Search

Thyroid neoplasms are the main types of endocrine malignancy, their incidence increasing in recent years. Routine diagnosis may present inconclusive results, leading to the need for using additional techniques that are more precise, such as molecular analysis. Therefore, it is essential to search for molecular markers for the diagnosis of these malignancies and their different histological types. The objective of this study was to identify diagnostic molecular markers for papillary thyroid carcinomas (PTC) and goiter lesions. For this, expression of genes belonging to the MAPK/KINASE pathway was assessed by the RT-qPCR technique. Additionally, complete biochemical profiles of the samples were obtained using Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR). Results of RT-qPCR suggest that FOS, JUN, MAP2K6, CCNA1, SFN genes have the potential to be tumor markers of thyroid lesions, and the MAP2K6, CCNA1, SFN genes further have the potential to distinguish PTC samples from other thyroid lesions. FTIR results showed that PTC lesions can be distinguished from normal and benign tissues with 95.83% efficiency; changes in nucleic acids being the major classifying factor. Overall, results suggest potential of molecular and FTIR analysis in diagnosis of thyroid cancer. Las neoplasias tiroideas son los principales tipos de malignidad endocrina, incrementándose su incidencia en los últimos años. El diagnóstico de rutina puede presentar resultados no concluyentes, lo que obliga a utilizar técnicas adicionales más precisas, como el análisis molecular. Por lo tanto, es fundamental la búsqueda de marcadores moleculares para el diagnóstico de estas neoplasias malignas y sus diferentes tipos histológicos. El objetivo de este estudio fue identificar marcadores moleculares de diagnóstico para carcinomas papilares de tiroides (CPT) y lesiones de bocio. Para ello, se evaluó la expresión de genes pertenecientes a la vía MAPK/KINASE mediante la técnica RT-qPCR. Además, se obtuvieron perfiles bioquímicos completos de las muestras mediante espectroscopia infrarroja transformada de Fourier (FTIR). Los resultados de RT-qPCR sugieren que los genes FOS, JUN, MAP2K6, CCNA1, SFN tienen el potencial de ser marcadores tumorales de lesiones tiroideas, y los genes MAP2K6, CCNA1, SFN tienen además el potencial de distinguir muestras de CPT de otras lesiones tiroideas. Los resultados de FTIR mostraron que las lesiones de CPT se pueden distinguir de los tejidos normales y benignos con una eficiencia del 95,83 %; siendo los cambios en los ácidos nucleicos el principal factor de clasificación. En general, los resultados sugieren el potencial del análisis molecular y FTIR en el diagnóstico del cáncer de tiroides. As neoplasias da tireoide são os principais tipos de malignidade endócrina, apresentando incidência aumentada nos últimos anos. O diagnóstico de rotina pode apresentar resultados inconclusivos, levando à necessidade de utilização de técnicas adicionais mais precisas, tais como a análise molecular. Portanto, é essencial a busca de marcadores moleculares para o diagnóstico dessas neoplasias e seus diferentes tipos histológicos. O objetivo deste estudo foi identificar marcadores moleculares diagnósticos para carcinoma papilífero de tireoide (CPT) e lesões de bócio. Para isso, a expressão de genes pertencentes à via MAPK/KNASE foi avaliada pela técnica de RT-qPCR. Adicionalmente, perfis bioquímicos completos das amostras foram obtidos por meio da espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR). Os resultados do RT-qPCR sugerem que os genes FOS, JUN, MAP2K6, CCNA1, SFN têm o potencial de serem marcadores tumorais de lesões da tireoide, e os genes MAP2K6, CCNA1, SFN têm ainda o potencial de distinguir amostras de CPT de outras lesões de tireoide. Os resultados do FTIR mostraram que as lesões de CPT podem ser diferenciadas de tecidos normais e benignos com 95,83% de eficiência; sendo as alterações nos ácidos nucleicos o principal fator de classificação. No geral, os resultados sugerem o potencial da análise molecular e do FTIR no diagnóstico do câncer de tireoide.

Resumo Pterígios são lesões geralmente benignas que na maioria dos casos não requer tratamento específico. É um crescimento fibrovascular sobre a córnea, geralmente a partir do lado nasal. Sua causa ainda não foi elucidada, mas parece estar relacionada à exposição aos raios ultravioleta. Quando os sintomas não são controlados com tratamento conservador, a cirurgia é indicada, porém o índice de recidiva ainda é alto, e os esforços têm sido no sentido de reduzir esse índice. A mitomicina C (MMC) é uma opção de adjuvante à cirurgia por ser um inibidor da proliferação de fibroblastos, diminuindo o risco de recorrência do pterígio. Relatamos aqui um caso que descreve cirurgia de pterígio realizada em ambos os olhos de uma mesma paciente, sendo um com MMC e outro sem ela. Os resultados e o índice de proliferação celular dos dois olhos foram comparados entre si. Abstract Pterygia are usually benign lesions that do not require specific treatment. It is a fibrovascular growth onto the nasal side of the cornea. It`s cause has not been fully elucidated yet, but seems to be related to long -term ultraviolet ray exposure. When symptoms are not controlled with conservative treatment surgery is considered, but the recurrence rate is still high, and efforts have been made to avoid it. Mitomycin C (MMC) is a fibroblast proliferation inhibitor that can be used as adjuvant to surgery to reduce recurrence. We report here a case that describes pterygium surgery performed in both eyes of the same patient, being one with MMC and the other eye without it. Both pterygium were sent to laboratory analysis. The results and proliferation index were compared between the eyes.

