e as arestas representam reacções moleculares individuais, como as interacções entre proteínas através das quais os produtos de um gene afectam os de outro. A representação de regulações genéticas em redes de regulação genética promove, entre outros aspectos, a descoberta de grupos de genes que, sendo co-regulados, participam no mesmo processo biológico. Tal como referido anteriormente, os factores de transcrição podem ser regulados por outros factores de transcrição, o que significa que existem dois tipos de regulações: directas e indirectas. Regulações directas dizem respeito a pares gene-factor de transcrição em que a expressão do gene é regulada pelo factor de transcrição considerado no par; regulações indirectas dizem respeito a pares em que a expressão do gene é regulada por um factor de transcrição cuja expressão é regulada pelo factor de transcrição considerado no par. Existem dois tipos de métodos experimentais que permitem a identificação de regulações genéticas: métodos directos, que identificam regulações directas; métodos indirectos, identificam regulações mas sem ser possível diferenciar entre directas e indirectas. Os métodos directos avaliam a ligação física do factor de transcrição ao gene, enquanto os métodos indirectos avaliam a existência de alterações nos padrões de expressão dos genes devido à influência dos factores de transcrição (isto é, se a acção de um determinado factor de transcrição se deixar de sentir, quais os genes cuja transcrição sofrerá alterações, e com que intensidade). Dos quatro métodos descritos em seguida, os dois primeiros são directos e os dois últimos indirectos:Chip (imunoprecipitação de cromatina) – esta técnica é utilizada na investigação de interacções in vivo entre DNA e proteínas [1,2]. CHIP-chip – esta técnica consiste numa adaptação da anterior, sendo realizada à escala genómica: um microarray representativo do genoma completo de um organismo é exposto a um dado FT, permitindo a identificação de todos os genes que este regula [3].Microarrays – a utilização de microarrays permite a avaliação de alterações de expressão genética em grande escala, considerando o genoma completo de um organismo ou apenas uma via metabólica [4]. Proteómica – esta abordagem inclui diversos métodos que permitem a identificação dos genes regulados por um determinado factor de transcrição através do estudo do nível de expressão das proteínas codificadas pelos genes [5]. O conhecimento existente sobre regulações genéticas encontra-se disponível essencialmente na literatura. Embora actualmente exista um número elevado de bases de dados biológicas públicas, a grande maioria contém dados sobre entidades biológicas mas não sobre regulações genéticas de forma explícita. Com o objectivo de colocar à disposição da comunidade científica dados existentes sobre regulações genéticas em Saccharomyces cerevisiae, foi criada uma base de dados portuguesa, denominada Yeastract, mantida por curação manual de literatura científica. Devido à crescente quantidade de artigos publicados actualmente, é de extrema importância o desenvolvimento de ferramentas automáticas que auxiliem o processo de curação manual. No caso concreto da Yeastract, surgiu a necessidade de criar uma ferramenta que auxiliasse o processo de identificação de artigos científicos que descrevam regulações genéticas em S. cerevisiae. Esta ferramenta é composta por dois componentes: um primeiro que identifica factores de transcrição nos resumos dos artigos e que verifica se os resumos contêm descrições de regulações genéticas; um segundo que avalia se as regulações hipotéticas que o artigo contém correspondem a regulações válidas do ponto de vista biológico. Este segundo componente foi denominado GREAT (Gene Regulation EvAluation Tool) e constitui o objectivo do meu trabalho. A ferramenta que desenvolvi recebe como input uma lista de artigos em cujos resumos foram identificados factores de transcrição e, na validação das regulações, explora dados obtidos exclusivamente de bases de dados biológicas de acesso público. Esses dados são utilizados na avaliação dos seguintes aspectos: participação de um gene e de um factor de