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Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2019. Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). Bactérias pertencentes à espécie Clostridium acetobutylicum têm sido amplamente utilizadas para a produção de solventes por realizarem um processo fermentativo conhecido como fermentação ABE (Acetone/Butanol /Ethanol). Através desta via, este micro-organismo é capaz de produzir acetona, butanol e etanol a partir de carboidratos simples. Dessa forma, C. acetobutylicum é considerado um micro-organismo promissor na produção de bioálcoois, sobretudo, de butanol em escala industrial. Diferentes cepas de C. acetobutylicum já foram estudadas e exibiram capacidade de produzir solventes, no entanto, bactérias deste gênero apresentam resistência à manipulação genética decorrente de um sistema endógeno de restrição capaz de clivar sequências de DNA não metilado, impedindo o melhoramento genético desses organismos. O presente estudo teve o objetivo de desenvolver uma cepa de Escherichia coli expressando a metiltransferase φ3Ti-MTP, isolada do fago ϕ3T de Bacillus subtillis, que se mostrou eficiente para a proteção de sequências de DNA contra a ação do sistema de restrição de C. acetobutylicum. Para tanto, foram utilizados como estratégia de edição genômica o sistema CRISPR/Cas9 e o sistema de reparo por HDR (Homology Direct Repair) de E. coli com o objetivo de integrar o gene φ3Ti expressando a metiltransferase no genoma de E. coli. As cepas mutantes foram confirmadas por PCR do fragmento integrado ao DNA genômico de E. coli e a funcionalidade de φ3Ti in vitro foi confirmada pela digestão de vetores previamente introduzidos em células mutadas de E. coli com a enzima SatI, isoesquizômero da enzima de restrição Cac824I, presente no sistema de restrição de C. acetobutylicum. Em seguida a capacidade de metilação e proteção de material plasmidial desses clones foi avaliada in vivo pela transformação de C. acetobutylicum com vetores previamente submetidos aos clones de E. coli. Finalmente, uma técnica de PCR com princípio semelhante ao da TAIL-PCR e o subsequente sequenciamento das regiões amplificadas foram utilizados como estratégia para determinar o local aproximado de integração do gene Φ3Tim. Os resultados obtidos mostraram que o gene φ3Ti foi integrado e expresso com sucesso em E. coli, gerando uma plataforma universal de metilação com a finalidade de permitir a manipulação genética de C. acetobutylicum. Bacteria belonging to the Clostridium acetobutylicum specie have been widely used for the production of solvents due to their capacity of performing an uncommon fermentative process known as ABE fermentation (Acetone/ Butanol/Ethanol). Through this pathway this microorganism is capable of fermenting simple carbohydrates obtaining as final products the acetone, butanol and ethanol. Thus, C. acetobutylicum is considered promisor for the production of bioalcohols, specially, of butanol in an industrial scale. Different strains of C. acetobutylicum had already been studied and showed capacity of producing solvents; however, bacteria belonging to this genus present resistance to genetic manipulation because of their endogenous restriction system capable of breaking down DNA sequences there are not methylated, hampering the genetic improvement of these organisms. The present study had as objective the development of an Escherichia coli expressing the methyltransferase φ3Ti-MTP, isolated from the ϕ3T phage of Bacillus subtillis, which showed to be efficient for the protection of DNA sequences against the cleavage action of the C. acetobutylicum restriction system. Therefore, the CRISPR/Cas9 system as well as the HDR (Homology Direct Repair) system present in E. coli cells were used as genomic edition strategies for the integration of the gene φ3Ti expressing the methyltransferase in E. coli DH10B genomic DNA. The mutant strains were confirmed by a PCR of the integrated fragment on the E. coli genomic DNA and the functionality in vitro of the φ3Ti gene was confirmed by the digestion of vectors previously introduced in mutant E. coli cells with SatI, an isoschizomer of the Cac824I restriction enzyme, present on the C. acetobutylicum restriction system. Then, the capacity of methylating and protecting plasmidial material of the tested clones was evaluated in vivo through the transformation of C. acetobutylicum with vectors previously subjected to the E. coli clones. Finally, a PCR technique with a principal similar to the one of TAIL-PCR and the subsequent sequencing of the amplified regions were used as strategy to identify the approximate site of integration of the φ3Ti gene. The results obtained showed that the φ3Ti gene was integrated and successfully expressed in E. coli, generating an universal methylation system with the purpose of permitting the genetic manipulation of C. acetobutylicum.