Search

O estado nutricional materno durante a gestação e lactação, pode ter impacto direto no desenvolvimento do filhote e atuar de forma terapêutica em situações de estresse no início da vida. A separação materna (SM), é considerada um modelo de estresse, que consiste na ruptura da ligação mãe-filhote e que pode programar o metabolismo e o comportamento dos filhotes na vida adulta de maneira sexo-específica. A SM pode induzir alterações hipocampais que parecem estar intimamente correlacionadas com o desenvolvimento da depressão e, de modo geral, o estresse pode afetar outros fatores como o metabolismo energético, função mitocondrial, neurogênese e astrócitos. Nesse sentido, uma estratégia não farmacológica com característica neuroprotetora é o consumo de azeite de oliva (AO), que possui nutrientes que podem agir em diferentes regiões encefálicas, atuando na ativação de proteínas sensoras do metabolismo energético, manutenção da integridade mitocondrial e da barreira hematoencefálica (BHE), além de estar relacionado com neurogênese e prevenção de doenças neuropsiquiátricas. Assim, o objetivo deste trabalho foi investigar os efeitos do consumo de uma dieta rica em AO no período gestacional/lactacional sobre o comportamento do tipo depressivo e fatores associados ao desenvolvimento da depressão em ratos submetidos à SM. No capítulo I realizou-se um compilado de dados da literatura acerca da importância do consumo de ácidos graxos (AG) durante o período perinatal, destacando os efeitos sobre o hipocampo e comportamento. A revisão forneceu evidências de que o ambiente intrauterino e pós-natal do filhote é modulado pela dieta materna. Por exemplo, o hipocampo durante as fases iniciais do desenvolvimento está passando por constantes processos de maturação e desenvolvimento e se mostrou extremamente modulado pelo consumo de dietas materna contendo diferentes AGs. Alterações precoces na sinaptogênese, na neurogênese, na astrogênese e na resposta inflamatória parecem estar diretamente relacionadas aos desfechos comportamentais dependentes do hipocampo na idade adulta. No capítulo II, utilizando modelo experimental de SM, observamos que o consumo de dieta materna contendo AO preveniu o ganho de peso nos ratos machos e diminuiu o comportamento anedônico induzido pela SM em ambos os sexos. De forma sexo específica, o AO preveniu os efeitos da SM sobre comportamento depressivo avaliado pelo nado forçado nos machos, bem como reduziu espécies reativas de oxigênio e aumentou a atividade de enzimas antioxidantes. Além disso, essa dieta mostrou efeitos específicos do sexo diminuindo a massa e o potencial mitocondrial, reduzindo a ativação de AMPK e aumentando o imunoconteúdo de sinaptofisina e da proteína de densidade pós-sináptica 95 (PSD-95) no hipocampo dorsal (HD) dos machos. Já a SM, causou diminuição da produção de radicais livres e diminuição do imunoconteúdo de SIRT1 no HD também dos machos. No capítulo III, utilizamos o mesmo modelo experimental para buscar compreender melhor os mecanismos de atuação do AO sobre a funcionalidade do hipocampo dorsal. Observamos que a dieta materna causou um aumento no imunoconteúdo de claudina-5 nos machos. Os filhotes separados provenientes de mães que consumiram AO apresentaram um aumento na marcação de astrócitos e ainda preveniram a redução da neurogênese causada pela SM. Dessa forma, conforme o capítulo I observamos a importância do consumo de AGs durante o período perinatal, e demonstramos através dos capítulos II e III que o consumo de AO durante o período perinatal atua como fator protetor em indivíduos que passaram pela SM, prevenindo o comportamento do tipo depressivo, possivelmente por meio de mecanismos relacionados ao metabolismo energético, sistema antioxidante, astrogênese e neurogênese. Maternal nutritional status during pregnancy and lactation can have a direct impact on the development of the offspring and act therapeutically in stressful situations in early life. Maternal separation (MS) is considered a model of stress, which consists of the rupture of the mother-pup bond and that can program the metabolism and behavior of the pups in adult life in a sex-specific way. MS can induce hippocampal changes that seem to be closely correlated with the development of depression and, in general, stress can affect other factors such as energy metabolism, mitochondrial function, neurogenesis and astrocytes. In this sense, a non-pharmacological strategy with a neuroprotective characteristic is the consumption of olive oil (OO), which has nutrients that can act in different brain regions, acting on the activation of proteins that sense energy metabolism, maintenance of mitochondrial integrity and the blood-brain barrier. (BBB), in addition to being related to neurogenesis and prevention of neuropsychiatric diseases. Thus, the objective of this work was to investigate the effects of the consumption of a diet rich in OO in the gestational/lactational period on depressive-like behavior and factors associated with the development of depression in rats submitted to MS. In chapter I, a compilation of literature data was carried out on the importance of fatty acid (FA) consumption during the perinatal period, highlighting the effects on the hippocampus and behavior. The review provided evidence that the pup's intrauterine and postnatal environment is modulated by the maternal diet. For example, the hippocampus during the early stages of development is undergoing constant maturation and development processes and has been shown to be extremely modulated by the consumption of maternal diets containing different FAs. Early changes in synaptogenesis, neurogenesis, astrogenesis, and the inflammatory response appear to be directly related to hippocampus-dependent behavioral outcomes in adulthood. In chapter II, using an experimental model of MS, we observed that the consumption of maternal diet containing OO prevented weight gain in male rats and decreased the anhedonic behavior induced by MS in both sexes. In a sex-specific way, OO prevented the effects of MS on depressive behavior assessed by forced swimming in males, as well as reduced reactive oxygen species and increased the activity of antioxidant enzymes. In addition, this diet showed sex-specific effects by decreasing mitochondrial mass and potential, reducing AMPK activation, and increasing the immunocontent of synaptophysin and postsynaptic density protein 95 (PSD-95) in the dorsal hippocampus (DH) of males. MS, on the other hand, caused a decrease in the production of free radicals and a decrease in the immunocontent of SIRT1 in DH also in males. In chapter III, we used the same experimental model to better understand the mechanisms of action of the OO on the functionality of the DH. We observed that maternal diet caused an increase in claudin-5 immunocontent in males. Separated offspring from mothers who consumed OO showed an increase in astrocyte labeling and even prevented the reduction in neurogenesis caused by MS. Thus, according to chapter I, we observe the importance of FAs consumption during the perinatal period, and we demonstrate through chapters II and III that OO consumption during the perinatal period acts as a protective factor in individuals who have undergone MS, preventing the behavior of the depressive type, possibly through mechanisms related to energy metabolism, antioxidant system, astrogenesis and neurogenesis.

A hipercolesterolemia familiar (HF) é uma doença prevalente que nos últimos anos vem sendo fortemente associada a alterações cerebrais características de doenças neurodegenerativas. A HF é causada por mutações no gene que codifica o receptor da lipoproteína de baixa densidade (LDLr), a principal carreadora de colesterol periférico. Estudos com camundongos nocautes para o LDLr (LDLr-/-) apontaram que a neuroinflamação e disfunção da barreira hematoencefálica (BHE) são eventos importantes no distúrbio cerebral associado à HF. Nesse sentido, foi demonstrado em camundongos LDLr-/- que a inibição da mTOR pode atenuar a quebra da BHE. Dessa forma, nesta dissertação nós hipotetizamos que a exposição dos animais modelos experimentais de HF à metformina, um fármaco que potencialmente modula a sinalização da mTOR via AMPK, poderia atenuar as alterações cerebrais causadas pela HF. Camundongos LDLr-/- e selvagens (WT) machos adultos receberam metformina (200 mg/Kg) ou salina diariamente por 30 dias. Todos os animais foram pesados semanalmente. Na última semana de tratamento, foram realizados o teste de campo aberto para avaliação da atividade locomotora e exploratória, os testes de reconhecimento e realocação de objetos para avaliação da memória e o teste de suspensão pela cauda para avaliação do fenótipo depressivo. Uma coorte de animais foi eutanasiada por exsanguinação via punção cardíaca ao fim do tratamento. Na sequência, o plasma heparinizado foi usado para dosagem de colesterol total e triglicerídeos. Outra coorte de animais foi perfundida com paraformaldeído para a coleta de cérebros fixados. O colesterol total dos camundongos LDLr-/- se mostrou aumentado em relação aos grupos WT. O tratamento com metformina aumentou os triglicerídeos e diminuiu o peso corporal nos camundongos LDLr-/- em comparação com os animais administrados com salina. Os camundongos LDLr-/- mostraram atividade hiperlocomotora, danos cognitivos e um fenótipo depressivo, o que foi parcialmente atenuado pela metformina. Não se observou diferença significativa entre os grupos com relação à imunorreatividade microglial no córtex pré-frontal ou hipocampo, mas a metformina pareceu melhorar a astrogliose no hipocampo de camundongos LDLr-/-. No geral, o tratamento com metformina mostrou efeito promissor contra o dano de memória e a reatividade astroglial observados em camundongos LDLr-/-, independentemente da redução do colesterol plasmático. Familial hypercholesterolemia (FH) is a prevalent disease that has been strongly associated with brain alterations characteristic of neurodegenerative diseases in recent years. FH is caused by mutations in the gene that encodes the low-density lipoprotein receptor (LDLr), the main carrier of peripheral cholesterol. Studies with LDLr knockout mice (LDLr-/-) showed that neuroinflammation and blood-brain barrier (BBB) breakdown are important events in FH-related brain dysfunction. In this sense, it was demonstrated in LDLr-/- mice that mTOR inhibition can attenuate BBB disruption. Thus, in this dissertation, we hypothesized that exposure of experimental FH animal models to metformin, a drug that potentially modulates mTOR signaling via AMPK, could attenuate the brain alterations caused by FH. LDLr-/- and wild-type (WT) male adult mice received a daily oral administration of metformin (200 mg/Kg) or saline for 30 days. All animals were weighed weekly. In the last week of treatment, mice performed the open field test to evaluate locomotor and exploratory activity, the novel object recognition, the object reallocation task for evaluation of memory, and the tail suspension test to evaluate a depressed phenotype. A cohort of animals was euthanized by exsanguination via cardiac puncture at the end of the treatment protocol. Heparinized plasma was used to determine total cholesterol and triglyceride levels. Another cohort of animals was perfused with paraformaldehyde to collect fixed total brains. Total cholesterol levels of the LDLr-/- mice were significantly higher than the WT groups. Metformin treatment increased triglyceride levels and decreased total body weight in LDLr-/- mice in comparison to saline administration. LDLr-/- mice showed hyperlocomotive activity, cognitive damage, and a depressed phenotype, which was in parts attenuated by metformin treatment. We did not observe significant differences between groups regarding microglia immunoreactivity in the pre-frontal cortex or hippocampus of the animals, but metformin treatment seemed to ameliorate astrogliosis in the hippocampus of LDLr-/- mice. Overall, metformin treatment showed a promising effect on the memory impairment and astrocyte reactivity observed in LDLr-/- mice, which was not via a cholesterol-lowering outcome.

Astrocytic cells modulate neuronal activity, including glutamate uptake from the extracellular environment. In renovascular hypertension (HRv) there is an increase in released glutamate by neurons in brainstem nuclei involved in the cardiovascular modulation, contributing to increasing pre-sympathetic neurons activity. However, it is not clear about the involvement of the astrocytes in the extracellular glutamate uptake and recycling in hypertension. This study aimed to analyze the astroglial participation in the uptake and glutamate recycling in the brainstem and hypothalamus in HRv rats. For this purpose, we performed guide-cannula implantation intracisterna magna (ICM) in SHAM and 2K1C rats (HRv model) for microinjections of: a) astrocytic glutamate transporter EAAT2 / GLT1 inhibitor [DHK (1mM)], b) astrocytic glutamine synthetase inhibitor [L-AAA (2mM)] and c) gliotoxin fluorocitrate [FCt (0.2mM)]. One group of animals (2K1C/LOS) was treated with Losartana (AT1 antagonist) by gavage at a dose of 30 mg/kg/day for 4 weeks. After femoral artery catheterization, we made cardiovascular measurements. For in vitro studies, we analyzed by western blotting the astrocytic cytoskeleton - glial fibrillary acid protein - (GFAP), the glutamate receptors (EAAT2 / GLT1 and EAAT1 / GLAST) and the enzyme glutamine synthetase (GS) protein expression. into subfornical organ (SFO), paraventricular nucleus (PVN), rostral ventrolateral brainstem (RVLM), solitary tract nucleus (NTS) and cortex (control area) regions. Our results showed that DHK, or L-AAA ICM microinjection did not change baseline MAP (mmHg) or HR (bpm) in SHAM, 2K1C or 2K1C/LOS groups. FCt ICM microinjection promoted an increase in MAP (mmHg) in the 2K1C group, but not SHAM or 2K1C/LOS. The western blotting analysis showed t in the RVLM a reduction in the GLT1 / EAAT2 and GLAST / EAAT1 transporters expression in the 2K1C. There was also a decrease in the GFAP and GS expression into NTS and RVLM of 2K1C rats. In addition, we observed a reduction in the GLAST / EAAT1 transporter expression into SFO and an increase in GFAP expression into PVN of 2K1C animals. Our results showed that inhibition of astrocytic glutamate transporters or GS on bulbar surface does not seem to be involved in the cardiovascular modulation in normotensive or 2K1C rats. However, glia appears to be involved with BP modulation in HRv. Furthermore, our in vitro studies showed HRv induce changes in the expression of different astrocytic protein in the brainstem hypothalamic nuclei involved with the cardiovascular modulation. In that regards, our studies suggest the involvement of glial cells in the modulation of blood pressure in HRv. However further studies are needed to better understand the participation of astrocytes to modulate cardiovascular function in hypertensive rats. Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES Os Astrócitos modulam a atividade neuronal por meio de diferentes mecanismos, incluindo a recaptação de neurotransmissores do meio extracelular. Sabe-se que na hipertensão renovascular (HRv) há aumento na liberação do glutamato por neurônios de núcleos bulbares envolvidos com a modulação cardiovascular, contribuindo para o aumento da atividade de neurônios pré-simpáticos. Entretanto, pouco se sabe sobre a participação dos astrócitos na recaptação e conversão do glutamato na região do bulbo de ratos hipertensos. O objetivo deste estudo foi analisar a participação dos astrócitos na recaptação e reciclagem do glutamato no bulbo e no hipotálamo de ratos com HRv. Para tanto, realizamos o implante de cânula-guia na região intracisterna magna (ICM) de ratos normotensos e com HRv (pelo modelo 2 Rins -1 Clipe / 2R1C) para a realização das microinjeções: a) do Inibidor do transportador de glutamato astrocítico GLT1 [DHK (1 mM)], b) do inibidor da glutamina sintetase astrocítica [L-AAA (2 mM)] e c) da gliotoxina fluorocitrato [FCt (0,2 mM)]. Um grupo de animais com 2R1C foi tratado com Losartanaa (antagonista AT1) por gavagem na dose de 30mg/kg/dia durante 4 semanas após o período de estabilização do quadro hipertensivo. Para os estudos in vitro, realizamos, por meio da técnica de western blotting, a análise da expressão proteica do citoesqueleto astrocítico - glial fibrillary acid protein - (GFAP), dos recaptadores de glutamato (GLT1 e GLAST) e da enzima glutamina sintetase (GS) das regiões do órgão subfornicial (SFO), núcleo paraventricular do hipotálamo (PVN), bulbo ventrolateral rostral (RVLM), núcleo do trato solitário (NTS) e Córtex. Nossos resultados mostraram que a inibição dos transportadores de glutamato astrocíticos com o DHK ou a inibição da enzima GS com a L-AAA ICM não promoveu alterações cardiovasculares significativas entre os animais dos grupos SHAM, 2R1C e 2R1C/LOS. Entretanto, a inibição da atividade da glia com o FCt ICM promoveu aumento significativo pontual na pressão arterial média (PAM) dos animais 2R1C, mas não nos animais SHAM ou 2R1C/LOS. A análise da expressão proteica no bulbo mostrou que os animais hipertensos apresentaram redução da expressão dos transportadores GLT1 e GLAST no RVLM, bem como redução na expressão de GFAP e da GS no NTS e no RVLM. Na região do hipotálamo, observamos redução na expressão proteica do transportador GLAST no SFO e aumento na expressão de GFAP no PVN dos animais hipertensos. Nossos resultados mostraram que os transportadores de glutamato astrocíticos e a GS da superfície bulbar parecem não estar envolvidos com a modulação cardiovascular de animais normotensos ou 2R1C. Entretanto, a glia parece estar envolvida com a modulação da PAM nesta fisiopatologia. Além disso, nossos estudos in vitro mostraram alterações na expressão proteica de diferentes marcadores da atividade astrocítica nos núcleos bulbares (NTS e RVLM) e hipotalâmicos (SFO e PVN) de animais 2R1C. Nesse sentido, nossos estudos sugerem a participação das células da glia na modulação da pressão arterial na HRv, contudo são necessários estudos adicionais, para melhor compreendermos a participação dos astrócitos na modulação cardiovascular em ratos hipertensos.

