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As amebas de vida livre do gênero Acanthamoeba são protozoários ubíquos que eventualmente agem como parasitas, causando infecções graves como a encefalite amebiana granulomatosa e a ceratite amebiana. Um dos aspectos importantes da fisiopatologia das acantamebíases é a capacidade de encistamento do protozoário nos tecidos infectados. Os cistos de Acanthamoeba são formados por paredes duplas resistentes, resultando em menor eficácia de medicamentos e consequente demora no tratamento das infecções e ainda em falha terapêutica. O processo de encistamento ainda não é amplamente compreendido e as ciências ômicas podem fornecer importantes contribuições na avaliação do fenótipo de organismo. Portanto, esse trabalho teve como objetivo determinar o perfil metabólico de Acanthamoeba castellanii durante o processo de diferenciação celular de trofozoítos para cistos. Uma cepa de A. castellanii em cultivo axênico foi induzida ao encistamento em salina de Neff, estabelecendo-se a cinética de formação de pré-cistos e cistos. Culturas em tempo zero (somente trofozoítos), 24 horas (encistamento iniciado) e 72 horas (somente cistos) foram submetidas à extração de metabólitos para avaliação por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas (GC/MS). Foram identificados dezoito metabólitos com significância estatística, incluindo aminoácidos, lipídios, carboidratos, compostos nitrogenados e poliaminas. De forma geral, houve redução da concentração dos metabólitos com o avanço do encistamento, com exceção da arbutina, celobiose e lactose. Os resultados indicam uma diminuição do metabolismo de Acanthamoeba durante o encistamento, além de alteração de sua fonte energética e de carbono. Sugere-se ainda o envolvimento dos transportadores ABC no encistamento, como possíveis exportadores do produto da degradação de organelas e macromoléculas no processo. The free-living amoebae of the genus Acanthamoeba are ubiquitous protozoa that can eventually act as parasites, causing serious infections such as granulomatous amoebic encephalitis and amoebic keratitis. A relevant aspect of the pathophysiology of acanthamoebiasis is the ability of the protozoa to encyst on infected tissues. Acanthamoeba cysts present resistant double walls, resulting in lower efficacy of drugs, delay in the treatment and therapeutic failure. The encystment process is not entirely understood and the omics sciences can contribute to evaluate the phenotype of organisms. Thus, the aim of this work was to determine the metabolic profile of Acanthamoeba castellanii during the process of cell differentiation of trophozoites into cysts, since the omics sciences can contribute to the evaluation of gene expression and phenotype of organisms. Encystment was induced in a strain of A. castellanii in axenic culture with Neff saline, establishing the kinetics of pre-cysts and cysts formation. Time zero (throphozoites only), twenty-four hours (transformation initiated) and seventy-two hours (cysts only) cultures were submitted to extraction of metabolites for evaluation by gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC/MS). Eighteen metabolites with statistical significance were identified, including amino acids, lipids, carbohydrates, nitrogen compounds and polyamines. In general, there was a reduction of the concentration of metabolites with the advance of the encystment, with the exception of arbutine, cellobiose and lactose. The results indicated a decrease of Acanthamoeba metabolism during encystment, as well as an alteration of its energy and carbon source. The involvement of ABC transporters in encystment was also suggested. They could act as exporters of degradation products from organelles and macromolecules during the process.

