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Dissertação de Mestrado em Biotecnologia para as Ciências da Saúde O cancro é uma patologia complexa e heterogénea associada a uma elevada taxa de mortalidade (13% de todas as mortes em todo o mundo em 2008) e morbilidade. O cancro da mama é fatal em cerca de 20 a 60% dos casos nos países desenvolvidos e subdesenvolvidos, respetivamente. Evidências experimentais e epidemiológicas apontam para um efeito benéfico do exercício físico no cancro da mama, afetando muitos processos celulares, incluindo o metabolismo energético. A utilização de técnicas moleculares e bioquímicas tem possibilitado a investigação dos fatores que podem afetar o desenvolvimento e/ou progressão desta doença (sistema imunitário, fatores genéticos, metabolismo, entre outros). No âmbito da presente dissertação, induziram-se tumores mamários em ratos fêmea Sprague-Dawley com 1-metil-1-nitrosureia (MNU) (50 mg/kg peso corporal). Os animais foram exercitados numa passadeira rolante à velocidade de 20 m/min, 1 hora/dia, 5 dias/semana, 8 meses. No final do protocolo experimental, analisaram-se células normais e tumorais de dois animais sedentários através de bandeamento GTL, CBL e NOR e analisou-se o efeito do exercício físico na expressão das proteínas ATP sintase (subunidade β) e gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) em células tumorais (epiteliais e fibroblastos). Os resultados obtidos evidenciaram que o cariótipo normal da espécie Rattus norvegicus fêmea (modelo animal utilizado neste trabalho) é de 2n=42, XX. A análise de 50 metafases tumorais revelou somente a presença de anomalias cromossómicas numéricas (2n=84; 2n=75 e duas células com 2n=41, XX, -12). A nível do bandeamento NOR, verificou-se um caso de poliploidia (2n=82). A ausência de alterações cromossómicas estruturais pode dever-se à presença de mutações pontuais ou alterações epigenéticas. Outra hipótese será a impossibilidade de deteção de pequenas alterações cromossómicas pela técnica de bandeamento GTL. Investigações futuras recorrendo à citogenética molecular poderão esclarecer estas dúvidas e contribuir para uma melhor caracterização citogenética dos tumores mamários induzidos pelo MNU. A análise da expressão das proteínas ATP sintase (subunidade β) e GAPDH sugere a existência de diferenças entre o grupo sedentário e exercitado com um aumento da expressão de ambas as proteínas no grupo exercitado. Verificaram-se, também, diferenças entre as células epiteliais e os fibroblastos, sendo que estes últimos apresentaram níveis de expressão superiores de ambas as proteínas. Estas diferenças entre os dois tipos celulares podem ser reveladoras da complexidade de interações entre o tumor e o estroma envolvente. Deste modo, estudos futuros baseados nestas evidências poderão ser úteis para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas mais eficazes. Concluindo, os resultados citogenéticos indicam que as alterações cromossómicas induzidas pelo MNU mais evidentes são as numéricas, pelo que este modelo poderá não ser o mais indicado para o estudo de alterações estruturais através de bandeamento G. Os resultados bioquímicos, apesar de preliminares, evidenciam que o exercício físico, ao modular o metabolismo das células tumorais, poderá ter um papel fundamental no desenvolvimento e/ou progressão do cancro mamário. Estudos futuros sobre os mecanismos subjacentes a estes efeitos irão providenciar novas evidências que possam permitir recomendar a prática de atividade física aos doentes com cancro mamário como abordagem terapêutica não farmacológica complementar. Cancer is a complex and heterogeneous pathology associated with a high mortality (13% of all worldwide deaths in 2008) and morbidity. With regard to breast cancer, it is fatal in about 20 to 60% of cases in developed and developing countries respectively. Experimental and epidemiological evidences suggest that physical exercise has a beneficial effect on breast cancer, affecting several cellular processes including energy metabolism. The use of