Submitted by PMBqBM null (pmbqbm@ufba.br) on 2021-11-30T19:06:29Z No. of bitstreams: 1 Tese Rafael Short _PMBqBM UFBA.pdf: 4057247 bytes, checksum: 4a4052d2ec3e0292f636fddad44454bd (MD5) Approved for entry into archive by Delba Rosa (delba@ufba.br) on 2021-12-20T20:10:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese Rafael Short _PMBqBM UFBA.pdf: 4057247 bytes, checksum: 4a4052d2ec3e0292f636fddad44454bd (MD5) Made available in DSpace on 2021-12-20T20:10:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese Rafael Short _PMBqBM UFBA.pdf: 4057247 bytes, checksum: 4a4052d2ec3e0292f636fddad44454bd (MD5) Bolsa Capes A excitotoxicidade glutamatérgica é um mecanismo fisiopatológico presente em muitas doenças neurodegenerativas crônicas (ex: Doença de Alzheimer) e agudas (ex: acidente vascular cerebral isquêmico – AVEI). Por ter alta densidade populacional de neurônios glutamatérgicos, uma das regiões afetadas neste processo é o hipocampo. Sob estas condições, neurônios e oligodendrócitos podem ser severamente afetados. No entanto, quando ativados, astrócitos podem atuar com agentes captadores de glutamato e atenuar ou impedir morte celular por esse mecanismo. Sabe-se que metabólitos secundários podem proteger desses danos excitotóxicos. Além disto, estudos apontam efeitos promissores relacionados à neuroproteção com extratos da Amburana cearensis em modelos in vitro, sendo a cumarina o agente potencial. O objetivo deste trabalho foi investigar os mecanismos neuroprotetores associados ao tratamento com Extrato Diclorometano da A. cearensis (EDAC). Para isto, dois modelos de AVEI no hipocampo foram utilizados: 1. Fatias de hipocampo de camundongos transgênicos (C57BL/6) (P10), nos quais a expressão da proteína de verde fluorescente (EGFP) é acionada por GFAP em astrócitos ou SOX-10 em oligodendrócitos, submetidas ao pré-tratamento com EDAC por 1 h e depois para condições normais (OGN) ou privação de oxigênio e glicose (OGD) por 1 h na presença ou ausência de EDAC. 2. Culturas organotípicas de fatias de hipocampo (COH) de ratos Wistar do tipo selvagem (P6-8) ou camundongos transgênicos (C57BL/6) GFAP-EGFP tratadas com glutamato e/ou EDAC. Três camadas do cornu ammonis 1 das fatias foram analisadas por imunohistoquímica para anticorpo anti-NeuN, anti-GLT1, anti-GLAST ou anti-GS. A expressão das proteínas foi avaliada por intensidade de fluorescência ou contagem de ramificações ou de células com ramificações de imagens obtidas via microscopia confocal. Os níveis de mRNA de genes de transcrição relacionados à proteção e sobrevivência neural foram avaliados por RT-qPCR. A viabilidade celular foi analisada por captação de iodeto de propídio (intensidade de fluorescência). Nossos resultados mostraram que, em condição de OGD sem reperfusão e em todas 9 camadas avaliadas, o EDAC impediu a redução de processos celulares da expressão de SOX10, sem aumento na expressão de proteínas astrocitárias entre os grupos controle OGN e OGD. Contudo, o EDAC foi capaz de aumentar a expressão de GFAP em condições de OGD. Em COH, observamos que o excesso de glutamato induziu um aumento de morte celular e que esta foi inibida pelo tratamento com EDAC. No entanto, os dados mostram que, nestas condições, o EDAC não protege neurônios. Por outro lado, GFAP, GLT1, GLAST e GS foram superexpressos em culturas tratadas com EDAC sob excitotoxicidade glutamatérgica. Também observamos, por RT-qPCR, um leve aumento da transcrição em GDNF, GLT1, GS, NGF e OLIG2 em fatias de hipocampo tratadas com EDAC. Nossos resultados demonstram que o EDAC tem potencial efeito farmacológico em modelos de isquemia encefálica. Mais estudos precisam ser realizados para melhor elucidar os efeitos observados com o EDAC e quais são os mecanismos de ação do efeito neuroprotetor. Glutamatergic excitotoxicity is a pathophysiological mechanism present in many chronic neurodegenerative diseases (eg, Alzheimer's disease) and acute (eg, ischemic stroke – IS). Due to its high population density of glutamatergic neurons, one of the regions affected in this process is the hippocampus. Under these conditions, neurons and oligodendrocytes can be severely affected. However, when activated, astrocytes can act as glutamate capturing agents and attenuate or prevent cell death through this mechanism. It is known that secondary metabolites can protect from these excitotoxic damages. Furthermore, studies point to promising effects related to neuroprotection with Amburana cearensis extracts in in vitro models, with coumarin being the potential agent. The aim of this work was to investigate whether there are neuroprotective effects associated with treatment with A. cearensis Dichloromethane Extract (EDAC) in models of ischemia. For this, IS models (normoxia/hypoxia – OGN/OGD – or glutamate excitotoxicity) in the hippocampus were used to evaluate markers for expression of oligodendrocyte, astrocytic or neuronal proteins, or cell viability in slices, or mRNA levels related to protection and neural survival by RT-qPCR. Our results showed that, under OGD condition without reperfusion, EDAC prevented the reduction of cellular processes of oligodendrocytes, without increase in astrocytic protein (GFAP) expression or morphological changes between OGN and OGD control groups. However, EDAC was able to increase morphological changes and GFAP expression under OGD conditions. In organotypic hippocampal culture, we observed that excess glutamate induced an increase in cell death and that this was inhibited by treatment with EDAC. However, the data show that, under these conditions, EDAC does not protect neurons. On the other hand, astrocytic proteins related to glutamate metabolism were overexpressed in cultures treated with EDAC under glutamatergic excitotoxicity. We also observed, by RT-qPCR, a mild increase in mRNA transcription related to neural protection and survival in hippocampal slices treated with EDAC. Our results demonstrate that EDAC has a potential pharmacological effect in brain ischemia 8 models. Complementary studies with EDAC or its components can help to deepen and explain the characterization of the effects observed in this work.

Tese de Doutoramento em Envelhecimento e Doenças Crónicas, The presence of reactive astrocytes in multiple sclerosis (MS), a chronic inflammatory disease of the central nervous system, has been described for a long time, however its contribution for disease pathophysiology is still not fully understood. Therefore, in this work we proposed to further explore the contribution of astrocytes in MS using different experimental approaches. We started by performing a temporal transcriptomic analysis of astrocytes in the chronic experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) MS animal model. For that we isolated astrocytes from the cerebellum in 3 disease time points: before the symptom’s appearance (pre-symptomatic phase), at the onset/peak of the disease and at the chronic phase of EAE. Particularly at the onset phase of disease, astrocytes overexpressed genes associated with a neurotoxic phenotype (known as A1 phenotype), along with the overexpression of genes involved in metabolic pathways, like glycolysis and tricarboxylic acid cycle. This suggested that astrocytes could be undergoing metabolic reprogramming, similarly to what happens in macrophages/microglia in response to different inflammatory stimuli. On the second part of this work, we induced EAE in a model that presents “silent” astrocytes, i.e. astrocytes that present minimal calcium elevations in the soma and main processes, due to the ablation of the inositol 1,4,5-triphosphate receptor type 2 (IP3R2-null). IP3R2- null mice and wild-type littermates presented similar disease clinical scores, however IP3R2-null mice had decreased lesion burden in the cerebellum white matter, which could be associated with the increased astrocyte reactivity observed in these mice near the lesions, compared to the normal appearing white matter. Next, we studied the effects of a neuroprotective drug, dimethyl fumarate (DMF), on astrocyte activation and on the cognitive function in the EAE model. DMF treatment, started at the symptomatic phase of disease, was able to reduce astrocyte reactivity, evaluated by a decrease in the number of cells, and demyelination in the fimbria, which is the most important white matter pathway in the hippocampus, possibly contributing to the prevention of cognitive deficits observed in DMF-treated EAE animals. Finally, we focused our attention on a protein produced by astrocytes during EAE, lipocalin-2 (LCN2), an acute phase protein that was previously suggested as a possible disease biomarker. After the quantification of LCN2 concentration in cerebrospinal fluid samples from MS patients, we observed that increased LCN2 levels were associated with faster disease progression. However, this association was no longer statistically significant after controlling for the patients’ age and the presence of oligoclonal bands., A presença de astrócitos reativos na esclerose múltipla (EM), uma doença inflamatória crónica do sistema nervoso central, já é conhecida há muito tempo, porém a sua contribuição para a patofisiologia da doença não está totalmente esclarecida. Assim, neste trabalho propomos explorar a contribuição dos astrócitos na EM usando diferentes abordagens experimentais. Começámos por fazer uma análise temporal do transcriptoma dos astrócitos no modelo animal crónico de EM de encefalomielite autoimune experimental (EAE). Para isso, isolámos astrócitos do cerebelo em 3 momentos experimentais: antes do aparecimento de sintomas (fase pré-sintomática), no pico da doença e na fase crónica. Em particular no pico da doença, os astrócitos sobre-expressaram genes associados a um fenótipo neurotóxico (conhecido como fenótipo A1), e genes envolvidos em diferentes vias metabólicas, tais como a glicólise e o ciclo dos ácidos tricarboxílicos. Estas alterações sugeriram que os astrócitos poderiam estar a passar por um processo de reprogramação metabólica, semelhante ao que acontece com macrófagos/microglia em resposta a diferentes estímulos inflamatórios. Na segunda parte deste trabalho, induzimos EAE num modelo de astrócitos “silenciados”, i.e. astrócitos que apresentam elevações de cálcio mínimas no soma e processos principais, devido à deleção do recetor tipo 2 do inositol 1,4,5-trifosfato (IP3R2-null). Os animais IP3R2-null e do tipo selvagem das mesmas ninhadas desenvolveram a doença de modo semelhante, no entanto os animais IP3R2-null apresentaram uma diminuição da carga de lesão na substância branca do cerebelo, que poderá estar associada ao aumento da reatividade dos astrócitos observada perto destas regiões de lesão, comparativamente à substância branca aparentemente normal. De seguida, estudámos os efeitos de um fármaco neuroprotetor, o dimetil fumarato (DMF), na ativação dos astrócitos e na função cognitiva no modelo de EAE. O tratamento com DMF, iniciado na fase sintomática da doença, reduziu a reatividade dos astrócitos, avaliada através de uma diminuição do seu número, e a desmielinização na fimbria, que é o feixe de substância branca mais importante no hipocampo, o que poderá ter contribuído para a prevenção de défices cognitivos nos animais EAE tratados com DMF. Por último, focámos a nossa atenção numa proteína produzida pelos astrócitos em resposta à EAE, a lipocalina-2 (LCN2), uma proteína de fase aguda que foi anteriormente sugerida como um possível marcador de doença. Após a quantificação dos níveis de LCN2 no líquido cefalorraquidiano de doentes com EM, observámos que níveis elevados de LCN2 estavam associados a uma progressão mais rápida da doença. Porém, esta associação perdeu a significância estatística após controlar para a idade dos doentes e para a presença de bandas oligoclonais., This work was supported by Foundation for Science and Technology (FCT) and COMPETE through the project EXPL/NEU-OSD/2196/2013 and by The Clinical Academic Center (2CA-Braga) through the project EXPL/001/2016. The work at ICVS/3B’s has been developed under the scope of the project NORTE-01-0145-FEDER-000013, supported by the Northern Portugal Regional Operational Programme (NORTE 2020), under the Portugal 2020 Partnership Agreement, through the European Regional Development Fund (FEDER), and funded by FEDER funds through the Competitiveness Factors Operational Programme (COMPETE), and by National funds, through the Foundation for Science and Technology (FCT), under the scope of the project POCI-01-0145-FEDER-007038. FM is an assistant researcher and recipient of an FCT Investigator grant with the reference CEECIND/01084/2017. SN is a recipient of a Ph.D. fellowship with the reference PD/BD/114120/2015 from MCTES national funds.

A sepse é caracterizada por um processo inflamatório sistêmico grave que compromete funções vitais do organismo. A encefalopatia associada à sepse, é uma complicação neurológica associada que, causa disfunções no sistema nervoso central (SNC), como ruptura na barreira sangue-cérebro (BSC), comprometimento da função cognitiva, alterações a níveis metabólicos e celulares e, está relacionada a um aumento na taxa de mortalidade. Os eventos pelos quais a inflamação sistêmica promove danos tão significativos ao SNC, principalmente a longo prazo, ainda não estão completamente estabelecidos. Por essa razão, essa dissertação buscou investigar as alterações cerebrais persistentes após um episódio inflamatório sistêmico grave. Nossos resultados sugerem que os animais sobreviventes à indução de sepse por modelo de ligação cecal e perfuração apresentam um prejuízo na memória declarativa a longo prazo. Além disso, foi observado que o dano à BSC promovido pela sepse é persistente mesmo após a sua resolução. O estudo utilizando esse modelo também demonstrou uma diminuição no metabolismo de glicose cerebral, porém não foram evidenciadas alterações no metabolismo glutamatérgico. E, por fim, observamos que animais sobreviventes a inflamação sistêmica apresentam alterações persistentes em proteínas astrocitárias. Com esses resultados, evidenciamos que a inflamação sistêmica grave impacta, de forma persistente, na funcionalidade cerebral. Sepsis is characterized by a severe systemic inflammatory process that compromises vital body functions. Sepsis-associated encephalopathy (SAE) is an associated neurological complication that causes dysfunction of the central nervous system (CNS), such as disruption of the blood-brain barrier (BBB), impairment cognitive functions, changes at metabolic and cellular levels. Additionally, SAE is related to an increased mortality rate. The events by which systemic inflammation promotes such significant damage to the CNS, especially in the long term, are not yet fully established. For this reason, this dissertation sought to investigate the brain changes that persist after a severe systemic inflammatory episode. Our results suggest that animals surviving the induction of sepsis by cecal ligation and perforation exhibit an impairment in long-term declarative memory. Furthermore, it was observed that the BBB damage promoted by sepsis is persistent even after its resolution. Our study also demonstrated a decrease in brain glucose metabolism, but no changes in glutamatergic metabolism were evident. Finally, we observed that animals surviving systemic inflammation presented persistent alterations in astrocyte proteins. Together, our results, evidenced that on episode of severe systemic inflammation persistently impacts on brain functionality.