As leishmanioses compõem um grupo de doenças causadas por parasitos do gênero Leishmania e possuem grande importância em saúde pública. O controle dessas doenças ainda é um desafio, devido a crescente resistência às drogas utilizadas no tratamento. Nesse contexto, o estudo de modelos resistentes a drogas é essencial para se explorar o potencial metabólico dos parasitos e melhor compreender os mecanismos envolvidos na aquisição de resistência a fármacos. Neste estudo, foi gerada uma linhagem mutante de Leishmania braziliensis resistente ao antibiótico tunicamicina, fármaco que atua na inibição da glicosilação proteica. Para a geração dos mutantes foi utilizado o método de aumento gradual de concentração de droga (stepwise). Com o intuito de avaliar as adaptações metabólicas induzidas durante o processo de aquisição de resistência à tunicamicina, foram realizadas análises genômicas, ensaios de microscopia, infectividade, citometria e análise do metaboloma da linhagem resistente. As promastigotas de Leishmania braziliensis resistentes à tunicamicina (até 80 vezes o valor da DL50), apresentaram amplificação gênica e um concomitante aumento de virulência. Modificações morfológicas foram observadas na linhagem resistente como, desorganização das cisternas do complexo de Golgi indicando possíveis alterações no processo de glicosilação proteica. Alterações no metabolismo de várias fontes de carbono, relacionados à produção de substrato para a síntese de dolicol, molécula que desempenha papel importante na glicosilação de proteínas, foram detectadas como resposta ao bloqueio do processo induzido pela tunicamicina. Os dados gerados permitiram a concepção de um modelo de estudo dos mecanismos de resistência a drogas, bem como a influencia da glicosilação proteica nas relações parasito-hospedeiro em Leishmania. Leishmaniasis is a group of diseases caused by parasites of the Leishmania type and is of great importance in public health. Disease control is still a challenge due to its resistance to the drugs used in treatment. In this context, the study of potential resistance is essential for the exploration of the potential metabolism of parasitism and improve the structures of the drugs of the stress of drugs In this study, a mutant strain of Leishmania braziliensis resistant to the antibiotic tunicamycin, a drug that inhibits the glycosylation of protein, was generated by the gradual increase in drug concentration (stepwise). In order to evaluate the metabolic adaptations caused during the process of developing resistance to tunicamycin. In order to evaluate the metabolic changes during the acquisition of resistance to tunicamycin, genomic analyzes, microscopy, infectivity, cytometry and resistance metabolism analysis were performed. Promastigotes of Leishmania braziliensis resistant to tunicamycin (up to 80 times the value of LD50), gene amplification and a concomitant increase in virulence. Morphological changes were observed in the lineage such, disorganization of cisterns of the Golgi complex, changes in the process of protein glycosylation. Changes in the metabolism of various carbon sources, related to the production of substrate for a synthesis of fatty acid, molecules that play an important role in the glycosylation of proteins, were detected as responses to the induction blocking process of tunicamycin. The results suggests that main mechanisms of drug resistance, as well as the influence of protein glycosylation on host parasitic infections in Leishmania.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior As amebas de vida livre do gênero Acanthamoeba são protozoários ubíquos isolados dos mais variados ambientes. Eventualmente, são encontradas causando sérias doenças nos seres humanos. A infecção mais comum causada por esse protozoário é a ceratite amebiana (CA), caracterizada por uma grave inflamação na córnea que pode levar à cegueira. O conhecimento sobre as proteínas parasitárias envolvidas no processo fisiopatológico pode ser útil para desenvolver estratégias de diagnóstico e terapêuticas para CA. Assim, realizou-se de um estudo proteômico comparativo para identificar proteínas diferencialmente expressas por trofozoítos de Acanthamoeba, provenientes de cultura de longo prazo e de re-isolados obtidos de lesão da córnea induzida em modelo animal de CA. Para tal, uma cepa de Acanthamoeba castellani isolada de um paciente com CA, mantida em cultura axênica em meio PYG desde 2006, foi utilizada. Ratos Winstar (45 dias) foram utilizados para induzir CA, após a inoculação intraestromal de 104 trofozoítos. Com o objetivo de definir qual o método de obtenção de proteínas mais adequado para a análise proteômica, trofozoítos da cepa ALX de longo prazo foram submetidos aos métodos de extração proteica por sonicação e “freeze/thaw” na presença de detergente CHAPS. O método de sonicação mostrou-se mais adequado, resultando em mapas bidimensionais de maior resolução. Para a confecção dos géis bidimensionais das culturas avaliadas, as proteínas totais de ALXltc, ALXrec1, ALXrec2 e ALXrec3 foram focalizadas