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CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Dermatofitoses são infecções fúngicas que afetam humanos e animais. Dentre os agentes etiológicos mais prevalentes nessas infecções está presente a espécie Trichophyton rubrum. As amebas do gênero Acanthamoeba apresentam ampla distribuição ambiental, se alimentando de bactérias, fungos, virus presentes no ambiente. Ambos os microrganismos podem conviver em um mesmo ambiente, sendo assim o objetivo desse trabalho foi avaliar a interação de A. castellanii sobre T. rubrum em diferentes condições (PYG, NA e ND). Para tanto, foi estudada a cinética de encistamento de A. castellanii na presença e na ausência de T. rubrum, além de ensaio de fagocitose para confirmar a interação ameba-fungo, avaliar a influência de diferentes condições nutricionais (meios PYG, NEFF). Os resultados demonstram um encistamento da ameba de aproximadamente 30% com presença de T. rubrum e 25% sem o fungo, e a interação foi confirmada por fagocitose, onde na condição NA (adição de NEFF antes da infecção pelo fungo) há uma maior internalização na primeira hora, decaindo com o tempo. Foi realizado também a adição ou subtração de íons Ca2+ e Mg2+, adição de manose e citocalasina D na fagocitose, atividade fungicida e liberação do fungo do interior da ameba. Os íons demonstraram-se importantes para a predação do fungo pela ameba e citocalasina D demonstrou a importância da actina no processo de liberação dos conídios, visto que houve uma diminuição na exocitose dos conídios. A manose diminuiu a fagocitose em PYG de forma dependente da concentração, não ocorrendo mesmo para NA. NA propiciou uma maior recuperação do fungo no interior da ameba e também uma menor liberação, concomitante a uma reduzida produção de espécies oxidativas, tendo também maior número de hifas no interior. Foram avaliadas também produção de espécies oxidativas, capacidade da ameba em inativar o fungo e a capacidade deste de sobreviver e ser liberado da ameba, e a produção de enzimas antioxidantes pelo fungo. O fungo recuperado da ameba foi testado frente ao itraconazol, cetoconazol e terbinafina, a fim de determinar a concentração inibitória mínima (CIM) destes antifúngicos. A presença de enzimas do complexo antioxidante demonstrou-se maior nas condições com passagens pela ameba do que o controle, mostrando uma adaptação para sobrevivência do fungo. A CIM de itraconazol apresentou variação significantes em PYG 1h e NA 24h e os demais antifúngicos não apresentaram alterações significativas. Assim, a ameba internaliza o fungo, independente da condição nutricional e esta internalização decresce com o tempo, sendo que esta predação pode ser aumentada n apresença de íons Ca2+ e Mg2+. Por outro lado, a ameba internaliza T. rubrum por mecanismo dependente de manose em trofozítos e não em cistos e A. castellanii produz ROS e PRN que influenciam a sua atividade fungicida, que é independente de manose e o fungo produz enzimas do complexo antioxidante para sobreviver no interior da ameba. Dermatophytoses are fungal infections that affect humans and animals. Among the most prevalent etiological agents in these infections are the Trichophyton rubrum species. The amoebas of the genus Acanthamoeba present wide environmental distribution, feeding on bacteria, fungi, viruses present in the environment. Both microorganisms can live in the same environment, so the objective of this work was to evaluate the interaction of A. castellanii on T. rubrum in different conditions (PYG, NA and ND). The kinetics of A. castellanii in the presence and absence of T. rubrum were studied, as well as the phagocytosis assay to confirm the ameba-fungus interaction, to evaluate the influence of different nutritional conditions (PYG media, NEFF). The results show an amoeba encroachment of approximately 30% with presence of T. rubrum and 25% without the fungus, and the interaction was confirmed by phagocytosis, where in the NA condition (addition of NEFF prior to fungus infection) there is a greater internalization in addition, the addition or subtraction of Ca2+ and Mg2+ ions, addition of mannose and cytochalasin D in