O hipocampo é uma estrutura cerebral crucial para os processos de aprendizado e memória, e alterações na funcionalidade de células hipocampais podem estar associadas ao desenvolvimento de transtornos neuropsiquiátricos. Neste sentido, os astrócitos são células gliais responsáveis pela captação de glutamato, sendo este neurotransmissor associado aos processos cognitivos e mecanismos patobioquímicos de doenças neurológicas. Além disso, os astrócitos são responsáveis pelo suporte metabólico, manutenção da homeostase iônica, modulação da neurotransmissão sináptica, manutenção da barreira hematoencefálica, defesa antioxidante e resposta inflamatória. Antipsicóticos são fármacos utilizados para o tratamento de transtornos neuropsiquiátricos e podem modular importantes funções astrocitárias por mecanismos ainda pouco esclarecidos. Estes fármacos são classificados em típicos, como por exemplo, haloperidol, clorpromazina e flufenazina; e atípicos como a risperidona, clozapina e quetiapina, em função dos receptores cerebrais onde atuam. Estudos anteriores do nosso grupo, mostraram que estes antipsicóticos modulam parâmetros gliais em células C6. Neste sentido, fatias agudas de hipocampo podem ser utilizadas para o entendimento de mecanismos de forma integrada entre as células neurais. Além disso, o papel dos astrócitos de forma isolada pode ser avaliado a partir da utilização da cultura de astrócitos. Assim, este trabalho avaliou o efeito dos antipsicóticos risperidona e haloperidol em fatias agudas hipocampais e em cultura de astrócitos de ratos Wistar de 30 dias para melhor compreender os mecanismos de ação dos antipsicóticos sobre parâmetros neuroquímicos, celulares e moleculares. Foram realizados experimentos de viabilidade celular, parâmetros metabólicos, avaliação do metabolismo glutamatérgico, atividade da Na+K+-ATPase, liberação de fatores tróficos, perfil inflamatório e mecanismos associados à funcionalidade glial. Os fármacos não alteraram a viabilidade celular tanto em fatias quanto em culturas, no entanto, houve alteração no metabolismo da glicose e lactato pelo haloperidol. Os antipsicóticos também modularam a liberação de fatores tróficos, como BDNF, GDNF e TGF-β, e os níveis das citocinas pró- e anti-inflamatórias, como IL-1β, TNF-α, IL-6 e IL-10. Mecanismos de sinalização também foram avaliados e observamos que os fármacos são capazes de modular vias como AMPK, Nrf2, HO-1 e NF-kB, bem como os receptores de adenosina A2a. Nossos resultados indicam que o haloperidol parece desencadear um processo pró-inflamatório, com alterações no metabolismo energético e envolvimento de vias de sinalização citoprotetoras, enquanto a risperidona parece exercer um efeito anti-inflamatório relacionado às mesmas vias de sinalização. É importante destacar que a cultura de astrócitos hipocampais refletiu resultados observados em fatias. Dessa forma, concluímos que os antipsicóticos risperidona e haloperidol modulam diferentemente parâmetros neuroquímicos, celulares e moleculares, particularmente relacionados aos astrócitos. Tais ações podem estar associadas aos efeitos positivos e negativos destes fármacos, podendo futuramente ser levadas em consideração para a escolha do esquema terapêutico adotado em transtornos neuropsiquiátricos. Hippocampus is a crucial brain structure for learning and memory processes, and alterations in the functionality of hippocampal cells may be associated with the development of neuropsychiatric disorders. In this regard, astrocytes are glial cells responsible for the uptake of the neurotransmitter glutamate, which is associated with cognitive processes and pathobiochemistry mechanisms of neurologic diseases. In addition, astrocytes are responsible for the metabolic support, maintenance of ionic homeostasis, modulation of synaptic neurotransmission, maintenance of brain-blood barrier, antioxidant defense and inflammatory response. Antipsychotics are drugs used for the treatment of neuropsychiatric disorders and can modulate important astrocytic functions by mechanisms poorly understood. These drugs are subdivided as typical, such as haloperidol, chlorpromazine and fluphenazine; and atypical, risperidone, clozapine and quetiapine, depending on the brain receptors in which they act. Previous studies from our group have shown that these antipsychotics modulate glial parameters in C6 astroglial cells. In this sense, acute hippocampal slices can be used for understanding mechanisms in an integrative manner. Additionally, the particular role of astrocytes can be evaluated using astrocyte cultures. Therefore, this study evaluated the effect of the antipsychotics risperidone and haloperidol in acute hippocampal slices and in astrocyte culture from 30-days old Wistar rats to further understand the antipsychotics' mechanisms of action on neurochemical, cellular and molecular parameters. Experimental analyses of cellular viability, metabolic parameters, glutamate metabolism, Na+K+-ATPase activity, trophic factor release, inflammatory profile and mechanisms associated with glial functionality were performed. The drugs did not alter cellular viability both in slices and cultures, but there were changes in glucose and lactate metabolism caused by haloperidol. Antipsychotics also modulated the release of trophic factors, such as BDNF, GDNF and TGF-β, as well as the levels of pro- and anti-inflammatory cytokines, IL-1β, TNF-α, IL-6 and IL-10. Signaling mechanisms were also evaluated and we observed that the drugs are able to modulate pathways such as AMPK, Nrf2, HO-1 and NF-kB, and the adenosine receptor A2a. Our results indicate that haloperidol can trigger a pro-inflammatory process, with alterations in energy metabolism and involvement of cytoprotective signaling pathways, while risperidone seems to exert an anti-inflammatory effect related to the same signaling pathways. It is important to note that hippocampal astrocyte cultures reflected the results observed in slices. Thus, we conclude that the antipsychotics risperidone and haloperidol differentially modulate neurochemical, cellular and molecular parameters, particularly related to astrocytes. Such actions can be associated with the positive and negative effects of these drugs, and can be considered in the future to the choice of the therapeutic approach in neuropsychiatric disorders.

A Esclerose Multipla (EM) é uma doença neurológica, crônica, autoimune, de caráter progressivo e não tem cura. Combinação de predisposição genética juntamente com fatores tóxicos ambientais podem ser determinantes no desencadeamento dessa doença. Os intomas variam entre motores, sensoriais e cognitivos. As manifestações clínicas variam muito de um individuo para outro, sendo um dos problemas na hora do tratamento dessa doença. A encefalomielite autoimune experimental (EAE) é um modelo que simula a esclerose múltipla do tipo Remitente-Recorrente (EMRR) em roedores. Evidências sugerem que a ativação da indoleamina-2,3-dioxigenase (IDO), a enzima limitadora da velocidade da via da quinurenina (VQ), desempenha um papel crucial nas doenças relacionadas à inflamação. O presente estudo teve como objetivo investigar o envolvimento do processo inflamatório e dos componentes do VQ em um modelo de EAE em camundongos. A compreensão da influencia dessa via poderá possibilitar a delimitação de alvos terapêuticos, bem como estudar a participação da vida da quinurenina nessa doença. Para isso a EAE foi induzida por imunização subcutânea (s.c.) com 200 μl de emulsão contendo 200 μg do peptídeo da proteína de oligodendrócito de mielina (MOG35-55) e 500 μg de extrato de Mycobacterium tuberculosis. Para identificar o papel do VQ na patogênese da EAE, os camundongos receberam o inibidor IDO (INCB024360) na dose de 200 mg/kg (por via oral) por 25 dias. Demonstramos que o inibidor de IDO mitigou os sinais clínicos da EAE, em paralelo com a redução dos níveis de citocinas (cérebro: córtex pré-frontal e hipocampo, medula espinhal, baço e linfonodo) e expressão do gene da proteína adaptadora de ligação de cálcio ionizada-1 (Iba-1) na região central sistema nervoso de camundongos com EAE. Além disso, o inibidor IDO causa uma diminuição significativa nos níveis de triptofano, quinurenina e metabólitos neurotóxicos de VQ, como 3-hidroxiquinurenina (3-HK) e ácido quinolínico (QUIN) no córtex pré-frontal, hipocampo, medula espinhal, baço e linfonodo em camundongos com EAE. A expressão de mRNA e a atividade enzimática de IDO e quinurenina 3- monooxigenase (KMO) também foram reduzidas pelo inibidor de IDO. Esses achados indicam que o processo inflamatório concomitante à ativação de IDO/VQ está envolvido nos mecanismos patogênicos da EAE. A modulação do VQ é um alvo promissor para um tratamento coadjuvante em paciente com EM. Multiple sclerosis (MS) is a neurological, chronic, autoimmune disease, progressive in nature and has no cure. Combination of genetic predisposition together with toxic environmental factors can be decisive in triggering this disease. Symptoms vary between motor, sensory and cognitive. Clinical manifestations vary widely from one individual to another, being one of the problems when treating this disease. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a model that simulates remitting-recurrent multiple sclerosis (EMRR) in rodents. Active evidence that the activation of indoleamine-2,3-dioxigenase (IDO), an enzyme that limits the speed of the kynurenine pathway (KP), plays a crucial role in diseases related to inflammation. The present study aimed to investigate the involvement of the inflammatory process and the components of the KP in a model of EAE in mice. Understanding the influence of this pathway can enable the delimitation of therapeutic targets, as well as studying the participation of the life of quinurenine in this disease. For this, an EAE was induced by subcutaneous immunization (s.c.) with 200 μl of emulsion containing 200 μg of myelin oligodendrocyte protein peptide (MOG35-55) and 500 μg of Mycobacterium tuberculosis extract. To identify the role of VQ in the pathogenesis of EAE, the mice received the inhibitor IDO (INCB024360) at a dose of 200 mg/kg (orally) for 25 days. We demonstrated that the IDO inhibitor mitigated the clinical signs of EAE, in parallel with the reduction of cytokine levels (brain: prefrontal cortex and hippocampus, spinal cord, spleen and lymph node) and expression of the ionized calcium binding adapter gene (Iba-1) in the central nervous system of mice with EAE. In addition, the inhibitor IDO c’auses a decrease in levels of tryptophan, quinurenine and KP neurotoxic metabolites such as 3- hydroxyquinurenine (3-HK) and quinolinic acid (QUIN) in the prefrontal cortex, hippocampus, spinal cord, spleen and lymph node in mice with EAE. An mRNA expression. and an enzyme activity of IDO and quinurenine 3-monooxygenase (KMO) were also reduced by the IDO inhibitor. These findings indicate that the inflammatory process concomitant with the activation of IDO/VQ is related to the pathogenic mechanisms of EAE. A modulation of KP is a promising target for an adjunctive treatment in patients with MS.

Orientadora: Profa. Dra. Giselle Cerchiaro Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biotecnociência, Santo André, 2020. A proteína príon celular (PrPC) exerce inúmeras funções celulares e cognitivas, dentre elas se destacam funções como sinalizadora e auxiliar na fixação da memória, também pode se ligar aos metais divalentes, em especial com até 5 íons cobre através de seu domínio octarepetido. Estudar essa relação permite não só concluir o papel da PrPC no sistema nervoso central mediado via cobre, como inferir se o fenótipo observado em doenças priônicas é consequência de falhas na interação metal-PrPC. Este trabalho tem como objetivo o estudo da influência de quelantes metálicos de cobre sob condições de estresse oxidativo, visando avaliar o desempenho destes quelantes na viabilidade e no ciclo celular de astrócitos.Para isso, células de astrócitos de camundongos foram utilizadas do tipo selvagem (WT) e nocaute para a PrPC (KO), bem como quelantes (Neocuproína e Triethilenotetramina). Os resultados de viabilidade celular por Trypan Blue mostraram uma diminuição da viabilidade das células tratadas com CuSO4, ZnSO4, Neocuproína, TRIEN, comparadas ao controle negativo em ambas as linhagens. Além de uma diminuição de viabilidade celular da Neocuproína e um aumento da viabilidade celular do TRIEN ambos mediante condição oxidativa pelo peróxido (H2O2). No ensaio de ciclo celular via citometria de fluxo verificou-se que as células tratadas com os devidos tratamentos não apresentaram alterações no ciclo celular quando comparadas com suas respectivas células controles (células sem tratamentos). No ensaio de peroxidação lipídica observamos que células das linhagens WT e KO induz um aumento de danos lipídeos para o tratamento com CuSO4 quando comparamos os tempos de 24 e 48 h. Os resultados obtidos nos ensaios de viabilidade celular, ciclo celular e peroxidação lipídica demonstraram uma tendência de dados qualitativos. A Neocuproína pode proteger as células de alteração da homeostase do cobre causada pela condição oxidativa, segundo ensaio de viabilidade celular. No ensaio de ciclo celular houve uma diminuição da população na fase Sub G1 que indica a fragmentação do DNA, sob o tratamento com a Neocuproína. Portanto, esses dados iniciais poderão estabelecer uma base para novas pesquisas. The cellular prion protein (PrPC) performs numerous cellular and cognitive functions, among which functions such as signaling and assisting in memory fixation, can also bind to divalent metals, especially with up to 5 copper ions through its octarepeted domain. Studying this relationship allows not only to conclude the role of PrPC in the central nervous system mediated via copper, but also to infer whether the phenotype observed in prionic diseases is a consequence of failures in the metal-PrPC interaction. This work aims to study the influence of metallic copper chelators under oxidative stress conditions, aiming to evaluate the performance of these chelators in the viability and cell cycle of astrocytes. For that, cells from astrocytes of mice were used in the wild type (WT) and knockout for PrPC (KO), as well as chelators (Neocuproin and Triethylene Tetramine). The results of cell viability by Trypan Blue showed a decrease in the viability of cells treated with CuSO4, ZnSO4, Neocuproin, TRIEN, compared to the negative control in both strains. In addition to a decrease in cell viability of Neocuproin and an increase in cell viability of TRIEN both under oxidative condition by (H2O2). In the cell cycle assay via flow cytometry it was found that the cells treated with the appropriate treatments did not show changes in the cell cycle when compared to their respective control cells (cells without treatments). In the lipid peroxidation assay, we observed that cells from the WT and KO lines induce an increase in lipid damage for treatment with CuSO4 when comparing the 24 and 48 h times. The results obtained in the tests of cell viability, cell cycle and lipid peroxidation demonstrated a trend in qualitative data. Neocuproin can protect cells from changes in copper homeostasis caused by the oxidative condition, according to a cell viability test. In the cell cycle assay there was a decrease in the population in the Sub G1 phase, which indicates DNA fragmentation, under treatment with Neocuproin. Therefore, these initial data may establish a basis for further research.

A doença de Alzheimer (DA) é uma das desordens neurodegenerativas mais comuns na idade avançada). Esta condição neurológia progressiva e irreversível é caracterizada por perda cognitiva e da função ou morte de células neuronais. A maior parte dos casos de DA (90% a 95%) é de início tardio ou esporádica (DAe). As principais características fisiopatológicas são a deposição de peptídeo β-amiloide (βA) e emaranhados neurofibrilares, porém a DAe também está relacionada a outros eventos patológicos como a neuroinflamação, o polimorfismo da apolipoproteína E (ApoE), déficit colinérgico, e estresse oxidativo. A causa da DAe ainda é desconhecida, mas tem sido associada a vários fatores de risco, como o avanço da idade, o tabagismo, e as doenças crônicas graves, como diabetes mellitus, hipertensão e hipercolesterolemia. Estudos epidemiológicos sugerem uma forte ligação entre altos níveis de colesterol sanguíneo e a DAe, bem como uma baixa prevalência e um menor risco para a DAe em indivíduos que fazem uso de estatinas, fármacos usados eficazmente no controle da hipercolesterolemia. Além das estatinas, o tratamento com bisfosfonatos, usados no tratamento da osteoporose, também tem sido relacionado com menor chance de desenvolver a doença. Nesse sentido, este trabalho teve como objetivo avaliar o possível efeito neuroprotetor da sinvastatina e do alendronato sobre modelo de DAe induzido por administração intracerebroventricular (ICV) de estreptozotocina (STZ) em ratos Wistar adultos. A administração oral de sinvastatina e alendronato reverteram o déficit cognitivo induzido pela infusão ICV-STZ, avaliado pelo teste de reconhecimento de objetos; bem como alterações metabólicas cerebrais, com a diminuição da captação de glicose em fatias hipocampais; o aumento de marcadores de reatividade de astrócitos, analisado pelo conteúdo hipocampal de GFAP, a redução da capacidade redox das células hipocampais analisados pelo conteúdo de glutationa reduzida (GSH) e a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs); e o conteúdo de colesterol de membrana no hipocampo. Portanto, a sinvastatina e alendronato demostraram um efeito neuroprotetor em modelo animal, reforçando o potencial terapêuticos desses dois fármacos na DAe. Alzheimer's disease (AD) is one of the most common neurodegenerative diseases in old age. This progressive and irreversible neurological condition is characterized by cognitive loss and neuronal cell function or death. Most cases of AD (90% to 95%) are late-onset or sporadic (SAD). The main pathophysiological features are β-amyloid peptide (βA) and neurofibrillary deposition, but SAD is also using other pathological events such as neuroinfection, apolipoprotein E polymorphism (ApoE), cholinergic deficit and oxidative stress. The cause of SAD is still unknown, but it has been associated with several risk factors such as advancing age, smoking and serious chronic diseases such as diabetes mellitus, hypertension, and hypercholesterolemia. Epidemiological studies suggest a strong link between high blood cholesterol and SAD, as well as a low prevalence and lower risk for SAD in individuals who use statins, drugs that are effectively used to control hypercholesterolemia. In addition to statins, bisphosphonate used to treat osteoporosis was also related to the lower chance of developing a SDA. In this sense, the objective of this study was to evaluate the possible neuroprotective effects of simvastatin and alendronate in a model of SDA in adult Wistar rats induced by streptozotocin intracerebroventricular. Oral administration of simvastatin and alendronate reversed cognitive impairment in ICV-STZ model, assessed by the object recognition test; as well as cerebral metabolic alterations, with decreased glucose uptake in hippocampal slices; increased astrocyte reactivity markers analyzed by hippocampal content of GFAP, a reduction in redox capacity of hippocampal cells analyzed by controlled glutathione content (GSH) and a production of reactive oxygen species (ROS); and the membrane cholesterol content in the hippocampus. Therefore, simvastatin and alendronate demonstrated a neuroprotective effect in the animal model, reinforcing the therapeutic potential of these two drugs in SDA.