Galectina-3 (GAL3) é uma lectina que apresenta importantes papéis na biologia tumoral e recentemente tem sido associada com a via de sinalização Wnt, auxiliando a beta-catenina na translocação ao núcleo. Alterada expressão de GAL3 e beta-catenina tem sido descrita em muitos cânceres, mas não em modelos de carcinogênese bucal em animais modificados geneticamente. Objetivo é estudar o processo de carcinogênese bucal em camundongos selvagens (GAL3+/+) e nocautes (GAL3-/-) para GAL3 bem como a expressão de GAL3 e beta-catenina em lesões displásicas e carcinomas desenvolvidos nas línguas desses animais. Vinte camundongos C57BL/6, machos, GAL3+/+ e GAL3-/- foram desafiados com 4NQO na água de beber por 16 semanas e sacrificados na semana 16 e 32. Após o sacrifício, as línguas foram removidas, processadas, coradas por H&E para detecção de displasias e carcinomas. Ensaio imuno-histoquímico para detecção do antígeno GAL3 e beta-catenina foi realizado. Carcinogênese bucal foi mais evidente nos camundongos GAL3+/+, com 55,5% deles acometidos por carcinomas contra 28,5% no grupo GAL3-/- ao final do experimento. Um predomínio de beta-catenina não membranosa em displasias e carcinomas foi observado em ambos os grupos (p>0,05). Um predomínio de expressão de GAL3 citoplasmática foi observado displasias e carcinomas de camundongos GAL3+/+ (p>0,05). No entanto, um aumento de GAL3 nuclear foi observado na evolução de displasias para carcinomas de animais GAL3+/+ (p

INTRODUÇÃO: A galectina-3 (Gal-3) é uma lectina de mamíferos ligante de resíduos b-galactosídeos. Numerosos estudos têm mostrado que a Gal-3 apresenta importantes papéis na biologia tumoral, atuando em fenômenos como apoptose, metástase e transformação maligna. No entanto, em carcinomas de cabeça e pescoço, a real significância da sua expressão ainda é pouco compreendida. OBJETIVO: O objetivo deste estudo foi avaliar a expressão de Gal-3 em tumores de língua induzidos experimentalmente em camundongos desafiados com o carcinógeno 4-nitroquinolona-1-óxido (4NQO). MATERIAL E MÉTODOS: Quarenta e dois camundongos C57BL/6, machos, foram desafiados com 4NQO na água de beber por 16 semanas e sacrificados em diferentes períodos depois do tratamento. Após o sacrifício, as línguas foram removidas, processadas, coradas por hematoxilina e eosina (HE) e microscopicamente analisadas quanto à presença de carcinoma. Ensaio imuno-histoquímico para detecção do antígeno Gal-3 e análise descritiva da sua expressão nos tumores induzidos foram realizados. RESULTADOS: Ao final do experimento, foram produzidos 15 tumores. No tecido epitelial não-neoplásico, forte imunorreatividade foi observada apenas na camada parabasal. Nas camadas mais superficiais a intensidade de marcação foi mais fraca, e na camada basal variou de ausente a fraca. Todos os carcinomas bem diferenciados exibiram fraca marcação, exceto nas áreas queratinizantes. No único caso de carcinoma pouco diferenciado, forte imunorreatividade para Gal-3 foi observada. CONCLUSÃO: Nossos resultados descritivos mostram que a transformação maligna é acompanhada de redução da intensidade de expressão da Gal-3 e que o aumento da sua expressão com a perda da diferenciação neoplásica sugere a sua vinculação com agressividade tumoral. BACKGROUND: Galectin-3 (Gal-3) is a b-galactoside-binding mammalian lectin. Numerous studies have demonstrated that Gal-3 plays an important role in tumor biology, acting in some events such as apoptosis, metastasis and malignant transformation. However, in carcinomas of head and neck, the real significance of Gal-3 expression requires a better understanding. OBJECTIVES: The aim of this paper was to evaluate Gal-3 expression in tongue carcinomas experimentally induced in mice challenged with carcinogen 4-nitroquinoline-1-oxide (4NQO). MATERIAL AND METHOD: Forty-two C57BL/6 male mice were challenged with 4NQO in drinking water for 16 weeks and killed at different periods after induction. In each period, their tongues were removed, routinely processed, stained with hematoxylin and eosin (H&E) and microscopically analyzed as to the presence of carcinoma. Immunohistochemical test for Gal-3 and a descriptive analysis of its expression in induced tumors were performed. RESULTS: By the end of the experiment, 15 tumors had been induced. In the non-neoplastic lingual epithelium, strong and weak immunoreactivity for Gal-3 was noted in parabasal and superficial layers, respectively. In the basal layer, Gal-3 expression varied from absent to weak. All the well-differentiated carcinomas showed weak immunoreactivity for Gal-3, except in keratinized areas. The only case of poorly differentiated squamous cell carcinoma indicated strong immunoreactivity for Gal-3. CONCLUSION: Our results show that malignant transformation is associated with reduced expression of Gal-3, whereas its increased expression in poorly differentiated carcinoma seems to be connected with tumor aggressiveness.