transcrição no mesmo processo biológico; existência do local de ligação do factor de transcrição na região promotora do gene; método experimental com que a regulação foi identificada. O resultado de cada um destes aspectos é utilizado por um método de aprendizagem automática, árvores de regressão ou árvores modelo, para o cálculo de um score de confiança, a atribuir a cada potencial regulação. Artigos que contenham regulações com scores elevados serão curados manualmente para extracção das regulações genéticas. Foi implementado com sucesso um primeiro protótipo do GREAT. No entanto, do ponto de vista biológico, os resultados obtidos não foram satisfatórios, pelo que se realizou uma análise detalhada dos dados utilizados. Esta análise revelou questões importantes, essencialmente relacionadas com a insuficiência de dados disponíveis, e permitiu a identificação de medidas que poderão ser implementadas no actual protótipo para a resolução dos problemas encontrados., The understanding of biological systems is dependent on the study of the mechanisms that regulate gene expression. These mechanisms control when and for how long the information coded in a gene is used, and can act several of the steps in the gene expression process. In the present work, the step of interest is the transcription, where the DNA sequence of a gene is transformed into an RNA sequence, which will later be used to synthesise a protein. The knowledge about gene regulations is mainly available in the literature. Although there are currently multiple public biological databases, the majority of those contain data on biological entities but not explicitly on gene regulations. In order to provide the scientific community with data on Saccharomyces cerevisiae transcription regulations, a Portuguese public repository maintained by manual curation of scientific literature, named Yeastract, was created. Due to the increasing amount of papers published nowadays, the development of automatic tools that can help the curation process is of great importance. In the specific case of Yeastract, a tool was needed to help in the identification of papers describing gene regulations of S. cerevisiae. This tool was created with two components: one that identifies transcription factors in the papers’ abstracts and verifies if they describe gene regulations; the other that evaluates if the hypothetical regulations the paper contains correspond to valid regulations from a biological point of view. This second component was named GREAT, Gene Regulation EvAluation Tool, and is the goal of my work. The tool I developed uses data obtained exclusively from public biological databases to validate the regulations. That data is used in the evaluation of three aspects: the participation of a gene and a transcription factor in the same biological process; the existence of the transcription factor binding motif in the gene promoter region; the experimental method with which the regulation was identified. The output of these features is used by a machine learning method, either regression or model trees, to calculate a confidence score to attribute to each putative gene regulation. Papers containing regulations with high scores will be manually curated to extract the gene regulations. Although a first prototype of GREAT was implemented, from a biological point of view the results obtained are unsatisfactory. This prompted a detailed analysis of the data used, which uncovered important questions that need to be addressed in order to further improve this tool.

Tese de mestrado, Biologia (Biologia Molecular Humana), 2009, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências Nível de preservação: critical, Criado em: 2010-03-09 18:49:00, Criado por: creator:LSARAM, Alterado em: 2010-03-24 17:23:50, Modificado por: super:LSARAM Made available in DSpace on 2010-07-27T08:58:49Z (GMT). No. of bitstreams: 2 21556_ulfc080729_tm.pdf: 1535947 bytes, checksum: 5a03511b6a61b63951b5e70ee171bb9e (MD5) 21556.xml: 10139 bytes, checksum: 64ba16924ad91300248a98ba146b966b (MD5) Previous issue date: 2009

