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Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES Permethrin (PM) is a Type I synthetic pyrethroid (SP) widely used in crops and especially in domestic environments to control harmful insects. Pyrethroids are considered safe, with low mammalian toxicity. However, studies have indicated the potential toxic effects of this compound to developing organisms. The present work aimed to investigate the toxicity mechanisms of PM on behavior, redox homeostasis and cellular respiration from early stages of development until the adulthood. This work was divided into two chapeters: (I) lethal and non-lethal PM concentrations were determined in acutely exposed zebrafish larva, where the LC50 was found to be 108 μg/L in this model and the sublethal concentrations of 25 and 50 μg/L were determined and used for subsequent analyzes. It was observed that both concentrations were able to cause redox unbalance, leading to the increased reactive oxygen species (ROS). Consequently, oxidative damage on biomolecules, genotoxicity and apoptosis induction was also observed. On the other hand, there was activation of the antioxidant defense system, which was not sufficient to neutralize oxidative damage, characterizing the oxidative stress state due to exposure to PM. At this same stage itwas observed a significant decrease in cellular respiration and a shift in aerobic energy metabolism, which, alltogether with oxidative damage, could influence the anxiety-related non-motor behavioral changes observed in chapter I. In chapter (II) the effects of PM exposure on zebrafish development were assessed by determining behavioral patterns at key developmental stages. At this stage the zebrafish embryos were exposed only during the first 24h of development. We observed that exposure was able to alter basal behaviors such as spontaneous movements even during the embryonic stage, as well as in the later stages of development until adulthood. Behaviors related to anxiety and fear were altered during the larval period and persisted until adulthood, when increase of aggressiveness parameters were also observeded. These results indicate that damage caused by embryonic exposure to PM persisted during development and led to behavioral changes in adulthood, which may be related to anxiety and depression disorders. Taken together, the two chapters of the study corroborate to the understanding of the toxicity mechanisms of PM on developing organisms and their relationship with behavioral disorders, and contribute to the validation of the zebrafish model for neurodevelopmental studies linked to environmental contaminants. A permetrina (PM) é um inseticida sintético piretróide do tipo I e amplamente utilizada no campo e principalmente em ambientes domésticos no controle de insetos nocivos. Os piretróides são considerados relativamente seguros, com baixa toxicidade em mamíferos. No entanto, estudos tem indicado importante potencial tóxico desse composto sobre organismos em desenvolvimento. O presente trabalho teve como objetivo investigar os mecanismos de toxicidade da PM sobre o comportamento, homeostase redox e respiração celular de peixes-zebra em estágios iniciais do desenvolvimento até a fase adulta. Este trabalho foi dividido em duas etapas: (I) foram determinadas as concentrações letais e não letais de PM em larvas de peixe-zebra expostas de forma aguda, onde foram determinadas a CL50 de 108 μg/L e as concentrações subletais de 25 e 50 μg/L foram utilizadas para as subsequentes análises. Foi observado que ambas as concentrações foram capazes de causar desbalanço redox, levando ao aumento de espécies reativas de oxigênio (EROS). Consequentemente, foram observados danos oxidativos sobre biomoléculas, genotoxicidade e indução de apoptose. Em contrapartida, houve ativação do sistema de defesa antioxidante, os quais não foram suficientes para neutralizar os danos oxidativos, caracterizando o estado de estresse oxidativo em decorrência a exposição à PM. Nesta mesma etapa, observamos significativa diminuição da respiração celular e desvio da via aeróbica, os quais, em conjunto com os danos oxidativos poderiam influenciar as alterações comportamentais não-motoras ligadas a ansiedade observadas na etapa I. Na etapa (II) foram avaliados os efeitos da exposição a PM sobre o desenvolvimento de peixe-zebra por meio da determinação de padrões comportamentais em estágios chave do desenvolvimento. Nesta etapa os embriões de peixe-zebra foram submetidos a uma única exposição ao inseticida durante as primeiras 24h do desenvolvimento e subsequentemente, os comportamentos foram avaliados nas diferentes fases do desenvolvimento até a fase adulta. Observou-se que a exposição foi capaz de alterar comportamentos basais como os movimentos espontâneos ainda durante o estágio embrionário, assim como nos estágios posteriores do desenvolvimento até a fase adulta. Comportamentos ligados à ansiedade e medo foram significativamente alterados durante o período larval e persistiram até a fase adulta, quando também foram observados aumento nos parâmetros de agressividade. Estes resultados indicam que os danos provocados pela a exposição embrionária à PM persistiram durante o desenvolvimento e levaram a alterações comportamentais na fase adulta, os quais podem estar relacionados com distúrbios de ansiedade e depressão. Dados em conjunto, as duas etapas do estudo corroboram para o entendimento dos mecanismos de toxicidade da PM sobre organismos em desenvolvimento e sua relação com distúrbios comportamentais, além de contribuir na validação do modelo de peixe-zebra para estudos de neurodesenvolvimento ligados a contaminantes ambientais.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2017. A frutose é um monossacarídeo presente naturalmente em alimentos como frutas, cana-de-açúcar, beterraba, mel, entre outros. Por ter sabor mais doce que a glicose e a sacarose, a indústria alimentícia utiliza a frutose como um de seus principais adoçantes, fazendo com que o consumo de frutose tenha aumentado de forma alarmante nas últimas décadas. O consumo de bebidas adoçadas contendo grandes quantidades de frutose, principalmente refrigerantes, é considerado um dos principais fatores associados ao desenvolvimento de síndrome metabólica e diabetes. Além disso, por ser uma molécula mais reativa que a glicose, o consumo de frutose está associado ao aumento na formação de metabólitos intermediários tóxicos, dentre os quais, o metilglioxal (MGO). O MGO parece estar associado ao desenvolvimento e a progressão de diabetes e doença de Alzheimer, uma vez que indivíduos portadores dessas patologias apresentam concentrações aumentadas de MGO no plasma e no líquido cefalorraquidiano. Além disso, dados prévios do nosso grupo e da literatura já demonstraram que o MGO prejudica os sistemas antioxidantes da glioxalase (Glo1/Glo2) e da tiorredoxina (Trx/TRxR), levando a degradação das proteínas tiorredoxina e glioxalase 2. Porém, estes efeitos foram investigados somente em linhagens celulares, e não há dados com o uso de sistemas mais complexos, como estudos in vitro com tecidos ou in vivo. Além disso, o efeito do MGO sobre a enzima antioxidante GR ainda é desconhecido e, visto que a GR apresenta estrutura muito similar a TrxR, e também por possuir cisteínas reativas, é possível que o MGO também afete a atividade e expressão da GR. Dessa forma, no presente trabalho objetivou-se investigar os efeitos do consumo crônico de frutose in vivo sobre o perfil metabólico e os parâmetros comportamentais de camundongos. Além disso, foram investigados em modelos in vitro de fatias hipocampais os efeitos do MGO sobre os sistemas da glioxalase, da tiorredoxina e da glutationa redutase. E ainda, investigou-se em modelo de células neurais HT22, se as diminuições dos níveis de Trx1 e Glo2, induzidos pelo MGO, poderiam ser mediados por degradação proteassomal ou autofágica, bem como se esses efeitos são mediados pela indução da ativação da proteína cinase ativada por AMP (AMPK). Os dados obtidos demonstram que o consumo de frutose em camundongos causa diminuição do consumo alimentar, aumento do consumo calórico e do peso corporal, aumento de colesterol total e da fração LDL, aumento dos níveis de glutationa e da atividade da Glo1 no fígado, aumento da atividade da glutationa peroxidase no córtex pré-frontal, bem como induz aumento da atividade locomotora. Com relação ao MGO, foi demonstrado que o tratamento in vitro de fatias de hipocampo com MGO compromete a atividade e o imunoconteúdo de GR em fatias hipocampais, diminui os níveis de glutationa (GSH) e induz uma rápida e robusta resposta das proteínas GR, Glo1, Glo2, Gr e TrxR1. Além disso, nossos dados demonstram que existe um claro efeito sinérgico entre e toxicidade induzida pelo MGO e a inibição da GR e da TrxR, sugerindo a toxicidade induzida pelo MGO é mediada pela depleção de antioxidantes celulares. Com relação aos estudos in vitro com células HT22, foi demonstrado que o MGO induz autofagia via ativação de AMPK, e que a Trx1 e a Glo2 são degradadas através da autofagia. Dessa maneira, a partir dos dados apresentados neste estudo, conclui-se que o consumo de frutose está relacionado a alterações no perfil lipídico e causa alterações comportamentais relacionadas ao aumento da locomoção. Além disso, nossos dados reforçam a hipótese de que alterações no ambiente redox podem ser o principal mecanismo de toxicidade induzido pelo MGO através de sua ação sobre os sistemas redutores de tiol GSH/GR e Trx/TrxR, bem como a indução da degradação proteica através da ativação de autofagia, mediada via AMPK. Abstract : Fructose is a monosaccharide naturally present in foods such as fruits, sugarcane, beets, honey, among others. Because it tastes sweeter than glucose and sucrose, the food industry uses fructose as one of its main sweeteners, causing fructose consumption to rise alarmingly in the last decades. The consumption of sweetened beverages containing large amounts of fructose, mainly soft drinks, is considered one of the main factors associated with the development of metabolic syndrome and diabetes. In addition, because fructose is a more reactive molecule than glucose, the consumption of fructose is associated with an increase in the formation of toxic intermediate metabolites, among them methylglyoxal (MGO). MGO appears to be associated with the development and progression of diabetes and Alzheimer's disease, since individuals with these conditions have increased concentrations of MGO in the plasma and cerebrospinal fluid. Furthermore, previous data from our group and the literature have demonstrated that MGO seems to impair the antioxidant systems of glyoxalase (Glo1/Glo2) and thioredoxin (Trx/TRxR), leading to the degradation of the proteins thioredoxin and glioxalase 2. However, these effects were investigated only in cell lines, and there are no data with the use of more complex systems, such as in vitro studies with tissues or in vivo studies. Also, the effect of MGO on the antioxidant enzyme glutathione reductase (GR) is still unknown and, since GR has a structure very similar to TrxR, and also because it has reactive cysteines, it is possible that MGO also affects the activity and expression of GR. Thus, the present work aimed to investigate the effects of chronic consumption of fructose in vivo on the metabolic profile and behavioral parameters of mice. In addition, the effects of MGO on the glyoxalase, thioredoxin and glutathione reductase systems were investigated in in vitro models of hippocampal slices. Furthermore, it was investigated in a neural HT22 cell model if the MGO-induced decreases in the levels of Trx1 and Glo2 was mediated by proteassomal or autophagic degradation, as well as whether those effects were mediated by the induction of the AMP-activated protein kinase (AMPK) activation. The data obtained demonstrate that the consumption of fructose in mice causes a decrease in food consumption, an increase in caloric intake and body weight, increase in total cholesterol and LDL fraction, increase of glutathione (GSH) levels and Glo1 activity in the liver, increase in the activity of the glutathione peroxidase in the prefrontal cortex, as well as an increase in locomotor activity. With respect to MGO, we found that in vitro treatment of hippocampal slices with MGO has compromised the activity and immunocontent of GR, decreased GSH levels and induced a rapid and robust response of GR, Glo1, Glo2, and TrxR1. In addition, our data demonstrate that there is a clear synergistic effect between MGO-induced toxicity and inhibition of GR and TrxR, suggesting that MGO-induced toxicity is mediated by depletion of cellular antioxidants. With respect to in vitro studies with HT22 cells, it has been shown that MGO induces autophagy via AMPK activation, and that Trx1 and Glo2 are degraded through autophagy. Thus, from the data presented in this study, it is concluded that the consumption of fructose is related to changes in the lipid profile and causes behavioral changes related to increased locomotion. In addition, our data reinforce the hypothesis that changes in the redox environment may be the main mechanism of toxicity induced by MGO through its action on GSH / GR and Trx / TrxR thiol reducing systems, as well as the induction of protein degradation through autophagy activation, mediated through AMPK activation.