molecular and biochemical techniques has enabled the investigation of several factors that may affect disease’s development and/or progression (immune system, genetic factors, metabolism and others). In the present work, mammary tumors were chemically-induced by 1-methyl-1-nitrosourea (MNU) (50 mg/kg) in female Sprague-Dawley rats. The animals were exercised in a treadmill at a speed of 20 m/min, 1 h/day, 5 days/week, during 8 months. At the end of the experimental protocol, normal and tumor cells of two sedentary animals were cytogenetically analyzed by GTL, CBL and NOR banding and the effect of physical exercise on the ATP synthase (β-subunit) and glyceraldehyde-3-phosphate desidrogenase (GAPDH) proteins expression was also analyzed in tumor cells (epithelial cells and fibroblasts). The results confirmed that the female Rattus norvegicus species normal karyotype (animal model used in this work) is 2n=42, XX. The analysis of 50 tumor metaphases has shown the presence of numerical chromosome alterations (2n=84; 2n=75 and two cells with 2n=41, XX, -12). The NOR banding revealed a polyploidy case (2n=82). The absence of structural chromosome changes can be due to punctual mutations or epigenetic alterations. Another hypothesis is that GTL banding technique does not detect small chromosome changes. Future investigations using molecular cytogenetics might clarify these questions and therefore contribute to an improved cytogenetic characterization of MNU-induced mammary tumors. The ATP synthase (β subunit) and GAPDH expression analysis suggests the existence of differences between the sedentary and exercised groups revealing an increased expression of both enzymes in exercised group. Also, differences between epithelial cells and fibroblasts were found, with these last ones having higher expression levels of both proteins in comparison to epithelial cells. These differences between the two types of cells may suggest complex interactions between the tumor and the surrounding stroma. So, future studies based on these evidences might be useful for the development of more effective therapeutic approaches. In conclusion, the cytogenetic results indicate that the most evident chromosome alterations induced by MNU are numerical ones. Therefore, this model may not be the most suitable model for the study of chromosome changes detectable by G banding. The biochemical results, although preliminary, show that physical exercise through the modulation of tumor cells metabolism might play a fundamental role in breast cancer development and/or progression. Future studies about the mechanisms underlying these effects will provide new scientific evidences that may allow recommending the practice of physical activity to breast cancer patients as a complementary non-pharmacological therapeutic approach.

Dissertação de Mestrado em Biologia Clínica Laboratorial Os trihalometanos (THMs) são subprodutos da desinfecção da água resultantes da reacção lenta do cloro livre com a matéria orgânica e os iões brometo, presentes naturalmente na água. O objectivo deste trabalho foi avaliar as alterações nos parâmetros bioquímicos, os efeitos histológicos hepáticos e os efeitos na bioenergética mitocondrial da exposição oral de machos Murganhos da estirpe ICR a baixas doses de dois THMs, o bromodiclorometano (BDCM) e o dibromoclorometano (DBCM). Os animais foram distribuídos aleatoriamente por quatro grupos experimentais, um grupo controlo e três grupos destinados a posterior administração de metanol, DBCM e BDCM. A administração dos compostos foi feita por gavage durante dois dias consecutivos, um dia de intervalo e, novamente, dois dias consecutivos. Quatro semanas depois os animais foram eutanaziados e recolhidos o sangue e os órgãos para avaliar as alterações bioquímicas, histopatológicas e da bioenergética mitocondrial. Para avaliar as alterações bioquímicas foram determinadas as actividades séricas da alanina aminotranferase, da aspartato aminotransferase e da fosfatase alcalina e as concentrações séricas da albumina, da bilirrubina