phagocytosis, fungicide activity and release of the fungus from the amoeba interior were performed. The ions proved to be important for the predation of the fungus by amoeba and cytochalasin D demonstrated the importance of actin in the conidial release process, since there was a decrease in the exocytosis of conidia. Mannose decreased phagocytosis in PYG in a concentration-dependent manner, not occurring even for NA. NA provided a greater recovery of the fungus inside the amoeba and also a lower release, concomitant to a reduced production of oxidative species, also having a greater number of hyphae in the interior. The production of oxidative species, the capacity of amoeba to inactivate the fungus and its ability to survive and be released from the amoeba, and the production of antioxidant enzymes by the fungus were also evaluated. The fungus recovered from amoeba was tested against itraconazole, ketoconazole and terbinafine in order to determine the minimum inhibitory concentration (MIC) of these antifungals. The presence of enzymes of the antioxidant complex was shown to be greater in the conditions with passages through the amoeba than the control, showing an adaptation for survival of the fungus. The MIC of itraconazole presented significant variation in PYG 1h and NA 24h and the other antifungal drugs did not show significant alterations. Thus, the amoeba internalizes the fungus, independent of the nutritional condition and this internalization decreases over time, and this predation can be increased in the presence of Ca2+ and Mg2+ ions. On the other hand, the amoeba internalizes T. rubrum by mannose-dependent mechanism in trophozites and not in cysts and A. castellanii produces ROS and PRN that influence its fungicidal activity, which is independent of mannose and the fungus produces enzymes of the antioxidant complex for survive within the amoeba.

Amebas de vida livre (AVL) podem ser encontradas em diferentes ambientes, onde se alimentam de diversos micro-organismos. Algumas bactérias, vírus e fungos predados por AVL são chamados de micro-organismos resistentes a amebas (MRA), pois resistem à fusão lisossomal e são capazes de se multiplicar e se evadir das AVL após a internalização. As amebas podem ser ferramentas para a identificação desses micro-organismos intracelulares, como também ser utilizadas para estudos de virulência, patogenicidade e interação micro-organismo-hospedeiro. O objetivo do trabalho foi utilizar dois métodos de identificação de micro-organismos ambientais, denominados cocultura e enriquecimento amebiano, além de aplicar a culturômica, para identificar AVL e MRA em amostras de água de origem antropogênica externa e nosocomial. Utilizando a cocultura amebiana e a culturômica, foram identificados 17 gêneros diferentes, incluindo Mycobacterium spp., Pseudomonas spp., Candida spp. e a bactéria fastidiosa Bosea vestrisii. Das amostras positivas para AVL, utilizando o enriquecimento amebiano, foram identificadas Acanthamoeba spp. (90,9%), Vermamoeba vermiformis (54,5%) e Naegleria spp. (45,4%). Free living amoebae (FLA) can be found in different environments, where they feed on diverse microorganisms. Some bacteria, viruses and fungi preyed by FLA are called amoeba-resistant microorganisms (ARM), as they resist to lysosomal fusion and are capable of multiplying and evading FLA after internalization. Research show that amoebae can be tools for intracellular microorganisms identification, as well as for research of virulence, pathogenicity and microorganism-host interaction. The aim of this work was to apply two methods for identification of environmental microorganisms, called amoebal coculture and amoebal enrichment, as well applying culturomics to identify FLA and ARMs in water samples of external anthropogenic and nosocomial environment. Seventeen different microorganisms genera have been identified through amoebic coculture and culturomics, including Mycobacterium spp., Pseudomonas spp., Candida spp. and the fastidious bacteria Bosea vestrisii. Of the positive samples for FLA, through amoebal enrichment, Acanthamoeba spp. (90,9%), Vermamoeba vermiformis (54,5%) and Naegleria spp. (45,4%) were identified.