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2017. A doença de Parkinson (DP) é a segunda doença neurodegenerativa mais comum em humanos, sendo classicamente caracterizada por sintomas motores que estão relacionados à degeneração de neurônios dopaminérgicos da via nigroestriatal. A etiologia da DP ainda não é completamente compreendida, mas acredita-se que se trata de uma doença multifatorial, onde fatores genéticos e ambientais influenciam no seu desenvolvimento. Entre os fatores ambientais, a exposição a pesticidas, como o ziram (dimetilditiocarbamato de zinco), vem ganhando destaque. A exposição ocupacional e residencial ao ziram foi recentemente relacionada ao aumento do risco do desenvolvimento da DP. Diferentes sais de dimetilditiocarbamato são amplamente utilizados na agricultura e indústria, expondo a população em geral aos seus efeitos tóxicos. Estes contaminantes ambientais podem atingir estruturas encefálicas através do sistema olfatório, via nervos olfatório e trigêmeo, ou mesmo pela passagem transcelular a partir da mucosa nasal. Neste sentido, este estudo teve como objetivo avaliar os efeitos da administração intranasal (i.n.) de dimetilditiocarbamato de sódio (NaDMDC), um sal mais solúvel de dimetilditiocarbamato, sobre os comportamentos motores e as alterações bioquímicas relacionadas ao estresse oxidativo/nitrosativo, inflamação e sistema dopaminérgico de camundongos. Além disso, avaliou-se possíveis alterações no sistema melatoninérgico (níveis de melatonina e seus receptores MT1 e MT2) no sistema nervoso central (SNC) de camundongos após a administração i.n. de NaDMDC e o efeito do tratamento com a melatonina sobre as alterações comportamentais e bioquímicas induzidas pelo NaDMDC. A administração de NaDMDC (1 mg/narina/dia) por quatro dias consecutivos induziu déficits motores avaliados no teste do campo aberto, escore neurológico de severidade (ENS) e rotarod até o dia 7 após a última administração da toxina. Os déficits comportamentais no teste do rotarod assim como a redução da massa corporal induzida pelo NaDMDC foram observados até o 35o dia após o término da administração. O tratamento com os fármacos usados no tratamento da DP L-DOPA e apomorfina atenuaram os déficits locomotores induzidos pelo NaDMDC. As alterações comportamentais foram relacionadas ao aumento inicial dos níveis de espécies reativas de oxigênio (EROs) no bulbo olfatório (BO) e estriado, 2 horas e 24 horas após a última administração, além de dano a membrana celular no estriado, a qual demonstrou ser mais susceptível a toxicidade exercida pelo NaDMDC. A administração de NaDMDC também provocou o aumento de metabólitos do estresse oxidativo/nitrosativo no BO, estriado, córtex pré-frontal e hipocampo, assim como o aumento nos níveis do fator de necrose tumoral-a (TNF-a) no BO e estriado, 24 horas após a última administração de NaDMDC. Com relação ao sistema dopaminérgico, a administração de NaDMDC provocou um aumento no imunoconteúdo de tirosina hidroxilase (TH) no estriado, no 1o e 7o dia após a última administração de NaDMDC, e a sua redução no 35o dia. No dia 1 após o tratamento com NaDMDC observou-se uma redução nos níveis de dopamina e o aumento no seu turnover no estriado. Com relação ao sistema melatoninérgico, a administração de NaDMDC aumentou os níveis de melatonina no BO, nos dias 1 e 7, e no hipocampo no dia 1. Além disso, observou-se um aumento no dia 1 após o término do tratamento com NaDMDC no imunoconteúdo do receptor melatoninérgico MT2 no BO. O tratamento com melatonina (30 mg/kg, via intraperitoneal), 1 h antes de cada administração de NaDMDC, preveniu o aparecimento de déficits motores, perda de massa corporal, alterações do sistema dopaminérgico, assim como, inibiu o aumento de metabólitos do estresse oxidativo/nitrosativo no BO, estriado e córtex pré-frontal dos animais. Em conjunto, estes resultados demonstram que a administração i.n. de NaDMDC provoca alterações comportamentais e bioquímicas em camundongos relacionadas à DP. O presente estudo demonstra de maneira pioneira que o tratamento com a melatonina possui efeitos neuroprotetores frente à toxicidade exercida pelo NaDMDC, o que destaca o potencial terapêutico deste neuro-hormônio em condições de dano neuronal. Abstract : Parkinson's disease (PD) is the second most common neurodegenerative disease in humans, being classically characterized by motor symptoms, which are related to the dopaminergic neuronal loss in the nigrostriatal pathway. The primary PD etiology remais unclear, but it is believed to be a multifactorial disease, where the combination of genetic and environmental factors influence its development. Among environmental factors, exposure to pesticides, such as ziram (zinc dimethyldithiocarbamate), has been highlighted. Occupational and residential exposure to ziram has recently been linked to increased risk of PD developing. Different dimethyldithiocarbamate salts are widely used in agriculture and industry, exposing the general population to their toxic effects. These environmental contaminants can target encephalic structures to exert their toxic effects via the olfactory pathway, through olfactory and trigeminal nerves, or even through transcellular passage from nasal mucosa. Therefore, this study aimed to evaluate the effects of intranasal (i.n.) administration of sodium dimethyldithiocarbamate (NaDMDC), a more soluble salt of dimethyldithiocarbamate, on motor function and biochemical changes related to oxidative/nitrosative stress, inflammation and dopaminergic system of mice. In addition, putative NaDMDC-induced alterations on the melatoninergic system in the central nervous system (CNS) and the effects of melatonin treatment on changes caused by NaDMDC were also evaluated. I.n. administration of NaDMDC (1 mg/nostril/day) for four consecutive days induced motor deficits addressed in the open field, neurological severity score (NSS) and rotarod tests up to day 7 after the last administration. Behavioral deficits in the rotarod test as well as the reduction of body mass induced by NaDMDC were found to remain significant up to 35th day after the end of its administration. Pharmacological treatment with the anti-parkinsonian drugs L-DOPA and apomorphine improved the locomotor deficits induced by NaDMDC. Behavioral changes were related to the initial increase of reactive oxygen species (ROS) levels in the olfactory bulb (OB) and striatum, 2 hours and 24 hours after the last administration, besides cell membrane damage in the striatum, which proved to be more susceptible to NaDMDC toxicity. The administration of NaDMDC also increased oxidative/nitrosative stress metabolites in OB, striatum, prefrontal cortex and hippocampus, as well as increased tumor necrosis factor-a (TNF-a) levels in the BO and striatum, 24 hours after the last NaDMDC administration. Regarding the dopaminergic system, administration of NaDMDC increased striatal tyrosine hydroxylase (TH) immunocontent on the 1st and 7th day after the last administration of NaDMDC, and decreased TH levels in the 35th day. On day 1, there was a reduction in dopamine levels and an increase in dopamine turnover in the striatum. Regarding the melatoninerg system, the administration of NaDMDC increased the OB melatonin levels on days 1 and 7, whereas in the hippocampus only on day 1. In addition, on day 1 after the end of NaDMDC treatment, the immunocontent of melatonin MT2 receptor was increased in the OB. Treatment with melatonin (30 mg/kg intraperitoneally), 1 h before each administration of NaDMDC, prevented the onset of motor deficits, loss of body mass, changes in the dopaminergic system, as well as inhibited the increase of stress oxidative/nitrosative metabolites in OB, striatum and prefrontal cortex in animals. Taken together, these results demonstrate that i.n. NaDMDC administration promotes behavioral and biochemical changes in mice, related to PD in humans. These findings reinforce the relationship of dimethyldithiocarbamate exposure with increased PD development risk, as well as highlight the importance of olfactory vectoring of environmental toxins as a possible access route to the CNS. Finally, we demonstrated for the first time that treatment with melatonin exerts neuroprotective effects against the NaDMDC toxicity, reinforcing the therapeutic potential of this neurohormone in neuronal damage conditions including PD.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2017. Nrf2 (do inglês Nuclear factor erythroid 2-related factor 2) é um fator de transcrição essencial para a indução coordenada dos genes que codi-ficam enzimas de resposta ao estresse oxidativo, incluindo várias defe-sas antioxidantes e enzimas de biotransformação. Sua ação é dependente da ligação ao elemento de resposta antioxidante (ARE) na região promotora dos genes-alvo. A indução da via Nrf2/ARE oferece enorme potencial para a proteção antioxidante, no entanto, não há pesquisa sobre a ativação desta via em bivalves. Desta forma, o presente trabalho investigou a resposta antioxidante nas brânquias e glândula digestiva de ostras do Pacífico, Crassostrea gigas, tratadas com indutores da via Nrf2/ARE (curcumina ou tert-butilhidroquinona, tBHQ). Com a anotação do genoma da ostra Crassostrea gigas analisamos as regiões conservadas do gene do Nrf2 que revelou um domínio típico, a região cap 'n' colar. Os dados indicam que vários domínios, pertencentes ao modulador negativo do Nrf2 (Keap1, do inglês Kelch-like ECH-associated protein 1), também estão conservados em moluscos. Nossos estudos indicam que Nrf2 e Keap1 são conservados em ostras, pois o Keap1 apresentou um alto grau de homologia nas espécies selecionadas de moluscos e vertebrados, incluindo a presença de cisteínas redox-sensíveis que são cruciais para sua função. A análise filogenética agrupou tanto o Nrf2 quanto o Keap1 de C. gigas juntamente com outras sequências de moluscos, mas separadas de vertebrados e artrópodes. As ostras C. gigas foram expostas a 10 ou 30 µM de curcumina ou tBHQ, ativadores clássicos da via Nrf2/ARE, porém o número de cópias de mRNA de Nrf2 e Keap1 não foram modulados na brânquia. Estes dados indicam que estes compostos não modularam transcricionalmente Nrf2 ou Keap1. Apesar deste resultado negativo, a principal forma de ativação do Nrf2 envolve a oxidação das cisteínas sensíveis de seu modulador negativo (Keap1), permitindo seu acúmulo e translocação para o núcleo. Desta forma, ao analisarmos a resposta antioxidante, pode ser observada uma clara indução de defesas antioxidantes nas brânquias, as quais são sabidamente controladas pelo Nrf2. Noventa e seis horas após o início do tratamento, os animais expostos à curcumina (10 e 30 µM), tiveram um aumento nos níveis de ?-glutamil-L-cisteinilglicina (GSH), e na atividade glutationa redutase (GR), glutationa peroxidase (GPx), e glutationa S-transferase (GST). Por outro lado, a glândula digestiva não apresentou amplificação antio-xidante. Os níveis relativos de mRNA que codificam para a enzima glutamato-cisteína ligase, GR, MDR3 e GSTpi foram claramente indu-zidos pelo tratamento com curcumina (30 µM, 24 h). O pré-tratamento com curcumina durante 96 h aumentou a sobrevivência das ostras ao hidroperóxido de cumeno. Da mesma forma, ostras expostas à tBHQ por 96 h apresentaram um claro aumento nas defesas antioxidantes na brânquia e em menor intensidade na glândula digestiva. Esta resposta incluí aumento nos níveis de GSH, e na atividade GST, GPx e GR. Aumento na expressão do mRNA e proteína GR, também foram observadas após tratamento com tBHQ. Interessantemente, a diminuição na atividade GST, GPx e GR no início do tratamento (24 h) pode ser explicada pelo efeito inibitório da tBHQ ou de seus metabólitos. Esta conclusão é baseada na forte inibição in vitro da atividade GR, e em menor intensidade das atividades de GST e GPx. Apesar da ausência de aumento no mRNA do Nrf2, verificamos que: a) tanto o Nrf2 quanto o Keap1 são conservados filogeneticamente em bivalves; b) houve um aumento de defesas antioxidantes dependentes do Nrf2 após o tratamento com dois indutores clássicos do Nrf2 (curcumina ou tBHQ); c) houve uma clara modulação nos níveis de mRNA de vários genes alvos do Nrf2, e d) o tratamento com curcumina aumenta a resistência de ostras desafiadas com um oxidante. Em conjunto, estes dados indicam pela primeira vez a funcionalidade de Nrf2 em bivalves. Este trabalho apresenta novas informação sobre a via Nrf2/ARE em bivalves, as quais permitirão estudos mecanísticos relacionados as defesas antioxidantes e processos de biotransformação. Abstract : Nrf2 (Nuclear factor erythroid 2-related factor 2) is an essential transcription factor for the coordinated induction of genes encoding oxidative stress response enzymes, including several antioxidant defenses and biotransformation enzymes. Its action is dependent on the binding to the antioxidant response element (ARE) in the promoter region of the target genes. Induction of the Nrf2/ARE pathway offers enormous potential for antioxidant protection, however, there is no research on the activation of this pathway in bivalves. Thus, the present work investigated the antioxidant response in the gills and digestive gland of Pacific oysters, Crassostrea gigas, treated with inducers of the Nrf2/ARE pathway (curcumin or tert-butylhydroquinone, tBHQ). With the annotation of the genome of the Crassostrea gigas oyster we analyzed the conserved regions of the Nrf2 gene that revealed a typical domain, the cap 'n' colar region. The data indicate that several domains, belonging to the negative modulator of Nrf2 (Keap1), are also conserved in mollusks. Our studies indicate that Nrf2 and Keap1 are conserved in oysters because Keap1 presented a high degree of homology to selected species of molluscs and vertebrates, including the presence of redox-sensitive cysteines that are crucial for their function. Phylogenetic analysis grouped both the Nrf2 and Keap1 of C. gigas along with other mollusc sequences but separated from vertebrates and arthropods. C. gigas oysters were exposed to 10 or 30 µM curcumin or tBHQ, classical activators of the Nrf2 / ARE pathway, but the number of mRNA copies of Nrf2 and Keap1 were not modulated in the gill. These data indicate that these compounds do not transcriptally modulate Nrf2 or Keap1. Despite this negative result, the main form of activation of Nrf2 involves the oxidation of the sensitive cysteines of its negative modulator (Keap1), allowing its accumulation and translocation to the nucleus. Thus, when analyzing the antioxidant response, a clear induction of antioxidant defenses can be observed in the gills, which are known to be controlled by Nrf2. Ninety-six hours after initiation of treatment, animals exposed to curcumin (10 and 30 µM) had an increase in ?-glutamyl-L-cysteinyl glycine levels (GSH), and glutathione reductase (GR) activity, glutathione peroxidase (GPx), and glutathione S-transferase (GST). On the other hand, the digestive gland did not present antioxidant amplification. The relative levels of mRNA encoding glutamate-cysteine ligase, GR, MDR3 and GSTpi were clearly induced by curcumin treatment (30 µM, 24 h). Curcumin pre-treatment for 96 h increased oyster survival to cumene hydroperoxide. Likewise, oysters exposed to tBHQ for 96 h showed a clear increase in antioxidant defenses in the gill and lower intensity in the digestive gland. This response included increase in GSH levels, and in GST, GPx and GR activity. Increased mRNA and GR protein expression were also observed after treatment with tBHQ. Interestingly, the decrease in GST, GPx and GR activity at the start of treatment (24 h) may be explained by the inhibitory effect of tBHQ or its metabolites. This conclusion is based on the strong in vitro inhibition of GR activity, and on lower intensity of GST and GPx activity. Despite the lack of increase in the Nrf2 mRNA, we verified that: a) both Nrf2 and Keap1 are conserved phylogenetically in bivalves; B) there was a clear increase of Nrf2-dependent antioxidant defenses following treatment with two classic Nrf2 inducers (curcumin or tBHQ); C) there was a clear amplification at the mRNA level of various target genes of Nrf2, and d) curcumin treatment increased the resistance of oysters challenged with an oxidant. Together, these data indicate for the first time the functionality of Nrf2 in bivalves. This work presents new information about the Nrf2/ARE pathway in bivalves, which will allow mechanistic studies related to the antioxidant defenses and biotransformation processes.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2017. Tióis celulares estão entre os principais alvos das espécies reativas de oxigênio (ERO), portanto, estão no centro dos processos redox celulares. A oxidação de tióis proteicos pode levar à perda de função de enzimas, modulação de vias de sinalização e morte celular; assim, a manutenção do estado redox destes tióis é crucial para a homeostasia celular. Os sistemas da glutationa (GSH) e da tiorredoxina (Trx) são considerados os principais tampões redox celulares e são os principais sistemas envolvidos na manutenção do estado redox celular. A contínua reciclagem das formas oxidadas da GSH e Trx pelas enzimas glutationa redutase (GR) e tiorredoxina retudase (TrxR) é crucial para este processo, mantendo o contínuo fluxo de elétrons para peroxidases. A glutationa peroxidase (GPx) e as peroxirredoxinas (Prx) estão entre as peroxidases mais eficientes. As Prx são consideradas sensores de H2O2, participando de vias de sinalização redox, sendo o estado de oxidação de sua cisteína catalítica um marcador de estresse oxidativo. A perda da homeostasia redox tem sido correlacionada com diversas situações patológicas, como inflamação e câncer. Dessa forma, o presente trabalho tem como objetivo analisar a importância dos sistemas da GSH e Trx na proteção de células contra oxidantes, além de estudar a modulação redox das Prx durante a fagocitose em neutrófilos. No primeiro trabalho investigamos o efeito de 2-acetylamino-3-[4-(2-acetylamino-2- carboxyethylsulfanylthiocarbonylamino)phenylthiocarbamoylsulfanyl] propionic acid (2-AAPA), um inibidor da GR, sobre parâmetros de viabilidade celular e balanço redox em células derivadas de glioblastoma humano A172. Nossos dados demonstram que o 2-AAPA, além de inibir a GR, também é um potente inibidor da TrxR. A inibição dessas enzimas por 2-AAPA diminuiu drasticamente a capacidade dessas células em metabolizar peróxidos orgânicos, deixando as células mais vulneráveis a este peróxido. 