total e directa, das proteínas totais, da ureia e da creatinina. Macroscopicamente não foram observadas alterações em nenhum dos órgãos recolhidos. Ambos os THMs administrados induziram um aumento da actividade sérica da alanina aminotransefrase e o BDCM induziu um aumento da concentração sérica da bilirrubina total. Em termos histológicos, os THMs administrados causaram uma hepatite ligeira caracterizada pela presença de degenerescência vacuolar dos hepatócitos, existência de necrose de coagulação moderada e presença de infiltrado inflamatório. A bioenergética mitocondrial foi alterada negativamente, ambos os THMs provocaram diminuição da respiração dissociada da fosforilação oxidativa. O DBCM aumentou o estado 4 da respiração. A função enzimática mitocondrial foi também afectada. A administração de DBCM induziu uma diminuição da actividade das enzimas succinato desidrogenase e citocromo c oxidase e um aumento da actividade enzimática da glutatiao S-transferase. A administração do BDCM induziu uma diminuição das actividades enzimáticas da succinato desidrogenase e da ATP sintetase e um aumento da actividade enzimática da glutatião S-transferase. Os resultados observados permitem concluir que não e seguro ingerir água que contenha BDCM e DBCM pois a exposição a estes compostos, mesmo em pequenas doses e por períodos de tempo curtos, causam diversas alterações no normal funcionamento do fígado. Trihalomethanes (THMs) are water disinfection byproducts (DBP) resulting from the slow reaction of chlorine and naturally occurring organic precursors and bromide. The purpose of this study was to determine the effects of the oral exposure of male ICR Mice to low doses of two THMs, bromodichloromethane (BDCM) and dibromochloromethane (DBCM) in hepatic histology, biochemistry and mitochondrial bioenergetics. The animals were randomly assigned to four experimental groups, a control group and 3 groups for further administration of methanol, DBCM and BDCM. Administration was carried out daily for two days, off for one day and then daily again for two days, by oral gavage. Four weeks later the animals were sacrificed, blood and organs were collected for serum biochemical analysis, histological analysis and evaluation of mitochondrial bioenergetics. To evaluate biochemical changes, serum activities of alanine aminotransferase, aspartate aminotransferase and alkaline phosphatase and serum concentrations of albumin, total and direct bilirrubine, ureia nitrogen and creatinine were determined. Macroscopically it was not observed any changing in all harvested organs. Both THMs administered induced an increase of alanine aminotransferase serum activity and BDCM induced an increase in total bilirubine serum concentration. Histologically, the administered THMs caused a mild hepatitis characterized by the presence of hepatocyte vacuolar degeneration, coagulative necrosis and inflammatory infiltrate. Mitochondrial bioenergetics was negatively altered by the THMs’s administration, both THMs induced a decrease in respiration dissociated from the oxidative phosphorylation. DBCM increased the sate 4 respiration. Enzymatic function was also affected. Administration of DBCM induced a decrease in the enzymatic activities of succinate-coenzyme Q reductase and cytochrome c oxidase and an increase in the activity of glutathione S-transferase. BDCM induced a decrease in the activities of succinate-coenzyme Q reductase and ATP syntetase and an increase of the activity of glutathione S-transferase. These results lead to the conclusion that it is not safe to ingest water containing both BDCM and DBCM once the exposure to these THMs, even in small doses and for a short period of time, causes various changes in the normal hepatic function and bioenergetics.