Marseilleviridae é uma família de vírus gigantes cujos membros infectam amebas de vida livre. Esses vírus têm sido encontrados em amostras ambientais de água, larvas de inseto, torres de resfriamento e mais recentemente em amostras humanas. Eles possuem capsídeo icosaédrico medindo entre 190-250 nm e genoma de DNA dupla fita circular ou linear. Sua replicação ocorre no citoplasma amebiano onde observam-se fábricas virais. Este trabalho tem como objetivo investigar a presença de vírus gigantes em mexilhões-dourados (Limnoperna fortunei) que habitam o Lago Guaíba, Porto Alegre, Brasil. Quarenta indivíduos foram coletados e agrupados em pools de 5 amostras (água interna e corpo, totalizando dezesseis pools). Os pools foram homogeneizados em tampão fosfato, centrifugados e o sobrenadante filtrado em membrana de 0,45μM. Foram cultivadas amebas da espécie Acanthamoeba polyphaga em meio PYG em microplacas de 24 poços, inoculadas com os sobrenadantes, incubadas a 30ºC e examinadas diariamente em busca de efeito citopático (ECP) até 72 horas após a inoculação. Quando CPE era evidente, os sobrenadantes foram coletados e ultracentrifugados através de um gradiente de sacarose de 25%. Um dos dezesseis pools induzindo CPE claro foi submetido à extração de DNA e sequenciamento do genoma viral completo um sequenciador de nova geração (Illumina MiSeq). O genoma do vírus chamado Golden mussel marseillevirus consiste de uma única molécula de DNA de 360610 pb, com um teor de G+C de 43,1%. A análise da sequência de nucleotídeos traduzida revelou a presença de proteínas virais que apresentam homologia com proteínas de outros membros da família Marseilleviridae, como Lausanevirus e vírus Insectomime, porém grande parte do seu genoma não apresenta identidade com proteínas depositadas no banco de dados. A análise filogenética do gene D6/D11 Helicase sugere que este vírus faça parte de uma nova linhagem de marseillevirus. Este é o primeiro estudo que demonstra o isolamento de um vírus gigante a partir de tecidos de mexilhão-dourado e infere que estes vírus estão distribuídos amplamente no meio ambiente. Marseilleviridae is a family of giant viruses whose members infect free living amoebae. These viruses have been found in environmental samples of water, insect larvae, cooling towers and, more recently, in human samples. They have icosahedral capsids measuring between 190-250 nm and their genome is double-stranded circular or linear DNA. Replication occurs in the host cell cytoplasm, inside the viral factories. This study aims to investigate the presence of giant viruses in tissues of golden mussels (Limnoperna fortunei) that inhabit the Guaiba Lake, Porto Alegre, Brazil. Forty specimens were pooled in groups of 5 specimens (internal water and body, totalizing sixteen pools). The pools were homogenized with phosphate buffer, centrifuged and the supernatant was filtered in 0,45μM. Monolayers of Acanthamoeba polyphaga were cultivated with PYG medium in 24-well microplates, inoculated with the pooled samples, incubated at 30 ºC and examined daily in search for cytopathic effect (CPE) up to 72 hours after inoculation. When CPE was evident, the supernatants were collected, clarified and ultra centrifuged through a 25% sucrose cushion. One out of the sixteen CPE positive pools was submitted to DNA extraction and complete sequencing of the viral genome in a NGS apparatus (Illumina MiSeq). The genome of the virus named Golden mussel marseillevirus consists of a single DNA molecule of 360,610 bp, with a G+C content of 43.1%. The analysis of the translated nucleotide sequence reveals the presence of proteins which are homologs to proteins predicted in other members of the family Marseilleviridae like, e.g. Lausannevirus and Isectomime virus. However, part of the viral genome has no identity with the nucleotide sequences available at the database. The phylogenetic analysis of the D6/D11 Helicase gene suggests that this virus is part of a new lineage of marseillevirus. This is the first study where the isolation of a giant virus from golden mussel tissues is achieved, suggesting that these viruses are widely distributed in the environment.