2-AAPA apresentou um perfil de toxicidade tempo- e concentração-dependente. A oxidação da Prx 1, Prx2 e Prx3 foi observada apenas na concentração tóxica de 100µM, após 30 min de incubação. 2-AAPA também causou uma severa disfunção mitocondrial, afetando o potencial de membrana e respiração acoplada a produção de ATP. Apresentamos evidências de que a oxidação de peroxirredoxinas e disfunção mitocondrial são eventos precoces na toxicidade de 2-AAPA a células A172. Coletivamente, esses dados reforçam a hipótese do papel central dos sistemas da GSH e Trx na proteção de células a agentes oxidantes, e reforça a hipótese de que a inibição conjunta de GR e TrxR pode ser uma estratégia interessante para o tratamento de câncer. No segundo trabalho, estudamos a modulação redox de Prx durante o burst oxidativo em células pró-mielocíticas HL60 diferenciadas em neutrófilos. Demonstramos que a diferenciação dessas células com DMSO diminui a expressão da Prx2 de uma maneira tempo dependente, mas não alterou os níveis de Prx1, indicando um possível papel regulatório da Prx2 na diferenciação dessas células por DMSO. Enquanto isso, a diferenciação com ATRA não alterou os níveis de Prx2. A estimulação das células diferenciadas com forbol miristato acetato ou staphylococcus aureus induziu o burst oxiativo nas células diferenciadas, levando à oxidação da Prx1 de uma maneira tempo-dependente. A oxidação da Prx1 foi dependente da atividade da NADPH oxidase, já que a sua inibição aboliu esse efeito. Além disso, demonstramos que a inibição da NADPH oxidase por Diphenyleneiodonium chloride diminui a oxidação basal da Prx1. Por último, discutimos os resultados apresentados com dados obtidos em neutrófilos durante a minha estadia no Center for Free Radical Research da Nova Zelândia, sob orientação da Christine Winterbourn. Mostramos que as Prx estão completamente oxidadas em condições basais, um fenômeno nunca antes observado. Assim, apresentamos dados relevantes que podem ter implicações importantes para a sinalização redox e, consequentemente, para a função de células inflamatórias. De modo geral, os dados apresentados ressaltam a importância da modulação do ambiente redox na função e morte celular. Abstract : Thiol groups are amongst the main targets of reactive oxygen species (ERO), therefore they are at the center of all redox processes in the cell. Protein thiol oxidation can lead to loss of function, response signaling and cell death and, hence, the maintenance of thiols in cell is critical for cellular homeostasis. The glutathione (GSH) and thioredoxin (Trx) systems are the main redox buffers in cells. The continuous recycling of the oxidized forms of GSH and Trx is achieved by the action of glutathione reductase (GR) and thioredoxin reductase (TrxR), which keep the constant supply of electrons for the peroxidases. Among these, the peroxiredoxins (Prx) have a special role, acting as a peroxide sensor and marker of oxidative stress. The loss of redox homeostasis has been linked to several pathologies such as inflammation and cancer. Therefore, this work aims at study the importance of the GSH and Trx systems to cell protection against oxidants, and to analyze the redox modulation of Prx during inflammatory processes. In the first work, we investigated the effect of 2-acetylamino-3-[4-(2-acetylamino-2- carboxyethylsulfanylthiocarbonylamino)phenylthiocarbamoylsulfanyl]propionic acid (2-AAPA), an inhibitor of GR and TrxR, on parameters of cell viability and redox balance in A172 glioblastoma cells. The inhibition of these enzymes drastically reduced cell?s capacity to metabolized organic peroxides (but not H2O2) and, consequently, rendered cells more susceptible to organic peroxide. 2-AAPA also displayed a time and concentration dependent toxicity. We observed a marked oxidation of Prx 1, 2 and 3, as well as a severe mitochondrial dysfunction. Collectively, our results highlight the importance of GSH and Trx systems to cell?s protection against oxidants. Also, we present evidence that oxidation of Prx and mitochondrial dysfunction are early events in 2-AAPA toxicity to A172 cells. In the second work, we studied the redox modulation of Prx during oxidative burst in differentiated promyelocytic HL60 cells. We demonstrated that the differentiation of these cells to a neutrophil-like phenotype with dimethylsulfoxide (DMSO) greatlydiminished Prx2 expression in a time-dependent manner, but didn´t change Prx1 expression. Pharmacological stimulation or exposure to microbes induced the oxidative burst in the differentiated cells, leading to Prx1 oxidation in a time-dependent manner. Oxidation of Prx1 was dependent on NADPH oxidase, because inhibition of this enzyme abolished this effect. Furthermore, inhibition of the oxidase by Diphenyleneiodonium chloride reduced the basal oxidation of Prx1 in unstimulated cells. Lastly, we discuss the presented results with data obtained from human neutrophils during my stay at the Center for Free Radical Research in New Zealand under supervision of Christine Winterbourn. We show for the first time that the Prx are completely oxidized under unstimulated conditions. Therefore, the presented results may have important implications for the role of Prx in inflammatory cells function. Overall, this thesis highlights the central role of the modulation of the redox environment to cell function and death, as well as shows, for the first time, a Prx fully oxidized in unstressed conditions.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Neurociências, Florianópolis, 2016. O metilglioxal (MG) é uma toxina endógena sintetizada em diversas vias metabólicas, sendo a glicólise a principal delas. O aumento nos níveis de MG foi associado a transtornos de humor, como a depressão e a ansiedade, além de ser considerado um dos principais agentes causais do envelhecimento e de doenças neurodegenerativas. Contudo, não se sabe quais são os mecanismos moleculares envolvidos na indução desses efeitos. Assim, no presente trabalho foram avaliados os efeitos comportamentais e neuroquímicos após administração via intraperitoneal (i.p.) aguda e repetida de MG, em camundongos Swiss fêmeas, com 3 meses de idade. Os animais que receberam MG tiveram um aumento de imobilidade no teste da suspensão da cauda (TSC), tanto 15 minutos (25 - 200 mg/kg) ou 4 h após uma única administração de MG (10 e 25 mg/kg). Administrações repetidas de MG (1 injeção diária por 6 dias consecutivos de 10 e 25 mg/kg, seguida do TSC 24 h após a última injeção) também levou a um aumento no tempo de imobilidade no TSC. Este efeito tipo-depressivo não pode ser atribuído a uma alteração na atividade locomotora dos animais, uma vez que esta não foi afetada no teste do campo aberto. O MG 10 mg/kg induziu um efeito ansiolítico no TCA, uma vez que o tempo no centro foi aumentado 4 h após o tratamento com MG, o que já havia sido relatado na literatura. Este efeito ansiolítico também foi observado no teste da caixa claro/escuro, onde os animais tratados com MG (25 mg/kg) permaneceram mais tempo na área clara 4 h após a administração de MG. Este mesmo efeito foi observado no tratamento com doses repetidas de MG. As análises bioquímicas revelaram que o tratamento com MG (10 e 25 mg/kg) não é capaz de alterar os níveis de glutationa, e a expressão das enzimas glutamato-cisteína ligase, glutathiona redutase, glioxalase 1 e tiorredoxina redutase no hipocampo, estriado e cortex cerebral, exceto pelo aumento da atividade TrxR no hipocampo. O comportamento do tipo-depressivo induzido pelo MG não foi encontrado em outros trabalhos com injeção intracerebroventricular e por períodos prolongados, entretanto os testes comportamentais de forma aguda (15 min e 4 h) e administrações repetidas foram bastante consistentes. O conhecido efeito ansiolítico foi confirmado pelos nossos dados experimentais, cujo mecanismo de ação parece envolver os receptores GABAA. O conjunto de dados, juntamente com aqueles apresentados por outros autores, confirmam que o MG está envolvido com a modulação de comportamentos relacionados a depressão e a ansiedade em roedores. Adicionalmente, este trabalho mostrou que o9MG não é capaz de alterar os parâmetros bioquímicos relacionados às defesas antioxidantes 4 h após a sua administração. As buscas por mecanismos de ação do MG ainda precisam ser investigadas em estudos futuros. Abstract : Methylglyoxal (MG) is an endogenous toxin synthesized in several metabolic pathways, glycolysis is the main one. The increase in MG levels has been associated with mood disorders such as depression and anxiety, besides being one of the main causative agents of aging and neurodegenerative diseases. However, it is not known which are the molecular mechanisms involved in the induction of these effects. In the present study we evaluated the behavioral and neurochemical effects after intraperitoneal (i.p.) acute and repeated MG in Swiss female mice, 3 months old. The animals that received MG had an increased immobility time in the tail suspension test (TST) for both 15 minutes (25-200 mg / kg) or 4 h after a single administration of MG (10 and 25 mg / kg). Repeated administration of MG (1 injection daily for 6 consecutive days of 10 and 25 mg / kg, followed by the TSC 24 h after the last injection) also led to an increase in immobility time in the TST. Such depressant effect can not be attributed to a change in locomotor activity of the animals, since it was not affected in the open field test. The MG 10 mg / kg induced an anxiolytic effect on the OFT, since the time was increased in the center 4 h after MG treatment, which had already been reported in the literature. This anxiolytic effect was also observed in the light /dark box test where the animals treated with MG (25 mg / kg) remained longer in the light area 4 h after MG administration. This same effect was seen in treatment with repeated doses of MG. Biochemical analysis revealed that treatment with MG (10 and 25 mg / kg) is not capable of altering levels of glutathione, and expression of glutamate-cysteine ligase enzyme glutathione reductase, glyoxalase 1 and thioredoxin reductase in the hippocampus, striatum and cerebral cortex, except for increased TrxR activity in the hippocampus. The type-depressant behavior induced by MG has not been found in other studies with intracerebroventricular injection and for prolonged periods, though the behavioral tests acutely (15 min, 4 h) and repeated administration here were quite consistent. The known anxiolytic effect was confirmed by our experimental data, whose mechanism of action appears to involve the GABAA receptor. The data set, along with those presented by other authors, confirm that the MG is involved in the modulation of behaviors related to depression and anxiety in rodents. In addition, this study showed the MG is not able to change the biochemical parameters related to the antioxidant defenses 4 h after administration. The search for MG mechanisms of action still need to be investigated in future studies.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2016. Biomarcadores são respostas rápidas podendo ser avaliados nos menores níveis de organização biológica, os quais podem detectar sinais precoces de danos a biomoléculas, tecidos, ou órgão, avaliando um determinado processo biológico. O impacto de contaminantes sobre os indivíduos podem ser avaliados, oferecendo, assim, oportunidade para a aplicação de medidas corretivas. Extensas áreas de manguezais em todo o mundo já foram perdidas, particularmente aquelas localizadas em áreas urbanas, as quais estão sob pressão devido a contaminação por efluentes domésticos. Estão presentes no esgoto sanitário metais, cosméticos, hormônios, detergentes, matéria orgânica, entre outros. Em uma primeira etapa desta tese foi estudado o efeito da exposição de ostras nativas Crassostrea brasiliana junto ao Mangue do Itacorubi, Florianópolis, SC, o qual é conhecido por estar moderadamente contaminado com esgoto sanitário. Dessa forma foi avaliada a presença de contaminantes, tais como HPAs, PCBs e LABs. As ostras da espécie C. brasiliana foram transplantadas para o Mangue do Itacorubi, apresentando várias alterações bioquímicas nas brânquias, quando comparadas a ostras transplantadas por 24 ou 96 h para um sítio de referência (Mangue de Ratones). As defesas antioxidantes (catalase, glutationa peroxidase e glutationa) foram diminuídas, apresentando um efeito mais expressivo em 96 h (primavera e outono). Os dados estão de acordo com a ideia de que as brânquias de ostras são especialmente responsivas após uma exposição aguda, neste caso a um mangue contaminado com esgoto sanitário. A contaminação de águas superficiais por cobre ocorre em todo o mundo, usualmente originado de mineração, atividades agriculturais, industriais, comerciais e residenciais. A contaminação de águas superficiais por cobre ocorre em todo o mundo, usualmente originado de mineração, atividades agriculturais, industriais, comerciais e residenciais. Os limites permitidos de cobre são variáveis entre os países, mas geralmente estão na faixa de µg/L. Estes níveis já são capazes de perturbar várias funções de peixes em seus estágios iniciais de desenvolvimento. Em uma segunda etapa da tese foram estudados os efeitos da exposição ao cobre sobre o comportamento de larvas e de indivíduos adultos do peixe paulistinha Danio rerio, além de respostas antioxidantes no peixe adulto. Indivíduos adultos e larvas do peixe paulistinha foram expostos por 96 h ao cobre (concentração nominal: 0, 5, 9, 20 e 60 µg/L; medida: 0.4, 5.7, 7.2 16.6 e 42.3 µg/L). Na concentração de cobre de 60 µg/L, as larvas tiveram uma redução de 5% no comprimento do corpo, e nos adultos prejuízo na memória espacial, decréscimo na atividade glutationa S-transferase. Exposição ao cobre não afetou o comportamento social (agressividade e interação conespecífica), nem a atividade da enzima glutationa redutase. Interessantemente, na concentração nominal de cobre de 9 µg/L a distância e a velocidade de natação das larvas foram aumentadas, e nos adultos a memória de longa duração foi abolida e a atividade da enzima glutationa S-transferase das brânquias foi diminuída. A exposição a concentrações de cobre próximas aos limites permitidos no Brasil foi capaz de alterar o desempenho natatório e perturbar o comportamento dos peixes adultos. Estes dados indicam que, os limites nacionais para o cobre em água doce podem afetar significativamente o desenvolvimento e o comportamento de peixes. Nosso trabalho indica que novos trabalhos precisam ser realizados a fim de confirmar que os níveis de cobre permitidos pela legislação brasileira não são totalmente seguros para peixes de água doce. Abstract : Biomarkers are quick responses that can be evaluated at lower levels of biological organization, which can detect early signs of damage to biomolecules, tissue, or organ, evaluating a particular biological process. The impact of contaminants on individuals can be evaluated, thus, offering the opportunity for the application of corrective measures. Extensive mangrove areas have been lost around the world, particularly those located in urban