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CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Na placentação inicial, as células de citotrofoblasto proliferam e diferencia-se por fusão celular para formar uma camada multinucleada, o sinciciotrofoblasto e também formam o trofoblasto extraviloso que invade a mucosa uterina, fenômeno essencial para uma gestação de sucesso. No curso da gestação, a infecção causada por Toxoplasma gondii pode desencadear manifestações graves e potencialmente afetar o desenvolvimento fetal.. Diferenças na susceptibilidade de células trofoblásticas à infecção por T. gondii devem ser avaliadas para subsidiar o estabelecimento de novas abordagens terapêuticas capazes de interferir no controle da infecção fetal sem comprometer o sucesso da gestação. Assim, este estudo teve como objetivo avaliar a susceptibilidade de citotrofoblasto, sinciciotrofoblasto e células de trofoblasto extraviloso à infecção por T. gondii e possíveis mecanismos celulares envolvidos neste fenômeno. As células BeWo foram utilizadas como modelo de células de citotrofoblasto e sinciciotrofoblasto (após processo de sincicialização usando Forskolin e PMA), enquanto as células HTR-8/SVneo serviram como modelo de células de trofoblasto extraviloso. As células foram cultivadas sobre lamínulas redondas em placas de 6 poços e infectadas por taquizoitos de T. gondii (cepa RH) por 24 horas adicionais. Em paralelo, os três tipos de células foram tratados com inibidor de quinase regulada por sinais extracelulares (ERK)1/2 (PD98059) durante 3 horas e infectados por T. gondii por adicionais 24 horas. Os sobrenadantes foram coletados para avaliar o perfil das citocinas e as células para analisar quanto ao índice de infecção, número total de parasitos e fosforilação de quinases reguladas por sinais extracelulares (MAPKs). Como resultado, as células HTR-8/SVneo apresentaram maior susceptibilidade à infecção por T. gondii quando comparadas às células de sinciciotrofoblasto e citotrofoblasto, enquanto que o sinciciotrofoblasto foi o tipo de célula mais resistente à infecção parasitária. Além disso, células de citotrofoblasto e sinciciotrofoblasto produziram significativamente mais IL-6 do que as células HTR-8/SVneo. Por outro lado, as células HTR-8/SVneo apresentaram maior fosforilação de ERK1/2 do que as demais células trofoblásticas. A inibição de ERK1/2 reduziu a infecção por T. gondii e aumentou a produção de IL-6 em células HTR-8/SVneo. Assim, é possível sugerir que as células HTR-8/SVneo foram mais suscetíveis à infecção por T. gondii provavelmente porque essas células apresentaram maior fosforilação ERK1/2 e menores níveis de IL-6 em comparação com outras células trofoblásticas, sugerindo que esses mediadores podem ser importantes para favorecer a infecção parasitária neste tipo de população celular placentária. During initial placentation, cytotrophoblast cells proliferate and differentiate by cellular fusion to form a multinucleated layer, the syncytiotrophoblast, and also form the extravilous trophoblast that invades the uterine mucosa, an essential phenomenon for successful gestation. In the course of gestation, infection caused by Toxoplasma gondii can trigger serious manifestations and potentially affect fetal development. . Differences in the susceptibility of trophoblastic cells to T. gondii infection should be evaluated to support the establishment of new therapeutic approaches capable of interfering in the control of fetal infection without compromising the success of pregnancy. This study aimed to evaluate the susceptibility of cytotrophoblast, syncytiotrophoblast and extravillous trophoblast cells to T. gondii infection and possible mechanisms involved in this process. BeWo line cells were used as model of cytotrophoblast (before syncytialization process) and syncytiotrophoblast cells (after syncytialization process by using forskolin and PMA), whereas human HTR-8/SVneo cells served as model of extravillous trophoblast cells, according to previous studies. Cells were cultured in coverslips into 6-well plates and infected by T. gondii tachyzoites (RH strain) for additional 24 hours. In parallel, the three cell types were treated with extracellular signals regulated kinases (ERK) 1/2 inhibitor (PD98059) for 3 hours and infected by T. gondii for additional 24 hours. The supernatants were collected to measure cytokine profile, and the cells analyzed for infection index, total number of parasites and mitogen activated protein kinases (MAPKs) phosphorylation. HTR-8/SVneo cells showed the highest susceptibility to T. gondii infection when compared to syncytiotrophoblast and cytotrophoblast cells, whereas syncytiotrophoblast was the cell type more resistant to the parasite infection. In addition, cytotrophoblast and syncytiotrophoblast cells produced significantly more IL-6 than HTR-8/SVneo cells. On the other hand, HTR-8/SVneo cells showed higher ERK1/2 phosphorylation than cytotrophoblast and syncytiotrophoblast cells. ERK1/2 inhibition reduced T. gondii infection and increased IL-6 production in HTR-8/SVneo cells. Thus, it is possible to suggest that HTR-8/SVneo cells are more susceptible to T. gondii infection likely because these cells presented higher ERK1/2 phosphorylation and lower IL-6 levels compared to other cells, suggesting that these mediators can be important to favor the parasite infection in this type of trophoblastic population. Tese (Doutorado)