em strips. Posteriormente, as proteínas já focalizadas foram separadas na segunda dimensão em eletroforese de poliacrilamida. A detecção das proteínas diferencialmente expressas foi realizada através do software ImageMaster 2D Platinum. Sessenta e dois spots foram selecionados para a espectrometria de massas, sendo 42 identificados na base de dados específica de Acanthamoeba. Destas, oito correspondiam a proteínas hipotéticas com função desconhecida. Análises de função molecular revelaram que a maioria das demais proteínas estão associadas à processos biológicos relacionados à oxirredução e função molecular de ligação à outra proteína. Por intermédio da representação em um heatmap da análise de expressão diferencial entre a cultura de longo prazo e culturas recuperadas, foi possível inferir que Acanthamoeba modula a expressão de várias proteínas associadas principalmente ao metabolismo energético, à atividade proteolítica, ao controle da expressão gênica, pela degradação de proteínas ou metilação do DNA, à resposta ao extresse e reparo do DNA, para adaptação ao novo ambiente e resistência aos mecanismos imunes do hospedeiro, promovendo lesões teciduais. The free-living amoeba of the genus Acanthamoeba are ubiquitous protozoa isolated from the most varied environments. Eventually, they are found causing serious illness in humans. The most frequently infection caused by this protozoan is amoebic keratitis (KA), characterized by severe inflammation in the cornea that can lead to blindness. Knowledge about the parasitic proteins involved in the pathophysiological process may be useful to develop diagnostic and therapeutic strategies for CA. Thus, a comparative proteomic study was performed to identify proteins differentially expressed by Acanthamoeba trophozoites from long-term culture and from re-isolates obtained from KA-induced in a animal model. For this purpose, a strain of Acanthamoeba castellanii isolated from a patient with KA maintained in axenic culture in PYG medium since 2006 was used. Winstar rats where used to induce KA after intraestromal inoculation of 104 trophozoites. In order to define the most suitable method of obtaining proteins for the proteomic analysis, trophozoites of the longo-term culture ALX were submitted to the methods of protein extraction by sonication and freeze/thaw in the presence of detergent CHAPS. The sonication method was more adequate, resulting in two-dimensional maps of higher resolution. For the preparation of the two-dimensional gels of the evaluated cultures, total proteins of ALXltc, ALXrec1, ALXrec2 and ALXrec3 were focused. Subsequently, the already focused proteins were separated in the second dimension in polyacrylamide electrophoresis. Detection of differentially expressed proteins was performed using ImageMaster 2D Platinum software. Sixty-two spots were selected for mass spectrometry, of which 42 were identified in the Acanthamoeba specific database. Of these, eight hypothetical proteins with unknown function could be detected. Molecular function analyzes revealed that most proteins are associated with biological processes related to oxidation and molecular function of binding to the other protein. Through the representation in a heatmap of the analysis of differential expression between long-term culture and re-isolated cultures, it was possible to infer that Acanthamoeba modulates the expression of several proteins associated mainly to energy metabolism, proteolytic activity, control of gene expression, protein degradation or DNA methylation, response to DNA stress and repair, adaptation to the new environment, resistance to host immune mechanisms, and promotion of tissue damage.

A amebíase é a protozoose mais grave que atinge o ser humano e a segunda maior causa de morte entre as doenças parasitárias, superada apenas pela malária. Considera-se que apenas a Entamoeba histolytica é capaz de penetrar nos tecidos e produzir amebíase invasiva. Contudo, alguns estudos têm demonstrado que a Entamoeba dispar é capaz de produzir lesões em modelos experimentais. Com o objetivo de determinar se as bactérias enteropatogênicas contribuem para aumentar a expressão gênica dos fatores de virulência amebianos, bem como de induzir lesões mais intensas, propusemos avaliar a influência da bactéria Salmonella enterica sorovar Typhimurium sobre a virulência da Entamoeba dispar e da Entamoeba histolytica em trofozoítos isolados da cultura in vitro e avaliar patologicamente a colite amebiana, em ratos infectados com trofozoítos amebianos e co-infectados com S. Typhimurium. As cepas MCR, ADO e VEJ de E. dispar e, EGGp e EGGa de E. histolytica foram cultivadas separadamente e, associadas ou não à bactéria S. Typhimurium. Em seguida foi realizada a extração do RNA dessas culturas para produção de cDNA dos fatores de virulência de E. histolytica e E.dispar e quantificada a expressão dos fatores de virulência. Para a indução de colite amebiana, 8 ratos wistar (Rattus norvegicus) por grupo, previamente submetidos a uma intubação intragástrica da S. Typhimurium, foram