Orientadores: Sandra Martha Gomes Dias, Marilia Meira Dias Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Tumores consomem grandes quantidades de glicose e glutamina. O aumento do consumo de glutamina, além de contribuir para a formação de precursores biossintéticos, está relacionado à progressão tumoral. As glutaminases são codificadas por dois genes, GLS e GLS2. Ambas glutaminases são proteínas modulares, com domínios notoriamente envolvidos em interações proteína-proteína. GLS é oncogênico em diversos tipos tumorais, enquanto GLS2 desempenha um papel ambíguo, sendo anti- ou pró-tumoral em diferentes contextos. Em publicação recente do grupo, foi comprovado o papel pró-tumorigênico de GLS2 em um grupo de tumores de mama com expressão aumentada de GLS2, via eixo de interação ZEB/ERK/vimentina. O objetivo deste trabalho foi entender o papel de GLS2 no crosstalk com células do sistema imune infiltradas no microambiente, e o papel desta interação para a progressão tumoral em câncer de mama. Análise in silico utilizando o banco de dados doTCGA (The Cancer Genome Atlas) revelou que tumores com altos níveis de expressão de GLS2 são depletados de linfócitos e enriquecidos em macrófagos M2, um subtipo envolvido na progressão tumoral. Ensaios de co-cultura in vitro com a linhagem de câncer de mama humana MCF7 com expressão ectópica de GLS2 (GLS2+) com monócitos humanos revelaram secreção aumentada de citocinas anti-inflamatórias responsáveis pela polarização de macrófagos M2, comparado as células controle (Mock). Co-cultura com a linhagem tumoral de mama murina EO771 Mock e GLS2+ alterou o fenótipo de polarização de macrófagos primários murinos no sentido de favorecer o fenótipo M2, mas isto não dependeu da expressão de GLS2. Expressão de GLS2 diminuiu (e atrasou) a invasão de EO771; M2 não acelerou este processo tanto em Mock quanto em GLS2+. Implantes ortotópicos de EO771 GLS2+ em camundongos singênicos cresceram mais e ficaram mais pesados do que tumores Mock. Análise histológica dos cortes tumorais GLS2+ revelou extensas regiões de fibrose, necrose e hemorragia nestes tumores, comparados aos tumores Mock. Análise de infiltração de macrófagos nos cortes tumorais revelou maior presença de macrófagos M1 em tumores Mock do que em tumores GLS2+, enquanto que, qualitativamente, presença de M2 aparentou ser igual, sugerindo maior taxa M2/M1 em tumores GLS2+ comparado a Mock. Cortes tumorais GLS2+ também revelaram aumento na marcação de células endoteliais comparado aos tumores controle. Por fim, com o intuito de identificar parceiros de interação de GLS2, realizamos co-imunoprecipitação seguida de espectroscopia de massas na linhagem EO771 Mock/GLS2+ cultivada in vitro. As proteínas identificadas não nos apontaram nenhuma relação clara e necessitam de posterior comprovação. Concluímos que existe uma relação entre a isoenzima GLS2 e o conteúdo de macrófagos infiltrados em tumores com o aumento da resposta inflamatória e progressão tumoral em câncer de mama. Entretanto, esta reposta, no modelo estudado, não está relacionada com algum crosstalk específico entre a expressão de GLS2 nas células de câncer e o perfil de polarização de macrófagos, sendo, provavelmente, o produto de uma relação mais complexa entre o tumor e distintas células imunes (e/ou outros tipos celulares) no microambiente tumoral Abstract: Tumors consume large amounts of glucose and glutamine. The increase in glutamine consumption, in addition to contributing to the formation of biosynthetic precursors, is related to tumor progression. Glutaminases are encoded by two genes, GLS and GLS2. Both glutaminases are modular proteins, with domains notoriously involved in protein-protein interactions. GLS is oncogenic in several tumor types, while GLS2 plays an ambiguous role, being anti- or pro-tumor in different contexts. In a recent publication by the group, the protumorigenic role of GLS2 was proven in a group of breast tumors with increased expression of GLS2, via the ZEB/ERK/vimentin interaction axis. The aim of this work was to understand the role of GLS2 in crosstalk with immune system cells infiltrated in the microenvironment, and the role of this interaction for tumor progression in breast cancer. In silico analysis using the TCGA (The Cancer Genome Atlas) database revealed that tumors with high levels of GLS2 expression are depleted of lymphocytes and enriched in M2 macrophages, a subtype involved in tumor progression. In vitro co-culture assays with the human breast cancer line MCF7 with ectopic expression of GLS2 (GLS2+) with human monocytes revealed increased secretion of anti-inflammatory cytokines responsible for the polarization of M2 macrophages compared to control cells (Mock). Co-culture with murine breast tumor lineage EO771 Mock and GLS2+ altered the polarization phenotype of murine primary macrophages towards favoring the M2 phenotype, but this did not depend on GLS2 expression. GLS2 expression slowed down (and delayed) EO771 invasion; M2 didn't speed up this process in either Mock or GLS2+. EO771 GLS2+ orthotopic implants in syngeneic mice grew larger and heavier than Mock tumors. Histological analysis of the GLS2+ tumor sections revealed extensive regions of fibrosis, necrosis and hemorrhage in these tumors, compared to Mock tumors. Analysis of macrophage infiltration in tumor sections revealed a greater presence of M1 macrophages in Mock tumors than in GLS2+ tumors, while qualitatively, the presence of M2 appeared to be equal, suggesting a higher M2/M1 rate in GLS2+ tumors compared to Mock tumors. GLS2+ tumor sections also revealed increased endothelial cell labeling compared to control tumors. Finally, to identify GLS2 interaction partners, we performed co-immunoprecipitation followed by mass spectroscopy in the EO771 Mock strain /GLS2+ cultured in vitro. The identified proteins did not show any clear relationship and need further proof. We conclude that there is a relationship between the GLS2 isoenzyme and the content of macrophages infiltrating tumors with increased inflammatory response and tumor progression in breast cancer. However, this response, in the model studied, is not related to any specific crosstalk between the expression of GLS2 in cancer cells and the polarization profile of macrophages, being probably the product of a more complex relationship between the tumor and different cells (and/or other cell types) in the tumor microenvironment Doutorado Genética Animal e Evolução Doutora em Genética e Biologia Molecular FAPESP 2016/06625-0 ; 2016/23301-4