Submitted by Celso Magalhaes (celsomagalhaes@ufrrj.br) on 2021-05-21T14:43:03Z No. of bitstreams: 1 2017 - Raquel do Nascimento de Souza.pdf: 3278183 bytes, checksum: 6a7686883b9353e1554436c0d371a3e8 (MD5) Made available in DSpace on 2021-05-21T14:43:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017 - Raquel do Nascimento de Souza.pdf: 3278183 bytes, checksum: 6a7686883b9353e1554436c0d371a3e8 (MD5) Previous issue date: 2017-05-17 The aim of the present study was to investigate the cell types and physiological mechanisms related to the use of apipuncture in the model of moderate spinal cord injury (SCI) by compression in Wistar rats. For induction of SCI, a fogarty embolectomy catheter was inflated with 15?L of distilled water in the extradural space, between the T8 and T9 vertebrae, for 5 minutes. Initially, it was evaluated the improvement of the locomotor capacity and coordination by locomotor rating scale (BBB test) and the grid walkway in the following groups: 1- Bee Venom Group (VB) at the acupuncture point - application of BV at the dose of 0.08 mg / kg diluted in 20?L of saline in acupoints (E36 - Zunsanli + VG3 - Yaoyangquan); 2-VB group at no point (VB-NP) - application of VB in a region that was not an acupuncture point at the same dose as the VB-E36 + VG3 group; 3 - Control Group (CTL-SCI) - group with SCI that did not undergo any type of treatment. In this first experimental trial, it was detected that the locomotor improvement was actually associated with the stimulation of the E36 + VG3 acupoints by the VB, since the VB-NP group and the CTL-SCI group did not show significant improvement of the partial locomotor capacity as the VB-E36 + VG3 group. Our results indicated that the improvement of the locomotor capacity was correlated to the significant reduction of spinal cord tissue loss promoted by apipuncture. The next step of the research investigated cell types, neuroinflammatory and apoptotic factors, and survival of neurons and oligodendrocytes. The apipuncture reduced the activation of microglia / macrophages in the 1st, 3rd and 5th days, whereas, the activation of astrocytes was only influenced by apipuncture on the 3rd day. The apipuncture also had an influence on microglia / macrophage polarization associated with pro (M1) and anti-inflammatory (M2) phenotypes, in which iNOS mRNA expression - marker of the M1 phenotype was reduced in the 3rd and 5th Day and Arginase-1 and TGF-? (M2 markers) mRNA expression were reduced only on the 5th day. The reduction of COX-2 (inflammatory factor) mRNA expression influenced by apipuncture occurred on day 1 and 5, while the reduction of NF-kB occurred only on day 3. The apipuncture showed no influence over caspase-3 mRNA expression in any of the analysed times, but promoted a significant increase in the expression of the anti-apoptotic protein BCL-2 on the 5th day. Finally, apipuncture influenced the preservation of neurons and oligodendrocytes in spinal cord tissue on the 7th day after SCI. Thus, the set of results suggests that apipuncture, applied in E36 + VG3 acupoints, was able to promote partial recovery of locomotion. This locomotor improvement may be associated with an influence of apipuncture on the reduction of astrocyte activation, modulation on microglial / macrophage polarization, reduction of neuroinflammation through the increase of anti-apoptotic protein content, BCL-2, and neuroprotection of neurons and oligodendrocytes in spinal cord tissue after SCI. O objetivo do presente estudo foi investigar os tipos celulares e os mecanismos fisiol?gicos envolvidos com a apipuntura no modelo de les?o medular moderada (SCI) por compress?o. Para indu??o da SCI, um cateter fogarty de embolectomia foi inflado com 15?L de ?gua destilada no espa?o extradural, entre as v?rtebras T8 e T9, por 5 minutos em ratos Wistar. Inicialmente, avaliou se a melhora da capacidade e da coordena??o locomotora pelo teste de avalia??o da capacidade locomotora (teste BBB) e da passarela gradeada nos grupos: 1- Grupo Veneno de Abelha (VB) no ponto de acupuntura - aplica??o do VB na dose de 0,08 mg/kg dilu?do em 20?L de salina nos acupontos (E36 - Zunsanli + VG3 - Yaoyangquan); 2- Grupo VB em n?o ponto (VB-NP) ? aplica??o do VB em regi?o que n?o fosse ponto de acupuntura na mesma dose que o grupo VB-E36+VG3; 3- Grupo Controle (CTL-SCI) ? grupo com SCI que n?o foi submetido a nenhum tipo de tratamento. Nesse primeiro ensaio experimental, detectou-se que a melhora locomotora estava realmente associada ? estimula??o dos acupontos E36+VG3 pelo VB, j? que o grupo VB-NP e o grupo CTL-SCI n?o apresentaram melhora significativa da capacidade locomotora parcial como o grupo VB-E36+VG3. Nossos resultados indicaram que a melhora da capacidade locomotora estava correlacionada ? significativa redu??o da perda de tecido medular espinal promovido pela apipuntura. A pr?xima etapa da pesquisa investigou os tipos celulares, os fatores neuroinflamat?rios, os fatores apopt?ticos e a sobreviv?ncia de neur?nios e de oligodendr?citos. A apipuntura reduziu a ativa??o de micr?glia/macr?fagos no 1?, 3? e 5? dias, enquanto, a ativa??o de astr?citos s? foi influenciada pela apipuntura no 3? dia. A apipuntura tamb?m apresentou influencia sobre a polariza??o de micr?glia/macr?fagos associados aos fen?tipos pro (M1) e anti-inflamat?rios (M2), no qual, a express?o de RNAm da iNOS, - marcador do fen?tipo M1, foi reduzido no 3? e 5? dia e as express?es de RNAm da Arginase-1 e TGF-?, - marcadores M2, foram reduzidas apenas no 5? dia. A redu??o da express?o de RNAm do fator inflamat?rio - COX-2, influenciado pela apipuntura ocorreu no 1? e 5?dia, enquanto, a redu??o do NF-kB ocorreu somente no 3? dia . A apipuntura n?o demonstrou influencia sobre a express?o de RNAm da caspase-3 em nenhum dos tempos estudados, mas promoveu aumento significativo da express?o da prote?na antiapopt?tica, - o BCL-2, no 5? dia. Por fim, a apipuntura influenciou a preserva??o de neur?nios e oligodendr?citos no tecido medular espinal no 7? dia ap?s a SCI. Dessa forma, o conjunto de resultados sugere que a apipuntura, aplicada nos acupontos E36+VG3, foi capaz de promover recupera??o parcial da locomo??o e os resultados indicaram que esta melhora locomotora pode estar associada a uma influencia da apipuntura sobre a redu??o da ativa??o de astr?citos, modula??o sobre a polariza??o de micr?glia/macr?fagos, sobre a redu??o da neuroinflama??o no aumento do conte?do da prote?na antiapopt?tica, o BCL-2, e na neuroprote??o de neur?nios e oligodendr?citos no tecido medular espinal ap?s a SCI

Submitted by Boris Flegr (boris@uerj.br) on 2021-01-06T20:58:42Z No. of bitstreams: 1 Luiza Spiegel de Almeida Dissertacao completa.pdf: 3054923 bytes, checksum: 70d6a37fb7681891fe4f8eb93767fc3c (MD5) Made available in DSpace on 2021-01-06T20:58:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Luiza Spiegel de Almeida Dissertacao completa.pdf: 3054923 bytes, checksum: 70d6a37fb7681891fe4f8eb93767fc3c (MD5) Previous issue date: 2017-05-17 Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico Hypoxia-ischemia (HI) is characterized by transient or permanent interruption of the blood flow and oxygen supply. Children affected by HI present hypomyelination, astrogliosis and deficiency in cortical and motor development and increased sensitivity to pain. Juvenile and adults with cerebral palsy have frequent complaints of chronic pain. Astrocytes among their multiple neural functions are involved in the modulation of pain signalling and are altered after HI events. The enzyme neuronal Nitric Oxide Synthase (nNOS) is linked to brain damage, cell death, cognitive deficits and changes in nociception. The periaquedutal gray matter (PAG) exerts functions in the descending inhibitory pain pathway. Animal models of HI which the uterine arteries of pregnant rats are clamped have astrogliosis, oligodendroglial death, axonal rupture, and decreased expression of nNOS in the hippocampus. In this work, we verified the sensitivity to touch and the response to acute and chronic pain, besides verifying nNOS and Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) immunostaining in the PAG of young and adult male rats submitted to a prenatal systemic HI model. At 18 days of gestation, female rats had their uterine horns exposed and the uterine arteries clamped for 45 minutes. In SHAM operated rats, the same procedure was done, except for obstruction of the arteries. After the procedure, gestation continued normally and the pups were born at term. 30 or 90 days after birth, male rats were submitted to the behavioural tests of von Frey and formalin 2.5% or histological processing to perform immunohistochemistry for nNOS and GFAP. We did not observed differences in the touch sensitivity between the groups in both ages. We did not observe differences between the groups in the number of contractions observed in young animals, but the HI group showed an increase in time licking the injected paw, being significant in the 30-35min and 35-40min periods. Adult animals showed an increase in the number of contractions throughout the test period, being significant in the time of 15 and 45 minutes after the injection, we also observed the increase in time licking the paw, being significant in the period of 5-10min. We did not observe quantitative differences in nNOS and GFAP distribution in young animals. However, the number of nNOS+ cells was reduced in HI animals in the dlPAG and vlPAG subregions at the approximate distance of -7.80 mm from bregma. The immunostaining of GFAP is increased in those animals in the dlPAG and dmPAG subregions at the approximate distance of -5.80 mm from bregma. Our results demonstrate for the first time that the animals submitted to prenatal HI presents hyperalgesia throughout the formalin test period, but without alterations in the touch sensitivity. We have also shown that there are morphofunctional changes in PAG of these animals, which may be related to hyperalgesia also observed in our study. A hipóxia-isquemia (HI) é caracterizada pela interrupção momentânea ou permanente do fluxo sanguíneo e do aporte de oxigênio, sendo a principal causa de lesão cerebral em crianças. Crianças afetadas por HI apresentam hipomielinização, astrogliose e deficiência no desenvolvimento cortical e motor e maior sensibilidade à dor. Jovens e adultos que apresentam paralisia cerebral possuem como queixa frequente a dor crônica. Astrócitos, dentre suas múltiplas funções neurais, estão envolvidos na modulação da sinalização da dor e apresentam-se alterados após eventos hipóxico-isquemicos. A enzima óxido nítrico sintase neuronal (nNOS), produtora de óxido nítrico (NO), está ligada a danos cerebrais, morte celular, déficits cognitivos e alterações na nocicepção. A substância cinzenta periaquedutal (PAG) participa da modulação nas vias descendentes inibitórias da dor, promovendo a analgesia. Modelos animais de HI, onde as artérias uterinas de ratas grávidas são clampeadas, apresentam astrogliose, morte da oligodendroglia, ruptura axonal e diminuição da distribuição de nNOS no hipocampo. Neste trabalho buscamos verificar a sensibilidade ao toque e a resposta à dor aguda e crônica, além de avaliar a distribuição da enzima nNOS e da proteína gliar fibrilar ácida (GFAP) na PAG de ratos adultos e jovens submetidos a um modelo de HI sistêmica pré-natal. Ao completarem 18 dias de gestação, ratas fêmeas tiveram seus cornos uterinos expostos e as artérias uterinas obstruídas durante 45 minutos. Nas ratas controle SHAM, o mesmo foi feito, com exceção da obstrução das artérias. Após o procedimento, a gestação continuou normalmente e os filhotes nasceram a termo. 30 ou 90 dias após o nascimento, ratos machos foram submetidos aos testes comportamentais de von Frey e formalina a 2,5% ou ao processamento histológico para realização de imunohistoquímica para nNOS e GFAP. Não observamos diferenças na sensibilidade ao toque entre os grupos em ambas as idades. Não observamos diferenças entre os grupos no número de contrações observadas nos animais jovens, porém o grupo HI apresentou aumento no tempo lambendo a pata injetada, sendo significativo nos períodos de 30-35min e 35-40min. Os animais adultos apresentaram aumento no número de contrações por todo o período do teste, sendo significativo nos tempos de 15 e 45min após a injeção. Também observamos o aumento do tempo lambendo a pata, sendo significativo no período de 5-10min. Não observamos diferenças quantitativas na expressão de nNOS e GFAP nos animais jovens, porém o número de células nNOS+ foi reduzido nos animais HI adultos nas sub-regiões dlPAG e vlPAG nas distâncias aproximadas de -7,80mm do bregma e a distribuição de GFAP está aumentada nesses mesmos animais nas sub-regiões dlPAG e dmPAG nas distâncias aproximadas de -5,80mm do bregma. Nossos resultados demonstram pela primeira vez que os animais submetidos a HI pré-natal apresentam hiperalgesia por todo o período de teste da formalina, mas sem alterações na sensibilidade ao toque. Também demonstramos que existem alterações morfofuncionais da PAG destes animais, as quais podem estar relacionadas a hiperalgesia também observada em nosso trabalho.

A epilepsia do lobo temporal (ELT) é a um dos casos mais frequente epilepsia em humanos e de maior refratariedade nos pacientes. A maioria dos fármacos antiepilépticos são moduladores da atividade neuronal e atuam sobre canais iônicos do receptor GABAA. Estudos vêm demonstrando o papel das células gliais e da neuroinflamação na epileptogênese e a modulação desta resposta pode ser um alvo potencial para drogas adjuvantes aos fármacos anti-epilépticos. Astrócitos são células gliais participantes da sinapse tripartite, moduladores da atividade neuronal. Os astrócitos são capazes de promover a homeostase de íons e de neurotransmissores, são responsáveis pelo metabolismo energético e da produção de fatores neurotróficos, glutationa, glutamina, S100B e citocinas. Neste trabalho, induzimos status epilepticus (SE) em ratos jovens (PN28) através do modelo lítio-pilocarpina que mimetiza alterações neuronais, bioquímicas e morfológicas similares à ELT em humanos. Os animais foram divididos nos tempos 1, 14 e 56 dias após a indução de status epilepticus (SE). Estes períodos são caracterizados respectivamente como a fase aguda, latente e crônica da epilepsia. Inicialmente, analisamos as mudanças neuroquímicas e astrocitárias ao longo do tempo. Foi observada neuroinflamação inicial e transitória que promove morte neuronal e mudanças ao longo do tempo de astrogliose e disfunção astrocitária. Também foi observado que a proteína S100B, proteína ligante de cálcio, predominantemente astrocitária, pode ser considerado um marcador da disfunção neuronal e astrocitária promovida neste modelo de epilepsia. Em seguida, demonstramos que a modulação da secreção de S100B pelo anti-inflamatório dexametasona um dia após indução de SE reverte a neuroinflamação, astrogliose e disfunção astrocitária à curto e à longo prazo. Por conseguinte, observamos que a modulação do receptor GABAA através de agonistas e antagonistas GABAérgicos altera a secreção de S100B em fatias hipocampais agudas e em cultura de astrócitos. Portanto, pode-se sugerir que as alterações astrogliais e a neuroinflamação dependentes do tempo podem estar ligadas à excitabilidade neuronal e/ou à morte neuronal em ratos jovens em modelo de epilepsia; que a proteína S100B pode ser considerada um marcador deste modelo de epilepsia e que a modulação da sua secreção pode ser um possível alvo farmacológico no tratamento da epilepsia. Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most frequent type of epilepsy in humans and is more associated to refractory to anti-epileptic drugs (AED) in patients. The most AEDs are modulators of neuronal activity and act on ion channels, such as GABAA receptor. Studies have been demonstrating the role of glial cells and neuroinflammation in epileptogenesis. The modulation of this response may be a potential target for adjunctive drugs to anti-epileptic drugs. Astrocytes are glial cells that participated in the tripartite synapse and modulated neuronal activity. Astrocytes are able to promote homeostasis of ions and neurotransmitters, are responsible for energy metabolism and the production of neurotrophic factors, glutathione, glutamine, S100B and cytokines. In this work, we induced status epilepticus (SE) in young rats (PN28) through the lithiumpilocarpine model that mimics neuronal, biochemical and morphological alterations similar to ELT in humans. The animals were divided at times 1, 14 and 56 days after the induction of SE. These periods are characterized respectively as the acute, latent and chronic phase of epilepsy. Initially, we analyzed neurochemical and astrocytic changes over time. Initial and transient neuroinflammation was observed and promoted over time neuronal death, astrogliosis and astrocytic dysfunction. It has also been observed that the protein S100B, a calcium-binding protein, predominantly astrocytic, can be considered a marker of neuronal and astrocytic dysfunction promoted by this model of epilepsy. Next, we demonstrate that the modulation of S100B secretion by the antiinflammatory dexamethasone one day after SE induction reverses neuroinflammation, astrogliosis and astrocytic dysfunction in the acute and chronic time. Therefore, we analyzed that modulation of the GABAA receptor through GABAergics agonists and antagonists alters the secretion of S100B in acute hippocampal slices and in astrocyte culture. Therefore, it may be suggested that astroglial changes and time dependent neuroinflammation may be related to neuronal excitability and/or neuronal death in young rats in this epilepsy model; that S100B protein can be considered a marker of this epilepsy model and that the modulation of its secretion may be a possible pharmacological target in the treatment of epilepsy.