inoculados pela via intracecal com 5x105 trofozoítos. Como grupos controles, 40 ratos foram somente inoculados com trofozoítos amebianos das cepas de Entamoeba estudadas. Outros 16 ratos constituíram os grupos controles somente infectados com S. Typhimurium e controle não infectado. Todos os ratos foram sacrificados 7 dias após a infecção amebiana para a coleta do ceco, confecção de lâminas histológicas para análise histopatológica e morfométrica e, para a realização de reações imuno-histoquímicas anti IL-1á, IL4, COX-2 e MUC-2. Nosso estudo permitiu observar que a co-cultura de E. dispar com a enterobactéria S. Typhimurium foi capaz de aumentar a expressão dos fatores de virulência amebianos amebaporo A, cisteína proteinase-5 e lectina ligante de Galactose e N-Acetilgalactosamina. Ao contrário do observado por outros autores, as cepas de E. dispar por nós estudados foram capazes de expressar o fator de virulência amebiano cisteína proteinase-5. A co-cultura de E. histolytica com a enterobactéria S. Typhimurium foi capaz de aumentar a expressão do fator de virulência amebiano amebaporo A. Também verificamos que na maioria dos grupos analisados, a associação in vivo da E. dispar ou da E. histolytica com a S. Typhimurium foi capaz de aumentar a intensidade da colite amebiana ulcerativa, também acompanhada pelo aumento da expressão de mediadores pró-inflamatórios e da redução da expressão de IL-4. Além disso, na maioria dos grupos analisados, a associação in vivo da E. dispar ou da E. histolytica com a S. Typhimurium foi capaz de aumentar a expressão da mucina MUC2, em virtude da maior intensidade da agressão à mucosa colônica. Diante dos resultados obtidos, concluímos que a interação da S. Typhimurium com a E. dispar e a E. histolytica foi capaz aumentar a virulência destas espécies de amebas levando à colite ulcerativa amebiana de maior intensidade. Amebiasis is the most serious protozoa that hits the human intestine and is the second-leading cause of death among parasitic diseases, surpassed only by malaria. It is considered that only Entamoeba histolytica is able to penetrate tissues and produce invasive amebiasis. However, some studies have shown that Entamoeba dispar is capable of producing lesions in experimental models. In order to determine if the enteropathogenic bacteria contribute to increase the gene expression of amebic virulence factors, as well as to induce more intense lesions, we propose to evaluate the influence of Salmonella Enterica sorovar Typhimurium on the virulence of Entamoeba dispar and Entamoeba histolytica in trophozoites isolated from the in vitro culture and pathologically evaluate amoebic colitis in rats infected with amoebic trophozoites and co-infected with S. typhimurium. E. dispar, MCR, ADO and VEJ strains from E. dispar and, EGGp and EGGa from E. histolytica were cultured separately and associated or not with the S. Typhimurium bacterium. Then, the RNA extraction from these cultures was carried out to produce cDNA from the virulence factors of E. histolytica and E.dispar and quantified the expression of the virulence factors. For the induction of amoebic colitis, 8 wistar rats (Rattus norvegicus) per group, previously submitted to an intragastric intubation of S. Typhimurium, were inoculated by the intracecal route with 5x105 trophozoites. As control groups, 40 rats were only inoculated with amebian trophozoites from the Entamoeba strains studied. Another 16 rats were the control groups infected only with S. typhimurium and uninfected control. All rats were sacrificed 7 days after amebic infection to collect cecum, histological slides for histopathological and morphometric analysis, and for the immunohistochemical anti-IL1á, IL4, COX-2 and MUC-2 immunohistochemical reactions . Our study showed that the co-culture of E. dispar with the S. typhimurium enterobacterium was able to increase the expression of amebaporo A, cysteine proteinase-5 and Galactose-binding lectin and N-acetylgalactosamine virulence factors. Contrary to what was observed by other authors, E. dispar strains studied by us were able to express the amoebic virulence factor cysteine proteinase-5. The co-culture of E. histolytica with the S. typhimurium enterobacterium was able to increase the expression of the amebian virulence factor amebaporo A. We also found that in the majority of the groups analyzed, the in vivo association of E. dispar or E. histolytica with S. typhimurium was able to increase the intensity of ulcerative amebic colitis, also accompanied by increased expression of proinflammatory mediators and reduced IL-4 expression. In addition, in most of the analyzed groups, the in vivo association of E. dispar or E. histolytica with S. typhimurium was able to increase MUC-2 mucin expression, due to the greater intensity of aggression to the colonic mucosa. In view of the results obtained, we conclude that the interaction of S. Typhimurium with E. dispar and E. histolytica was able to increase the virulence of these species of amoebae leading to ulcerative amebic colitis of greater intensity.