Tese de mestrado, Biologia (Biologia Molecular Humana), 2009, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências Nível de preservação: critical, Criado em: 2010-03-09 18:48:59, Criado por: creator:LSARAM, Alterado em: 2010-03-09 19:05:39, Modificado por: viewer:internal Made available in DSpace on 2010-07-27T08:58:45Z (GMT). No. of bitstreams: 2 21546_ulfc080683_tm.pdf: 1703253 bytes, checksum: 84f082fe4723bb4cd0efcb2c7c6ecc79 (MD5) 21546.xml: 10220 bytes, checksum: 557ac86442f900d801f0f78d7aca0d61 (MD5) Previous issue date: 2009

Tese de mestrado, Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento), 2009, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências Nível de preservação: critical, Criado em: 2009-12-17 17:47:52, Criado por: creator:LSARAM, Alterado em: 2009-12-17 18:26:34, Modificado por: viewer:internal Made available in DSpace on 2010-07-27T08:58:08Z (GMT). No. of bitstreams: 2 20456_ulfc080621_tm.pdf: 9145107 bytes, checksum: ffbf5027fe280641d624b1c076868af4 (MD5) 20456.xml: 9224 bytes, checksum: 7ca44cb6cf44cc19bc7e596a77b9b428 (MD5) Previous issue date: 2009

Tese de doutoramento em Biologia (Biologia Evolutiva) apresentada à Universidade de Lisboa através da Faculdade de Ciências, 2009. Nível de preservação: critical, Criado em: 2009-03-24 17:11:50, Criado por: super:MARTA, Alterado em: 2010-04-22 14:24:13, Modificado por: super:MARTA Made available in DSpace on 2010-07-27T08:59:49Z (GMT). No. of bitstreams: 2 17230_Tese_PhD_IrenePala.pdf: 14692091 bytes, checksum: c1de6b4bfa6121a3a1568e44035a9aa0 (MD5) 17230.xml: 7917 bytes, checksum: 3ba6b58a546412a44b566866cd273ad3 (MD5) Previous issue date: 2008

Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados As doenças lisossomais de sobrecarga (DLS) são um grupo de doenças hereditárias do metabolismo, caracterizadas pela deficiência em determinadas vias catabólicas intralisossomais. A maioria das DLS envolve defeitos em proteínas lisossomais solúveis que são endereçadas para o lisossoma pela via da manose-6-fosfato (M6P). A síntese da M6P inicia-se com a transferência da GlcNAc-1-fosfato para manoses específicas nas enzimas lisossomais recémsintetizadas, este passo é catalizado pela enzima N-acetilglucosaminil-1- fosfotransferase (GlcNAc-fosfotransferase). Após a aquisição da marcação M6P, as enzimas lisossomais são reconhecidas por receptores que direccionam o seu transporte até aos lisossomas. Na ausência de actividade da GlcNAc-fosfotransferase, as enzimas lisossomais são secretadas. Esta deficiência é conhecida por Mucolipidose tipo II (ML II ou doença I-cell) uma doença autossómica recessiva caracterizada por um atraso psicomotor muito grave e que leva à morte do doente na primeira década de vida. A Mucolipidose tipo III (ML III ou polidistrofia pseudo- Hurler) é uma doença menos grave em que a sobrevivência até à idade adulta é possível. Na ML III a actividade da GlcNAc-fosfotransferase em vez de ausente está diminuída. A GlcNAc-fosfotransferase é uma enzima hexamérica: α2β2γ2, codificada por 2 genes diferentes. O gene que codifica a subunidade γ (GNPTG) localiza-se no cromossoma 16. As subunidades α e β são codificadas pelo gene GNPTAB, localizado no cromossoma 12, sendo originadas após o processamento proteolítico do precursor α/β. Alterações no gene GNPTAB podem originar a ML II ou a ML IIIA, enquanto que mutações no gene GNPTG dão origem à ML IIIC, que ao nível das características clínicas e bioquímicas não é distinguível da ML IIIA. Este trabalho teve como principais objectivos: 1) a caracterização genotípica de doentes portugueses com ML II e ML III para os genes GNPTAB e GNPTG; 2) a obtenção de dados acerca do espectro mutacional das ML II e ML III e da sua distribuição em Portugal; 3) a implementação de estratégias de diagnóstico molecular para estas patologias; 4) a avaliação da causalidade das mutações encontradas no que respeita ao seu impacto ao nível do mRNA e previsão dos seus efeitos na estrutura e função da proteína; 5) o estabelecimento de uma correlação entre a presença de uma determinada mutação nos genes GNPTAB e GNPTG e o fenótipo clínico. Foram estudados dez doentes não consanguíneos (nove portugueses e um de origem indiana) classificados clinicamente como