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico O consumo de dietas hiperlipídicas, ricas em ácidos graxos saturados, induz o ganho de peso corporal e a expressão de citocinas pro inflamatórias que podem ativar vias de apoptose em neurônios que controlam fome e saciedade no hipotálamo. A atividade física e a mudança de hábito alimentar representam alguns tratamentos para a obesidade. Assim, o foco do trabalho foi estudar a resposta corporal de animais submetidos à dieta hiperlipídica e treinamento físico, com exercício de natação, e analisar a reatividade glial, densidade sinaptica, morte celular e perfil de expressão de citocinas no hipotálamo. Após 16 semanas de tratamento com dietas, sendo as 8 últimas com atividade física, os animais tiveram o hipotálamo extraído para análise dos núcleos arqueado, paraventricular e lateral. Os grupos que ingeriram dieta hiperlipídica (HFD) mostraram aumento de peso corporal, hipofagia, maior adiposidade, maior taxa glicêmica, juntamente, com maior reatividade astroglial, menor densidade sináptica, maior TNF e IL-6, e, maior expressão das proteínas caspases 3 e 7 clivadas, em relação aos grupos que foram alimentados com dieta padrão (ND). O grupo HFD que praticou natação com carga de 80% da carga máxima atingida no teste progressivo de esforço foi o que mostrou melhores resultados para os dados fisiológicos e para as dosagens de citocinas e caspases, bem como, mostraram menor reatividade astroglial e maior densidade sináptica, indicando um papel protetor do exercício físico praticado nesse trabalho. The consumption of diets rich in saturated fatty acids induces a gain in body weight and the expression of cytokines pro-inflammatory that can enable the process of apoptosis in neurons that control food intake and satiety in the hypothalamus. Physical activity and the change of dietary habits are the treatments for obesity. Thus, the focus of the study was to evaluate the response of animals submitted to fat diet and physical training, with the exercise of swimming, and analyze the glial reactivity, synapse density, cell death and profile of expression of cytokines in the hypothalamus. After 16 weeks of treatment with diets, being the 8 latest with physical activity, the animals had the hypothalamus extracted for analysis of arcuate, paraventricular and lateral nuclei. The groups that ingested the high fat diet (HFD) showed increased body weight, hypofagia, greater adiposity, increased glucose, along with greater astroglial reactivity, lower synaptic density, greater TNF and IL-6, and, greater expression of s 3 and 7 caspases in relation to the groups that were fed with standard diet (ND). The HFD group that practiced swimming with a load of 80% of the maximum load reached in the progressive effort test showed better results for physiological data and for the determination of cytokine and caspases levels, as well as, showed lower astroglial reactivity and higher synaptic density, indicating a protective role of physical exercise practiced in this work. Dissertação (Mestrado)

The central Ang II (ANG II) induces neuroendocrine, behavioral and cardiovascular responses. Knowing that AT1 and AT2 receptors for ANG II are located in neurons and glial cells in the lamina terminalis (LT), our hypothesis is that neuroendocrine, behavioral and cardiorespiratory responses induced by central ANG II are mediated by glia of lamina terminalis. Our aim was to evaluate the participation of the glia of lamina terminalis in the release of plasma vasopressin (AVP) and oxytocin (OT), water and sodium (1.5%) intake and cardiorespiratory responses induced by ANG II into lateral ventricle (LV). We used Wistar rats [(260-280g) Ceua/Cbiotec 133/2015]. We perform microinjections of ANG II diluted in sterile saline solution (0.9% saline) with final concentration of 25 ou 50 ng/0.5 μl and of Fluorocitrate [(FCt) inhibitor of glial activity] with final concentration of 21 ou 41 μg/0.5 μl or sterile saline 0.9% (500nl) into VL of the unanesthetized rats. Plasma was collected for analysis of AVP and OT concentration by radioimmunoassay. The analysis of the water and sodium (1.5%) intake were done after adaptation of animals to the metabolic cage. In another group of animals, the femoral artery was catheterizedfor the records of baseline blood pressure (BP, mmHg) and heart rate (HR, bpm). For the record the respiratory rate (cpm) the animals were placed in a plethysmographic chamber. The results showed that ANG II into VL promoted an increase in the AVP [2.3 ± 0.4 vs. 1.3 ± 0.1 pg/ml, p=0.039 (n=6)] and OT [3.9 ± 0.8 vs. 1.4 ± 0.2 pg/ml, p=0.025 (n=6)] compared to the control saline (0.9%). FCt into VL increased plasma OT (2.6 ± 0.4 vs. 1.4 ± 0.2 pg/ml, p=0.024 (n=6)], but did not change the plasma AVP (0.99 ± 0.1 vs. 1.3 ± 0.1 pg/ml, p=0.78 (n=6)]. Prior microinjection of FCt attenuated ANG II-induced AVP (1.3 ± 0.2 vs 2.3 ± 0.4 pg/ml, p=0.05 (n=6)], but no OT (2.9 ± 0.4 vs. 3.9 ± 0.8 pg/ml, p=0.31 (n=5-6).] The plasma release ANG II increased the cumulative water (5.3 ± 1.6 vs. 1.2 ± 0,4 ml/4 h, p=0.02 (n=4-6)] and sodium (1.5 %) intake [16 ± 1.1 vs. 2.5 ± 0.7 ml/4 h, p=0.0001 (n=5-6)]. The FCt did not change the cumulative water [1.3 ± 0.3 vs. 1.2 ± 0.4 ml/4 h, p=0.79 (n=5-6)], but decreased sodium (1.5 %) intake [0.83 ± 0.3 vs. 2.5 ± 0.7 ml/4 h, p=0.04 (n=6)]. Prior microinjection of FCt decrease the sodium intake [2.7 ± 0.3 vs. 16 ± 1.1 ml/4 h, p=0.0001 (n=5-7)], but did not change the water intake induced by ANG II [8 ± 2.4 vs. 5.3 ± 1.6 ml/4 h, p=0.44 (n=4-7)]. ANG II into VL promoted increase in baseline MAP [137.8 ± 4.9 vs. 115.1 ± 3.5 mmHg, p=0.002 (n=7)]. The pressor response promoted by ANG II was significantly reduced after 5 minutes by prior microinjection of FCt [Δ12.6 ± 2.1 vs. Δ22.6 ± 1.9 mmHg, p=0.004 (n=7)]. Did not change by ANG II [311.7 ± 37.9 vs. 352.4 ± 15 bpm, p=0.10 (n=7)] or FCt [310.4 ± 16.7 vs. 341.3 ± 14 bpm, p=0.18 (n=7)] in HR (bpm) baseline. The ANG II did not changes in respiratory rate (FR) [109.6 ± 5.9 vs. 105.9 ± 4.6 cpm, p=0.63 (n=6)], tidal volume (VC) [8.6 ± 0.7 vs. 7.8 ± 0.7 mL.Kg-1, p=0.43 (n=6)] or expiratory volume in the first minute (VM) [950.7 ± 98.2 vs. 873.5 ± 86.7 mL.Kg-1.min-1, p=0.57 (n=6)]. The microinjection of FCt promoted significant decrease in basal FR [77.7 ± 3.8 vs. 105.9 ± 4.6 cpm, p=0.002 (n=6)], but did not change in VC [9.7 ± 0.6 vs. 7.8 ± 0.7 mL.Kg-1, p=0.66 (n=6)] and VC [827.2 ± 57.3 vs. 873.5 ± 86.7 mL.Kg- 1.min-1, p=0.66 (n=6)]. Our results suggest that the hypothalamic glial cells: 1) participate of plasma OT release and sodium intake; 2) modulate ANG II-induced AVP plasma release, sodium intake and pressor response; 3) furthermore, modulate the basal respiratory rate in unanesthetized rats. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES A Angiotensina II (ANG II) intracerebroventricular (icv) induz respostas neuroendócrinas, comportamentais e cardiovasculares. Sabendo que receptores AT1 e AT2 para ANG II estão localizados em neurônios e células da glia da lâmina terminal (LT), nossa hipótese é que as respostas neuroendócrinas, comportamentais e cardiorespiratórias induzidas pela ANG II central são mediadas, em parte, pela glia da lâmina terminal. O objetivo do presente estudo foi avaliar a participação da glia da lâmina terminal na liberação de Vasopressina (AVP) e Ocitocina (OT) plasmáticas, ingestão de água e sódio (1,5 %) e nas respostas cardio-respiratórias induzidas pela microinjeção de ANG II no ventrículo lateral (VL) de ratos não anestesiados. Utilizamos ratos Wistar [(260-280g) Ceua/Cbiotec nº133/2015]. Realizamos microinjeções de ANG II diluída em solução fisiológica estéril (salina 0,9%) com concentração final de 25 e 50 ng/0.5 μl e Fluorocitrato [(FCt) um inibidor da atividade da glia] diluído com concentração final de 21 ou 41 μg/0.5 μl, ou de salina estéril 0,9% (500 nL) no VL de ratos não anestesiados. O plasma foi coletado para análise da concentração AVP e OT plasmáticas, pela técnica de radioimunoensaio. A análise da ingestão de água e sódio (1,5%) foi feita após a adaptação dos animais à gaiola metabólica. Em outro grupo de animais, a artéria femoral foi cateterizada para os registros da pressão arterial (PA, mmHg) e frequência cardíaca (FC, bpm) basais. Para o registro da frequência respiratória (cpm) os animais foram colocados em uma câmera pletismográfica. Os resultados mostraram que a ANG II no VL promoveu aumento na concentração de AVP [2,3 ± 0,4 vs. 1,3 ± 0,1 pg/ml, p=0,039 (n=6)] e OT plasmáticas [3,9 ± 0,8 vs. 1,4 ± 0,2 pg/ml, p=0,025 (n=6)] comparada ao controle salina 0,9%. O FCt microinjetado no VL promoveu aumento na liberação de OT plasmática (2,6 ± 0,4 vs. 1,4 ± 0,2 pg/ml, p=0,024 (n=6)], mas não alterou a concentração plasmática de AVP (0,99 ± 0,1 vs. 1,3 ± 0,1 pg/ml, p=0,78 (n=6)]. A prévia microinjeção de FCt atenuou a resposta à ANG II de aumento na concentração de AVP (1,3 ± 0,2 vs 2,3 ± 0,4 pg/ml, p=0,05 (n=6)], mas não de OT plasmática (2,9 ± 0,4 vs. 3,9 ± 0,8 pg/ml, p=0,31 (n=5-6)]. A ANG II no VL promoveu aumento na ingestão cumulativa de água (5,3 ± 1,6 vs. 1,2 ± 0,4 ml/4 h, p=0,02 (n=4-6)] e de sódio (1,5 %) [16 ± 1,1 vs. 2,5 ± 0,7 ml/4 h, p=0,0001 (n=5-6)]. O FCt não promoveu alterações na ingestão cumulativa de água [1,3 ± 0,3 vs. 1,2 ± 0,4 ml/4 h, p=0,79 (n=5-6)], mas reduziu a ingestão cumulativa de sódio (1,5%)[0,83 ± 0,3 vs. 2,5 ±0,7 ml/4 h, p=0,04 (n=6)]. A prévia microinjeção de FCt inibiu a resposta de ingestão de sódio (1,5%) [2,7 ± 0,3 vs. 16 ± 1,1 ml/4 h, p=0,0001 (n=5-7)], mas não alterou a ingestão de água induzida pela ANG II no VL [8 ± 2,4 vs. 5,3 ± 1,6 ml/4 h, p=0,44 (n=4- 7)]. A ANG II no VL promoveu aumento na PAM basal dos ratos [137,8 ± 4,9 vs. 115,1 ± 3,5 mmHg, p=0,002 (n=7)]. A resposta pressora promovida pela ANG II foi significativamente reduzida pela prévia microinjeção do FCt no VL após 5 minutos [Δ12,6 ± 2,1 vs. Δ22,6 ± 1,9 mmHg, p=0,004 (n=7)]. Não foram observadas alterações promovidas pela ANG II [311,7 ± 37,9 vs. 352,4 ± 15 bpm, p=0,10 (n=7)] ou FCt [310,4 ± 16,7 vs. 341,3 ± 14 bpm, p=0,18 (n=7)] na FC basal (bpm) dos animais. A microinjeção de ANG II não promoveu alterações significativas na frequência respiratória basal {FR [109,6 ± 5,9 vs. 105,9 ± 4,6 cpm, p=0,63 (n=6)]}, no volume corrente {VC [8,6 ± 0,7 vs. 7,8 ± 0,7 mL.Kg-1, p=0,43 (n=6)]} ou no volume/min. {VM [950,7 ± 98,2 vs. 873,5 ± 86,7 mL.Kg-1.min-1, p=0,57 (n=6)]}. A microinjeção de FCt promoveu diminuição significativa na frequência respiratória basal {FR [77,7 ± 3,8 vs. 105,9 ± 4,6 cpm, p=0,002 (n=6)]}, sem alterações significativas no VC [9,7 ± 0,6 vs. 7,8 ± 0,7 mL.Kg-1, p=0,66 (n=6)] e no VM basais [827,2 ± 57,3 vs. 873,5 ± 86,7 mL.Kg1.min1, p=0,66 (n=6)]. Nossos resultados sugerem que as células da glia hipotalâmicas: a) participam da modulação tônica da liberação de OT plasmática e da ingestão de sódio; b) modulam a resposta angiotensinérgica central para a liberação de vasopressina plasmática, indução da ingestão de sódio e de resposta pressora. c) além disso, participam da modulação da frequência respiratória basal em ratos não anestesiados.

Submitted by GESTTER WILLIAN LATTARI TESSARIN null (gestter@ibb.unesp.br) on 2016-05-30T16:08:19Z No. of bitstreams: 1 dissertação de mestrado.pdf: 2479559 bytes, checksum: e2d5280c14d3836364ea31e8d2f02d67 (MD5) Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-05-31T16:13:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 tessarin_gwl_me_bot_par.pdf: 1166089 bytes, checksum: 8b7ac3f2f9386e8cd43e648c1443ac20 (MD5) Made available in DSpace on 2016-05-31T16:13:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tessarin_gwl_me_bot_par.pdf: 1166089 bytes, checksum: 8b7ac3f2f9386e8cd43e648c1443ac20 (MD5) Previous issue date: 2016-02-22 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) As teneurinas (TENs) pertencem a uma família de proteínas transmembrana do tipo II constituída por quatro membros homólogos, estruturalmente conservados entre as espécies. Essas proteínas estão presentes no SNC, principalmente durante a neurogênese, colaborando na estabilização dos circuitos neurais. Estudos neuroanatômicos mostraram que as TENs apresentam distribuição similar em peixes, aves e roedores durante o desenvolvimento e maturação do SNC, permanecendo em algumas regiões em animais adultos. A participação das TENs durante reparação tecidual tem sido pobremente explorada; entretanto a presença neurestina (uma proteína homóloga a Ten-2) foi notada em neurônios do bulbo olfatório de ratos adultos, após indução de lesão química na mucosa olfatória. O propósito do presente estudo foi verificar possíveis alterações na Ten-2 após indução de lesão mecânica no córtex cerebral de ratos adultos empregando técnicas de imuno-histoquímica (IHQ) e reação em cadeia da polimerase (PCR convencional). Para isso, ratos machos adultos (Rattus norvegicus, n=32) foram divididos em grupo controle (n=4, IHQ; n=4, PCR), grupo lesão 12 horas pós-operatório (n=4, IHQ; n=4, PCR), grupo lesão 24 horas (n=4, IHQ; n=4, PCR) e grupo lesão 48 horas (n=4, IHQ; n=4, PCR). A lesão mecânica foi realizada usando agulha hipodérmica de metal (0,8mm de diâmetro) acoplada ao aparelho estereotáxico (coordenadas AP: +10,21 mm; DV: -2,5 mm e ML: +1,5 mm). Os animais do grupo controle não foram submetidos aos processos cirúrgicos. Para as análises imuno-histoquímicas, os animais foram submetidos à perfusão transcardíaca usando paraformaldeído tamponado a 4% e os cortes histológicos foram obtidos utilizando micrótomo de congelação. Os cortes histológicos foram submetidos às técnicas de imunofluorescência ou imunoperoxidase indiretas usando anticorpos para identificar proteína ácida fibrilar glial (GFAP) e Ten-2, seguido por análises em microscopias de campo claro ou confocal. Para análises de expressão gênica, os animais foram sacrificados, o córtex cerebral foi imediatamente coletado para extração e purificação do RNA total. O RNA foi usado para amplificar a Ten-2 e o neurofilamento de cadeia leve (Nefl, para normalização) através de PCR convencional e as análises semi-quantitativas foram realizadas pela mensuração da densidade óptica das bandas em gel de agarose. Os principais resultados indicaram um aumento significante em astrócitos imunorreativos para a Ten-2 em todos os grupos lesões, especialmente no grupo lesão 48 horas (p