Submitted by Boris INFORMAT (boris@uerj.br) on 2021-04-26T01:12:14Z No. of bitstreams: 1 Renata Machado Brandao Costa Tese completa.pdf: 6613075 bytes, checksum: f049ac323e4f5f707c8a9d54c619285c (MD5) Made available in DSpace on 2021-04-26T01:12:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Renata Machado Brandao Costa Tese completa.pdf: 6613075 bytes, checksum: f049ac323e4f5f707c8a9d54c619285c (MD5) Previous issue date: 2018-03-20 Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico Alterations in the composition and architecture of the extracellular matrix (ECM) can influence cancer growth and dissemination. ECM is a complex physical barrier that must be overcome by tumor cells to allow their escape from primary sites and invasion of tissues during metastasis. Epithelial-mesenchymal transition (EMT) is a cellular process that allows a polarized epithelial cell to assume a mesenchymal cell phenotype, contributing to metastasis. During EMT, epithelial cells change their profile from cell-cell contacts to mostly cell-matrix interactions. Breast tumors usually present cells at different stages of differentiation that are able to produce distinct extracellular matrices. However, the contribution of ECM derived from metastatic tumor cells to EMT has not yet been investigated. Here, we have investigated the mechanisms involved in the effects resulting from the interaction of MCF-7, a low-metastatic epithelial breast cancer cell line, with the ECM produced by MDAMB-231, a high-metastatic breast tumor cell line. Our data show that compared to the ECM derived from MCF-7 (MCF-ECM), the ECM produced by MDAMB-231 cells (MDA-ECM) has considerably different composition, with higher expression of tenascin-C, laminin, osteopontin, and vitronectin contents and lower expression of fibronectin. The interaction of MCF-7 cells with MDA-ECM induced morphological changes in MCF-7 cells, characteristics of mesenchymal cells. There was a decrease in expression of the epithelial marker E-cadherin and up-regulated mesenchymal markers, contributing to the increase in their migration capability. Induction of EMT was independent of the presence of TGF-β and dependent on the direct contact of MCF-7 cells with MDA-ECM. These interactions triggered the activation of integrin-associated signaling, increasing the phosphorylation of FAK, ERK, and AKT and activating SMAD2 and SMAD4 nuclear translocation in MCF-7 cells. Blockage of integrins impaired the shift to the EMT profile induced by MDA-ECM, maintaining epithelial morphology and E-cadherin-mediated adhesions, and inhibited SMAD2 phosphorylation. Preliminary analysis, by microarray, of MCF-7 cells that interacted with the MDA-MEC showed modification of genes involved in cell-ECM adhesion, migration, EMT and tumor progression. Our findings revealed ECM derived from metastatic tumors may act as a trigger of EMT in breast cancer epithelial cells, mediated by integrin-associated signaling, leading to a mesenchymal cell transition. These data contribute to the understanding of adhesion-related interactions during breast cancer progression and may aid in the development of antimetastatic therapies. Alterações na composição e arquitetura da matriz extracellular (MEC) podem influenciar no crecimento e disseminação tumoral. A MEC se comporta como uma barreira física que precisa ser atravessada pelas células tumorais, permitindo que estas células saiam do sítio primário e invadam outros tecidos durante o processo de metástase. A transição epitélio-mesênquima (TEM) é um processo que permite a polarização das células epiteliais para assumir um fenótipo mesenquimal, contribuindo para a metástase. Durante a TEM, as células epiteliais modificam o seu fenótipo, passando da adesão célula-célula para interações célula-matriz. Os tumores de mama frequentemente apresentam células em diferentes estágios de diferenciação que, por sua vez, produzem MEC distintas. Porém, a possível contribuição da MEC derivada de células tumorais metastáticas para a TEM ainda não foi investigada. Neste trabalho, investigamos os mecanismos envolvidos no efeito da interação de células MCF-7, uma linhagem celular de câncer de mama com baixo potencial metastático, com a MEC produzida pelas células MDAMB-231, uma linhagem celular de câncer de mama com alto potencial metastático. Nossos dados mostraram que a MEC produzida pelas células MDAMB-231 (MDA-MEC) tem composição glicoproteica diferente da MEC derivada das células MCF-7 (MCF-MEC), apresentando maior expressão de tenascina-C, laminina, osteopontina e vitronectina e menor quantidade de fibronectina. A interação das células MCF-7 com a MDA-MEC induziu mudanças morfológicas nas células MCF-7, características de células mesenquimais. Ocorreu uma diminuição dos níveis do marcador epitelial E-caderina e aumento de marcadores mesenquimais, contribuindo para o aumento da sua capacidade migratória. A indução de TEM ocorreu independente da presença de TGF-β, sendo dependente do contato direto das células MCF-7 com a MDA-MEC. Estas interações levaram à ativação de integrinas e suas vias de sinalização, aumentando a fosforilação de FAK, ERK e AKT e ativando SMAD2 e a translocação de SMAD4 para o núcleo nas células MCF-7. O bloqueio das integrinas impediu a TEM induzida pela MDA-MEC, mantendo a morfologia epitelial e adesões célula-célula mediadas por E-caderina, além de inibir a fosforilação de SMAD2. A análise preliminar por microarray de células MCF-7 que interagiram com a MDA-MEC mostrou a modificação de genes envolvidos em processos de adesão célula-MEC, migração, TEM e progressão tumoral. Nossos resultados revelam que a MEC extraída de tumores de mama metastáticos pode desencadear a TEM em células de tumor de mama com características epiteliais, através da ativação de integrinas e de vias de sinaliazação associadas, levando a um fenótipo mesenquimal. Esse trabalho contribui para o melhor entendimento das interações de adesão célula-célula durante a progressão do câncer de mama e pode ajudar no desenvolvimento de terapias anti-metastáticas.