ML II ou ML III. Nestes doentes as mutações foram identificadas através de uma estratégia analítica que englobou o estudo quer do cDNA quer do gDNA. Foram identificadas cinco mutações distintas no gene GNPTAB. Destas, três mutações são novas (p.E667X, p.I403T e c.440delC) e duas estavam previamente descritas na literatura (c.3503delTC e p.S399F). Foram também encontradas duas mutações novas no gene GNPTG, a c.639delT e a c.610- 1G> T. Verificou-se que as mutações previamente descritas no gene GNPTAB (S399F e 3503delTC) estão associadas, nos doentes estudados neste trabalho, a fenótipos similares aos descritos em outros doentes que apresentavam estas mutações. Na presença das mutações novas I403T, E667X e 440delC (esta em homozigotia) os doentes apresentavam na presença da primeira um fenótipo compatível com ML IIIA e no caso das últimas duas um fenótipo característico de ML II. O doente com alterações no gene GNPTG apresenta um fenótipo compatível com ML IIIC. Este estudo permitiu também clarificar a classificação clínica inicial, o que levou ao diagnóstico mais preciso do tipo de Mucolipidose. A mutação 3503delTC constitui 50% dos alelos identificados nos doentes portugueses. Uma vez que esta mutação já tinha sido descrita anteriormente como sendo frequente em doentes de origem árabe, foi efectuada uma análise haplotípica para esclarecer se a presença desta mutação em ambas as populações se deve a um efeito fundador ou se, pelo contrário, resulta de eventos mutacionais independentes. Os dados obtidos parecem indicar que estamos na presença de um evento mutacional único e que, possivelmente, o alelo mutante presente nos dois grupos de doentes tem uma origem comum. Os estudos de expressão dos genes GNPTAB e GNPTG por qRT-PCR mostraram a ocorrência de uma diminuição dos níveis de mRNA GNPTAB na presença de mutações frameshift e nonsense no gene GNPTAB (440delC, 3503delTC e E667X). Nesta situação, a redução dos níveis de mRNA GNPTAB, pode ser explicada pelo aparecimento prematuro de codões STOP o que torna bastante provável que os transcritos sejam alvo do mecanismo NMD. Na presença das mutações missense (S399F e I403T) a diminuição dos níveis de mRNA GNPTAB não é significativa. O doente com alterações no gene GNPTG (heterozigótico composto 610-1G>T/639delT) também apresentava níveis de mRNA GNPTG bastante reduzidos relativamente ao valor médio dos controlos. Os resultados da análise mutacional efectuada constituem, até à data, os únicos dados de caracterização molecular destas patologias na população portuguesa contribuindo também, para um melhor conhecimento a nível mundial das bases moleculares desta doença. Por outro lado, estes estudos são extremamente importantes na medida em que a análise mutacional permitirá a realização de um diagnóstico pré-natal molecular e um diagnóstico mais preciso aos familiares de doentes recentemente diagnosticados. Lysosomal storage diseases (LSD) are a group of inherited metabolic diseases characterised by the impairment of the intralysosomal catabolic pathways. The majority of LSD involve defects in soluble lysosomal proteins that are targeted to the lysosome by the mannose 6-phosphate (M6P) pathway. The initial step in M6P synthesis is the transfer of GlcNAc-1-phosphate to selected mannoses of newly synthesized lysosomal enzymes, which is catalysed by Nacetylglucosamine 1-phosphotransferase (GlcNAc-phosphotransferase). Following acquisition of the M6P marker, lysosomal enzymes can be recognized by specific receptors that target their transfer to lysosomes. In the absence of GlcNAc-phosphotransferase activity lysosomal enzymes are secreted from the cell. This defect is recognized as mucolipidosis II (ML II or Icell disease) an autosomal recessive disease characterised by severe psychomotor retardation often resulting in death in the first decade of life. Another type of mucolipidosis, mucolipidosis III (ML III or pseudo-Hurler polydystrophy) is a milder disease and survival into adulthood is possible. In ML III GlcNAc-phosphotransferase activity is reduced rather than absent. GlcNAc-phosphotransferase is a multimeric enzyme, α2β2γ2, encoded by two genes. The