High-fat diets induce the formation of inflammatory signals in the hypothalamus which reduces their ability to respond to the hormones leptin and insulin, involved with the control of satiety and food intake. The hypothalamus contains a large amount of glial cells highlighting the astrocytes, which are incorporated in heterogeneous groups of neurons that participate in the control circuit of energy homeostasis, additionally, they are involved in various processes, including the neuroinflammation. In this sense, the present study aimed to investigate the role of hypothalamic astrocyte responses in front of excess fatty acids and the interaction of these cells with neurons of the hypothalamus. For that, we used primary cell cultures of hypothalamic astrocytes and primary cultures of hypothalamic neurons. The medium removed from astrocyte cultures treated with fatty acid (estereato or palmitate) or LPS (positive control) was used on neuronal cultures for further in vitro study of synaptogenesis, also, measurement of cytokines present in conditioned medium was performed with the CBA kit mouse-Th1 /Th2/Th17 by flow cytometry with the aim of analyzing the profile of inflammatory response considering the different treatments. In front of this result, we have seen that the treatment with fatty acid promoted a profile of Th2 response (anti-inflammatory), especially when compared to Th1 profile (pro-inflammatory) of the LPS control. After the treatment, the total RNA of astrocytes was extracted for the sequencing of transcripts by RNA-Seq. Through the analysis of the genes differentially expressed between the groups, it was observed that treatment with fatty acid induced an inflammatory response, however, with lesser intensity in relation to treatment with LPS, and, at the same time, some genes related to neuroprotection were more expressed in astrocytes treated with fatty acid, collaborating with the data of the CBA. The culture of neuron was standardized in our laboratory and, subsequently, treated with conditioned medium. By immunostaining, we observed that treatment with the conditioned medium in astrocytes treated with fatty acids reduced the total synaptic density, primarily affecting excitatory synapses, on the other hand, the number of neurons was similar between treatments, however, with the presence of a reduced number of pyknotic nuclei after the treatment with fatty acids. These results suggest an active role of astrocyte in inflammation induced by the excess of fatty acids, participating in the modulation of the inflammatory response, apparently, with neuroprotective effects. Dietas ricas em gordura induzem a formação de sinais inflamatórios no hipotálamo que diminui sua capacidade de resposta aos hormônios leptina e insulina, envolvidos com o controle da saciedade e fome. O hipotálamo contém uma grande quantidade de células gliais destacando-se os astrócitos, que são incorporados em grupos heterogêneos de neurônios que participam do circuito de controle da homeostase energética, adicionalmente, estão envolvidos com vários processos, incluindo a neuroinflamação. Nesse sentido, o presente trabalho buscou estudar o papel dos astrócitos hipotalâmicos nas respostas frente ao excesso de ácidos graxos e a interação dessas células com neurônios também do hipotálamo. Para tanto, foram utilizadas culturas primárias de astrócitos hipotalâmicos e culturas primárias de neurônios hipotalâmicos. O meio removido de culturas de astrócitos tratados com ácido graxo (estereato ou palmitato) ou LPS (controle positivo) foi usado sobre culturas neuronais para posterior estudo da sinaptogênese in vitro, ainda, foi realizada a dosagem das citocinas presentes nesse meio condicionado com o kit CBA mouse-Th1/Th2/Th17 através de citometria de fluxo com o intuito de analisarmos o perfil de resposta inflamatória em função dos diferentes tratamentos. Com base nesse resultado, vimos que o tratamento com ácido graxo promoveu um perfil de resposta Th2 (anti-inflamatório), principalmente quando comparado ao controle LPS de perfil Th1 (pró-inflamatório). Após o tratamento, o RNA total dos astrócitos foi extraído para a realização do sequenciamento de transcritos por RNA-Seq. Através da análise dos genes diferencialmente expressos entre os grupos, observou-se que o tratamento com ácido graxo induziu uma resposta inflamatória, porém de menor intensidade em relação ao tratamento com LPS, e, ao mesmo tempo, alguns genes relacionados com neuroproteção também foram mais expressos por astrócitos tratados com ácido graxo, colaborando com os dados do CBA. A cultura de neurônio foi padronizada em nosso laboratório e, posteriormente, tratada com meio condicionado. Através de imunomarcação, observou-se que o tratamento com o meio condicionado em astrócitos tratados com ácidos graxos reduziu a densidade sináptica total, atingindo, principalmente sinapses excitatórias, no entanto, o número de neurônios foi semelhante entre os tratamentos, porém, com a presença de um menor número de núcleos picnóticos com o tratamento de ácidos graxos. Estes resultados sugerem um papel ativo dos astrócitos frente à inflamação induzida pelo excesso de ácidos graxos participando da modulação da resposta inflamatória, aparentemente, com efeitos neuroprotetores. Mestre em Biologia Celular e Estrutural Aplicadas

INTRODUÇÃO: A restrição do crescimento intrauterino (RCIU) é conhecida como uma condição na qual o feto não consegue desenvolver todo o seu potencial de crescimento intrínseco. Crianças com RCIU em idade escolar têm prejuízos no aprendizado, memória, atenção e cognição em geral, e maior predisposição a transtornos psicológicos como Transtorno de Déficit de Atenção e Hiperatividade (TDAH), quando comparados com crianças não restritas. OBJETIVO: este estudo busca encontrar modificações neurobiológicas encefálicas, em ratos Wistar adolescentes, que possam explicar os efeitos, em parâmetros comportamentais, de neuroplasticidade e memória, da RCIU por redução da pressão de perfusão uterina (RPPU). MÉTODOS: ratas Wistar prenhes de 75 dias de idade foram submetidas à RPPU no dia gestacional 14, período que corresponde ao inicio da fase de rápido crescimento, diferenciação e maturação em ratos, por meio da colocação de um clipe na artéria aorta abdominal descendente antes da bifurcação para as artérias ilíacas e um clipe em cada artéria ovariana. O grupo Sham foi submetido à laparotomia exploratória sem a RPPU e o grupo controle não foi submetido a nenhum procedimento cirúrgico. Ratos Wistar de 30 dias, provenientes de mães submetidas à RPPU, Sham ou Controles, foram submetidos ao Teste de Campo Aberto, para avaliação da atividade locomotora e exploratória, e no 32º dia pós-natal (DPN) foram submetidos ao teste de Reconhecimento do Novo Objeto para avaliar a memória de longo prazo. Os encéfalos da prole foram coletados no 34º DPN e conservados para análise. A Técnica de imunoistoquímica foi realizada para mensurar a expressão de marcadores celulares neurais: NeuN (neurônios maduros) GFAP (astrócito) no córtex pré-frontal e estriado da prole. RESULTADOS: a RPPU causou diminuição no peso ao nascimento no grupo RCIU e Sham, porém não houve diferença no peso entre os grupos no 30º DPN. A RPPU aumentou significativamente a duração da gestação no grupo RCIU em um dia. Os animais restritos apresentaram aumento na atividade exploratória no teste de campo aberto. RCIU e Sham apresentaram déficit de memória no teste de reconhecimento do novo objeto. Associado a essas alterações comportamentais, a RCIU levou a o aumento significativo na expressão de NeuN no CPF e de GFAP no estriado no 34º DPN. CONCLUSÃO: a RPPU produz alterações na gravidez causando maior duração da ges-tação e RCIU na prole, conduzindo a modificações comportamentais e de memória, assim como a nível encefálico celular, promovendo novas perspectivas sobre as consequências do modelo em ratos de RCIU-RPPU. São necessários mais estudos para desvendar se essas modificações continuam presente na vida adulta dos ratos. INTRODUCTION: Intrauterine growth restriction (IUGR) is known as a condition where the fetus cannot develop its intrinsic growth potential. IUGR Children in early scholar age have impaired learning abilities, memory, attention and cognitive deficit in general; also, they are in higher risk of psychological disorders as Attention Deficit and Hyperactivity Disorder (ADHD) when compared with non-IUGR children. OBJECTIVE: The study aims to find neurobiologi-cal brain modifications, in adolescent Wistar rats, that could clarify these memory and behav-ioral impairments in a rat animal model of IUGR by Reduced Uterine Perfusion Pressure (RUPP). METHODS: 75 days-old pregnant Wistar rats were underwent to RUPP procedure on 14th gestational day, period where the fast growing, differentiation and maturation phase begins in rats, by putting one clip at the abdominal descendent aorta before iliac bifurcation and one clip in each ovarian artery. The Sham group underwent exploratory laparotomy procedure without the RUPP and the control group was not exposed to any surgical procedure. 30 days old Wistar rats from RUPP, Sham, and Control mothers were exposed to the Open Field Test to assess the locomotor and exploratory activity and, at 32th postnatal day (PND), to the Novel Object Recognition test to assess the long-term memory. Offspring brains were collected at 34th PND and preserved for analysis. Immunohistochemistry technique was performed to measure the expression of neural cells markers: NeuN (mature neurons) and GFAP (astrocytes) in prefrontal cortex and striatum on the offspring. RESULTS: RUPP caused a decreased birth weight in IUGR and Sham group, however there was no difference between birth weight at 30th PND. RUPP significantly increased gestation in 1 day in IUGR rats. IUGR animals had greater exploratory, locomotor activity in the Open Field test. IUGR and Sham showed memory deficit in the Novel Object Recognition test. Associated to those behavioral modifications, the RUPP leaded to a significant increase in expression of NeuN and GFAP marker in prefrontal cortex and striatum at PND34. CONCLUSIONS: The RUPP dis-turbs pregnancy increasing gestation length and inducing IUGR in the offspring; which leads to behavioral and memory modifications, also, in a brain cellular level, promoting new insight about the IUGR-RUPP rat model consequences. Further analysis are needed to find whether this changes are still present in adult life.

As respostas inflamatórias no cérebro são mediadas principalmente pela microglia, mas evidências crescentes sugerem uma importância crucial dos astrócitos. A S100B, uma proteína ligante de cálcio e secretada por astrócitos, tem propriedades neurotróficas e de citocina inflamatória. No entanto, não se sabe se sinais primários que ocorrem durante a indução de uma resposta inflamatória como, por exemplo, lipopolissacarídeo (LPS) modulam diretamente a S100B. A neuroinflamação está implicada na patogênese ou na progressão de uma variedade de distúrbios neurodegenerativos e muitos estudos procuram uma conexão entre S100B e doenças degenerativas, incluindo a doença de Alzheimer e esquizofrenia. O uso terapêutico de fármacos anti-inflamatórios não-esteroidais (AINEs) para estas doenças tem aumentado. No entanto, existem poucos estudos sobre o efeito desses fármacos em relação à proteína S100B. Neste trabalho, nós avaliamos se os níveis de S100B no líquido cefalorraquidiano (LCR) e soro de ratos Wistar são afetados por injeção de LPS administrado por via intraperitoneal (IP) ou intracerebroventricular (ICV), bem como se as culturas primárias de astrócitos respondem diretamente ao LPS. Além disso, nós avaliamos o conteúdo e a secreção de S100B medido por ELISA (bem como o conteúdo de GFAP e secreção de TNF-α) em culturas primárias de astrócitos expostos a dexametasona e quatro classes químicas diferentes de AINEs (ácido acetilsalicílico, ibuprofeno, diclofenaco e nimesulida) durante 24 h. Os nossos dados sugerem que a secreção de S100B no tecido cerebral é estimulada rapidamente e persistentemente (durante pelo menos 24 h) por administração ICV de LPS. Este aumento da S100B no LCR foi transitório quando o LPS foi administrado IP. Em contraste com estes resultados de S100B, observou-se um aumento nos níveis de TNF-α no soro, mas não no LCR, após a administração IP de LPS. Em astrócitos isolados e em fatias de hipocampo frescas, observou-se uma estimulação direta da secreção de S100B por LPS numa concentração de 10 ug/ml. Um envolvimento de TLR4 foi confirmado pelo uso de antagonistas específicos deste receptor. No entanto, baixas concentrações de LPS em culturas de astrócitos foram capazes de induzir uma diminuição na secreção de S100B após 24 h, sem alteração significativa no conteúdo intracelular de S100B. Além disso, após 24 horas de exposição ao LPS, observou-se um decréscimo na glutationa e um aumento na proteína ácida fibrilar glial. Também foi observado que os AINEs apresentam diferentes efeitos sobre parâmetros gliais. O ácido acetilsalicílico e o diclofenaco foram capazes de aumentar a GFAP, enquanto que a nimesulida, um inibidor seletivo de COX-2, e a dexametasona diminuiram a secreção de S100B. No entanto, todos os AINEs reduziram os níveis de PGE2. Juntos, esses dados contribuem para a compreensão dos efeitos de LPS em astrócitos, especialmente sobre a secreção de S100B, e nos ajuda a interpretar mudanças nesta proteína no LCR e soro em doenças neuroinflamatórias. Além disso, tecidos periféricos que expressam S100B talvez devam ser regulados diferentemente, uma vez que a administração IP de LPS não foi capaz de aumentar os níveis séricos de S100B. Em relação aos AINEs, a PGE2 parece estar envolvida no mecanismo de secreção de S100B, mas vias adicionais, não claras neste momento, necessitam de uma maior caracterização. O papel inflamatório de S100B em doenças degenerativas, onde também são observados níveis elevados da COX-2 e PGE2, poderia ser atenuado por inibidores de COX-2. Inflammatory responses in brain are primarily mediated by microglia, but growing evidence suggests a crucial importance of astrocytes. S100B, a calciumbinding protein secreted by astrocytes, may act as a neurotrophic or an inflammatory cytokine. However, it is not known whether primary signals occurring during induction of an inflammatory response (e.g. lipopolysaccharide, LPS) directly modulate S100B. Neuroinflammation has been implicated in the pathogenesis or progression of a variety of neurodegenerative disorders and several studies have looked for a connection of S100B, and degenerative diseases including Alzheimer’s disease and schizophrenia. The therapeutic use of non-steroid anti-inflammatory drugs (NSAID) to these diseases has growth up. However, there are few reports about the effect of these drugs on S100B. In this work, we evaluated whether S100B levels in cerebrospinal fluid (CSF) and serum of Wistar rats are affected by LPS administered by intraperitoneal (IP) or intracerebroventricular (ICV) injection, as well as whether primary astrocyte cultures respond directly to lipopolysaccharide. Moreover we evaluated S100B content and secretion measured by ELISA (as well as GFAP content and TNF-α secretion) in primary astrocyte cultures exposed to dexamethasone and 4 different chemical classes of NSAID (acetyl salicylic acid, ibuprofen, diclofenac and nimesulide) for 24 h. Our data suggest that S100B secretion in brain tissue is stimulated rapidly and persistently (for at least 24 h) by ICV LPS administration. This increase in CSF S100B was transient when LPS was IP administered. In contrast to these S100B results, we observed an increase in in TNFα levels in serum, but not in CSF, after IP administration of LPS. In isolated astrocytes and in acute hippocampal slices, we observed a direct stimulation of S100B secretion by LPS at a concentration of 10 μg/mL. An involvement of TLR4 was confirmed by use of specific inhibitors. However, lower levels of LPS in astrocyte cultures were able to induce a decrease in S100B secretion after 24 h, without significant change in intracellular content of S100B. In addition, after 24 h exposure to LPS, we observed a decrease in astrocytic glutathione and an increase in astrocytic glial fibrillary acidic protein. We also observe that NSAIDs have distinct effects on glial parameters. ASA and diclofenac are able to increase GFAP, while nimesulide, a selective COX-2 inhibitor, and dexamethasone were able to decrease S100B secretion. However, all anti-inflammatories were able to reduce levels of PGE2. Together, these data contribute to the understanding of the effects of LPS on astrocytes, particularly on S100B secretion, and help us to interpret cerebrospinal fluid and serum changes for this protein in neuroinflammatory diseases. Moreover, non-brain S100B-expressing tissues may be differentially regulated, since LPS administration did not lead to increased serum levels of S100. With respect to NSAIDs, PGE2 is possibly involved in the mechanism of S100B secretion but additional pathways, unclear at this moment, demand further characterization. The inflammatory role of S100B in degenerative diseases, where also is observed elevated levels of COX-2 and PGE2, could be attenuated by COX-2 inhibitors in which elevated levels of COX-2.

A proteína glial fibrilar ácida (GFAP) constitui o principal marcador dos astrócitos, as células gliais mais numerosas do tecido nervoso e que exibem receptores a diversos hormônios esteroidais, os quais exercem aparente influência sobre a expressão gênica das mesmas. O objetivo do presente estudo foi o de avaliar se a administração de dexametasona (DX) em protocolos terapêuticos para cães seria capaz de afetar a expressão astrocitária dessa proteína. Para tal, amostras da ponte e da medula espinhal torácica de cães, tratados (n=6) ou não (n=6) com DX, foram submetidas à marcação imuno-histoquímica para a GFAP e a reatividade astrocitária foi determinada por colorimetria em um sistema computacional de análise de imagens. Diferença estatisticamente significativa foi constatada para as médias das áreas marcadas para GFAP na ponte de cães tratados e não-tratados com DX, assim como na medula espinhal torácica dos que haviam recebido previamente o corticoide ou não, com clara tendência, induzida pela droga, de redução da expressão astrocitária da proteína. Além disso, a expressão de GFAP na medula espinhal foi maior que na ponte, independentemente do emprego de DX ou não. Glial fibrillary acidic protein (GFAP) is the most important marker of astrocytes, that are the major glial cells in the nervous tissue and exhibit receptors to several steroid hormones, which have an apparent influence in their genic expression. The aim of this study was to evaluate if dexamethasone (DX) administration in therapeutic protocols to dogs would be capable of affecting the astrocytic expression of the protein. Samples from the pons and the spinal cord of dogs, treated (n=6) or not (n=6) with DX, were submitted to GFAP immunohistochemical staining and astrocytic reactivity was determined by colorimetry in a computer system for image analysis. Difference statistically significant was noted for the mean areas stained with GFAP in the pons of dogs treated and non-treated with DX, as well as in the spinal cord of dogs which previously received or not DX, with clear tendency of drug-induced reduction in the astrocyte expression of this protein. GFAP expression in the spinal cord was greater than in the pons, regardless the use of DX or not.