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Florianópolis, 2015. A fermentação ABE (acetona-butanol-etanol) da Clostridium acetobutyli-cum ATCC 824, muito usada industrialmente até 1940, é um dos mais importantes bioprocessos industriais. Recentemente, o interesse nesse processo foi retomado devido à necessidade de substituir fontes combus-tíveis fósseis por vetores energéticos renováveis, principalmente biohi-drogênio e biobutanol. O objetivo desta tese é contribuir para uma melhor compreensão dos problemas associados com a detecção precoce e moni-toramento das mudanças fisiológicas da C. acetobutylicum ATCC 824 em fermentações tipo batelada. Pretende-se também refinar o entendimento desse comportamento variável utilizando a informação genômica dispo-nível desta bactéria e assim contribuir para mostrar como algumas ferra-mentas da Engenharia Genômica podem incorporar novas informações aos métodos tradicionais de monitoramento de bioprocessos. É proposta a incorporação em três diferentes níveis, a saber: (i) nível genômico, (ii) nível metabólico e (iii) nível fenotípico. No nível genômico, a presente pesquisa detectou que existem seis regiões de alta similaridade, nas quais foram identificados 15 genes já mapeados. O gene rpoB foi identificado como um forte candidato a marcador molecular de variabilidade fenotípi-ca. Foi proposta uma relação entre a regulação da transcrição do gene rpoB e o pH do meio de cultura. No nível metabólico, dois modelos meta-bólicos foram desenvolvidos, um modelo simplificado de 20 reações e um modelo genômico completo de 502 reações. Foi detectado que o modelo simplificado era mais adequado para detectar as mudanças fenotípicas da bactéria. Foi criado um modelo simplificado protonado que integra infor-mações do pH do meio de cultura. No nível fenotípico, a técnica de colora-ção de Gram mostrou-se eficiente na detecção precoce das mudanças fisiológicas da C. acetobutylicum. Foi demonstrada uma correlação entre os dados de fermentação e mudanças fisiológicas da parede celular da bactéria. Sugere-se, portanto, um novo método de detecção precoce e monitoramento do estado fisiológico da C. acetobutylicum ATCC 824 (e outras espécies de Clostridium) utilizando técnicas de coloração de Gram para determinar o estado fisiológico no qual a bactéria se encontra, e quais os principais produtos metabólicos da sua fermentação. Abstract : The problem of renewable and sustainable energy is challenging and requires innovative approaches. The production of biohydrogen, and biofuels in general, particularly biobutanol in the so-called ABE fermenta-tion by Clostridium acetobutylicum, discovered in 1861 by Louis Pasteur, although extensively studied, still lacks some fundamental understanding to facilitate monitoring changes in the physiological state and optimiza-tion. Here we propose a genomic engineering approach, divided in three levels: i) genomic, ii) metabolic, iii) phenotypic. At the genomic level, a comparative whole-genome study was performed comparing C. acetobu-tylicum with six other chosen microorganisms and a in silico Gram type experiment; The whole-genome analysis detected one major gene, the rpoB gene, implied in acquired antibiotic resistance, and possibly impli-cated in phenotypic variation during ABE fermentation. A possible link between the pH regulation and rpoB expression is suggested. The 16S rRNA analysis consistently showed Gram-positive classification for the C. acetobutylicum strain used, incapable of detecting the existent phenotypic variations.at the metabolic level, two metabolic network models were developed: a simplified, core model, with 20 reactions, and a genome-wide model, comprising 502 reactions; to translate the molecular and biochemical information to a useful engineering level, a phenotypic rela-tion between the Gram stain response and pH developed during batch fermentation was analyzed. The simplified core metabolic network suc-cessfully captured the observed strain metabolic profile. Additional regu-latory mechanism was added to the simplified metabolic model with the integration of pH regulation. Using the Gram staining method, we demon-strated a strong correlation between bacterial growth and morphological changes of the cell wall that is useful in monitoring early detection of the metabolic stages of C. acetobutylicum ABE fermentation. The Gram stain-ing technique is proposed as an efficient, low cost method to identify the physiological state of the bacteria culture and its connection with the fermentation state.