Dissertação de Mestrado em análises laboratoriais A diminuição da produção de óxido nítrico (NO) parece estar envolvida na patogénese das doenças hepáticas crónicas. Portanto, um fármaco que aumente a biodisponibilidade do NO pode ter um efeito hepatoprotector. O nebivolol é um bloqueador β1 que aumenta a biodisponibilidade de NO através do aumento das sua síntese a partir do endotélio e da diminuição da sua inactivação pelo stress oxidativo. Este trabalho teve como objectivo, avaliar o efeito do tratamento com o nebivolol na lesão hepática induzida pela ligadura do conducto biliar comum (LBC), um modelo secundário de fibrose biliar. Neste estudo, foram utilizados 33 ratos machos da estirpe Wistar, dos quais 25 foram submetidos a uma LBC e nos restantes a cirurgia foi simulada. Três dias após a cirurgia os animais foram divididos em 3 grupos experimentais: LBC- ratos com LBC sem tratamento (n=8); LBC+N- ratos com LBC tratados com o nebivolol na dose de 8 mg/Kg de peso corporal (n=8); e Sham- ratos em que a cirurgia foi simulada (n=8). O tratamento foi administrado durante 5 semanas na água de bebida. A função hepática foi avaliada através da determinação da actividade plasmática da alanina aminotransferase (ALT), da aspartato aminotransferase (AST) e da gama glutamiltransferase (GGT) e das concentrações plasmáticas de bilirrubina total (BT), de bilirrubina directa (BD) e de albumina (Alb). A avaliação das lesões histológicas e do grau de fibrose hepática foram realizadas através das colorações de hematoxilina-eosina, de tricrómico de Masson e de reticulina. Neste trabalho, conseguiu-se induzir uma lesão hepática secundária à LBC, demonstrada pelo aumento da actividade plasmática da ALT, da AST e da GGT, pelo aumento da concentração plasmática de BT e de BD, e pela diminuição da concentração plasmática de Alb. O grau de fibrose hepática não foi afectado pelo tratamento com o nebivolol, no entanto, quando se comparam os grupos submetidos à LBC, verifica-se que, o grupo LBC+N apresentou uma maior sobrevida, um maior ganho ponderal de peso e um maior valor do hematócrito. Para além disso, observou-se uma menor alteração da funcionalidade hepática, evidenciadas pelo aumento menos acentuado da actividade plasmática da GGT e da concentração plasmática de BT e de BD, e pela menor diminuição da concentração plasmática de Alb. Os resultados obtidos sugerem que o nebivolol pode ter um efeito benéfico sobre algumas das lesões hepáticas induzida pela LBC.

Dissertação de Mestrado em Medicina Veterinária O estudo das doenças endócrinas é essencial dada a importância destas na prática clínica veterinária. Esta dissertação de mestrado descreve um estudo retrospectivo de 3 doenças endócrinas (diabetes mellitus, hiperadrenocorticismo e hipotiroidismo) decorridas no HVUTAD entre 2003-2008. Com este estudo pretendemos conhecer a expressividade destas doenças na população canina e felina, determinar qual delas é mais frequente e fazer uma análise, doença por doença, sobre a identificação do animal (idade, sexo e raça), o tipo de alimentação, se estavam vacinados e desparasitados, os sinais clínicos, o resultado das análises laboratoriais (hemograma, análises bioquímicas e urinárias), os exames imagiológicos efectuados, se os animais foram, ou não, tratados e a respectiva evolução destes perante o tratamento instituído. Os resultados obtidos foram discutidos entre si sendo, posteriormente, comparados com os apresentados na bibliografia. The study of endocrine diseases is essential due to their importance in veterinary clinical practice. This dissertation describes a retrospective study of 3 endocrine disorders (diabetes mellitus, hyperadrenocorticism and hypothyroidism) that took place during HVUTAD between 2003-2008. This study aims to know the expressivity of these diseases in dog and cat population, determine which one is more frequent and do an analysis, disease by disease and the identification of the animal (age, sex and race), the type of food, if they were vaccinated and dewormed, clinical signs, the result of laboratory tests (blood count, biochemical and urinary), imaging investigations carried out if the animals were either not treated and their development of these before the treatment. The results were discussed with each other and then compared with those presented in the bibliography.