Este trabalho objetivou analisar a expressão de Galectina=1(Gal=1), Galectina=3 (Gal=3) e ligantes de lectinas em ambientes hipóxicos e/ou privados de nutrientes em célula de câncer de mama e em biópsias tumorais. Para modelar o evento in vitro a linhagem celular de câncer de mama T47D foi submetida à hipóxia em câmara de hipóxia durante 24, 48 e 72h com ou sem privação de nutrientes. Os grupos controles (normóxia com ou sem nutrientes) foram mantidos em estufa de CO2. As biópsias tumorais de carcinoma ductal invasivo (CDI) foram divididas em dois grupos: um positivo e outro negativo para o marcador de hipóxia (CA IX) assim como as biópsias de carcinoma ductal in situ (CDIS) foram divididas em comedônicas/hipóxas e não=comedônicas/controle, para posterior comparação quanto aos parâmetros clínicos, histopatológicos e glicobiológicos. Os experimentos com T47D mostraram que a expressão de Gal=3 aumenta progressivamente quando submetida à hipóxia e privação de nutrientes durante 24, 48, 72h. As biopsias de CDI positivas para CA IX apresentaram uma marcação nuclear mais intensa que o grupo negativo e características tumorais mais agressivas como invasão linfonodal e ausência de Receptor de estrógeno. Gal=1 não foi expressa pelas células neoplásicas no modelo in vitro bem como nas biópsias, onde foi possível detectar positividade nas células do estroma associadas ao tumor. Quanto ao papel da Gal=3 na proteção a morte celular, utilizando=se citômetria de fluxo, observou=se que não houve correlação entre a inibição do domínio de reconhecimento a carboidratos da proteína e o aumento de morte celular. Entretanto, foi observada indução a morte para o anticorpo monoclonal M338, específico para o N=terminal de Gal=3, sendo esta marcação aumentada em até três vezes durante o aumento de morte celular em 48h e 72h de hipóxia e privação de nutrientes. A histoquímica com lectinas foi utilizada em amostras de CDIS com Con A, WGA e UEA=I e de CDI com L=PHA e SNA. Nos casos de CDIS as lectinas utilizadas reconheceram mais casos do grupo comedônico (hipóxico) que o não=comedônico. Ao passo que nas biópsias de CDI foi observado um aumento na sialilação assim como nas células T47D (in vitro) onde se pode avaliar que esta glicosilação não é de responsabilidade exclusiva de ST6GALNac. Nossos resultados indicam que ocorre uma glicosilação aberrante no ambiente hipóxico in vitro e in vivo associada a um fenótipo tumoral mais agressivo bem como sugere que Gal=3 participa da proteção contra morte celular e informativa para diagnóstico e prognóstico. This study aimed to analyze the expression of Galectin=1, Galectin=3 and lectin ligands in hypoxic environments starved or not of nutrients in breast cancer cells and in tumour biopsies. In vitro experiments in T47D breast cancer cells were subjected to hypoxia in hypoxia chamber for 24, 48 and 72h with or without nutrients; control groups (in normoxia and nutrients supplied) were kept in CO2 incubator. Invasive ductal carcinoma (IDC) biopsies were divided into two groups: one positive and one negative for hypoxia marker Carbonic Anhydrase (CA IX); and Ductal Carcinoma in situ (DCIS) samples were divided in comedonecrosis/hypoxic or non=comedonecrosis/control groups, and then they were compared to clinical, histopathological and glycobiology aspects. Confocal microscopy, real=time PCR and western blotting showed that Galectin=3 expression was predominantly nuclear and increased progressively when subjected to hypoxia for 24, 48, 72h and nutrient starvation. CDI samples positive for hypoxia marker CA IX presented an intense nuclear staining in comparison to control group besides more aggressive tumour features as node positivines and absence of ER staining. Gal=1 was not expressed by neoplastic cells in cell model and biopsies, where it was possible to detect positivity in tumour=associated stroma. The evaluation of Gal=3 role in cell death protection using flow cytometry showed that there was no correlation between inhibition of Gal=3 carbohydrate recognition domain and the increase in cell death rate. However, it was observed that monoclonal antibody M338, specific to Gal=3 N=terminal, positivity increased with the increasing of dead cells after 48h and 72h under hypoxia and starvation. Lectin histochemistry for Gal=3 ligands or Gal=3=ligant complex preventing carbohydrates were investigated using Con A, WGA, PNA and UEA=I for DCIS and L=PHA, SNA and VVA for CDI. Results indicated that in CDIS the lectins used recognized more intensely the comedogenic/hypoxic group while in CDI samples were observed an increase in sialylation as well as in T47D cells indicating that ST6GALNac is not the only responsible for this event. Our results indicate that aberrant glycosylation occurs in hypoxic environments associated with a high aggressive tumour phenotype providing information of diagnostic and prognostic value. Results also suggest that Gal=3 participates in the protection of cell death by N=terminal and that sialylation in hypoxic environment is not mainly caused by N=glycosylation.

Orientadores: Fábio Rogério, Roger Chammas Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Gliomas são as mais frequentes neoplasias primárias do sistema nervoso central e compõem um grupo heterogêneo, apresentando diferentes graus de malignidade. Glioblastomas (OMS grau IV) representam aproximadamente 50% dos tumores de origem glial e estão associados ao pior prognóstico, com sobrevida média de menos de um ano após o diagnóstico. O gliossarcoma, uma variante do glioblastoma, apresenta componente mesenquimal, além do componente glial. A linhagem celular de glioma utilizada no presente trabalho, NG97ht, é híbrida humano-murina e foi estabelecida a partir de células neoplásicas implantadas no dorso de camundongos nudes. Os tumores que se desenvolveram, por sua vez, são derivados de astrocitoma anaplásico (OMS grau III) ressecado de um paciente masculino de 66 anos. Realizou-se a caracterização morfológica e imunofenotípica de um modelo ortotópico de astrocitoma de alto grau e a análise do padrão de expressão de galectina-3 em tumores derivados da inoculação de células NG97ht. Através de cirurgia estereotáxica, foram inoculadas 5 x 105 células NG97ht no córtex cerebral de camundongos nude (imunodeprimidos) e BALB/c (imunocompetentes) com oito semanas de idade. Foi realizada ressecção dos tumores que se desenvolveram duas ou quatro semanas pós-implante. Análise morfológica e cálculo do índice mitótico foram realizados em cortes dos tumores incluídos em parafina, assim como coloração para detecção de fibras reticulínicas e reações imunoistoquímicas para GFAP, S-100, vimentina, PCNA, galectina-3, CD34, CD56/NCAM, 1A4, desmina, AE1AE3 e