REUNI; CAPES A glicerina bruta, subproduto da produção de biodiesel, vem sendo investigada como fonte de carbono em processos microbianos para a obtenção de bioprodutos de alto valor agregado. A utilização da glicerina na produção de 1,3-propanodiol por via microbiológica é uma forma bastante viável de utilização dessa substância. O processo microbiano ocorre em anaerobiose, onde bactérias (Klebsiella, Citrobacter, Enterobacter e Clostridium) convertem a glicerina bruta em 1,3-propanodiol e vários outros produtos, como: ácido acético, etanol, ácido succínico, ácido lático, ácido cítrico, ácido fórmico, CO2 e H2, de acordo com as vias metabólicas do seu processo fermentativo. Dentre os micro-organismos estudados, no entanto, destacam-se as bactérias Clostridium butyricum e Klebsiella pneumoniae como as de maior utilização e provavelmente as melhores produtoras deste composto, devido a sua tolerância ao substrato, seu rendimento e produtividade. O presente trabalho consistiu em avaliar o comportamento do Clostridium acetobutylicum ATCC 4259 através de fermentações em batelada utilizando glicerol PA como fonte de carbono. A fermentação foi realizada em meio de cultura próprio para obtenção de 1,3-propanodiol, importante monômero utilizado na síntese de polímeros. Foi realizado um planejamento fatorial 2² em estrela com ponto central para avaliar a influência de duas variáveis (glicerol PA e extrato de levedura) no crescimento do micro-organismo. Foram realizados 10 ensaios no planejamento, sendo 9 ensaios em pontos distintos e uma repetição no ponto central. Também foi realizado um experimento de cinética microbiana para estudar em detalhes o crescimento do micro-organismo. Em ambos os casos a técnica de filtração com peso seco foi utilizada para calcular a concentração celular presente no meio. A cinética microbiana mostrou que, para as condições experimentais da pesquisa, a fase exponencial de crescimento ocorreu até o tempo de 14 horas, e uma produtividade celular (P) de 0,0405 g/L.h, uma velocidade máxima de crescimento (μmáx) de 0,0403 h-1 e um tempo de geração (G) de 15,7 h foram alcançados. As melhores respostas obtidas no planejamento fatorial foram 1,42 g/L e 1,40 g/L (30 g/L e glicerol e 2 g/L de extrato de levedura no meio de cultura).

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Florianópolis, 2010 Estudos reportados na literatura indicam que a Clostridium acetobutylicum ATCC 824 não cresce em meio contendo apenas glicerol como fonte de carbono. Este indicativo foi reportado para situações onde o objetivo é a produção de biossolventes, por exemplo, biobutanol. Não há registro de obtenção de biohidrogênio a partir desta bactéria cultivada apenas em glicerol. A presente pesquisa teve como objetivo estudar o potencial de produção de hidrogênio por C. acetobutylicum ATCC 824, aproveitando um resíduo industrial da produção de biodiesel, o glicerol. Ferramentas de engenharia metabólica foram utilizadas para explorar a capacidade da C. acetobutylicum ATCC 824 de crescer e produzir hidrogênio a partir de glicerol como única fonte de carbono. Foi utilizado um modelo metabólico simplificado de 20 reações e 25 metabólitos. Com o resultado da Análise de Balanço de Fluxo (FBA), foi possível prever crescimento e produção de biohidrogênio. Foi estabelecido um protocolo experimental elaborado a partir da literatura e pela primeira vez foi demonstrado que, dadas as condições adequadas, é possível obter crescimento bacteriano e produção de hidrogênio a partir de glicerol como única fonte de carbono pela C. acetobutylicum ATCC 824. A comparação entre os processos de produção de hidrogênio através de glicose e glicerol mostrou que o rendimento da produção de hidrogênio a partir de glicerol nas condições estudadas é inferior à produção a partir de glicose. Uma avaliação dos perfis de produção de hidrogênio, consumo de substrato, e variação do pH do meio de cultura, indicou uma inibição que conduziu a bactéria a apresentar um comportamento predominantemente solventogênico durante as fermentações, o que indica que, apesar de terem permitido crescimento bacteriano, as condições operacionais definidas não são ótimas para esse processo. Podemos concluir também que a capacidade de produção de biohidrogênio a partir de glicerol poderá ser aumentada através da realização de otimização de parâmetros de operação e composição do meio de cultura. O glicerol bruto proveniente da fabricação do biodiesel por rota ácida mostrou-se um substrato adequado para promover o crescimento da C. acetobutylicum ATCC 824 sem tratamento prévio. A produção de energia elétrica #in situ# através da utilização direta de uma célula a combustível do tipo PEM foi demonstrada. Este é um resultado qualitativo, porém de grande interesse, uma vez que possibilita a aplicação direta da tecnologia aqui desenvolvida sem a