areas, which are under pressure due to contamination with domestic effluents. The sewage contains metals, cosmetics, hormones, detergents, organic matter, among others. Sanitary sewage tipically contains metals, cosmetic products, hormones, detergentes, organic mather, among others first part of this study investigated the effect of the exposure of native oyster Crassostrea brasiliana on the Itacorubi mangrove, Florianópolis, SC, which is known to be moderately contaminated with sewage. The presence of contaminants sucha as HPAs, PCBs e LABs was investigated. The Crassostrea brasiliana oysters transplanted to the Itacorubi mangrove presented several biochemical changes in the gills when compared to oysters transplanted for 24 or 96 h to a reference site (Ratones mangrove). Antioxidant defenses (catalase, glutathione peroxidase and glutathione) were decreased, showing a more significant effect in 96 h (spring and fall). The data are consistent with the idea that the oyster gills are especially responsive after acute exposure in a mangrove contaminated with sewage. Contamination of surface waters by copper occurs throughout the world, usually originated from mining, agricultural and industrial activities, as well as commercial and residential activities. Copper limits vary between countries, but generally are in µg/L range. These levels are already able to disrupt several fish functions in its early stages of development. In a second part of this work the effects of copper exposure on the behavior of larvae and adult individuals of zebrafish Danio rerio were investigated, in addition to the antioxidant responses in adult fish. Adult fish and larvae were exposed for 96 h to copper (nominal concentration: 0, 5, 9, 20 and 60 µg/L; measured: 0.4, 5.7, 16.6 7.2 and 42.3 µg/L). At the copper concentration of 60 µg/L, the larvae had a 5% reduction in the body length, and the adult fish had impaired spatial memory and activity of the enzyme glutathione S-transferase decreased. Social behavior (aggression and conespecífic interaction) and the activity of the enzyme glutathione reductase were not affected. Interestingly, at the nominal concentration of 9 µg/L of copper, the distance traveled and the swim speed were increased in the larvae, and in the adults the long-term memory was abolished, and the enzymic activity of glutathione S-transferase was decreased in the gills. Exposure to concentrations of copper close to the allowed limits was able to change the swimming performance and disrupt the behavior of adult fish. These data indicate that the national limits allowed for copper on water can significantly affect the development and the behavior of fish. This study indicates that further work are necessary in order to confirm that allowed copper levels in Brazil totally safy to fishes living in inland waters.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Neurociências, Florianópolis, 2016. Tratamento com vitamina C, ou ascorbato, diminui o comportamento tipo-depressivo em modelos animais, e já é utilizado na clínica médica como um adjuvante no tratamento da depressão. Há uma grande comorbidade entre depressão e ansiedade, sendo que até 70% dos pacientes com depressão, também possuem sintomas de ansiedade. Além disto, em estudos pré-clínicos há indícios de que a administração repetida de ascorbato tem feito ansiolítico. Com o objetivo de sistematizar o conhecimento sobre os efeitos do ascorbato sobre a ansiedade e depressão, o capítulo 1 apresenta a tradução de uma revisão a ser publicada. Além disto, hipotetizamos que uma única dose de ascorbato via oral poderia apresentar efeito ansiolítico. Para tal, avaliamos o efeito da suplementação com ascorbato no estado de ansiedade de universitários, o que é apresentado no capítulo 2. Foi utilizada uma amostra randomizada duplo-cego controlada por placebo envolvendo estudantes de pós-graduação que foram suplementados com uma única dose de ascorbato (1000 mg), ou placebo. Logo antes da ingestão do ascorbato, os participantes foram avaliados através do Inventário de Ansiedade Traço-Estado (IDATE) e Escala Analógica Visual de Humor (VAMS). Duas horas após a ingestão do ascorbato, ou placebo, os estudantes foram novamente avaliados pela IDATE Aestado e VAMS. Nenhuma diferença entre o grupo controle e o grupo ascorbato foi observada nos escores da escala IDATE A-estado e VAMS, quando todos os sujeitos foram incluídos na comparação. Os sujeitos do estudo foram, então, separados em dois grupos de acordo com seus escores na escala IDATE A-traço. O primeiro grupo foi constituído pelos indivíduos (75% da amostra) com os menores escores, sendo este considerados o grupo com traço de ansiedade baixo a moderado. O segundo grupo foi constituído pelos indivíduos (25% da amostra) com maiores escores de ansiedade, os quase foram considerados como tendo alto traço de ansiedade. Os resultados mostraram que o ascorbato reduziu os escores de ansiedade em ambas as escalas nos indivíduos com traço de ansiedade alto. Nenhuma diferença foi observada no subgrupo com traço de ansiedade baixo a moderado. O estudo avaliou uma amostra com características sociodemográficas muito limitada, composta principalmente de mulheres jovens com terceiro grau completo, limitando a generalização destes achados. Entretanto, os dados obtidos claramente indicam que o ascorbato tem um potencial efeito ansiolítico, especialmente em estudante caracteristicamente mais ansiosos. Estudos futuros avaliando os mecanismos de ação do ascorbato sobre os estados emocionais poderão fornecer evidências que apoiem esta hipótese, que se confirmada, poderá levar ao desenvolvimento de novos tratamentos. Abstract : Vitamin C, or ascorbate, treatment decreases the antidepressant-like behavior in pre-clinical animal studies and is being used in the medical practice as an adjuvant in the treatment of depression. The rate of depression and anxiety comorbidity is high, up to 70% of depressed patients also present anxiety symptoms. Beyond that, pre-clinical studies indicate that repeated administration of ascorbate present anxiolytic effects. Aiming at systematize the available knowledge over the ascorbate effects on anxiety and depression, chapter 1 presents a translated literature review to be published. Furthermore, we hypothesized that a single oral dose of ascorbate would present an anxiolytic effect. To accomplish this objective, we evaluated the effect of ascorbate supplementation on anxiety state, which is presented inchapter 2. A double blind randomized sample controlled by placebo involving post-graduation students that received a single ascorbate dose (1000 mg) or placebo. Immediately before ascorbate ingestion, the participants were evaluated by using the Trait Anxiety Inventory-State (STAI) and Visual Analog Scale of Humor (VAMS). Two hours after ascorbate, or placebo ingestion the students were assessed a second time by the STAI A-state and VAMS. No difference was found in the scale scores STAI A-state and VAMS when all subjects were included in the analysis. The subjects were then divided in two groups according to their scores on the STAI A-trait scale. The first group was composed of 75% of individuals with the lowest scores, and considered to present low to moderate trace of anxiety. The second group consisted of 25% of individuals with highest anxiety scores and considered to have high trait anxiety. The results showed that ascorbate decreased anxiety scores in both scales in individuals with high trait of anxiety. The results showed that ascorbate treatment decreased the anxiety scores in both scales in high trait anxiety subjects. No difference was noted in the subgroup with low to moderate trait of anxiety. This study evaluated a sample with very limited sociodemographic characteristics, composed mainly of young women with full college, limiting the generalization of the findings. However, the obtained data clearly indicate that ascorbate has a potential anxiolytic effect on students that are typically more anxious. Future studies evaluating the mechanisms by which ascorbate acts on the emotional states may provide evidence to support this hypothesis, if confirmed, could lead to the development of new treatments.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Neurociências, Florianópolis, 2016. As doenças de Parkinson, de Alzheimer e esclerose múltipla (EM), bem como os transtornos de humor, como a depressão, apresentam componentes inflamatórios. As células do sistema imune possuem 5 receptores que respondem ao neurotransmissor dopamina, os quais modulam diferentemente a inflamação. Assim, é esperado que o pramipexol (PPX), um agonista de receptores dopaminérgicos (D2/D3), tenha efeito imunomodulatório. Para testar essa hipótese foram utilizados dois modelos que causam neuroinflamação: a) a encefalomielite autoimune experimental (EAE), modelo de esclerose múltipla e b) a administração periférica de lipopolissacarídeo (LPS), modelo de transtorno depressivo maior. A EAE foi induzida em camundongos C57BL/6 através da administração do peptídeo 35-55 da glicoproteína de mielina oligodendroglial e o PPX (0,1 e 1 mg/kg/dia) foi administrado pela via intraperitoneal por 40 dias. A dose de 1 mg/kg inibiu completamente o surgimento dos sinais motores induzidos pela EAE, além de prevenir a desmielinização na medula espinhal. Além disso, o PPX teve um forte efeito anti-inflamatório, confirmado através da redução da infiltração de células inflamatórias, da ativação astroglial na medula espinhal, e da redução nos níveis de IL-17 nos linfonodos. Além disto, o PPX reverteu várias alterações induzidas pela EAE na medula espinhal e no estriado, incluindo a redução nos níveis de a-sinucleína, o aumento nos níveis de parkina, alteração na enzima glutationa peroxidase e a produção de espécies reativas de oxigênio. Em conjunto os dados sugerem que o PPX deve ser estudado como um possível agente farmacológico para tratar a EM. No modelo de depressão induzida por inflamação periférica através da injeção de LPS em camundongos Swiss, o PPX (1 mg/kg), foi administrado por 7 dias por via intraperitoneal. Uma hora após a última aplicação de PPX, injetou-se LPS (0,1 mg/kg) via intraperitoneal, 24 h depois foi dado início aos testes comportamentais. O LPS induziu comportamento tipo-depressivo no teste do nado forçado e no splash test, sem alterar a locomoção no teste do campo aberto. Também foi observado o aumento de Interleucina-1ß e adutos de 3-nitrotirosina no hipocampo dos animais tratados com LPS. Todos estes parâmetros foram revertidos pelo PPX, indicando que o PPX é capaz diminuir os eventos inflamatórios que podem estar associados ao comportamento tipo-depressivo. Os antagonistas de receptores dopaminérgicos, haloperidol e sulpirida, não reverteram o efeito tipo-antidepressivo do PPX, indicando que a atuação do PPX parece não ser mediada por estes receptores. Em conjunto, os dados sugerem que o PPX é capaz de causar uma forte diminuição em processos inflamatórios, tanto no modelo de EAE como no modelo de depressão, o que pode ser o mecanismo responsável por sua ação. Porém, mais estudos são necessários para confirmar esta hipótese. Abstract : Neurologic diseases as Parkinson's, Alzheimer's and multiple sclerosis (MS) as well as mood disorders, like major depression, present inflammatory components. Immune cells express 5 different dopamine receptors, which are known to modulate inflammation. In this context, it is expected that pramipexole (PPX), a dopamine D2/D3 receptor agonist, would have an immunomodulatory effect. To evaluate this hypothesis two neuroinflammatory disease models were used, the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a mice model of MS, and the peripheral administration of lipopolysaccharide (LPS), a mice model of major depression disorder (MDD). EAE was induced in C57Bl/6 mice by the injection of the 35-55 peptide of myelin oligodendroglial glycoprotein. PPX (0.1 and 1 mg/kg) was administered by intraperitoneal route for 40 days. The dose of 1 mg/kg of PPX completely abolished motor impairment induced by EAE, and prevented medular demyelination. Besides, PPX had a marked anti-inflammatory effect, which was observed by reduction of inflammatory cells infiltration, astroglyal activation, and by decreasing IL-17 levels in lymph nodes. Besides, PPX reversed several alterations in the spinal cord and striatum induced by EAE, inclunding reduction in a-synuclein levels, enhancement of parkin levels, alteration in glutathione peroxidase activity and reactive oxygen species production. Together, these results suggest that PPX can be studied as a potential drug for MS treatment. In the MDD model induced by peripheral inflammation induced with the bacterial lipopolysacchired (LPS) administration in Swiss mice, PPX (1 mg/kg) was administered for 7 days by intraperitoneal route. One hour after the last PPX injection, LPS (0.1 mg/kg) was administered intraperitoneally, and 24 h later behavioral analysis were performed. LPS induced depressive-like behavior in the forced swimming test and splash test, without locomotor alterations in the open field test. It was also observed enhancement of Interleukin-1ß and 3-nitrotyrosin protein adducts in mice hippocampus of LPS treated animals. PPX reversed all these alterations, indicating that PPX can prevent the inflammatory events related to the depressive-like behavior. Interestingly, the dopamine receptor antagonists, haloperidol and sulpiride, did not reverse the PPX antidepressant-like effect in the forced swimming test, indicating that PPX effect seems to be unrelated by these receptors. Together, these results suggest that PPX present a marked antiinflammatory action, in both EAE and LPS models, suggesting that this could be the mechanism of action of PPX. Nevertheless, further studies are required to confirm this hypothesis.