sinaptofisina. Além disso, foi realizada semiquantificação da expressão de galectina-3 através de Western Blotting. As características morfológicas e imunofenotípicas da neoplasia indicam um glioma de alto grau, particularmente o gliossarcoma. Os tumores apresentaram alta celularidade, presença de focos necróticos e exibem predominantemente células fusiformes com alto índice mitótico. A expressão de GFAP apresentou alta variabilidade, muitas vezes presente em agrupamentos de células neoplásicas. Foi observada imunopositividade citoplasmática para CD56 e 1A4, indicando diferenciação divergente neuroectodérmica e mesenquimal. Além disso, foi detectada rica e fina rede de fibras reticulínicas intercelulares. A localização da galectina-3 foi nuclear e/ou citoplasmática e sua expressão foi intensa, principalmente nos limites da lesão com o tecido normal adjacente. Não foi detectada diferença significativa na expressão de galectina-3 entre tumores obtidos duas e quatro semanas pós-implante. Em camundongos BALB/c não foi observado crescimento tumoral. Em conclusão, o implante ortotópico de células NG97ht representa uma interessante alternativa para investigações in vivo de gliossarcoma. Considerando-se a falta de estudos sobre o papel da galectina-3 em gliossarcomas e seu possível envolvimento com migração celular, angiogênese e quimiorresistência, a galectina-3 pode ser um potencial alvo para novas estratégias terapêuticas Abstract: Gliomas are the most frequent primary brain tumors and correspond to various histopathological types and malignancy grades. Glioblastomas (WHO grade IV) account for approximately 50% of glial tumors and are associated with the worst prognoses, with median survival rate of less than 1 year. Gliosarcoma is a rare variant of glioblastoma which displays distinct glial and mesenchymal components. NG97ht is a malignant murine and human hybrid cell line established from a human anaplastic astrocytomaderived tumor engrafted into nude mice. The aims of the present work were morphological and immunophenotypical characterization of an in vivo orthotopic glioma model and analysis of galectin-3 expression pattern in NG97ht cell line-derived tumors. 5 x 105 NG97ht cells were stereotactically inoculated into cerebral cortex of 8-week-old nude or BALB/c mice and tumors were resected after two or four weeks. Morphological analysis and calculation of mitotic index were made in paraffinembedded sections, as well as immunohistochemical reactions for GFAP, CD56, 1A4, AE1AE3 and galectin-3. Semi-quantification of galectin-3 expression was obtained through Western Blotting. The neoplastic features favour a high-grade glioma, particularly gliosarcoma. Tumors were predominantly constituted by spindle cells with high mitotic index and showed elevated cellular density and some necrotic areas. GFAP was expressed by groups of tumoral cells. Positivity for CD56 and 1A4 was cytoplasmic and indicates neuroectodermic and mesenchymal divergent differentiation. Localization of galectin-3 was nuclear and/or cytoplasmic and its expression was intense, mainly at tumor borders with adjacent tissue. There was no significant difference in galectin-3 expression between tumors resected after two or four weeks. Tumor growth was not detected in BALB/c mice. In conclusion, the orthotopic implant of NG97ht cells represents an interesting alternative for gliosarcoma in vivo studies. Considering the lack of investigation about the role of galectin-3 in gliosarcomas and the possible involvement of galectin-3 in cellular migration, angiogenesis and chemoresistance, it should be a potentially good target for new therapeutic strategies Mestrado Fisiologia Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Sara Teresinha Olalla Saad Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: ARHGAP21 é uma proteína pertencente à família RhoGAP e apresenta atividade GAP sobre Cdc42 e RhoA, interage com ARF-GTPases e com a-catenina, modulando a dinâmica da actina associada às membranas do Golgi e a integridade das junções aderentes. Devido ao relato da elevada expressão de ARHGAP21 em tecido nervoso surgiu o objetivo da presente tese que foi avaliar a expressão e a função de ARHGAP21 no tecido neural normal e neoplásico. Nossos resultados mostraram que ARHGAP21 localiza-se no núcleo e na região peri-nuclear de vários tipos celulares, e nos prolongamentos celulares de neurônios primários, e interage com FAK na região peri-nuclear. Os resultados da depleção de ARHGAP21 por moléculas de shRNAi indicaram que ARHGAP21 inibe a migração de células derivadas de glioblastoma multiforme através do controle negativo de ARHGAP21 sobre Cdc42, pela inativação da sinalização FAK?p130CAS, e pelo controle da secreção de metaloprotease-2. Além disso, a expressão da proteína ARHGAP21 correlaciona-se com o grau tumoral de astrocitomas in vivo, indicando a existência de um possível controle negativo de ARHGAP21 sobre a transformação ainda maior destas células, já que sua depleção in vitro resultou em aumento do grau tumoral. Em tecido cerebral normal, evidenciamos elevada expressão de ARHGAP21 em córtex e cerebelo humano. Além disso, o gene ARHGAP21 murino mostrou-se altamente expresso em E17, dia em que termina a migração de precursores neurais e que coincide com a queda de expressão de Mmp-2. Portanto, ARHGAP21 demonstrou, em sistema nervoso normal, controle semelhante sobre a expressão do gene Mmp-2 ao observado em linhagens de glioblastoma. Nossos resultados sugerem que ARHGAP21 pode ser uma poderosa reguladora da migração celular em diferentes tecidos e, assim, ter papel crucial no controle da progressão de diferentes tipos tumorais. Abstract: : ARHGAP21 is a RhoGAP protein with GAP activity over Cdc42 and RhoA, it also interacts with ARF-GTPases and with a-catenin, controlling actin dynamics on Golgi membranes and the integrity of adherens junctions, respectively. Due to ARHGAP21 high expression levels in nervous tissues has emerged the objective of the present thesis that was evaluate the expression levels and the function of ARHGAP21 in the normal and neoplasic nervous system. Our results evidenced that ARHGAP21 localizes to the nucleus and perinuclear region of several cell types, and on cell protrusions in primary mouse neurons, and interacts with FAK in the perinuclear region. Results of ARHGAP21 depletion by shRNAi molecules evidenced that ARHGAP21 inhibits glioblastoma cell migration through the negative control of Cdc42, the inhibition of FAK?p130CAS signaling, and through the control of metaloprotease 2 secretion. Besides that, ARHGAP21 expression correlates to tumor grade on astrocytomas samples, indicating the existence of a negative control of ARHGAP21 on astrocytoma cellular transformation, since its depletion in vitro resulted in higher malignity of T98G glioblastoma cell line. In normal cerebral tissue, ARHGAP21 murine gene is highly expressed on E17 animals, day in which neuronal precursor's migration finishes and when there is a reduction in mmp-2 expression. Therefore, ARHGAP21 showed in normal nervous system, similar control of mmp-2 gene expression as observed in glioblastoma cell lines. Our results suggest that ARHGAP21 might be a master regulator of cellular migration in different tissues and, like this, it may has a crucial role in the control of tumor progression. Doutorado Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento Doutor em Fisiopatologia Médica