necessidade do armazenamento de hidrogênio, que ainda é uma questão problemática cujo processo ainda está em aberto. Hydrogen is being projected as an important component of the new world energetic matrix as a clean efficient energy carrier. The use of low-priced glycerol streams generated in the production of biodiesel represents a promising route to improve its economic viability. Clostridium has been extensively studied for hydrogen generation with many substrates and these studies imply that C. acetobutylicum ATCC 824 only metabolizes glycerol in the presence of glucose. In this work we provide evidence and describe anaerobic batch fermentations of C. acetobutylicum utilizing glycerol as the only carbon source, and compared growth and product formation with glucose fermentations. In silico FBA studies were carried out considering glycerol as carbon source and they indicated that would be possible to grown a culture using only such substrate. It was described and shown the results of an anaerobic batch fermentation of C. acetobutylicum utilizing glycerol as the only carbon source. The maximum yield of hydrogen produced from pure glycerol was up to 0,133 mol/mol. This yield was obtained from a non-optimized (preliminary) experiment and possibly will be increased when the operational parameters are optimized. The experiments compared growth and product formation of C. acetobutylicum ATCC 824 utilizing both glucose and glycerol as the sole carbon source in batch cultures. Semiquantitative tests were also conducted with raw glycerol from biodiesel production and integrating a PEM fuel cell for online electricity generation. Results show that, although the production of biohydrogen from glycerol is lower when compared with glucose fermentations, it#s possible to produce hydrogen from pure glycerol and directly from biodiesel byproducts. The online electricity generation also show positive results. These results indicated that biodiesel derived glycerol is a promising low-cost renewable feedstock for hydrogen production.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico. Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química. Este trabalho reúne ferramentas computacionais de biologia de sistemas num aplicativo chamado GEnSys (Genomic Engineering System), desenvolvido usando o MATLAB®, e que é formado por um conjunto de módulos interdependentes que permite a análise e simulação de redes de reações bioquímicas. Os módulos implementados realizam as seguintes tarefas: simulação dinâmica determinística, análise de controle metabólico, análise de fluxo metabólico, análise de balanço de fluxo e determinação de modos elementares. Uma característica importante do GEnSys é que não há a necessidade da entrada direta da matriz estequiométrica que representa o modelo biológico, pois existe um módulo que lê um arquivo contendo as reações da rede metabólica, escritas em uma sintaxe específica. Este procedimento gera automaticamente a matriz estequiométrica da rede. Para tanto, foi criada uma linguagem formal batizada de Linguagem de Reações Bioquímicas (LRB), flexível e intuitiva. Por exemplo, os nomes dos reagentes e produtos de uma reação podem conter caracteres especiais, tais como +, -, espaço e apóstrofo. Esses símbolos são comuns nos nomes dos compostos bioquímicos. Da forma como foi projetado, o GEnSys pode ser facilmente extendido para outros tipos de métodos de análise envolvendo a matriz estequiométrica. A partir de dados da literatura foram modeladas e simuladas diversas redes metabólicas. Para a Clostridium acetobutylicum foram consideradas todas as reações usadas para a produção de ácidos, solventes e hidrogênio molecular a partir de dois substratos distintos: glicose e glicerol. A rede modelada captura importantes aspectos qualitativos, de acordo com padrão de distribuição de fluxos (velocidades de reação) desta bactéria. Em um dos casos analisados foi possível obter valores quantitativos próximos aos valores reportados na literatura. Foram determinados 29 modos elementares de fluxo para a produção de hidrogênio molecular pela C. acetobutylicum. Destes, há 13 modos distintos envolvidos na produção de H2: seis a partir da glicose, seis a partir do glicerol e um relativo ao NADH, o qual foi considerado externo. Um estudo de caso em que a regulação da expressão gênica é importante foi conduzido comparando-se as simulações estocástica e determinística da via de biossíntese do triptofano da Escherichia coli. Todos os mecanismos de regulação conhecidos do operon trp (transcrição, tradução e inibição enzimática) foram considerados nas simulações estocástica e determinística. Em ambas, o comportamento da atividade da enzima antranilato sintase foi avaliado e comparado aos valores experimentais para uma E. coli selvagem. This work considers a set of computational systems biology