gene for the γ subunit (GNPTG) is located on chromosome 16. The α and the β subunit are encoded by the GNPTAB gene, which is located on chromosome 12. Proteolytic processing of the α/β precursor generates the individual α and β subunits. Defects in GNPTAB result in mucolipidosis II and IIIA whereas mutations in GNPTG were only found in ML IIIC patients. ML IIIC is biochemical and clinically indistinguishable from ML IIIA. The main aims of the present work consisted in: 1) performing the molecular characterisation of Portuguese patients with ML II and ML III for the GNTPAB and GNPTG genes; 2) to obtain data about the mutational spectrum and the frequency distribution of causative mutations in Portugal 3) the development of a molecular diagnosis strategy; 4) the evaluation of the impact of novel mutations at mRNA and the predition of its effects on protein structure and function and 5) the establishment of a genotype-phenotype correlation. We have studied ten nonconsanguineous patients (nine Portuguese and one of Indian origin) with ML II or ML III. The mutations were identified by the study of both cDNA and gDNA. We have identified five different mutations in the GNPTAB gene. Two mutations were previously described in the literature: S399F and c.3503delTC and three are new mutations: c.440delT, I403T and E667X. In the GNPTG gene we have found two novel mutations: c.610-1G>T and c.639delT. Patients carrying mutations previously described in the GNPTAB gene (S399F and 3503delTC) presented similar phenotypes to those manifested by other patients with the same mutations described elsewhere. The present work enabled the establishment of a genotype-phenotype correlation for the novel mutations, I403T, E667X and 440delC (this one in homozygosity) showing that the first one seems to be associated with ML IIIA and the last two with the more severe ML II. The patient with mutations in the GNPTG gene (c.610-1G>T and c.639delT) presents a phenotype compatible with ML IIIC. The results obtained in this study also led to the revision of the initial clinical classification, some patients classified as ML II were after the molecular analysis classified as ML III (A or C) and vice-versa. An interesting result of our mutation analysis was that the most frequent disease allele among the Portuguese patients - c.3503delTC, which was harboured by 9 out the 18 mutant alleles (50%), was also the most common among a group of patients of Arab-Muslin origin studied by Bargal et al. (2006). This finding prompted us to perform a haplotypic analysis in order to address the question of whether the mutation had a single origin or, contrarily, whether it was a recurrent mutation. The results seem to indicate that in Portuguese and Arab Muslim patients the c.3503delTC disease chromosomes share a common origin. As to the mRNA expression, the values obtained by relative quantification using real time RT-PCR indicate that the presence of frameshift or nonsense mutations in the GNPTAB gene (c.440delC, c.3503delTC and p.E667X) was associated with a significant decrease in mRNA GNPTAB levels comparatively to the median controls value. Since these substitutions results in the formation of transcripts with premature termination codons, reduction in mRNA might reasonably be explained by the transcripts involvement in the NMD pathway. In the case of missense mutations (S399F and I403T) values of mRNA did not significantly differ from the median controls value. On the other hand, in the patient with alterations in the GNPTG gene (c.610-1G>T/c.639delT compound heterozygote) the mRNA GNPTG levels were found to be significantly decreased in comparison to the reference value. The results obtained with this study constitute, until now, the only molecular characterisation data of these pathologies in Portugal, contributing also to extend the knowledge of ML II and ML III causing mutations worldwide. Additionally, the strategies developed for mutation analysis, constitute valuable tools that will allow carrier detection and prenatal molecular diagnosis, leading to the improvement of genetic counselling with great benefits for the affected families.