Made available in DSpace on 2016-08-15T20:31:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 FerdinandoVFB_DISSERT.pdf: 10097957 bytes, checksum: aaf72cc9003c689e5792192fd220aef8 (MD5) Previous issue date: 2014-02-28 Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico The subplacenta is considered an ideal model for comparative studies of trophoblastic processes in humans. Thus, the aim of this study was made a morphological description of the development of the Spix s yellow-toothed cavy. To do this, 12 females were distributed in three groups in a proportion of 1 male to 4 females, kept in pickets of 5m2. Thereafter, vaginal cytology examinations were made daily, to verify if the females were copulated and to separate them from the other females. Then, the collection of subplacentas was made in the 15, 23, 30, 45, 53 and 55 days of gestation, by slaughtering the pregnant females using a specific anesthesic protocol. The samples were processed to standard histological techniques, cytochemistry and immunohistochemistry, and to transmission electronic microscopy. In the 15th day of gestation, the subplacenta was formed by a single cytotrophoblastic layer surrounded by a vacuolized syncytium with maternal lacunae which presented invasive characteristic in the portions apart of the cytotrophoblastic layer. In the 23th day of gestation, the subplacenta did not presented a well-defined shape, however, it was organized in lobules composed of predominantly of cytotrophoblast e its syncytium was related to the regions where maternal lacunae previously appeared. In the 30th day of gestation, the subplacenta appeared as a compact organ with a well-defined shape and with an evident mesenchymal capilarization; the lobules was composed by syncytiotrophoblast in the centre, and by a mesenchyme surrounded by cytotrophoblast. From the 45th day of gestation, the degeneration of the subplacental tissue was evident and the syncytiotrophoblast was more abundant than the cytotrophoblast; moreover, the syncytium was markedly vacuolized and presented signs of cellular death. Near to gestation term (53-54thday), the subplacenta was in an advanced degeneration stage, with evident signs of cellular death and reduction of subplacental tissue. The presence of fetal circulation was characteristic from the 23th day of gestation, evidenced by the positive reaction to vimentin; positive reaction to cytokeratin was observed during entire gestation. The proliferative activity of the subplacenta was assessed by PCNA and AgNOR procedures, and demonstrated to be higher in the beginning of the gestational period, decreasing progressively during the gestation. Ultrastructurally, the subplacenta presented cellular and syncytial trophoblastic characteristics. The development of the Spix s yellow-toothed cavy subplacenta starts around the 15th day of gestation, reaching maximum development in the 30th day and becomes necrotic in the end of gestation. Moreover, it presented an organization and structure similar to the subplacenta of other cavidae A subplacenta é considerada um modelo ideal para o estudo comparativo dos processos trofoblásticos em humanos. Dessa maneira objetivou-se descrever morfologicamente o desenvolvimento da subplacenta no preá. Para isto foram utilizadas 12 fêmeas desta espécie que foram distribuídas em três grupos numa relação de um macho para quatro fêmeas, mantidos em boxes de 5m2. Após formação dos grupos, exames de citologia vaginal eram realizados diariamente, para verificação da cópula, separando-se dos grupos as fêmeas que eram cobertas. A partir da ocorrência da cópula programaram-se as coletas das subplacentas nos dias 15, 23, 30, 45, 53, e 55 da gestação e estas foram realizadas mediante sacrifício das fêmeas gestantes com a utilização de protocolo anestésico específico. O material, então, era processado segundo técnicas para histologia convencional, citoquímica, imunohistoquímica e microscopia eletrônica de transmissão. No 15° dia de gestação observou-se que a subplacenta era constituída por uma monocamada citotrofoblástica envolta por sincício que apresentava vacúolos e lacunas maternas e que ao se afastar da camada de citotrofoblasto apresentava características invasivas. Aos 23 dias de gestação a subplacenta apresentou-se ainda sem uma forma característica definida, porém, mostrava uma conformação em lóbulos compostos predominantemente por citotrofoblasto e seu sincício esteve relacionado com as regiões onde apareciam as lacunas de origem materna. Aos 30 dias de gestação a subplacenta mostrou-se como um órgão compacto de forma definida e com a capilarização do mesênquima bastante evidente, os lóbulos eram constituídos por citotrofoblasto que envolvia o mesênquima e em seu centro possuía sinciciotrofoblasto. A partir dos 45 dias de gestação a degeneração do tecido subplacentário era evidente e a quantidade de sinciciotrofoblasto supera a de citotrofoblasto, alem disto o sincício apresenta uma grande quantidade de vacúolos e sinais de morte celular podiam ser visualizados. Aproximando-se ao termo da gestação (53 e 55 dias) a subplacenta encontrava-se em avançada degeneração e os sinais de morte celular assim como a diminuição de seu tecido eram evidentes. A presença da circulação fetal foi característica a partir do 23° dia de gestação podendo ser destacada pela reação positiva a vimentina, e a reação a citoqueratina foi positiva durante toda a gestação especialmente no citotrofoblasto. A atividade proliferativa do tecido subplacentário, avaliada pelas técnicas de PCNA e AgNOR, demonstrou ser maior no inicio da gestação e decair com o avançar desta. Ultraestruturalmente evidenciou-se as características do trofoblasto celular e sincicial. O desenvolvimento da subplacenta do preá inicia-se por volta do 15° dia de gestação, tem seu auge aos 30 dias e a termo é necrótica. Além disto, é muito semelhante a subplacenta de outros cavídeos, quanto a sua organização e estrutura