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2016 Ostras são organismos de ampla relevância econômica e ecológica. Contudo, mortalidades massivas de ostras têm aumentado em frequência e distribuição geográfica ao redor do mundo. Desta forma, estudos básicos a respeito da biologia desses animais, incluindo seus sistemas de defesa, são de fundamental importância. O presente trabalho investigou a presença de patógenos de bivalves em ostras cultivadas em Santa Catarina, os quais têm sido associados a mortalidades de ostras em outros países (Estudo 1). Além disso, buscou-se compreender melhor a respeito da relação entre os sistemas antioxidante e imune de ostras (Estudos 2 e 3). No Estudo 1, ostras do Pacífico Crassostrea gigas e nativas C. gasar (= C. brasiliana)foram coletadas ao longo da costa de Santa Catarina e avaliadas quanto à presença do vírus Ostreid herpesvirus 1 (OsHV-1) e das bactérias Vibrio aestuarianus e V. splendidus. Análises moleculares revelaram amostras positivas para V. splendidus (15 %) e OsHV-1 (28 %), sendo confirmadas por análises de sequenciamento. Este foi o primeiro trabalho demonstrando a presença de bactérias e vírus potencialmente patogênicos em ostras na costa brasileira, servindo de alerta para que medidas preventivas sejam adotadas para evitar o surgimento de mortalidades massivas de ostras no país. No Estudo 2, hemócitos de ostras C. gigas foram expostos ao agente eletrofílico 1-cloro-2,4-dinitrobenzeno (CDNB). O CDNB não afetou a viabilidade mitocondrial, entretanto, diminuiu a estabilidade da membrana lisossomal dos hemócitos (= 12,5 µM). O CDNB causou um forte distúrbio no sistema antioxidante, promovendo depleção da glutationa (= 0,1 µM) e inibição das enzimas glutationa redutase (2,5 e 50 µM) e tioredoxina redutase (50 µM). Importantes funções desempenhadas pelos hemócitos (adesão, fagocitose e produção de espécies reativas de oxigênio após imunoestimulação) foram comprometidas somente por 50 µM de CDNB. Os resultados indicam que a depleção total de glutationa não afeta a imunocompetência dos hemócitos, porém ocorre mediante uma inibição adicional de tiol redutases. No Estudo 3, a importância da glutationa para o sistema imune das ostras foi avaliada utilizando-se butionina sulfoximina (BSO), inibidor da síntese de glutationa. Ostras C. gigas foram expostas via intramuscular ao BSO (15 µmol/animal) por 1, 2 3 ou 6 dias, sendo observados menores níveis de glutationa (21-46 %) nas brânquias, glândula digestiva e hemócitos. O tratamento de 3 dias não afetou o hemograma das ostras, nem a viabilidade e capacidade de adesão e fagocitose dos hemócitos. Contudo, aumentou significativamente a susceptibilidade das ostras ao patógeno V. anguillarum (33 %), e de forma marginalmente significativa às espécies V. alginolyticus e V. harveyi. A depleção parcial da glutationa também aumentou a susceptibilidade das ostras ao peróxido de hidrogênio e hidroperóxidode cumeno. Os Estudos 2 e 3 sugerem que a glutationa não é indispensável para a função dos hemócitos, porém, quando outros componentes do sistema antioxidante são afetados, ou quando um segundo fator de estresse é aplicado, a homeostase destas células ou do organismo é comprometida. De forma geral, estes estudos básicos abrem caminho para vários outros nas áreas de aquicultura e ecotoxicologia, e contribuem para uma melhor compreensão dos mecanismos envolvendo respostas imunes e antioxidantes de bivalves. Abstract: Oysters are organisms that play important role economically andfor the natural ecosystems. However, oyster massive mortalities have increased in intensity and geographic distribution worldwide. Therefore, studies aiming basic knowledge regarding the biology of oysters are pivotal, especially regarding their defense mechanisms.Thus, the aim of this study was to investigate the presence of oyster pathogens in Santa Catarina, Brazil, which have been associated to oyster massive mortalities in other countries (study 1). Moreover, another aim was tocontribute to basic knowledge regarding the interrelationship of the immune and antioxidant system in oysters (studies 2 and 3). For the 1st study, Pacific oysters Crassostrea gigas and native oysters C. gasar (=C. brasiliana) were collected throughout the coast of Santa Catarina, and the presence of the virus Ostreid herpesvirus (OsHV-1), and the bacteria Vibrio aestuarianus and V. splendidus were evaluated. PCR analyses revealed positive samples for V. splendidus (15 %) and OsHV-1 (28 %), which was confirmed by sequencing analyses. This was the first study to investigate viral and bacterial pathogens to oysters in Brazil, and enlightens the need of preventive measures to be undertaken in order to avoid oyster massive mortalities in Santa Catarina. For the 2nd study, C. gigas hemocytes were in vitro exposed to the electrophilic agent 1-chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB). CDNB did not affect hemocyte mitochondrial viability, however decreased lysosomal membrane stability (=12.5 µM).CDNB strongly affected hemocyte antioxidant system by depleting glutathione (=0.1 µM) and by decreasing the activity of the enzymes glutathione reductase (2.5 and 50 µM) and thioredoxin reductase (50 µM). Hemocyte function (adhesion, phagocytosis, and reactive oxygen species production upon immunostimulation) were jeopardized only with CDNB 50 µM. These results revealed that total glutathione depletion does not affect hemocyte immunocompetence, however this may occur upon inhibition of thiol reductases. For the 3rd study, the importance of glutathione to the immune system of oysters was investigated by using butionine sulfoximine (BSO), an inhibitor of the glutathione synthesis.Oysters C. gigas were exposed to BSO through intramuscular injections (15 µmol/animal/day) for 1, 2, 3 or 6 days, which promoted reduced glutathione levels (21-46 %) in the gills, digestive gland and hemocytes. The injection protocol of 3 days did not affect oyster hemogram, hemocyte viability, adhesion and phagocytosis. Nevertheless, it significantly increased oyster susceptibility to the pathogenV. anguillarum (33 %), while only a trend was observed for thespeciesV. alginolyticusandV. harveyi. Glutathione partial depletions also increased oyster susceptibility to cumene and hydrogen peroxides. Studies 2 and 3 suggest that glutathione is not imperative for hemocyte function, however when other components associated to the antioxidant system are affected, or when a second stress challenge is applied, these cells or the whole organism homeostasis is impaired.Overall, these basic studies can make way for many others in the field of aquaculture and ecotoxicology, and contribute to a better understanding of the mechanisms guiding the immune and antioxidant responses of bivalves.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2014 Com o aumento nos níveis de contaminação ambiental em nível global, organismos aquáticos estão sujeitos à ação tóxica de diversos xenobióticos, necessitando de eficientes sistemas de defesas para garantir sua sobrevivência. Neste trabalho, os bivalves Crassostreagigas (ostra do Pacífico) e Perna perna (mexilhão marrom) foram utilizados como organismos modelo para o estudo dos sistemas de defesas antioxidantes e de biotransfomação. Em um primeiro trabalho,as vias de biotransformação de fase II e do ácido mercaptúrico foram estudadas em ostras C. gigas expostas ao agente eletrofílico 1-cloro-2,4-dinitrobenzeno (CDNB). Os dados apontam que a brânquia possui um robusto sistema de biotransformação, atuando como importante ponto de entrada para o CDNB e conjugando-o rapidamente com glutationa. A hemolinfa atuou como um transportador de metabólitos pelo organismo, permitindo que outros tecidos auxiliassem no processo de biotransformação e excreção, enquanto que a glândula digestiva atuou como um tecido auxiliar na metabolização. O derivado final da via do ácido mercaptúrico foi detectado como principal metabólito na água domar, comprovando sua excreção. Um segundo trabalho investigou o papel das enzimas antioxidantes glutationa redutase e tiorredoxina redutase em C. gigas e P. perna expostos a agentes oxidantes(hidroperóxido de cumeno e menadiona). Através de uma exposição aguda destes organismos a ZnCl2 ou CDNB, foi possível diminuir significativamente a atividade dessas enzimas, e consequentemente, afetando os sistemas de degradação de peróxidos dependentes das enzimas glutationa peroxidase e peroxirredoxina. Foi observada uma menor capacidade de degradação de peróxidos in vivo e maior mortalidade induzida por exposição ao peróxido de cumeno ou amenadiona. Estes resultados reforçam a ideia de uma maior susceptibilidade de organismos com um sistema antioxidante menos eficiente. O último estudo investigou a toxicidade de um contaminante emergente, nanopartículas de óxido de zinco (ZnONP), sobre ostras C.gigas. Neste trabalho foi observado que as ZnONP se agregam quando em água do mar, passando da escala nanométrica para micrométrica. Além disso, foi detectada uma alta taxa de liberação de zinco iônico na água do mar. A exposição de ostras a ZnONP por até 48 h causou acúmulo de zinco inicialmente na brânquia (24 e 48 h), seguido da glândula digestiva (48 h). Análises de microscopia eletrônica sugerem a presença de vesículas endocíticas contendo ZnONP em ambos os tecidos. Análises de marcadores antioxidantes e de estresse oxidativo apontam para um moderado efeito oxidativo das ZnONP no citosol, principalmente na brânquia após 48 h, causando peroxidação lipídica, oxidação de proteínas e inibição da glutationa redutase. Porém, tanto as análises ultraestruturais quanto as bioquímicas apontam para fortes distúrbios mitocondriais, com alterações estruturais e oxidação de proteínas na brânquia e glândula digestiva. De modo geral, os estudos apontam que em bivalves: (i) ataques eletrofílicos podem ocorrer de maneira indiscriminada pelo organismo na ausência de um sistema de biotransformação íntegro na brânquia, (ii) danos oxidativos podem ser acumulados na ausência de um eficiente sistema antioxidante, afetando a sobrevivência do organismo e (iii) a mitocôndria de bivalves é susceptível a eventos oxidativos induzidos por ZnONP. Abstract: With the increasing level of global environmental contamination, aquatic species are subjected to the effects of different xenobiotics, relying on efficient cellular defenses systems to provide their survival. In this study, bivalves Crassostrea gigas (Pacific oyster) and Pernaperna (brown mussel) were used as model organisms to study the antioxidant and biotransformation systems. In a first study, the phase II biotransformation and mercapturic acid pathways were investigated inoysters C. gigas exposed to the electrophilic agent 1-chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB). Data suggest that gill hold a robust biotransformation system, acting as an important site for CDNB uptake and quickly conjugating it with glutathione. The hemolymph allowed the transport of metabolites across the organism, allowing other tissues to aid on biotransformation and excretion processes. The digestive gland participated as a metabolizing ancillary tissue. The final product, mercapturic acid, was found as main metabolite in water, confirming its excretion by the organism. A second study investigated the role of the antioxidant enzymes glutathione reductase and thioredoxin reductase inC. gigas and P. perna exposed to oxidative agents (cumene hydroperoxide and menadione). Using an acute exposure to ZnCl2 orCDNB, enzymatic activity was considerably decreased, thus affecting the peroxide detoxification system of glutathione peroxidase and peroxiredoxin. These inhibitions jeopardized in vivo peroxide detoxification ability, inducing higher mortality on a further exposure to cumene hydroperoxide or menadione. These data reinforce the idea of a higher susceptibility in organisms with a less effective antioxidant system. The last study partially characterized the toxicity of an emerging contaminant, zinc oxide nanoparticles (ZnONP), to C. gigas. It was observed that ZnONP aggregate in seawater, changing from a nanometric to micrometric scale. Besides, it was detected a strong release of ionic zinc to seawater. Oysters exposure to ZnONP for up to 48 h caused zinc accumulation initially in gill (24 and 48 h), followed by digestive gland (48 h). Electron microscopy analysis suggests the presence of endocytic vesicles containing ZnONP in both tissues. Analysis of antioxidant and oxidative stress markers points to a moderate oxidant effect of ZnONP in the cytosol, especially in gills after 48 h, causing lipid peroxidation, protein oxidation and glutathione reductase inhibition. Nevertheless, both ultrastructural and biochemical analyses highlight a mitochondrial disturbance pattern, with structural alterations and protein oxidation in gill and digestive gland. In general, these studies allowed the conclusion that in bivalves, (i) electrophilic attacks can occur indiscriminately in the absence of a robust phase IIbiotransformation pathway in the gill, (ii) that oxidative damage can be accumulated in the absence of an effective antioxidant system, affecting animal survival, and (iii) bivalve mitochondria can be very susceptible to ZnONP.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Neurociências, Florianópolis, 2013 O manganês (Mn) é um dos metais mais abundantes da crosta terrestre, sendo encontrado em rochas, solos, água e alimentos. O manganismo, síndrome causada em consequência do acúmulo excessivo de Mn no sistema nervoso central, é caracterizado por apresentar sintomas similares aos observados na Doença de Parkinson (DP). Contudo, antes que apareçam os déficits motores (rigidez muscular, alterações de equilíbrio e tremor nos membros superiores), tanto no manganismo quanto na DP, se pode perceber a presença de sintomas mais sutis, como diminuição da cognição e da memória e distúrbios de comportamento. A curcumina, substância ativa extraída do rizoma da Curcuma longa L., uma planta pertencente à família Zingiberaceae, apresenta efeitos antioxidante e neuroprotetor. Dessa forma, no presente trabalho foi avaliado o efeito da administração crônica de curcumina na ração de camundongos Swiss com 2 meses de idade, nas doses de 500 e 1500 ppm. Um grupo de animais recebeu inalação crônica da mistura de cloreto de manganês (MnCl2 - 40 mM) e acetato de manganês (Mn(OAc)3 - 20 mM), por 1 hora, três vezes por semana, durante 14 semanas. Animais também foram tratados com a combinação de curcumina e Mn. O que se pôde observar foi que a inalação da mistura de Mn não alterou a capacidade locomotora no teste do beam walking. No entanto, tanto a curcumina quanto o Mn alteraram a capacidade motora acurada, avaliada pelo teste do single pellet. Além disso, os grupos que receberam curcumina e/ou Mn tiveram diminuição na memória (teste do step down). Com relação aos aspectos neuroquímicos, não foram encontradas alterações nas enzimas glutationa redutase e glutationa peroxidase, nas regiões do estriado e do hipocampo, nem no imunoconteúdo de tirosina hidroxilase no estriado. Interessantemente, nos grupos que receberam Mn e curcumina concomitantemente, houve um importante aumento nos níveis de Mn e ferro na região do hipocampo, acompanhada de importante diminuição nos níveis de serotonina e dopamina. Isto sugere que a região do hipocampo é mais susceptível que a região do estriado ao efeito da inalação de Mn. A interação entre curcumina e Mn é inesperada, mas revela o potencial tóxico da interação entre metais e flavonóides, que parece afetar a homeostase de metais e de neurotransmissores no hipocampo. Uma vez que o tratamento somente com Mn ou curcumina não causa a maioria destas alterações observadas, o déficit motor e de memória parece ser independente destas alterações neuroquímicas. O protocolo com o uso crônico do Mn resultou em efeitos motores leves, associado a perda de memória, indicando que este protocolo é adequado como um modelo in vivo para o estudo das fases iniciais da DP. Abstract : Manganese (Mn) is one of the most abundant metals in the earth's crust, being found in rocks, soil, water and foods. The manganism, syndrome aused as a result of excessive accumulation of Mn in the CNS, has numerous symptoms similar to those seen in Parkinson's disease (PD). However, before the appearance of motor deficits (muscle rigidity, tremor and balance disorders in the upper limbs), both, manganism and PD, shared the appearance of symptoms that are more subtle than the motor symptoms, such as decreased cognition and memory, comportamental disorders. Curcumin, the active and mainly ingredient extracted from the rhizome of Curcuma longa L., a plant belonging to the family Zingiberaceae that has various well documented pharmacological effects, among which antioxidant and neuroprotective. This study evaluated the effect of chronic administration of curcumin in the diet of Swiss mice, with 2 months of age, at doses of 500 ppm and 1500 ppm, concurrently with chronic inhalation of manganese chloride mixture (Mn(OAc)3 - 20 mM), for 1 hour, three times a week, 14 weeks compared to neurochemical and behavioral parameters. Inhalation of Mn did not impair locomotor capacity in the beam walking test, however both, curcumin as Mn, decreased performance of animals in the accurate motor ability, evaluated by the single pellet test. Moreover, the groups that received curcumin and Mn exhibited decreased memory scores in the step down test. Regarding the neurochemical aspects, there were no changes in the enzymes glutathione reductase, glutathione peroxidase, and acethylcholinesterase in the regions of the striatum and hippocampus, nor in the immunocontent of striatal tyrosin hydroxylase. There was a significant increase in the levels of Mn and Fe in the hippocampal region, in parallel to a significant decrease in dopamine and serotonin levels in the groups receiving concomitantly Mn and curcumin. This shows that the hippocampus is more susceptible than the striatum to the Mn inhalation. The interaction between curcumin and Mn is unexpected but revealed the potential toxic effect to flavonoid and metal interaction, which seem to affect neurotransmitter and metal homeostasis in the hippocampus. Since, Mn and curcumin alone did not cause most of these changes, motor and memory deficit seems to be independent of such neurochemical alterations. The Mn treatment protocol resulted in mild effect on motor performance allied to memory impairment, indicating that this protocol is appropriate as an in vivo initial phase PD model.