Orientadores: Anibal Eugenio Vercesi, Roger Frigerio Castilho Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: As estatinas são inibidores da 3-hidroxi-3-metilglutaril CoA (HMG-CoA) redutase usados no tratamento de hipercolesterolemia. Estudos in vitro e in vivo têm demonstrado que as estatinas podem ter efeitos anti-cancerígenos. No presente estudo analisamos os mecanismos de toxicidade de sinvastatina e de lovastatina nas linhagens de câncer de próstata LNCaP e PC-3. Curvas dose-resposta do efeito das estatinas (0,1-100 µM) sobre as células LNCaP e PC-3 mostraram efeitos similares e maior sensibilidade das células PC-3 do que das células LNCaP. Tratamentos de células PC-3 com sinvastatina 10 µM durante 48 h induziu morte principalmente por apoptose, a qual foi associada ao aumento de 3 vezes da [Ca2+]cit. Tanto a apoptose quanto o aumento da [Ca2+]cit foram prevenidos por mevalonato 100 µM presente no meio de cultura. Isso indica que a inibição da HMG-CoA redutase leva à apoptose mediada por Ca2+. Pifitrina-a, inibidor da proteína supressora tumoral p53, não preveniu apoptose em células PC-3 (p53 negativas) nem em células LNCaP (p53 positivas). Isso mostrou que a apoptose de células de câncer de próstata induzida por estatinas é independente de p53. Sinvastatina 60 µM induziu morte de células PC-3 principalmente por necrose, a qual foi associada ao aumento de 3 vezes da [Ca2+]cit e à diminuição da respiração e do potencial de membrana mitocondrial. Tanto a necrose quanto a disfunção mitocondrial foram parcialmente prevenidas pelos compostos ciclosporina A (inibidor da transição de permeabilidade mitocondrial [TPM] e da fosfatase calcineurina), FK506 (inibidor de calcineurina) e boncrecato (inibidor da TPM). O aumento da [Ca2+]cit não foi prevenido por ciclosporina A, FK506 ou boncrecato, porém a complexação de Ca2+ citossólico com BAPTA protegeu as células PC-3 da necrose, sugerindo que o aumento da [Ca2+]cit seja um dos primeiros passos no processo de necrose celular, seguido pela ativação da via de calcineurina. Conclui-se que a apoptose induzida por sinvastatina em células PC-3 seja dependente da via do mevalonato enquanto que a necrose seja dependente da via da calcineurina associada à disfunção mitocondrial Abstract: Statins are 3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA (HMG-CoA) reductase inhibitors used in the treatment of hypercholesterolemia. Both in vitro and in vivo studies have demonstrated that statins may have anti-cancer effects. In the present study we analyzed the mechanisms of simvastatin and lovastatina toxicity to the human prostate cancer cell lines LNCaP and PC-3. Dose-response curves of statins (0.1-100 µM) effects upon LNCaP and PC-3 cells showed similar effects and higher sensitivity of PC-3 than LNCaP cells. Treatments of PC-3 cells with 10 µM simvastatin during 48 h induced death mainly by apoptosis, which was associated with a 3-fold increase in [Ca2+]cyt. Both apoptosis and [Ca2+]cyt increase were prevented by 100 µM mevalonate present in the culture medium. This indicates that the inhibition of HMG-CoA reductase is followed by Ca2+ mediated apoptosis. Pifithrin-a, an inhibitor of tumor suppressor p53 protein, did not prevented apoptosis either in PC-3 (p53 negative) or LNCaP (p53 positive) cells. This showed that apoptosis of prostate cancer cells induced by statins is p53 independent. At 60 µM, simvastatin induced death in PC-3 cells mainly by necrosis, which was associated with a 3-fold increase in PC-3 [Ca2+]cyt, and decrease in both respiration and mitochondrial membrane potential. Both necrosis and mitochondrial dysfunction were partially prevented by the compounds cyclosporine A (mitochondrial permeability transition [MPT] and calcineurin inhibitor), FK506 (calcineurin inhibitor), and bongkrekic acid (MPT inhibitor). Increase in [Ca2+]cyt was not prevented by cyclosporine A, FK506 or bongkrekic acid, but chelation of [Ca2+]cyt with BAPTA protected PC-3 cells from necrosis, suggesting rise in [Ca2+]cyt is one of the first steps in the process of cell necrosis and is followed by activation of the calcineurin pathway. We may conclude that simvastatin-induced apoptosis in PC-3 cells is dependent on the mevalonate pathway whereas necrosis is dependent on the calcineurin pathway associated with mitochondrial dysfunction Mestrado Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento Mestre em Fisiopatologia Médica

Orientador: Jose Barreto Campello Carvalheira Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: A resistência dos tumores aos quimioterápicos é um problema clínico comum. Recentemente, foi demonstrado que o bloqueio. da via de sinalização da PI3-quinase aumenta a apoptose induzida pelo SN-38, um metabólito ativo do irinotecano. Entretanto, os mecanismos moleculares destas mudanças ainda não são esclarecidos. Para investigar os eventos moleculares envolvidos no aumento da sinalização na via da PI3-quinase associada ao irinotecano, aspirina e rapamicina foram utilizadas para modular esta via de sinalização. Nós observamos que a aspirina é capaz de inibir a fosforilação do IRS-l, através de seus alvos JNK e IKK, e aumentar o crescimento dos tumores em camundongos Scid previamente injetados com linhagem de adenocarcinoma de cólon (HT29). Adicionalmente, demonstramos que o bloqueio da mTOR reduz a proliferação celular induzida pelo irinotecano. Assim, a ativação da via PI3-quinase/ Akt/mTOR pode contribuir para a quimiorresistência induzi da pelo irinoteco Abstract: Resistance of tumors to chemotherapeutic agents is a common clinical problem in human cancer. Recently, the blocking of PI3-kinase signaling pathway was shown to enhance apoptosis induced by SN-38, an active form of irinotecan. To gain further insight into the molecular events of irinotecan-associated increase in PI3-kinase signaling pathway, aspirin and rapamycin were used to modulate this signaling pathway. We describe here that aspirin is able to further inhibit IRS-l serine phosphorylation induced by irinotecan through targeting JNK and IKK, thus agonist activation of IRS-l/PI3-kinase pathway blocked the growth-inhibitory effect of irinotecan in HT -29 colon cancer xenografts; our data also demonstrate a synergistic effect of mTOR inhibition and irinotecan on tumor growth. Activation of PI3-kinase/ Akt/mTOR pathway may thus contribute to refTactoriness to treatment with irinotecan Mestrado Ciências Básicas Mestre em Clínica Médica