Dissertação de Mestrado em Biologia Clínica Laboratorial O pó da folha de oliveira, devido aos compostos fenólicos presentes na sua constituição, é utilizado como um suplemento dietético e considerado eficaz na prevenção e no tratamento de doenças cardiovasculares e vários tipos de cancro. O objectivo deste trabalho experimental foi avaliar os efeitos do pó da folha de oliveira no fígado e em parâmetros hepáticos de fêmeas de murganho, da estirpe ICR, com 4 a 5 semanas de idade. À ração comercial Teklad Global Diet (Harlan-Interfauna, Espanha) foi adicionado pó da folha de oliveira em três concentrações diferentes (0.25%, 0.50% e 0.75%). Os animais foram distribuídos ao acaso por quatro grupos, um grupo controlo e três grupos suplementados com o pó da folha de oliveira. O ensaio experimental teve a duração de 14 semanas. No fim do ensaio, foram recolhidas amostras de vários órgãos e de sangue, para avaliar: alterações histológicas, a função hepática e stresse oxidativo. Nos grupos alimentados com as concentrações de 0.50% e 0.75% do pó da folha de oliveira morreram 2 e 5 animais, respectivamente. Nestes mesmos grupos alguns animais apresentaram icterícia e perda de peso. No grupo suplementado com 0.75% do pó da folha de oliveira observaram-se alterações macroscópicas nos fígados, nomeadamente a coloração esverdeada, a dilatação dos ductos biliares e a vesícula biliar distendida. No estudo histológico dos vários órgãos recolhidos não se observaram alterações, à excepção do fígado. Na análise histológica do grupo suplementado com maior concentração do pó da folha de oliveira observou-se alteração da arquitectura normal do fígado, nomeadamente hiperplasia dos ductos biliares, áreas de necrose e mitoses. Nos ensaios da respiração observámos uma diminuição significativa da respiração no grupo suplementado com a maior concentração do pó da folha de oliveira. As alterações morfológicas do fígado induzidas pela dieta suplementada com o pó da folha de oliveira podem estar relacionadas com a diminuição da energia da célula resultante da má funcionalidade da mitocôndria. Os resultados por nós obtidos sugerem que ao contrário do que alguns autores afirmam, o extracto da folha de oliveira não é um produto benéfico para a saúde, podendo conter substâncias que o tornam num produto perigoso e tóxico. The olive leaf extract, due to the phenolic compounds present in its constitution, is used as a dietary supplement, considered effective in the prevention and treatment of cardiovascular diseases and several types of cancer. This experimental work aimed to assess the effect of olive leaf extract in both liver and liver parameters of female ICR strain of mice with 4 to 5 weeks of age. To the Teklad Global Diet (Harlan-Interfauna, Spain) feed was added olive leaf extract in three different concentrations (0.25%, 0.50% and 0.75%). Animals were distributed randomly in four groups, one control group and three groups supplemented with olive leaf extract. The experimental test had the duration of fourteen weeks. At the end of the test, samples were collected from several organs and blood, to evaluate: histological changes, liver function and oxidative stress. In groups fed with 0.50% and 0.75% concentrations of olive leaf extract, 2 and 5 animals died respectively. In these groups some animals showed icterus and lost weight. In group supplemented with 0.75% of olive leaf extract, there were observed macroscopic changes in livers, namely a green coloration, expansion of bile ducts and gallbladder slack. In the histological study of various organs collected, no changes were observed, with the exception of the liver. In the histological analysis of group supplemented with highest concentration of olive leaf extract there were changes in the normal architecture of the liver namely hyperplasia of the bile ducts, areas of necrosis and mitoses. In the test of respiration, it was observed a significant decrease of breathing in the group supplemented with the highest concentration of olive leaf extract. Morphological changes in the liver induced by supplemented diet with olive leaf extract may be related to the reduction of cell energy resulting from the inadequate feature of mitochondria. The results we obtained suggest that contrary to what some authors say, that the olive leaf extract is not a beneficial product to health, and may contain substances that make it a dangerous and toxic product.

Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias A revisão bibliográfica desta tese de doutoramento descreve os aspectos gerais da carcinogénese química e enumera os diversos modelos experimentais, com roedores, que se podem utilizar no estudo da carcinogénese química do urotélio. Na parte experimental são apresentados quatro trabalhos experimentais diferentes. No primeiro trabalho caracterizámos as lesões histopatológicas identificadas em ratos Fisher 344 após a exposição oral durante 20 semanas à N-butil-N-(4-hidroxibutil) nitrosamina e instiladas intravesicalmente com a mitomicina C e o Bacillus de Calmette-Guérin. Estudámos o conteúdo em ADN destas lesões e verificámos que os animais instilados com a mitomicina C e o Bacillus de Calmette-Guérin apresentaram menor frequência de aneuploidia de ADN. Nos carcinomas papilares de baixo e de alto grau tratados com a mitomicina C ou o Bacillus de Calmette-Guérin o índice de proliferação diminuiu e o índice de apoptose aumentou. Observámos correlações positivas entre o índice de proliferação e o índice de apoptose (r=0,438, p