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Neurociências, Florianópolis, 2013. O trauma cranioencefálico (TCE) é uma patologia de grande impacto social e econômico. O TCE é a principal causa de mortalidade em pessoas com menos de 40 anos de idade. Desde os anos noventa do século 20, houve poucos avanços no tratamento e diagnóstico do TCE. Sabe-se que uma cadeia de eventos danosos, incluindo neuroinflamação, excitotoxicidade, disfunção do metabolismo mitocondrial e estresse oxidativo contribuem para a morte celular no TCE. O entendimento destes processos é essencial para projetarmos novas perspectivas de abordagem diagnóstica e terapêutica. Esta revisão tem por objetivo revisar a literatura e esclarecer qual é a correlação entre os dados envolvendo o estresse oxidativo e o traumatismo cranioencefálico, visando contribuir com novas perspectivas para a área. Esta revisão visa responder as seguintes perguntas: a) O estresse oxidativo está relacionado com o TCE? b) Marcadores de peroxidação lipídica são efetivos na avaliação e prognose no TCE? c) Quais estratégias antioxidantes estão sendo investigadas no TCE e qual é sua eficácia? e d) Quais as perspectivas para o uso de marcadores relacionados ao estresse oxidativo e de antioxidantes na prognose e tratamento do TCE? Desta forma, analisou-se a validade de se usar marcadores de peroxidação lipídica, enzimas antioxidantes, entre outros, na prognose do TCE. Também avaliamos estratégias antioxidantes testadas em estudos pré-clínicos e clínicos, apontando para novas perspectivas clínicas. Foi realizada revisão sistemática de publicações indexadas no Pubmed cruzando ?traumatic brain injury or head injury? com oxidative stress, Nrf2, antioxidant, glutathione e flavonoid. A base dedados foi filtrada focada nos objetivos e os principais resultados foram analisados. Há dados inequívocos da participação da peroxidação lipídica no dano induzido por TCE. A correlação dos marcadores de peroxidação lipídica com o prognóstico porém, não pode ser estabelecida. Um desses marcadores de estresse oxidativo, 8-iso-prostaglandina-F2a (8-iso-PGF2a), entretanto, apresentou grande correlação com o nível de severidade do trauma, e merece atenção em futuras pesquisas. As estratégias antioxidantes avaliadas até então, apesar de mostrarem algum sucesso pré-clínico, não foram bem sucedidas em ensaios clínicos. Perspectivas para futuros estudos podem incluir novos marcadores que poderão aumentar o poder preditivo de desfecho. Ativadores da via Nrf2/ARE, como é o caso de flavonóides, são uma estratégia neuroprotetora com boa perspectiva de sucesso. Isto baseado no fato de que estudos pré-clínicos foram bem sucedidos em demonstrar que a ativação desta via confere neuroproteção. Abstract : Traumatic brain injury (TBI) is a pathology of great social and economic impact. The TBI is the main cause of death in people under 40 years of age. Since the nineties of 20th century, there have been few advances in the treatment and diagnosis of TBI. It is known that a chain of damaging events, including neuroinflammation, excitotoxicity, mitochondrial metabolism dysfunction and oxidative stress contribute to cell death in the TBI. The understanding of these processes is essential for projecting new perspectives of diagnostic and therapeutic approach. This review aims to analyse data from to determine what is the correlation between the oxidative stress and traumatic brain injury, to contribute with new perspectives for the area. This review aims to answer the following questions: a) The oxidative stress is related to the TBI? b) The lipid peroxidation markers are effective in the evaluation and prognosis in TBI? c) What antioxidant strategies are being investigated in TBI and what is its effectiveness? and d) What are the perspectives for the use of markers related to oxidative stress and antioxidants on prognosis and treatment of TBI? We conducted systematic review of publications indexed in Pubmed including the terms "traumatic brain injury or head injury" and oxidative stress, antioxidant, glutathione, Nrf2 and flavonoids. The database was filtered focused on the objectives and the main results were analyzed. There is clear evidence of the involvement of lipid peroxidation in TCE-induced damage. The correlation of markers of lipid peroxidation with the prognosis, however, cannot be established. One of these markers, 8-iso-prostaglandin-F2 a (8-iso PGF2-a), however, showed high correlationwith the level of severity of the trauma, and deserves attention in future research. Antioxidants strategies assessed thus far, despite showing some pre-clinical success, have not been successfull in clinical trials. Prospects for future studies may include new markers that may increase the predictive power of outcome. Activators of via Nrf2ARE, as is the case of flavonoids, are neuroprotective strategy with good prospects of success. This based on the fact that pre-clinical studies have been successfull in demonstrating that the activation of this pathway confers neuroprotection.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Programa Multicêntrico de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas, Florianópolis, 2011 As defesas antioxidantes e os sistemas de detoxificação podem ser modulados frente a contaminantes ambientais, dependendo do tempo e da intensidade da exposição, podendo levar a danos oxidativos. O objetivo deste trabalho é avaliar a resposta antioxidante e de adaptação celular de tilápias do Nilo (Oreochromis niloticus) expostas a ambientes contaminados na Bacia do Rio Cubatão do Norte, Joinville, SC, principal pólo industrial de Santa Catarina. O estudo foi desenvolvido em outubro de 2009 e de 2010, onde as tilápias (S3>S1=REF. Os níveis de HPAs e biliverdina na bile, de HPAs no sedimento, a atividade 7-etoxi-resorufina-O-desetilase (EROD) e a expressão do citocromo P450 1A (CYP1A), mostraram uma correlação positiva entre si. A elevação dos níveis de metabólitos de HPAs na bile indica um aumento na capacidade de metabolização e eliminação destes compostos. A maior metabolização poderia ser explicada pela indução da atividade da EROD associada ao aumento da expressão de CYP1A, especialmente no ponto S2. O decréscimo nos níveis de tióis do fígado e sangue, bem como, o aumento dos danos ao DNA indicam que após 2 dias de exposição houve aumento nos índices de estresse oxidativo nos animais dos 3 pontos de estudo, o que foi corroborado pelo aumento da clivagem da poli (ADP-ribose) polimerase 1 (PARP1, 7 dias, S2). A restauração parcial do estado tiólico e de vários outros parâmetros, além da reversão nos danos ao DNA e a indução de peroxirredoxina 6 (Prx6, S2), indicam que houve uma resposta adaptativa aos 7 dias de exposição. As atividades tiorredoxina redutase (TrxR, 2 dias), glutationa redutase (GR, 7 dias) e colinesterásica (2 dias) diminuíram no ponto S1. Em 2009, as maiores alterações foram encontradas após 2 dias de exposição e relacionadas à depleção de grupos tióis, enquanto que as alterações enzimáticas aconteceram predominantemente em 2010, sugerindo uma diversidade de contaminantes e/ou de seu aporte. Este estudo mostrou que protocolos utilizando respostas antioxidantes, danos oxidativos e indução de CYP1A como biomarcadores de contaminação aquática foram complementares e eficientes em discriminar o grau de contaminação entre os vários pontos de estudo. Os dados comprovam que animais que habitam a região da Bacia do Rio Cubatão do Norte estão expostos a contaminantes de origem antrópica e que estes têm ação negativa sobre os indivíduos, necessitando de medidas corretivas a curto e longo prazo. Antioxidant defenses and detoxification systems may be modulated against environmental contaminants, depending on timing and intensity of exposure and may lead to oxidative damage. The aim of this study was to evaluate the antioxidant response and cellular adaptation of tilapia (Oreochromis niloticus) exposed to contaminated environments at Cubatão Basin, Joinville, SC, the main industrial area of Santa Catarina. The study was performed in October for two consecutive years (2009 and 2010). Tilapias ( S3> S1 = REF. The levels of PAHs and biliverdin in bile, PAHs in the sediment, 7-O-etoxiresorufina deetilase (EROD) activity and cytochrome P450 1A (CYP1A) expression presented good correlation. The high levels of PAH metabolites in bile indicates an increased ability to metabolize and dispose these compounds. The increased metabolization could be explained by the induction of EROD activity associated with increased CYP1A expression, especially at the site S2. The decrease in the levels of liver and blood thiols as well as an increase in DNA damage after 2 days of exposure are indicative of oxidative stress in animals from 3 studied sites, which is corroborated by the increased poly (ADP-ribose ) polymerase 1 (PARP1) cleavage (7 days, S2). The partial restoration of the thiol status and several other parameters, the reversal of DNA damage and peroxiredoxin 6 induction (Prx6, S2), indicate that there was an adaptive response after 7 days of exposure. The thioredoxin reductase (TrxR, 2 days), glutathione reductase (GR, 7 days) and cholinesterase (2 days) activities decreased at site S1. In the year 2009, most changes were found after 2 days of exposure and related to thiol status, whereas the enzyme changes occurred predominantly in 2010, suggesting a variety or diverse dosing of contaminants. This study showed that protocols using antioxidant responses, oxidative damage and CYP1A induction as biomarkers of aquatic contamination were complementary and efficient in discriminating the degree of contamination between the various sites of study. The data show that animals living in the Cubatão Basin, Joinville, SC, are exposed to contaminants of anthropogenic origin, producing a negative influence on individuals which requires corrective measures at short and at long term.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Neurociências, Florianópolis, 2010 Estudo comparativo das atividades das enzimas antioxidantes catalase, glutationa peroxidase e peroxirredoxina em fatias de hipocampo de ratos, células de glioma de ratos (C6) e células de neuroblastoma de camundongos (N2a) expostas aos peróxidos de hidrogênio (H2O2) e cumeno (CuOOH).

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Aqüicultura, Florianópolis, 2010 Nos sistemas intensivos de cultivo de peixes é comum a presença dos agentes estressores que interferem no metabolismo e no crescimento. Considerando isso, foi estudado o efeito dos agentes estressores densidade de estocagem e manuseio sobre o crescimento e sobre as respostas fisiológicas e bioquímicas de alevinos de Salminus brasiliensis, assim como as respostas dessa espécie ao estresse. Parte do estudo foi conduzido em laboratório, avaliando as densidades de 30, 150 e 300 peixes m-3, com presença e ausência de manuseio por 80 dias, e a outra parte foi conduzida em tanques-rede, no reservatório de Itá, avaliando as densidades de 15 e 30 peixes m-3, com manuseio por 40 dias. As variáveis analisadas foram: comprimento padrão e peso total, hematócrito (Ht) no sangue e hemoglobina ([Hb]), glicose e lactato, atividade das enzimas hepáticas antioxidantes glutationa peroxidase, glutationa redutase, glutationa-S-transferase, catalase e as concentrações de Na+, K+, Cl- e Ca2+ no plasma e nas brânquias. Os resultados indicaram que os alevinos de S. brasiliensis apresentaram melhor crescimento na ausência do manuseio e na densidade de 30 peixes m-3. A atividade das enzimas antioxidantes foi dependente do manuseio e do tempo, condição que não foi observada para a [Hb], para o Ht, para o lactato e para os íons Na+, Cl-, K+ e Ca2+ no plasma. As variações da concentração de glicose e do Ht nos peixes com manuseio sugerem a ocorrência de estresse agudo, assim como as da glicose e do lactato na ausência do manuseio.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2010 As espécies reativas de oxigênio (ERO), metabólitos secundários do metabolismo do oxigênio, são moléculas geradas e reguladas constantemente pela célula. O aumento na sua produção pode levar a inúmeros processos patológicos, e para evitar esses efeitos tóxicos das ERO a célula conta com um complexo sistema de defesas celulares, incluindo defesas antioxidantes. Esse sistema é bem estudado e caracterizado em eucariotos mais complexos, como os mamíferos, e em eucariotos mais simples, como as leveduras, mas ainda pouco se sabe sobre esse sistema e sua regulação em invertebrados marinhos. Desta forma, o presente trabalho tem como objetivo estudar o sistema antioxidante de bivalves marinhos em situação de estresse oxidativo, e propor possíveis mecanismos de modulação e regulação redox nesses modelos animais. O trabalho foi dividido em dois experimentos: no primeiro, mexilhões azuis Mytilus edulis foram pré-expostos ao selênio (4µg/L) por 3 dias, e subseqüentemente expostos por mais 3 dias a cobre (56 µg/L). Neste experimento, objetivamos detectar se os efeitos oxidativos do cobre podem ser atenuados pela pré-exposição ao selênio. Vários parâmetros antioxidantes e de dano celular foram avaliados. Nesta primeira etapa, observou-se que o cobre causa oxidação de tióis protéicos (PSH) e inibição da enzima tioredoxina redutase (TrxR) na brânquia e induz danos no DNA em hemócitos. O selênio aumenta a atividade da enzima glutationa peroxidase dependente de selênio (GPx-Se) e os níveis de glutationa (GSH). Quando os animais são pré-expostos a selênio e expostos em seguida ao cobre, a pré-exposição ao selênio é capaz de neutralizar os efeitos deletérios desse metal, revertendo a oxidação dos PSH, evitando a indução de danos no DNA e revertendo parcialmente a inibição da TrxR. No segundo experimento, mexilhões Perna perna foram expostos por até 21 dias ao zinco (10 µM), um metal conhecido por afetar o metabolismo da glutationa. A exposição aguda (2 dias) ao zinco causou consumo de GSH e inibição da GR, porém estes valores retornam aos níveis basais após 7 e 21 dias de exposição. Os animais expostos por 7 e 21 dias ao zinco demonstram uma amplificação do sistema antioxidante, com aumento na atividade de diversas enzimas auxiliares (TrxR, GR) ou de detoxificação de ERO (catalase, glutationa peroxidase total, superóxido dismutase). Apesar disso, essa amplificação não impediu um aumento nos níveis de peróxidos citosólicos e nos índices de peroxidação lipídica evidenciados após a exposição por 7 ou 21 dias. O conjunto de dados desses dois experimentos demonstram a importância do sistema antioxidante para esses animais em situações de estresse oxidativo. O aumento dos níveis de GSH e da atividade da GPx-Se parecem ser uma importante via de proteção contra os danos oxidativos em mexilhões M. edulis, mediados pelo cobre. Já com relação ao zinco, o restabelecimento do metabolismo da glutationa, o qual é afetado pelo zinco, é fundamental para as células branquiais de mexilhões P. perna, o qual responde ao insulto oxidativo com uma forte resposta adaptativa de amplificação das defesas antioxidantes celulares.