Orientadores : Olga Maria de Toledo Correa, Paulo Pinto Joazeiro Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A sínfise púbica é uma articulação não sinovial, do tipo anfiartrose, que conecta os dois ossos púbicos através de um disco fibrocartilaginoso. Durante a prenhez, a sínfise púbica de camundongos passa por numerosas modificações estruturais, facilitadas por hormônios, a fim de permitir a passagem dos fetos pelo canal de parto. Essas modificações incluem um aumento da flexibilidade dessa articulação e a transformação do disco fibrocartilaginoso em um ligamento interpúbico flexível e elástico. O desenvolvimento do ligamento interpúbico envolve o aumento da biossíntese dos componentes da matriz extracelular, principalmente colágeno, proteoglicanos e glicosaminoglicanos e a mudança na relação entre síntese e degradação dos mesmos. Levando-se em consideração que o tumover destes componentes na sínfise de camundongos foi caracterizado por estudos bioquímicos e de microscopia de luz, pouco se sabe a respeito dos aspectos ultra-estruturais e histoquímicos de componentes da matriz extracelular, tais como os proteoglicanos e o colágeno tipo VI, bem como das interações entre as diferentes macromoléculas extracelulares. Esses aspectos são importantes porque podem ajudar a entender as relações entre os diferentes componentes da matriz extracelular nesse modelo. Nesse sentido, o objetivo desse trabalho foi caracterizar os glicosaminoglicanos, proteoglicanos e colágeno tipo VI na articulação interpúbica de camundongos nos diferentes estágios da prenhez. Atenção especial foi dada para as interações entre proteoglicanos e colágeno VI com outras macromoléculas da matriz. Para isso, foram empregadas análises citoquímica, imunohistoquímica, uso de sonda para detecção de ácido hialurônico, além de análises bioquímica e ultra-estrutural. Os resultados obtidos demonstraram que: 1) os proteoglicanos presentes na sínfise púbica de animais virgens são tecido-específicos e refletem as funções mecânicas de cada um dos tecidos no papel biológico global da sínfise púbica. 2) existe uma variação na quantidade e distribuição dos glicosaminoglicanos e proteoglicanos, como, por exemplo, o aumento de condroitim sulfato e o ácido hialurônico, durante a prenhez. Essas observações indicam que os proteoglicanos e glicosaminoglicanos devem ter um papel importante na formação do ligamento interpúbico e no aumento da extensibilidade desse ligamento no final da prenhez de camundongos. Estas macromoléculas podem ter um efeito importante nas propriedades de tensão do tecido. 3) A distribuição do colágeno tipo VI na sínfise púbica de camundongos virgens e prenhes é diferente nos vários tecidos que compõem essa articulação. Essa diferença pode refletir exigências funcionais diferentes para esse tipo de colágeno. A localização pericelular sugere um papel na regulação da interação célula-matriz, protegendo a célula contra estresse mecânico. Entretanto, a interação do colágeno tipo VI com outros componentes da matriz extracelular tais como colágenos fibrilares pode ter um importante papel na organização do espaço interfibrilar, provavelmente associado às propriedades elásticas do tecido Abstract: Pubic symphysis is a nonsynovial amphiarthrodial joint that connects the two pubic bones by a fibrocartilaginous disk. During pregnancy, the mouse pubic symphysis undergoes a number of hormonally facilitated structural modifications to enable the passage of the fetuses through the birth canal. These modifications include an enhanced flexibility of the joint and the transformation of the fibrocartilaginous disk into a flexible and elastic interpubic ligament. The development of the interpubic ligament involves an increase of biosynthesis of the extracellular matrix components, mainly collagen, proteoglycans and glycosaminoglycans, in addition to a change in the relation between the synthesis and degradation of such components. The tu mover of these components in mouse symphysis has been well characterized by biochemical studies and light microscopy. H oweve r, relatively little is known about the ultrastructural and histochemical aspects of the extracellular matrix components, such as proteoglycans and type VI collagen, as well as the interactions between different extracellular macromolecules. These aspects are important since they can help in the understanding of the relationship between the different extracellular matrix components in this model. Hence the aim of this study was to characterize the glycosaminoglycans, proteoglycans and type VI collagen in the mouse interpubic joint through the different stages of pregnancy. Special attention was given to the interactions between proteoglycan and type VI collagen with other matrix macromolecules. The methodology used involved cytochemical analysis, immunohystochemistry, hyaluronic acid probes, biochemical and ultrastructural analysis. The results showed the following: 1) Proteoglycans present in virgin pubic symphysis were tissue specific and reflected the mechanical functions of each tissue in the overall biological role of the pubic symphysis. 2) There is a variation in the amount and distribution of the glycosaminoglycans and proteoglycans during pregnancy as, for example, a greater presence of GAGs, such as chondroitin sulphate and hyaluronic acid. These observations indicate that proteoglycans and glycosaminoglycans must play an important role in the formation of the interpubic ligament along with its increased extensibility during Iate pregnancy in the mouse. These macromolecules may have important effect on tensile properties of this tissue. 3) The distribution of type VI collagen in virgin and pregnant mice pubic symphysis is different in various tissues that compose this joint. This may reflect the different functional demands for this collagen. The pericellular localization suggests a role in the regulation of cell-matrix interaction, protecting the cell against mechanical stress. However, the interaction of type VI collagen with other ECM components, such as fibrillar collagens, may also play an important role in the organization of the interfibrillar space, probably associated with elastic properties of the tissue Doutorado Biologia Celular Doutor em Biologia Celular e Estrutural