As amebas do gênero Acanthamoeba são organismos de vida livre presentes nos mais variados ambientes, e eventualmente causam graves infecções no ser humano, como a encefalite amebiana granulomatosa e a ceratite por Acanthamoeba. Diferentes espécies de Acanthamoeba foram descritas e atualmente são classificadas em mais de 20 diferentes genótipos, com base em sequências do 18S rDNA. Um fator relacionado à patogenia e virulência de Acanthamoeba é a capacidade de secretar proteases, que parecem estar envolvidas na patogênese da infecção. Alguns estudos têm avaliado o perfil quantitativo e qualitativo desses produtos de secreção, buscando correlações com a virulência entre diferentes linhagens. O objetivo desse trabalho foi realizar uma análise comparativa do perfil de proteases secretadas por amostras clínicas e ambientais de Acanthamoeba de diferentes genótipos, e avaliar se ocorre alteração desse perfil após a interação com células de cultivo MDCK. Seis isolados de Acanthamoeba de origem clínica e ambiental, sendo três pertencentes ao genótipo T4 e as demais de genótipo T1, T2, e T11, foram cultivados em meio PYG a 32o C. Os isolados foram avaliados por curva de crescimento e efeito citopático sobre células MDCK. Para os ensaios de zimografia e azocaseína, utilizou-se meio condicionado a 32º C, por 24 horas. O meio condicionado também foi obtido de culturas interagidas por três dias consecutivos com células MDCK. O crescimento dos isolados foi variado e todos produziram efeito citopático. Os perfis de zimografia variaram entre os isolados, que apresentaram proteases de massa molecular entre 170 e 58 kDa, a maioria identificada pelo uso de inibidores como serinoproteases. O isolado de genótipo T1, obtido de poeira ambiental, apresentou maior produção de proteases que os demais e uma provável cisteínoprotease de alto peso molecular, ainda não descrita para esse genótipo (170 kDa). Após a interação com células MDCK, houve alteração do perfil de zimografia em todos os isolados, com a supressão de algumas proteases e o surgimento de outras, de baixa massa molecular (

Neste trabalho, aspectos da patogenicidade e virulência da cepa ICB-ADO polixênica de Entamoeba dispar foram abordados, visando um melhor conhecimento dos mecanismos de agressão que essa cepa apresenta. Considerada uma espécie não-patogênica, E. dispar tem sido isolada de pacientes brasileiros com colite não disentérica e demonstrado capacidade de ocasionar lesões em animais de experimentação, quando associada à flora da microbiota intestinal de seus hospedeiros. Estudos in vivo utilizando hamsters como modelo experimental, verificaram diferenças na cinética das lesões hepáticas ocasionadas pela cepa ICB-ADO polixênica de E. dispar, diferindo substancialmente do observado para as cepas ICB-EGG e HM1-IMSS de E. histolytica. Apesar de ocasionar lesões extensas após sete dias de inoculação, a cepa ICB-ADO demonstra uma capacidade de lesar mais lentamente os tecidos. Estudos in vitro demonstraram ser a cepa ICB-ADO de E. dispar capaz de ocasionar a destruição e a queda da medida da resistência transepitelial de células MDCK em monocamadas, embora de forma mais lenta e gradual que cepas de E. histolytica. A cepa ICB-ADO polixênica apresentou também uma maior atividade de proteases quando comparada com a cepa HM1-IMSS de E. histolytica, devendo a relação bactérias/amebas ser melhor estudada, objetivando conhecer mais profundamente as alterações que elas causam nos trofozoítos quando em associação.