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica Zinco na sua forma ionica livre e mantido em concentracoes muito baixas nas celulas de mamiferos. Em algumas vesiculas sinapticas de neuronios glutamatergicos, porem, ele pode ser encontrado em altas concentracoes, aonde atua como um modulador ionico. Em situacoes patologicas, porem, o zinco livre pode se acumular no citosol nas celulas neurais provocando diversos efeitos toxicos, tais como a inibicao de enzimas. O zinco e capaz de inibir as enzimas antioxidantes gluationa redutase (GR) e tioredoxina redutase (TrxR), duas enzimas envolvidas na defesa celular contra oxidantes. Essa inibicao, portanto, pode resultar em um decrescimo na degradacao de peroxidos, levado a uma maior vulnerabilidade a danos oxidativos. O presente trabalho tem como objetivo investigar a relacao da inibicao das enzimas antioxidantes GR e TrxR, pela exposicao de celulas neurais ao zinco, com a susceptibilidade destas celulas quando desafiadas com agentes oxidativos. Celulas derivadas de neuroblastoma (N2a), astroglioma (C6) e fatias de hipocampo de ratos adultos foram pre-incubadas com 100 uM de ZnCl2 por 30 min, e em seguida expostas por uma hora a 100 uM de H2O2 ou 100 uM de peroxido de cumeno. O tratamento com ZnCl2 provocou uma queda na atividade da GR nos 3 modelos, sendo que as celulas C6 foram mais afetadas (77% de inibicao comparado com 30-35 % nos outros modelos). A enzima TrxR tambem foi inibida em 30% nas celulas C6, enquanto nas celulas N2a e fatias de hipocampo, esse efeito nao foi observado. O tratamento com ZnCl2 diminuiu a taxa de consumo de H2O2 e CHP nas celulas C6, enquanto nas celulas N2a somente o consumo de H2O2 foi afetado. Em celulas N2a, tanto o tratamento com ZnCl2 como com H2O2 provocaram uma diminuicao na viabilidade celular, porem a combinacao de ambos nao aumentou esta toxicidade. As celulas C6 foram resistentes aos efeitos toxicos dos peroxidos e ZnCl2, porem, o pre-tratamento com ZnCl2 aumentou a susceptibilidade dessas celulas a toxicidade de ambos os peroxidos, diminuindo a viabilidade, aumentando a permeabilidade celular e o dano ao DNA. O ZnCl2 nao aumentou a vulnerabilidade das fatias de hipocampo a toxicidade dos peroxidos, porem, quando estas foram expostas a 1 mM de H2O2, em combinacao com ZnCl2, houve queda na viabilidade celular na mesma proporcao causada pelo pre-tratamento com BCNU, um inibidor da GR. Neste caso, supoe-se que esta queda na viabilidade e devido a inibicao da GR. Em conclusao, os dados apresentados demonstram que, apesar da alta susceptibilidade das células neuronais (N2a) ao ZnCl2 e aos peróxidos, a inibição da GR não aumentou esta sensibilidade. Por outro lado, as células derivadas de astrócitos (C6) foram mais resistentes ao ZnCl2 e aos peróxidos, porém a inibição da GR e da TrxR pelo tratamento com zinco aumentaram a citotoxicidade de ambos os peróxidos. Nas células C6, o sinergismo entre a inibição das enzimas antioxidantes e a toxicidade aos peróxidos, provavelmente se deve a menor capacidade em degradar peróxidos. Desta forma, nosso dados indicam que a inibição de enzimas antioxidantes GR e TrxR é um fator importante associado a sua toxicidade em células neurais. Zinc in its free, ionic form is kept in very low concentrations in mammalian cells. In some synaptic vesicles in glutamatergic neurons, however, it can be found in high concentrations where it acts as an ionic modulator. In pathological situations, however, this free zinc can accumulate in the cytosol of neural cells producing a myriad of toxic effects, such as the inhibition of enzymes. Zinc can inhibit glutathione reductase (GR) and thioredoxin reductase (TrxR), both antioxidant enzymes that are crucial for cell protection against oxidants. Therefore, a disturbance in the activity of these enzymes hinder peroxide degradation and increases vulnerability to oxidative damage. The present work aims to investigate the relation between the inhibition of these enzymes by zinc and the susceptibility of neuronal and astrocytic cells, as well as hippocampal slices, to H2O2 and cumene peroxide (CHP). Cells derived from neuroblastoma (N2a), astroglyoma (C6) and hippocampal slices were pre-incubated with 100 uM of ZnCl2 for 30 min, and then exposed to 100 uM of H2O2 or CHP for 1h. Treatment with ZnCl2 decreased GR activity in the three models, but this effect was higher in C6 cells (70 % of inhibition in comparison to 30-35 % of inhibition in the other models). TrxR was inhibited by 30 % in C6 cells, while in N2a and hippocampal slices this effect was not observed. Treatment with Zn decreased H2O2 and CHP consumption rate in C6 cells, but only H2O2 consumption rate was reduced in N2a cells. Both ZnCl2 and H2O2 treatment induced a decrease in cellular viability in N2a cells, but their combination did not enhance this toxicity. C6 cells were more resistant to toxic effects of ZnCl2 and peroxides, however, the preincubation with ZnCl2 increased cell vulnerability to both peroxides, decreasing cell viability, increasing membrane permeability and DNA damage. ZnCl2 did not increased vulnerability of hippocampal slices to toxic effects of peroxides, but when these cells were exposed to 1 mM of H2O2 after the ZnCl2 pre-treatment, a decrease in cell viability was observed in the same proportion as the effect caused by the pretreatment with BCNU, an inhibitor of GR, indicating that this effect is likely due to GR inhibition. In conclusion, this data demonstrate that despite the high susceptibility of N2a cells to ZnCl2 and H2O2, the zincinduced GR inhibition did not increased this vulnerability. In contrast, C6 cells were more resistant to ZnCl2 and peroxides, but the inhibition of GR and TrxR by zinc treatment highly increased the citotoxicity of both peroxides. Hippocampal slices were more resistant than the cell cultures to the toxic effects of the treatments, but when exposed to higher doses of H2O2, Zn was able to sensitize the cells to peroxide toxicity. In C6 cells, the synergism between the inhibition of enzymes and peroxide toxicity probably is related to the decreased capacity to metabolize peroxides. Therefore our data suggest that the inhibition of the antioxidant enzymes GR and TrxR by zinc is an important factor associated with its toxicity in neural cells.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2012 Os hemócitos são responsáveis por mediar uma série de reações imunológicas essenciais para a sobrevivência de bivalves. Dentre os vários fatores de estresse ambientais os quais os bivalves estão sujeitos, pode-se citar as florações de algas nocivas (FANs) que devido ao aumento abrupto de sua biomassa e produção de ficotoxinas, causam grandes prejuízos aos ecossistemas costeiros. O impacto dessas algas nocivas e suas ficotoxinas no sistema imune dos bivalves são, porém muito pouco conhecidos ainda. Para melhor compreender os possíveis efeitos dessas microalgas e suas toxinas no sistema imune de bivalves, hemócitos da ostra Crassostrea gigas foram expostos in vitro à microalga Alexandrium minutum, aos produtos extracelulares (PECs) da microalga Heterosigma akashiwo e às neurotoxinas purificadas saxitoxina (STX) e brevetoxina (PbTx-2). Foram então analisados alguns parâmetros celulares e a expressão quantitativa (qPCR) de 11 genes associados aos sistemas imunológico, antioxidante, de estresse e de biotransformação. Os resultados mostraram que apesar da viabilidade e a complexidade dos hemócitos se manterem inalteradas após incubação com A. minutum (1:6, alga/hemócito) ou com sua toxina STX (0,0375 µg/L), a capacidade fagocítica fagocitose e produção de espécies reativas de oxigênio foram prejudicadas em ambos os tratamentos (30 % e ? 38 % menores, respectivamente). Houve ainda, um aumento do tamanho dos hemócitos granulares (33 %) incubados apenas com as microalgas. Por outro lado, os hemócitos das ostras incubados com os PECs de H. akashiwo, microalga supostamente produtora de brevetoxinas (PbTxs) ou com diferentes concentrações de PbTx-2 (3 a 1.000 µg/L) também não tiveram sua viabilidade alterada. Além disso, as maiores concentrações de PbTx-2 testadas (300 e 1.000 µg/L) também não foram capazes de induzir a apoptose nos hemócitos. As análises de expressão gênica revelaram um aumento no número de transcritos da citocina IL-17 (4,5x) após 4 h de exposição à A. minutum, assim como, após exposição apenas à STX, da chaperona Hsp70 (2x) e do peptídeo antimicrobiano defensina (Defh2) (7x). Por outro lado, hemócitos incubados com a STX apresentaram também uma diminuição nos níveis de transcritos da IL-17 (10x) e de uma isoforma de citocromo P450 (CYP356A1) (3,6x). Com relação à PbTx-2 (1.000 µg/L) houve um aumento no número de transcritos da Hsp70 (2,4x) e do CYP356A1 (2x) e uma tendência a maiores valores para o gene que codifica a fatty acid binding protein (FABP) (2,8x). Em conjunto, estes resultados sugerem que a STX em geral promove uma imunosupressão dos hemócitos de ostras, enquanto que a PbTx-2 estimula a expressão de genes associados a respostas de estresse e detoxificação, mas não de genes associados aos sistemas imune e antioxidante. Os resultados claramente demonstram que as ficotoxinas apresentam efeitos específicos e interferem com a expressão gênica de hemócitos sendo, portanto, potencialmente tóxicas para bivalves.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina. Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Neurociências O mercurio, em suas formas organicas e inorganicas, e um toxicante ambiental capaz de provocar deficits neurologicos severos em animais e humanos. O sistema nervoso em desenvolvimento apresenta uma maior suscetibilidade aos efeitos deleterios induzidos por mercuriais. Neste contexto, exposicoes durante o periodo pre#]natal e lactacional representam importantes questoes do ponto de vista toxicologico. De fato, pouco se conhece a respeito da contribuicao lactacional para o desenvolvimento de neurotoxicidade frente a intoxicacoes com mercuriais. Alem disso, nao existem tratamentos efetivos capazes de reverter completamente os efeitos toxicos do mercurio. No presente estudo, foi demonstrado que a exposicao exclusivamente lactacional de camundongos jovens ao metilmercurio, uma forma organica de mercurio, causou deficits motores que foram correlacionados com um desequilibrio no estado tiolico cerebelar. Observamos tambem, que o mercurio inorganico causou neurotoxicidade em camundongos expostos a este metal atraves do leite materno. O cerebelo de animais jovens expostos ao mercurio inorganico apresentou uma atividade glutationa redutase aumentada, um efeito que pode estar relacionado a uma resposta de defesa celular frente a acao pro#]oxidativa do mercurio sobre tiois endogenos. Em contrapartida, os camundongos jovens expostos ao metilmercurio nao demonstraram esta resposta, o que aponta para mecanismos moleculares de resposta distintos para as diferentes formas de mercurio, sendo este fenomeno importante do ponto de vista toxicologico. O tratamento de animais adultos com metilmercurio por via oral causou uma diminuicao significativa na atividade glutationa peroxidase cerebral, uma enzima primaria no processo de detoxificacao de peroxidos produzidos endogenamente. Este efeito ocorreu em paralelo a um aumento na proteolise da enzima poli(ADP ribose) polimerase, um indice de apoptose. Em estudos in vitro, nossos dados demonstraram uma participacao importante do peroxido de hidrogenio como mediador da neurotoxicidade induzida por mercuriais e este fato foi acompanhado por uma marcante inibicao da enzima antioxidante glutationa peroxidase mitocondrial. O bloqueio da atividade desta enzima com acido mercaptosuccinico aumentou o estresse oxidativo e a disfuncao mitocondrial induzida pelos mercuriais in vitro. A incubacao de celulas de neuroblastoma humano SH#]SY5Y com metilmercurio causou uma diminuicao significativa na atividade glutationa peroxidase destas celulas. Este efeito tornou as celulas menos eficientes em degradar peroxido de hidrogenio e ocasionou um aumento na expressao de marcadores de dano oxidativo. Alem disso, a inibicao da lutationa peroxidase com acido mercaptosuccinico potencializou a perda de viabilidade celular e aumentou significativamente a expressao de marcadores de apoptose. O tratamento de animais adultos com extrato hidroalcoolico da planta Polygala paniculata preveniu os efeitos comportamentais e relacionados ao estresse oxidativo induzidos pelo tratamento com metilmercurio administrado por via oral. Este efeito se deu provavelmente devido a acao antioxidante do extrato. Em estudos in vitro, demonstramos a participacao do flavonoide quercetina como um importante mediador da neuroprotecao induzida pelo extrato de Polygala frente aos efeitos toxicos do metilmercurio. Alem disso, o flavonoide miricetina tambem apresentou efeito benefico contra a disfuncao mitocondrial e estresse oxidativo induzidos por metilmercurio in vitro. Em conclusao, nossos dados apontam para o sistema antioxidante da glutationa como um importante alvo molecular na neurotoxicidade induzida por mercuriais, onde disturbios no sistema antioxidante, causados por estes agentes, levam a um quadro de estresse oxidativo associado a disfuncao mitocondrial e aumentam a expressao de marcadores de morte celular. O extrato hidroalcoolico da planta Polygala paniculata, bem como os flavonoides quercetina e miricetina, representam potenciais agentes neuroprotetores contra a toxicidade induzida por mercuriais Mercury, in its organic and inorganic forms, is a potent environmental toxicant able to induce neurological deficits in both animals and humans. The developing central nervous system is particularly susceptible to the deleterious effects of mercury compounds. In this regard, mercury exposures during the pre#]natal and lactational periods are main factors from a toxicological point of view. In fact, little is known about the exclusive contribution of the lactational exposure to mercury and its relationship with neurotoxicity. In addition, there are no available treatments able to totally block mercurials#]induced toxicity. In the present study, we demonstrate that the exposure of young mice to methylmercury, an organic form of mercury, exclusively via maternal milk induces motor deficits associated with disturbs in the cerebellar thiol homeostasis. We also show that inorganic mercury caused neurotoxicity by exposure of young mice exclusively through the lactational route. The pups exposed to inorganic mercury presented an increased activity of the antioxidant enzyme glutathione reductase in the cerebellum. This effect appears to be related to an antioxidant response against the well known pro#]oxidative actions of mercury towards endogenous thiols. On the other hand, pups exposed to methylmercury through maternal milk did not show such adaptative response, pointing to different molecular mechanisms of action of the distinct forms of mercury. From a toxicological point of view, this is an important finding. Treatment of adult mice with methylmercury via oral route caused a significant decrease on the glutathione peroxidase activity in the brain. This enzyme is a main antioxidant defence against the deleterious effects of indogenous peroxides. This phenomenon was concomitant with an increase in poly(ADP ribose) polymerase proteolysis, an index of apoptosis. During in vitro studies, our data shows the central role of hydrogen peroxide as an important contributor to the neurotoxicity induced by mercuric compounds. We also show the inhibitory effect of methylmercury on mitochondrial glutathione peroxidase. The blockade of this enzyme with mercaptosuccinic acid caused an increase of oxidative stress markers and mitochondrial dysfunction induced by mercurials in vitro. The incubation of human neuroblastoma cells SH#]SY5Y with methylmercury caused a significant decrease on glutathione peroxidase activity. This effect resulted in a decreased ability of cells to remove hydrogen peroxide from the culture medium, causing an increase in the endogenous formation of peroxides. In addition, the inhibition of glutathione peroxidase improved the methylmercury#]induced anti#]viability effect and potentiated apoptosis. Treatment of adult animals with Polygala paniculata extract prevented the effects of methylmercury in inducing motor deficits and oxidative stress. This effect is probably related to the antioxidant actions of the extract. During in vitro studies, we demonstrated the participation of the flavonoid quercetin as an important mediator on the neuroprotection induced by Polygala extract. In addition, the flavonoid myricetin also displayed beneficial effects against methylmercury induced mitochondrial dysfunction and oxidative stress in vitro. In summary, our data point to the glutathione antioxidant system as an important molecular target for mercury#]induced neurotoxicity. Disturbances in this cellular defence system can induce oxidative stress associated with mitochondrial dysfunction and apoptosis. The Polygala paniculata extract, as well as the flavonoids quercetin and myricetin, may be potential therapeutic agents against mercury induced neurotoxicity.