Amebas de vida livre (AVL) são protozoários amplamente distribuídos na natureza e em ambientes artificiais. Alguns gêneros são oportunistas ou patogênicos, com característica anfizóica, são esses: Acanthamoeba spp., Naegleria spp., Balamuthia spp., Sappinia spp., e recentemente Vermamoeba spp. AVL podem servirem de reservatórios de várias bactérias patogênicas, uma vez que se alimentam dessas no ambiente por fagocitose, algumas espécies de bactérias após internalizadas escapam da via de degradação sobrevivem e multiplicam-se no interior das amebas. Face ao exposto, o presente trabalho objetivou isolar e identificar AVL e as bactérias associadas presentes em águas de torres de resfriamento, cuja temperatura da água varia entre 25 a 30°C (ideal para o desenvolvimento de diversos microrganismos). Amebas foram isoladas em cultivo monoxênico com Escherichia coli inativadas pelo calor. Das amostras positivas, foram realizadas Reações em Cadeia de Polimerase (PCR), utilizando oligonucleotídeos específicos para cada gênero. Os produtos das PCR foram sequenciados e as sequências geradas foram comparadas com sequências parciais de cada gene alvo depositadas no GenBank. Das 36 amostras, 33 (91,66%) foram positivas para presença de AVL, destas 15 (45,4%) foram positivas para Acanthamoeba spp., 12 (36,3%) para Naegleria spp., 6 (18,2%) para Vermamoeba spp. Dos endossimbiontes pesquisados, somente Pseudomonas spp. foram identificadas em 13 (39,3%) isolados de AVL. Os resultados obtidos no presente estudo confirmam a presença de amebas de vida livre potencialmente patogênicas e carreadoras de bactérias patogênicas oportunistas que podem representar um risco à saúde humana. Free-living amoebae (FLA) are protozoa widely distributed in natural and artificial environments. Some genus are opportunistic or pathogenic, with anfizoic feature : Acanthamoeba spp., Naegleria spp., Balamuthia spp., Sappinia spp., and recently Vermamoeba spp. AVL may serve as reservoirs for various pathogenic bacteria, since they feed by phagocytosis in the environment, some species of bacteria after internalized escape to the pathway of degradation surviving and multiplying within the amoebae. The aim of this study was to isolate and identify FLA and their associated bacteria present in water from cooling tower, whose temperature water varies between 25 to 30 °C (ideal for the development of different organisms). Amoebae were isolated in monoxenic cultivation with Escherichia coli inactivated by heat. Of the positive samples Polymerase Chain Reactions (PCR) were performed using specific primers for each genus. The PCR products were sequenced and the sequences were generated compared with partial sequences of each gene target deposited in GenBank. From the 36 samples, 33 (91.66%) were positive for the presence of FLA. Of these, 15 (45.4%) were positive for Acanthamoeba spp., 12 (36.3%) for Naegleria spp. and 6 (18.2 %) for Vermamoeba spp. Of the amoeba isolated, 13 (39.3%) were associated to bacteria wich belong to Pseudomonas genus (100%). Another bacteria investigated were absent. The results of this study confirm the presence of potentially pathogenic free-living amoebae as vehicles of opportunistic/pathogenic bacteria that can pose a risk to the human health.

Submitted by Guilherme Lemeszenski (guilherme@nead.unesp.br) on 2013-08-22T19:02:37Z No. of bitstreams: 1 S0034-89102003000200013.pdf: 160879 bytes, checksum: 21206f630336b5e079879ce8d6e54e7d (MD5) Made available in DSpace on 2013-08-22T19:02:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 S0034-89102003000200013.pdf: 160879 bytes, checksum: 21206f630336b5e079879ce8d6e54e7d (MD5) Previous issue date: 2003-04-01 Made available in DSpace on 2013-09-30T20:03:41Z (GMT). No. of bitstreams: 2 S0034-89102003000200013.pdf: 160879 bytes, checksum: 21206f630336b5e079879ce8d6e54e7d (MD5) S0034-89102003000200013.pdf.txt: 22136 bytes, checksum: f3a94ce0fc7a758a7f64f0a3b1b7a468 (MD5) Previous issue date: 2003-04-01 Submitted by Vitor Silverio Rodrigues (vitorsrodrigues@reitoria.unesp.br) on 2014-05-20T15:16:19Z No. of bitstreams: 