tools, written as a MATLAB® toolbox called GEnSys (Genomic Engineering System). GEnSys comprises several interdependent modules that allow analysis and simulation of biochemical reaction networks. The developed implemented modules perform the following tasks: deterministic dynamic simulation, metabolic control analysis, metabolic flux analysis, flux balance analysis and determination of elementary modes. An important GEnSys feature is that the stoichiometric matrix representing the biological model does not have to be supplied directly. A module that reads an external file describing the metabolic network, in a specified, proposed syntax (the Biochemical Reaction Language - LRB), automatically produces the stoichiometric matrix. LRB is a flexible but intuitive language, that also allows the use of common biochemical symbols such as +, -, blank space and primes. Due to its design strategy, GEnSys may be easily extended for other analytical methods involving the stoichiometric matrix. Several metabolic networks were modeled from literature data and simulated using the developed tools. For Clostridium acetobutylicum all important reactions involved in the production of acids, solvents and molecular hydrogen, using two substrates, glucose and glycerol, were considered. The modeled network captures essential qualitative behavior, according to expected flux distribution from that bacterium. In one of the analysed cases, good quantitative agreement with literature data was found. Twenty-nine flux elementary modes for the molecular hydrogen production were found, thirteen of them involved in the H2 biosynthesis: six from glucose, six from glycerol, and one regarding NADH production. NADH was considered an external metabolite. A comparison between stochastic and deterministic simulation was carried out using a model where genetic regulation is important, the tryptophan biosynthesis by Escherichia coli. All known regulatory mechanisms for the trp operon (transcription, translation and enzymatic inhibition) were taken into account. In both cases, the catalytic behavior of the anthranilate synthase enzyme was evaluated and compared to experimental values reported to wild type E. coli.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico. Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química. A produção biológica de hidrogênio é uma excelente alternativa de produção de energia. Dentre os processos biológicos de produção de hidrogênio, os fermentativos são os mais vantajosos do ponto de vista industrial. Clostridium acetobutylicum é uma bactéria muito utilizada industrialmente, tem um metabolismo fermentativo complexo que produz muitos metabólitos, incluindo hidrogênio com bons rendimentos e, freqüentemente, mostra um padrão de fermentação bifásico. Após produzir ácido acético, ácido butírico e hidrogênio durante a fase de crescimento exponencial, inicia-se a formação de solventes (etanol, acetona e butanol). Os rendimentos de hidrogênio podem ser melhorados com o uso de engenharia metabólica por meio de um redirecionamento do fluxo de elétrons para a produção de hidrogênio. O objetivo deste trabalho é investigar o metabolismo da C. acetobutylicum, visando encontrar as principais etapas que controlam a produção de hidrogênio. Para obter esse entendimento foram aplicadas duas ferramentas de engenharia metabólica: Análise de Fluxo Metabólico e Análise de Controle Metabólico. Dados da literatura foram usados como entrada nos modelos matemáticos construídos para as análises. A primeira ferramenta usada, Análise de Fluxo Metabólico, permitiu quantificar os fluxos internos do metabolismo da bactéria em estudo, sob duas condições de cultivo diferentes. O resultado dessa análise fornece um mapa de distribuição de fluxos. Também permite obter a sensibilidade dos fluxos medidos em relação ao fluxo de interesse Os modelos mostraram quais são as vias de maior sensibilidade, ou seja, as vias mais indicadas para possíveis modificações por manipulação genética. A segunda etapa desse trabalho foi aplicação de Análise de Controle Metabólico a fim de encontrar as etapas da via metabólica que controlam a produção de hidrogênio. Foi construído um modelo cinético e a partir dele foram obtidos os coeficientes de controle de fluxo, esse modelo foi ajustado com base nos próprios coeficientes de controle de fluxo apontados. O modelo obtido foi analisado e mostrou que as principais etapas que afetam a produção de hidrogênio são a via glicolítica e a via de regeneração do NADH. Pequenas variações na atividade enzimática dessas etapas produzirão grande efeito na produção de hidrogênio. Diante dessas ferramentas é possível prever melhores estratégias de modificações genéticas sítio-dirigidas. As conclusões deste trabalho estão baseadas em estudos in silico e não eliminam a necessidade de comprovação experimental.