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Neurociências. Cerebral ischemia is characterized by a transitory or a permanent reduction in the blood flow in a specific area of the central nervous system, producing glucose and oxygen deprivation (OGD) to cells. Events such as glutamatergic excitotoxicity and oxidative stress can lead to necrotic or apoptotic neuronal cell death. Besides being an essential element in the structure and function of a number of proteins, Zinc is released concurrently with glutamate in the glutamatergic synaptic transmission, exerting a modulatory role. Quercetin is a flavonoid obtained through the food, displaying known neuroprotective effects. The objective of this study was to develop neuroprotection strategies utilizing a model of ischemia and a model of oxidative stress by using hippocampal slices of adult rats. The animals treated in vivo with ZnCl2 (300 mg/L; p.o.) during 30 days did not show any evidence of neuroprotection in the hippocampal slices in the ex vivo ischemia model. The cell viability and permeability tests indicated impairment in the cell condition after 15 or 60 min of ischemia. The total glutathione (GSH-t) levels were decreased only after 2 hours of reperfusion. Protein thiol (PSH) content remained unchanged in all treatment conditions. In the in vitro treatment with ZnCl2 the response was dual, when the cell viability was evaluated, ZnCl2 10 and 100 ìM was able to protect hippocampal slices exposed to 15 minutes OGD followed by 2 hours of reperfusion, however, ZnCl2 100 ìM was neurotoxic when these slices were subjected to 60 minutes of OGD followed, or not, by 2 hours of reperfusion. In the cell permeability assay, ZnCl2 100 ìM was neuroprotective in the reperfusion period. Still, GSH-t and PSH content decreased after 15 or 60 min PGO specially at the highest ZnCl2 (10 and/or 100 ìM) tested concentration. In hippocampal slices incubated for 1 ctivity of the antioxidant enzyme glutathione reductase (GR), as did the GR specific inhibitor carmustine (BCNU). The GR inhibition by BCNU did not alter the ischemic response, indicating that GR inhibition is a secondary event in the toxicity induced by the ischemic insult, which is in accordance with published data. In the in vitro treatment using quercetin it was possible to unravel neuroprotection at quercetin 10 and 30 ìM when the cell viability was tested during the ischemic or in the reperfusion period. Quercetin at different concentration was unable to reverse the GSH-t content decrease in the 2-hours reperfusion period. The PSH levels remained unchanged in all treatments. Quercetin at 30 and 100 ìM produced neuroprotection in the cell viability test when the hippocampal slices were exposed to 2.5 mM H2O2, but was unable to reverse the GSH-t decrease when hippocampal slices were exposed to 1.0 or 2.5 mM H2O2. The PSH content remained unaltered after H2O2 treatment. These results suggest that ZnCl2 did not cause neuroprotection when administered in vivo, while, in vitro it caused a dual effect, being neurotoxic or neuropretective, depending on the parameter tested. Inhibition of GR is not a relevant fator in the ischemic model employed. Quercetin, demonstrated a strong neuroprotective action in the in vitro ischemia model and a moderate neuroprotective effect against H2O2.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciencias Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Neurociências.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Neurociências. A glutationa (GSH) é um tripeptídeo que possui diversas funções, incluindo defesa antioxidante, detoxificação de xenobióticos e regulação da apoptose. A literatura mostra que condições estressantes (choque) diminuem os níveis de GSH no córtex cerebral de camundongos, um efeito que foi revertido por antidepressivos. No presente estudo, o tratamento de camundongos com GSH produziu efeito antidepressivo no teste do nado forçado (TNF) nas doses entre 300-3000 nmol/sítio, i.c.v. e no teste da suspensão da cauda (TSC) nas doses entre 100-1000 nmol/sítio, i.c.v., sendo que as doses que diminuíram o tempo de imobilidade dos animais nos dois testes comportamentais não alteraram a locomoção no teste do campo aberto, evidenciando um efeito antidepressivo específico da GSH. O efeito da GSH no TNF perdurou até 3 h após sua administração. Após administração de GSH, não houve alterações nos níveis de GSH-t no hipocampo, nem na atividade das enzimas antioxidantes glutationa redutase, glutationa peroxidase e glutationa S-transferase. Além disto, a N-acetilcisteína (NAC; precursora de glutationa), reduziu o tempo de imobilidade dos animais no TNF nas doses de 100 e 150 mg/kg, i.p., sem alterar a locomoção no campo aberto, sendo que seu efeito perdurou até 4 horas após sua administração. Semelhante aos resultados obtidos com a administração de GSH, a administração de NAC não foi capaz de alterar os níveis de GSH-t em hipocampo. A inibição da síntese intracelular de GSH por butionina sulfoximina (BSO) não afetou a ação antidepressiva da GSH, ao contrário da inibição da degradação extracelular da GSH por acivicina que ocasionou a reversão do efeito antidepressivo da GSH (300 nmol/sítio, i.c.v.). O efeito antidepressivo da GSH (300 nmol/sítio, i.c.v.) no TNF foi prevenido pelo pré-tratamento dos animais com GMP (100 mg/kg, i.p., nucleotídeo que antagoniza várias ações induzidas pela ativação do receptor NMDA), ácido ascórbico (100 mg/kg, i.p., neuromodulador que se liga ao sítio redox do receptor NMDA e antagoniza seu efeito), cloreto de zinco (5 mg/kg, i.p., inibidor de receptor NMDA), melatonina (100 mg/kg, i.p., neurohormônio que pode atuar como antagonista de receptor NMDA), ditiotreitol (DTT, 25-100 mg/kg, i.p., agente redutor), L-arginina (750 mg/kg, i.p., precursor de óxido nítrico), S-nitrosoacetilpenicilamina (SNAP; 25 mg/sítio, i.c.v., doador de óxido nítrico), prazosim (62,5 mg/kg, i.p., antagonista de receptores a1-adrenérgicos), baclofen (1 mg/kg, i.p., agonista GABAB) e bicuculina (1 mg/kg; i.p., antagonista GABAA), mas não por ácido dinitrobenzóico (DTNB, 10 nmol/sítio, i.c.v., agente oxidante) e ioimbina (1 mg/kg, i.p., antagonista de receptores a2-adrenérgicos). O pré-tratamento dos animais com doses sub-ativas de GMP (0,5 mg/kg, i.p.), DTNB (0,01 nmol/sítio, i.c.v.), imipramina (5 mg/kg, i.p.), fluoxetina (10 mg/kg, i.p.), glutationa oxidada (GSSG, 30 nmol/sítio, i.c.v.) e a co-administração de MK-801 (0,001 mg/kg, i.p., dose sub-ativa) foi capaz de potencializar o efeito antidepressivo da GSH (100 nmol/sítio, i.c.v., dose sub-ativa no TNF). Estes resultados sugerem o envolvimento dos sistemas glutamatérgico (receptores NMDA), noradrenérgico e GABAérgico, da via L-arginina óxido nítrico, além de uma participação na modulação redox no efeito da GSH no TNF. Os resultados também mostram uma ação antidepressiva sinérgica da GSH com a fluoxetina e imipramina. O conjunto dos dados sugere que a GSH pode ter um papel importante na modulação da depressão. Glutathione (GSH) is a tripeptide that has important functions, including a role in antioxidant defenses, detoxification of xenobiotics and regulation of apoptosis. Literature data has shown that stressant conditions (shock) decreases cortical GSH levels in mice, an effect that was reversed by antidepressants. In the present study, the treatment of mice with GSH significantly decreased the immobility time in the forced swimming test (FST) (dose range 300-3000 nmol/site, i.c.v.) and in the tail suspension test (TST) (dose range 100-1000 nmol/site, i.c.v.), without accompanying changes in ambulation in an open-field test. Moreover, the effect of GSH in the FST lasted until 3 h after its administration. No alterations neither in the levels of GSH-t in hippocampus nor on the activities of the antioxidants enzymes glutathione reductase, glutathione peroxidase and glutathione S-transferase were observed. Beyond that, N-acetylcysteine (NAC; a precursor of glutathione) administered by i.p. route (100-150 mg/kg), significantly reduced the immobility time in the FST, without accompanying changes in ambulation in an open-field test. Moreover, this effect lasted until 4 h after its administration. Similarly to the results obtained with GSH administration, the treatment with NAC was not able to modify the levels of GSH-t in the hippocampus.The inhibition of the intracellular synthesis of GSH by butionine sulfoximine did not affect the antidepressant-like effect of GSH. In contrast, the inhibition of the extracellular degradation of GSH by acivicin reversed the anti-immobility effect of GSH in the FST. The antidepressant-like effect of GSH (300 nmol/site, i.c.v.) was completely prevented by pre-treatment of animals with GMP (100 mg/kg, i.p., a nucleotide that antagonizes some actions induced by NMDA receptor activation), ascorbic acid (100 mg/kg, i.p., a putative neuromoculator that antagonizes NMDA receptors), zinc chloride (5 mg/kg, i.p., an inhibitor of NMDA receptors), melatonin (100 mg/kg, i.p., neurohormonio that can to act as NMDA receptor antagonist), dithiothreitol (DTT, 25-100 mg/kg, i.p., reducing agent), L-arginine (750 mg/kg, i.p., a nitric oxide precursor), S-nitroso-N-acetyl-penillamine (SNAP, 25 mg/site, i.c.v., a nitric oxide donor), prazosin (1 mg/kg, i.p., an a1-adrenoceptor antagonist), baclofen (1 mg/kg, i.p., an GABAB receptor angonist) and bicuculline (1 mg/kg; i.p., an GABAB receptor antagonist), but not with DTNB (10 nmol/sítio, i.c.v., oxidizing agent) and yohimbine (1 mg/kg, i.p., an a2-adrenoceptor antagonist). An antidepressant-like effect of a sub-active doses of GSH (100 nmol/sítio, i.c.v.) was produced by the pre-treatment of animals with sub-active doses of GMP (0.5 mg/kg, i.p.), DTNB (0.01 nmol/sítio, i.c.v.), (5 mg/kg, i.p., a triciclic antidepressant), fluoxetine (10 mg/kg, i.p., a selective serotonin-reuptake inhibitor), oxidized glutathione (GSSG; 30 nmol/sítio, i.c.v.) and the co-administration of MK-801 (0.001 mg/kg, i.p., sub-active dose). The results demonstrate that the antidepressant-like effects of GSH in the FST appear to be mediated by the glutamatergic (NMDA receptors), noradrenergic (a1-adrenoceptors), and GABAergic (GABAA and GABAB receptors) systems, L-arginine nitric oxide pathway, and by a redox modulation. Furthermore, the potentiation of the antidepressant-like effect of fluoxetine and imipramine by GSH might have potential therapeutic value. Taken together, the data suggest that glutathione may have an important role in the modulation of depression.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-graduação em Neurociências. O presente estudo avaliou o efeito da exposição de doses aguda e repetidas (3 e 7 dias) do organofosforado malation e/ou cloreto de zinco sobre parâmetros comportamentais e bioquímicos. Os testes comportamentais utilizados foram o teste do nado forçado (TNF) e do campo aberto. As medidas bioquímicas avaliadas foram a lipoperoxidação e a atividade das enzimas acetilcolinesterase (AChE) cerebral, glutationa redutase (GR), glutationa transferase (GST), glutationa peroxidase (GPx), glicose-6-fosfato-desidrogenase (G6PDH), e os níveis de glutationa total (GSH t) em hipocampo e córtex de ratos Wistar fêmeas adultas. Os tratamentos com malation tiveram efeitos consistentes: a) promoveram aumento do tempo de imobilidade no TNF; b) promoveram peroxidação de lipídios, mensurada indiretamente por substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), em córtex cerebral e hipocampo, e c) reduziram a atividade da AChE que é uma efetiva marcadora de exposição a organofosforados (OF). Os tratamentos com malation que apresentaram estes efeitos foram: tratamento agudo nas doses de 250 e 500 mg/kg,i.p.; tratamento repetido por 3 ou 7 dias nas doses de 50, 100 e 250. O tratamento com malation por 3 dias na dose de 50 mg/kg, i.p. não apresentou alteração na atividade da AChE. Após a exposição aguda ao malation na dose 250 mg/kg i.p., foram avaliados alguns parâmetros antioxidantes. O tratamento com malation reduziu a atividade da GR e GST, e aumentou a atividade da G6PDH em córtex cerebral. Nenhuma mudança foi observada nos níveis de GSH-t e na atividade da GPx. No hipocampo nenhuma alteração foi observada nos parâmetros antioxidantes avaliados. Estes achados mostram uma clara ação seletiva do malation no córtex cerebral. Para investigar o possível efeito antidepressivo do cloreto de zinco, ratos foram tratados com 5 mg/kg, i.p. de cloreto de zinco. No tratamento agudo com cloreto de zinco não houve alteração no tempo de imobilidade no TNF. Porém o tratamento com cloreto de zinco reduziu a atividade locomotora dos animais no teste do aberto campo, indicando um efeito sedativo, e também, diminuiu a atividade da AChE. Foram observados efeitos semelhantes no tratamento durante três dias com cloreto de zinco. Uma dose aguda de cloreto de zinco 5 mg/kg, i.p. mostrou um moderado efeito pró-oxidante, observado pelo aumento nos níveis de TBARS no hipocampo. Quando cloreto de zinco foi co-administrado com malation houve uma reversão no efeito tipo-depressivo do malation, sendo este efeito observado no tratamento agudo e no de 3 dias. O aumento nos níveis de TBARS causado pelo tratamento com malation durante 3 dias também foi prevenido pelo cloreto de zinco, mas só em hipocampo. Nos parâmetros antioxidantes estudados o tratamento agudo com cloreto de zinco per se induziu a redução da atividade da GR e da GST, de forma semelhante ao malation. A combinação de ambos não mudou este quadro. Entretanto, o cloreto de zinco preveniu o aumento da atividade da G6PDH e reduziu o efeito do malation sobre a atividade da GR. Os níveis de GSH-t não foram alterados pelos tratamentos com malation e/ou cloreto de zinco.