2 S0034-89102003000200013.pdf: 160879 bytes, checksum: 21206f630336b5e079879ce8d6e54e7d (MD5) S0034-89102003000200013.pdf.txt: 22136 bytes, checksum: f3a94ce0fc7a758a7f64f0a3b1b7a468 (MD5) Made available in DSpace on 2014-05-20T15:16:19Z (GMT). No. of bitstreams: 2 S0034-89102003000200013.pdf: 160879 bytes, checksum: 21206f630336b5e079879ce8d6e54e7d (MD5) S0034-89102003000200013.pdf.txt: 22136 bytes, checksum: f3a94ce0fc7a758a7f64f0a3b1b7a468 (MD5) Previous issue date: 2003-04-01 OBJETIVO: Observar a ocorrência de amebas de vida livre dos gêneros Acanthamoeba e Naegleria em amostras de poeira coletadas em hospitais. MÉTODOS: Foram coletadas 132 amostras de poeira em dois hospitais do município de Presidente Prudente, São Paulo. Os locais da coleta foram: Unidade de Terapia Intensiva, Centro Cirúrgico, Isolamento de Moléstias Infecciosas, Berçário, Emergência e Cozinha. As amostras foram semeadas em três meios de cultura: meio de ágar não nutriente com Escherichia coli, meio de ágar infusão de soja e microcultivo em meio de Pavlova modificado por Giazzi. As amebas isoladas foram identificadas segundo critérios morfológicos. RESULTADOS: O índice geral de positividade para amebas de vida livre, potencialmente patogênicas, dos gêneros Acanthamoeba e Naegleria, foi de 45,5%, sendo positivas 41,6% das amostras de poeira coletadas no hospital universitário e 50% no hospital estadual. Obtiveram-se 45,5% de positividade do gênero Acanthamoeba e 3,8% para amebas do gênero Naegleria. CONCLUSÕES: As amebas de vida livre, potencialmente patogênicas, estavam presentes em todos os ambientes estudados dos dois hospitais, sendo que as espécies do gênero Acanthamoeba foram as isoladas com maior freqüência. OBJECTIVE: To evaluate the occurrence of free-living amoebas of the genera Acanthamoeba and Naegleria is dust samples colleted in two hospitals. METHODS: One-hundred and thirty-two dust samples were collected in two hospitals in Brazil. Hospital collection sites were the following: intensive care unit, operation rooms, nursery, kitchen, emergency and infectious diseases isolation room . The isolation of the amoebas was performed in three culture media: non-nutrient agar inoculated with Escherichia coli, soy agar, and microculture in Giazzi-modified Pavlova's medium. The amoebas were identified according to morphological criteria. RESULTS: Amoebas of the genera Acanthamoeba and Naegleria were found in 45.5% of the samples, of which 41.6% were collected in the university hospital and 50% in the state hospital. of all, 45.5% were positive for the genera Acanthamoeba and 3.8% for genera Naegleria. CONCLUSIONS: Potentially pathogenic free-living amoebas were seen in all sites of the two hospitals and Acanthamoeba was the most frequently isolated genera. Universidade do Oeste Paulista (UNOESTE) Faculdade de Farmácia e Bioquímica Universidade Estadual Paulista Faculdade de Ciências Farmacêuticas Departamento de Ciências Biológicas Universidade Estadual Paulista Faculdade de Ciências Farmacêuticas Departamento de Ciências Biológicas

Foram isoladas amebas dos gêneros Vahlkampfia, Glaeseria, Acanthamoeba, Filamoeba, Amoeba, Platyamoeba e Hartmanella de dez diferentes marcas de água mineral engarrafadas, servidas no Rio de Janeiro, RJ (Brasil). Somente uma das marcas foi negativa para protozoários, enquanto que de todas as outras foram isoladas amebas de vida livre. O significado desses resultados é discutido como um indicador de qualidade da água mineral usada comercialmente, destacando-se o fato de que alguns desses microorganismos são potencialmente patogênicos. Amoebae of the genera Vahlkampfia, Glaeseria, Acanthamoeba, Filamoeba, Amoeba, Platyamoeba and Hartmanella were isolated from ten different brands of bottled mineral water used in Rio de Janeiro. Of these brands, only one was negative after an incubation period of twenty days, while the others were all positive for free living amoebae. The results are discussed as an indicator of the quality of commercially used mineral water and it is stressed that some of these microorganisms are potentially pathogenic.