Os objetivos principais desta tese foram avaliar parâmetros bioquímicos gliais, inflamatórios e comportamentais em pacientes com lesão medular (LM) submetidos a um protocolo de dança, e em ratos submetidos aos protocolos de exercício voluntário e forçado. Para tanto, foram realizados 4 experimentos. No primeiro, os ratos foram submetidos a 4 semanas de exercício moderado em esteira ergométrica (20 min por dia). No segundo, os animais foram submetidos à 4 semanas de exercício voluntário em rodas de correr (12 horas por dia). No terceiro experimento, os ratos foram expostos à esteira ergométrica durante 2 semanas (20 min/dia) e, após o último treino, receberam uma injeção intraperitoneal de LPS. Neste último, a memória e aprendizagem dos animais foram investigadas. Ao término do período de exercício, ou após a injeção de LPS, as análises bioquímicas do hipocampo foram realizadas. O quarto experimento foi realizado com indivíduos com LM que foram submetidos a 4 semanas de dança. Análises sorológicas e comportamentais foram efetuadas. Os resultados mostraram que o exercício forçado promoveu o aumento da glutamina sintetase (GS) e diminuição de proteína glial fibrilar ácida (GFAP) e óxido nítrico (NO) no hipocampo, além de aumentar os níveis de corticosterona, o que pode estar mediando os efeitos do exercício sobre os astrócitos. O exercício voluntário induziu o aumento da GS e BDNF. A aplicação de LPS promoveu aumento dos níveis de TNF-α no hipocampo dos animais, o que coincidiu com o aumento dos níveis de S100B no fluído cerebrospinal. Os indivíduos com LM submetidos à dança apresentaram melhora significativa nos escores da Medida de Independência Funcional, Índice de Barthel, Escala de Berg e Escala Hospitalar de Ansiedade e Depressão, e aumento dos níveis sorológicos de BDNF. A dança não teve efeito sobre os parâmetros gliais, metabólicos e inflamatórios periféricos. Estes resultados sugerem que diferentes tipos de exercício físico exercem diferentes efeitos sobre os astrócitos hipocampais, o que pode interferir na indicação de um ou outro dependendo do objetivo a ser alcançado. O exercício em esteira pode ser uma atividade indicada para prevenção de doenças que envolvem neuroinflamação, e a dança pode ser uma intervenção terapêutica eficaz para reabilitação de indivíduos com lesão medular uma vez que contribui para melhora física e psicológica desta população. Tomados juntos, os resultados desta Tese ressaltam a importância da prática de exercício físico para o metabolismo neural, e a relevância de estudar os astrócitos para compreensão dos mecanismos envolvidos no efeito do exercício físico no SNC. The main aim of this Thesis was to evaluate the biochemical glial, inflammatory and behavioral parameters, in patient with spinal cord injury (SCI) submitted to a protocol of dance, and in rats submitted to voluntary and forced exercise. Four experiments were made. In the 1st, the rats were submitted to 4 weeks of moderate exercise on treadmill (20 min per day). In the 2nd, the animals were submitted to 4 weeks of voluntary exercise on wheel running (12 hours per day). In the 3rd experiment, the rats were exposed to treadmill during 2 weeks (20 min per day) and, after the last session, they received intraperitoneal injection of LPS. In this last experiment, the memory and learning were investigated. At the finish of the exercise period, or after the LPS injection, the biochemical analysis of the hippocampus was realized. The 4th experiment was realized with individuals with spinal cord injury that were submitted to 4 weeks of dance practice. Behavioral and serological analyses were performed. Data show that treadmill running increased glutamine synthetase (GS) activity and decreased hippocampal glial fibrillary acidic protein (GFAP) and nitric oxide (NO) , as well as increased corticosterone level, that can mediate the effects of the exercise on astrocytes. The voluntary exercise increased GS and BDNF. The LPS administration increased hippocampal TNF-α level in rats concomitantly with the increase in the S100B levels in cerebrospinal fluid. The individuals with spinal cord injury submitted to dance showed a significant improve in the scores of Functional Independency Measure, Barthel Index, Berg Scale and Ansiety and Depression Hospitalar Scale, and a increase in the serologic levels of BDNF. The dance had no effect on glial, metabolic and inflammatory parameters. These results suggest that different types of exercise exert different effects on hippocampal astrocytes, which may interfere with the appointment of one or the other depending on the objective to be achieved. The treadmill exercise can be a good strategy in the prevention of neuroinflammatory diseases, and dance can be an effective therapeutic intervention for rehabilitation of individuals with SCI as it helps to improve physical and psychological conditions in this population. Taken together, the present data highlight the importance of physical exercise for neural functions, and the relevance of studying astrocytes to understand the mechanisms involved in the effect of exercise on CNS.

Orientador: Maria Alice da Cruz Höfling Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O veneno da aranha Phoneutria nigriventer (PNV), também conhecida como aranha armadeira, é uma mistura complexa de peptídeos com ação neurotóxica em alguns canais iônicos. No sistema nervoso central (SNC) alguns peptídeos do PNV causam permeabilização da barreira hematoencefálica (BHE) e interferem na liberação de neurotransmissores. A BHE, embora essencial para a manutenção da homeostase do SNC, pode representar uma barreira muito restritiva para o acesso de drogas terapêuticas ao microambiente neural. O entendimento dos mecanismos associados à disfunção da BHE é relevante do ponto de vista científico e médico. O objetivo do estudo foi investigar alguns mecanismos envolvidos na neurotoxicidade do veneno da Phoneutria nigriventer em ratos Wistar (Rattus norvegicus). Para esse fim, o efeito vasogênico causado pela neurotoxicidade do veneno no cérebro, foi examinado através da avaliação da expressão de aquaporina 4 (AQP4), uma proteína formadora dos canais de água e abundantemente localizada nos pés astrocitários perivasculares e relacionada com o aparecimento de edema no cérebro. A análise da expressão da proteína foi feita por imunohistoquímica e western blotting e a expressão de RNAm por PCR em tempo real no cerebelo e hipocampo de animais neonatos (14 dias) e adultos (8 semanas). Os resultados obtidos mostraram aumento da expressão de AQP4 e seu RNAm nos animais envenenados, que entretanto foi variável em função do tempo de envenenamento (2, 5 ou 24 h), da região do cerebelo ou hipocampo examinada e da idade dos animais. Os resultados mostraram também intensa marcação anti-AQP4 ao redor de vasos com edema perivascular ou não, como também entre os corpos neuronais e seus prolongamentos. Concluímos que a AQP4 tem papel nas alterações de volume dos astrócitos perivasculares e na formação e resolução do edema ao redor da BHE causado pelo PNV. A dinâmica da expressão da AQP4 no cerebelo e hipocampo em função do tempo, região e idade dos animais sugere a existência de fatores intrínsicos que modulam diferencialmente a funcionalidade da BHE em função do microambiente local. A compreensão dos mecanismos envolvidos no envenenamento por PNV pode contribuir para o desenvolvimento de ferramentas úteis para a intervenção clínica, bem como pode ser relevante para o entendimento dos mecanismos relacionados ao funcionamento da BHE e de proteínas envolvidas na formação de canais de água, como a AQP4 Abstract: The Phoneutria nigriventer spider venom (PNV), also known as armed-spider, is a complex mixture of ion channels-acting peptides which exhibit neurotoxic action. In the central nervous system (CNS), PNV-containing peptides cause permeabilization of the blood-brain barrier (BBB) and interfere with neurotransmitter release. The BBB, although essential for the maintenance of homeostasis of the CNS, may represent a very restrictive barrier for the access of therapeutic drugs into the neural microenvironment. The understanding of BBB impairment-associated mechanisms are of scientific and medical importance. The aim of this study was to investigate some of the mechanisms involved in the neurotoxicity caused by Phoneutria nigriventer venom in Wistar rats (Rattus norvegicus). To this end, the vasogenic effect caused by the venom neurotoxicity in the brain was examined by evaluating the expression of aquaporin 4 (AQP4), a water channel forming protein abundantly expressed in perivascular astrocytic endfeet processes and associated to the formation and resolution of edema in the brain. The analysis of AQP4 expression was assessed in the cerebellum and hippocampus of neonate (14 day-old) and adult rats (8 week-old) through immunohistochemistry and western blotting, and the expression of mRNA by Real Time-PCR. The results showed increases of AQP4 expression and its mRNA in the envenomed animals, which though showed time- (2, 5 or 24h), regional- (regions of the cerebellum and hippocampus examined) and age-associated differences. Marked anti-AQP4 labeling was found around vessels with or without edema and among the neuron bodies and their processes. We conclude that AQP4 has a role in the volume alterations of the perivascular astrocytes and in the formation and resolution of edema around the BBB induced by PNV. The variability of the dynamics of AQP4 expression in the cerebellum and hippocampus in function of the time, region and animals age suggests the existence of intrinsic factors that modulate the BBB functionality depending on the molecular biology dynamics of the local microenvironment. The understanding of the mechanisms involved in the envenomation by PNV can contribute to the development of useful tools for clinical intervention, and may be relevant for understanding the mechanisms related to the functioning of the BBB and proteins involved in the formation of water channels, such as AQP4 Mestrado Histologia Mestra em Biologia Celular e Estrutural

O diabetes mellitus tipo 1 (DMT1) tem sido associado com complicações a longo prazo no sistema nervoso central, além dos efeitos periféricos comuns relacionados à doença, causando disfunções cognitivas no encéfalo. Por outro lado, o enriquecimento ambiental (EA) induz mecanismos de plasticidade dependentes da experiência, especialmente no hipocampo, melhorando o desempenho dos animais em testes de aprendizado e memória. Assim, nosso objetivo foi avaliar a influência do EA sobre o déficit de memória, a atividade locomotora, os níveis de corticosterona, a imunorreatividade da proteína sinaptofisina, e a densidade e a ativação de astrócitos e microglia no giro denteado (GD) do hipocampo de ratos diabéticos tipo 1. Para isso, ratos Wistar machos com 21 dias de idade, foram expostos ao EA ou mantidos em caixamoradia padrão (controles, C) por 3 meses. Quando adultos, os animais tanto C quanto EA foram randomicamente divididos e induziu-se diabetes através de injeção de estreptozotocina em metade dos animais de cada grupo, sendo mantidas as respectivas condições ambientais para cada um dos grupos. A memória espacial dependente de hipocampo foi avaliada em todos os grupos através do teste de reconhecimento de objeto reposicionado, no 41o dia após a indução do diabetes, bem como a locomoção geral dos animais no campo aberto durante o mesmo teste. Os níveis séricos de corticosterona foram medidos ao final do experimento, a imunorreatividade da sinaptofisina foi avaliada por imunoistoquímica, e a densidade e a ativação de astrócitos e da microglia por imunofluorescência no hilo do GD do hipocampo. Nossos resultados mostraram que o EA foi capaz de prevenir ou atrasar o desenvolvimento do déficit de memória causado pelo diabetes em ratos, porém não reverteu o déficit motor observado nos animais diabéticos. Não houve diferença significativa na imunorreatividade da sinaptofisina entre os grupos. Além disso, embora o EA não tenha modificado a densidade e a ativação dos astrócitos nos animais diabéticos, o enriquecimento atenuou os efeitos prejudiciais da hiperglicemia sobre a ativação microglial, bem como reduziu os níveis séricos de corticosterona nos ratos diabéticos adultos. Assim, o EA ajudou a amenizar as comorbidades cognitivas associadas ao diabetes, possivelmente por atenuar a hiperatividade do eixo HPA e a ativação microglial nos animais diabéticos. Type 1 diabetes mellitus (T1DM) has been associated with long-term complications in central nervous system, besides peripheral common adverse effects, causing neurocognitive dysfunction in the brain. On the other hand, enriched environment (EE) induces mechanisms of experiencedependent plasticity especially in hippocampus, improving the performance of animals in learning and memory tasks. Thus, our objective was to investigate the influence of the EE on memory deficits, locomotion, corticosterone levels, synaptophysin protein immunoreactivity, and density and activation of astrocytes and microglia in the hippocampal dentate gyrus (DG) of type 1 diabetic rats. For this, male Wistar rats, 21 days old, were exposed to the EE or maintained in standard housing (controls, C) for 3 months. At adulthood, C and EE animals were randomly divided and half of them induced to diabetes by streptozotocin, being maintained the respective environmental conditions for each animal groups. Hippocampus-dependent spatial memory was evaluated in all groups in the novel object-placement recognition task, on 41th day after diabetes induction, as well as the general locomotion in the open field at the same test. Serum corticosterone levels were measured in the end of the experiment, contents of synaptophysin was evaluated by immunohistochemistry, and density and activation of both astrocytes and microglia by immunofluorescence in the hilus of the DG in hippocampus. Our results showed that EE was able to prevent or delay the development of memory deficits caused by diabetes in rats, however did not revert the motor impairment observed in group diabetic. There was no significant difference in synaptophysin immunoreactivity among the groups. Furthermore, although the EE did not modify the density and activation of astrocytes in diabetic animals, it attenuated the injurious effect of hyperglycemia over microglial activation, as well as decreased the serum level of corticosterone in diabetic adult rats. Thus, the EE has helped to ameliorate cognitive comorbidities associated with T1DM, possibly by reducing the hyperactivity of HPA axis and the microglial activation in diabetic animals.

Ratos Wistar machos adultos jovens (6 meses) e velhos (24-25 meses) foram alocados em treinamentos de endurance (corrida em esteira) ou resistido (escalada em grade) durante 6 semanas e comparados a controles sedentários (n=6). Ao final, músculos dos membros posteriores (sóleo e gastrocnêmio) foram analisados por histogramas e atividade total da enzima acetilcolinesterase (AChE). Na medula espinhal lombar, motoneurônios (MN) foram contados, bem como astrócitos da substância cinzenta marcados com GFAP. Densidades ópticas foram medidas nos cornos ventral (CV) e dorsal (CD) para CGRP-ir (MN e CD), AChE e 5-HT-ir (CV e CD). Para histogramas, dados foram analisados usando-se MANOVA e post hoc de Tukey. Os demais dados foram analisados usando-se ANOVA de 1 via e post hoc de Duncan. Resultados: histogramas de ratos jovens mostraram perfis de distribuição distintos após corrida (predominância de fibras de médio diâmetro) ou escalada (predominância de fibras de grande diâmetro) no músculo gastrocnêmio, mas não no sóleo. O perfil de predominância de fibras de pequeno diâmetro observado em ratos velhos sedentários foi igualmente revertido por corrida ou escalada, mas ratos velhos apresentaram limitado aumento de fibras de maior diâmetro. Tanto corrida quanto escalada diminuíram a atividade da AChE muscular. A medula espinhal de animais velhos apresentou menor número de MN e aumento do número de astrócitos. Tanto corrida quanto escalada reduziram a astrogliose no CV, mas não no CD. Ratos velhos mostraram aumento da CGRP-ir em MN, mas nenhum treinamento alterou a CGRP-ir em MN ou no CD. Tanto corrida quanto escalada aumentaram a AChE no CV em todos os grupos treinados. A escalada diminuiu AChE no CD e 5-HT-ir no CV. Nos ratos jovens, a corrida elevou 5-HT-ir no CD, mas não nos ratos velhos. Estes resultados sugerem que distintas modalidades de exercícios crônicos evocam diferentes respostas de neurotransmissores na medula espinhal em diferentes idades. Young (6 months) and aged (24-25 months) male Wistar rats were assigned to endurance training (ET - treadmill running) and resistance training (RT - grid climbing with increasing weights) during 6 weeks and compared to sedentary controls (n=6). At the end, hindlimb muscles (soleus and gastrocnemius) were analysed by histograms and total AChE activity. In the lumbar spinal cord, motoneurons (MN) were counted, as well as gray matter's GFAP-labeled astrocytes. Optical densities were measured in the ventral (VH) and dorsal (DH) horns for CGRP-ir (MN and DH), AChE staining and 5-HT-ir (VH and DH). Data from histograms were analysed using MANOVA and Tukey’s post hoc. The remaining data Weir analysed using ANOVA and Duncan´s post hoc. Results: gastrocnemius, but not soleus, muscle histograms in young rats showed distinct fiber distribution profiles under ET (toward medium-diameter fibers) and RT (toward large-diameter fibers). The predominance in small-diameter muscle fibers in aged rats was similarly reversed by ET and RT, but aged rats presented limited increase in large-diameter muscle fibers. Both ET and RT decreased muscle AChE activity. The aged spinal cords presented MN loss and greater astrocyte numbers. Both ET and RT reduced astrogliosis in VH, but not in DH. The aged rats displayed elevated CGRP-ir in MN, and neither ET nor RT altered CGRP-ir in MN or DH. Exercise (ET and RT) markedly increased AChE staining in VH in all groups. RT decreased AChE in DH and 5-HT-ir in VH. In young rats, running elevated 5-HT-ir in the DH. These results suggest that different chronic exercise modalities and age evoke distinct spinal cord neurotransmitter responses.

Orientador: Alexandre Leite Rodrigues de Oliveira Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O complexo de histocompatibilidade principal de classe I (MHC I) é uma molécula originalmente do Sistema Imunológico. A presença desses elementos no Sistema Nervoso Central (SNC) parece estar relacionada a diferentes funções, apresentando papel importante no refinamento sináptico durante o desenvolvimento do SNC e sendo fundamental no processo de eliminação sináptica após uma lesão nervosa no adulto. No intuito de investigarmos os processos de plasticidade sináptica e reatividade glial no microambiente da medula espinal foram utilizados dois imunomoduladores empregados no tratamento da Esclerose Múltipla, o interferon beta (IFN beta) e o acetato de glatirâmer (AG). O IFN beta, potencialmente capaz de influenciar a expressão de MHC I, foi utilizado in vivo, juntamente com axotomia periférica e in vitro, enquanto o AG foi utilizado para testes in vitro. Para tanto, camundongos C57BL/6J foram tratados com 10.000 UI de IFN beta durante 2 semanas, antes e depois da transecção unilateral do nervo isquiático. Os camundongos foram submetidos à eutanásia e suas medulas espinais lombares processadas para imunohistoquímica (anti-MHC I, sinaptofisina, GFAP - glial fibrillary acidc protein, ezrina e iba1), hibridação in situ (sondas para GFAP e microglobulina beta-2), Western blotting (GFAP e MHC I) e microscopia eletrônica de transmissão. Grupos axotomizados, placebo e não tratado foram utilizados como controles. Adicionalmente ao estudo in vivo, foram estabelecidas culturas purificadas de astrócitos para o tratamento com diferentes doses de IFN beta (0, 100, 500 ou 1000 UI/ml) ou AG (0, 1.2, 2.5 ou 5.0µg/ml) durante 5 dias. As culturas tratadas com IFN beta foram submetidas à imunohistoquímica para MHC I, ezrina, GFAP, enquanto nas culturas tratadas com AG foi realizado o estudo para verificar a reatividade e proliferação através da marcação anti-GFAP e DAPI (para identificação dos núcleos das células). In vivo, os resultados mostraram um aumento do RNAm e da expressão protéica para MHC I após axotomia, sendo que este incremento foi maior no grupo tratado com INF. Observou-se a intensificação da expressão das proteínas que expressam a reatividade astrocitária, GFAP e ezrina, concomitantemente à diminuição da imunomarcação para sinaptofisina, especialmente no grupo tratado. O tratamento realizado não influenciou a reatividade da microglia. A análise do material in vitro também mostrou, após o tratamento com IFN beta, um aumento da expressão de MHC I e GFAP, bem como de ezrina. As doses que mais estimularam a elevação da expressão dos marcadores estudados foram as de 500 e 1000 UI/ml. Dado que não ocorreu para o tratamento com o acetato de glatirâmer. Assim, o tratamento com AG não alterou o nível de reatividade astrocitária, apesar de estimular a proliferação celular. A ultraestrutura das sinapses mostrou uma intensa retração dos terminais pré-sinápticos em contato com os motoneurônios alfa, induzida pela axotomia mais o tratamento com IFN beta. Em conjunto, esses resultados reforçam a importância da expressão de moléculas de MHC I em resposta à lesão nervosa e seu papel como mecanismo de comunicação entre neurônio e glia, além de reafirmar que os astrócitos são elementos ativos no processo de plasticidade sináptica. Abstract: The class I main histocompatibility complex (MHC I) is a molecule originally restricted to Immune System. The presence of such element in the Central Nervous System (CNS) may indicate other functions, including an important role in the synaptic refinement during the development of the CNS as well as in the synaptic elimination process after a peripheral nerve injury in the adult. To investigate the synaptic plasticity and glial reactivity in the spinal cord, two immunomodulators, widely used for treating Multiple Sclerosis, were applied, namely the Interferon beta (IFN beta) and the glatiramer acetate (GA). The IFN beta was used in order to upregulate the MHC I expression in vivo, after a peripheral axotomy, and also in vitro. GA treatment was only used for in vitro experiments. C57BL/6J mice were injected with 10,000 IU of IFN beta for 2 weeks, before and after the nerve transection. The animals were sacrificed and the lumbar spinal cords were processed for immunohistochemistry (MHC I, synapthophysin, GFAP, ezrin and Iba-1 antisera), in situ hybridization (beta 2 immunoglobulin, a component of the MHC I molecule, and GFAP), Western blotting (GFAP and MHC I) and transmission electron microscopy. Placebo and non-treated axotomized groups were used as controls. Additionally to the in vivo study, primary cultures of astrocytes were established and treated during five consecutive days with different doses of IFN beta (0, 100 IU, 500 IU and 1000 IU/ml). In this case, some cultures were treated with GA (0, 1.2, 2,5 and 5.0 µg/ml). INF treated cultures were processed for immunocitochemistry (MHC I, GFAP and ezrin antisera). GA treated cultures were evaluated with anti-GFAP antibody and cell proliferation was accessed with DAPI staining. In vivo, the results showed an upregulation of MHC I mRNA and protein expression after axotomy, that was stronger in the IFN treated group. We observed a greater GFAP and ezrin expression, coupled with a decrease of synapthophysin immunoreactivity. Such alterations were more evident in the IFN treated group. Interestingly, the IFN beta treatment did not interfere in the microglial reactivity. The in vitro analysis also showed a sharp upregulation of MHC I, GFAP and ezrin, mostly when the cultures were subjected to 500 and 1000 IU/ml of IFN beta. Regarding the GA treatment, the results showed that treatment did not change the level of astroglial reactivity despite stimulating cellular proliferation. The ultrastructural analysis of synapses showed a larger pruning of presynaptic terminals in contact with alpha motoneurons, induced by axotomy plus IFN beta treatment. Together, our results reinforce the importance of the MHC I expression as a response to nerve injury and its role as a communication mechanism between neurons and surrounding glial cells. Furthermore, the present data confirm that astrocytes are active elements during the synaptic plasticity process. Doutorado Anatomia Doutora em Biologia Celular e Estrutural

The aim of this study was to investigate whether exercise could improve motor behavioral deficits and alter expression of glial fibrillary acidic protein (GFAP) in dorsal striatum in a 6-hydroxydopamine (6-OHDA) rat model of Parkinson’s disease (PD). To this end, animals were randomly divided into 4 groups: sham sedentary (SS, n = 7); sham trained (ST, n=8); lesioned sedentary (LS, n=8) and lesioned trained (LT, n = 8). Rats were unilaterally lesioned with 6-OHDA (10 μg/3 μg) injected into the left medial forebrain bundle and sham groups were only injected with vehicle solution. The treadmill training protocol consisted of running with progressive increase in velocity, 5 days/week, during 4 weeks. Behavioral tasks were applied to asses the motor abilities of all animals prior to 6-OHDA injection and at 8th and 29th days post-injection. The tyrosine hydroxylase (TH - in substantia nigra pars compacta) and GFAP (in dorsal striatum) immunostaining was evaluated by semiquantitative analysis of the intensity (optical density - OD). The 6-OHDA lesion decreased the OD of TH and increased the OD of GFAP. In addition, the 6-OHDA lesion increased the number of ipsilateral rotations induced by methylphenidate (40 mg/kg, i.p., 30 min) and caused motor behavioral deficits. On the other hand, the treadmill training resulted in an increase in maximal exercise capacity in both trained groups (ST and LT). The training was able to reduce the number of ipsilateral rotations and ameliorated the motor behavioral deficits on 8th and 29th days postlesion. Interestingly, the exercise led to a significant increase in OD of GFAP in the LT group while there was no such effect in ST group. Our results indicate that treadmill training can improve motor behavioral deficits and suggest that the effects of exercise may be directly or, indirectly, mediated by astrocytes, as an increase in GFAP was observed in the dorsal striatum. Nevertheless, these are the first data showing an increase in GFAP expression post-exercise in this model and further research is needed to determine the precise action of exercise on astrocytes in Parkinson’s disease.

O termo neuroplasticidade se refere às mudanças funcionais ou anatômicas que ocorrem no sistema nervoso decorrentes de experiências. O enriquecimento ambiental (EA) é um dos modelos experimentais utilizados para estudar eventos relacionados à neuroplasticidade, pois aumenta a neurogênese, os níveis de neurotrofinas, a sobrevivência neuronal, a sinaptogênese, além de induzir cascatas de sinalização e uma mudança na arborização dendritica dos neurônios de diversas regiões encefálicas. Nos últimos anos a importância dos astrócitos tem ganho destaque, principalmente no que tange a sua capacidade de modular sinapses e na participação ativa em eventos plásticos no encéfalo, essas mudanças estão relacionadas a alterações funcionais e morfológicas. O EA é um modelo interessante para avaliar performances comportamentais pois é um modelo que ocasiona mudanças na capacidade de armazenar e acessar novas informações. Sendo assim, acreditamos que o EA é capaz de gerar efeitos plásticos nos astrócitos do Stratum Radiatum da região CA1 e alterar as respostas comportamentais a tarefa de reconhecimento de objetos. Após oito semanas de EA iniciado logo após o desmame, camundongos CF-1 albinos não apresentam diferenças significativas no número de astrócitos GFAP-ir e na densidade óptica para GFAP no Stratum Radiatum. Entretanto ocorreu um aumento no número de processos originários do soma, aumento no tamanho destes processos no eixo lateral, paralelo as colaterais de Schaffer e no número de intersecções aos círculos concêntricos de Scholl na mesma região. Os astrócitos adquirem um formato estrelado, este achado pode estar relacionado ao aumento da densidade sináptica nesta região e corroboram com a idéia de que modificações astrocitárias são parte ativa dos processos plásticos que ocorrem no encéfalo. Nossos resultados mostraram também uma mudança comportamental na resposta a tarefa de reconhecimento de objetos. Os animais expostos ao EA despendem menos tempo explorando os objetos, tanto familiar como não familiar e apresentam igual capacidade de discriminar os objetos. Estes resultados demonstram um comportamento mais propicio a sobrevivência da espécie em animais expostos ao EA, o que inclui uma rápida exploração e um possível aumento na capacidade de aprender sobre o ambiente. Environmental enrichment (EE) induces plastic changes in the brain, including morphological changes in hippocampal neurons, with increases in synaptic and spine densities. In recent years, the evidence for a role of astrocytes in regulating synaptic transmission and plasticity has increased, and it is likely that morphological and functional changes in astrocytes play an important role in brain plasticity. In others hand EE is used to investigate behavioral modifications associated with gene-environmental interaction. Our study was designed to evaluate changes in astrocytes induced by EE in the hippocampus, focusing on astrocytic density and on morphological changes in astrocytic processes and the performance in object recognition task (ORT) for evaluate animals ability to learn about their environment. After 8 weeks of EE starting at weaning, CF-1 mice presented no significant changes in astrocyte number or in the density of glial fibrillary acidic protein immunoreactivity (GFAP-ir) in the Stratum Radiatum. However, in the same region occur significant increase in the ramification of astrocytic processes, as well as by an increase in the number and length of primary processes extending in a parallel orientation to CA1 nerve fibers. This led astrocytes to acquire a more stellate morphology, a fact which could be related to the increase in hippocampal synaptic density observed in previous studies. These findings corroborate the idea that structural changes in astrocytic networks are an integral part of plasticity processes occurring in the brain. In other hand, our results indicate that EE decreased the time the animals spent exploring familiar and unfamiliar objects and total time spent exploring both objects, without affecting the capacity of discrimination of objects. These findings indicate a more propitious behavior for species survival in animals subjected to EE, including rapid exploration and learning about the environment.

Uma vez que muitos dos aspectos envolvidos na patogenia dos processos desmielinizantes do sistema nervoso central (SNC) são ainda pouco esclarecidos e que os astrócitos parecem estar envolvidos na mediação de tais processos, este estudo analisou morfologicamente a participação astrocitária na desmielinização do SNC por meio da marcação imunoistoquímica de duas proteínas dos filamentos intermediários astrocitários - a proteína glial fibrilar ácida (GFAP) e a vimentina (VIM) -, comparando amostras de cerebelo e de tronco encefálico de oito cães com cinomose e de dois cães normais, de diferentes raças e com idades entre um e quatro anos. Cortes histológicos dos tecidos foram submetidos à marcação pelo método indireto da avidina-biotina-peroxidase (ABC) e a reatividade astrocitária, observada em microscopia de luz, foi quantificada em um sistema computacional de análise de imagens. Observou-se, na maioria dos cortes de animais doentes, a presença de lesões degenerativas compatíveis com desmielinização. A marcação para a GFAP e para a VIM foi mais intensa nos animais com cinomose do que nos animais normais, especialmente nas regiões circunventriculares e nas adjacentes às áreas de degeneração tecidual. Não houve diferença significativa entre a imunomarcação (GFAP e VIM) dos animais com cinomose com e sem infiltração inflamatória da substância branca do cerebelo. O aumento da imunorreatividade dos astrócitos para a GFAP e a reexpressão de VIM nas áreas lesionais indicam o envolvimento astrocitário na resposta do tecido nervoso às lesões desmielinizantes induzidas pelo vírus da cinomose (CDV) no SNC. Considering that many aspects involved in the pathogenesis of the central nervous system (CNS) demyelinating diseases are still poorly understood and that astrocytes seem to mediate such processes, this study analyzed the participation of astrocytes in the demyelinating processes of CNS by using immunohistochemical staining of two astrocytic proteins - glial fibrillary acidic protein (GFAP) and vimentin (VIM) -, comparing samples of cerebellum and brainstem from eight dogs with canine distemper and from two healthy dogs, from different breeds and ages varying from 1 to 4 years old. Histological sections were submitted to the avidin-biotin-peroxidase indirect method of immmunohistochemical staining (ABC) and the astrocytic reactivity, observed in light microscopy, was quantified in a computer system for image analysis. It was possible to notice, on most of the sections from sick animals, degenerative lesions that indicate demyelination. The immunostaining for GFAP and VIM was more intense on animals with canine distemper, specially around the ventricules and near degenerated sites. There was no significant difference between the immunostaining (GFAP and VIM) of animals with canine distemper with and without inflammatory infiltrate of the cerebellar white matter. The increased immunoreactivity of astrocytes for GFAP and the VIM reexpression in injured areas indicate the astrocytic involvement on nervous tissue response to the demyelinating lesions induced by the canine distemper virus (CDV) in the CNS.

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais The purpose of this work was to analyze, in an in vitro model, the influence of the heparin on the susceptibility of retinal cells to infection by Toxoplasma gondii. Primary cultures of retinas from chick embryos of 8 and 11 days-old and astrocytes from human optic nerve heads were maintained in coverslips for one week, when were infected with T. gondii tachyzoites for 24 hours. Chick embryo and human foreskin fibroblasts were used as controls for chick and human experiments, respectively. Parasites were pre-treated with heparin and anti-T. gondii surface antigen 1 (SAG-1) antibody and the astrocytes were stimulated with interferon gamma (IFN-y) before ante after infection. The number of cells infected with T. gondii and the number of parasites per cell were determined by counting at least 100 cells in each experimental condition. Monoclonal anti-heparin antibody was used to determine the distribution of heparin on the surface of cells. Pre-treatment with heparin increased the rates of replication E8 cells, while, in human astrocytes heparin pre-treatment decreased intracellular parasite replication. The labeling for heparin was more discrete in the chick embryo fibroblasts, while in the retinal cells there was strong labeling. Astrocytes stimulated with IFN-y showed a little difference in the rates of infection and there was no detectable nitric oxide (NO) production in the stimulated cells. Retinal cells of chick embryos (E8) were more susceptible to infection by T. gondii than fibroblasts possible by differential distribution of heparin on the surface of these cells, which may facilitate adhesion and invasion by T. gondii. The inhibition of the replication of T. gondii by IFN-y in human astrocytes probably is independent from mechanisms involving NO production. O objetivo deste estudo foi determinar, em modelo in vitro, a influência de heparina na susceptibilidade de células da retina à infecção por Toxoplasma gondii. Culturas primárias de retina de embrião de galinha de 8 e 11 dias (E8 e E11) e de astrócitos da cabeça do nervo óptico humano foram mantidas em lamínulas durante aproximadamente uma semana, quando foram infectadas com taquizoítas de T. gondii por 24 horas. Fibroblastos de embrião de galinha e fibroblastos de prepúcio humano foram usados como controle. Parasitos foram pré-tratados com heparina e anticorpos anti-SAG-1, enquanto astrócitos humanos foram estimulados com IFN-y antes e após a infecção, sendo realizada dosagem de nitritos no sobrenadante destas células. As taxas de infecção (invasão), o índice global de infecção (invasão) e as taxas de replicação celular, foram determinados pela contagem de, no mínimo, 100 células por condição experimental. Anticorpo monoclonal antiheparina foi utilizado para determinar a distribuição de heparina na superfície das células. Pré-tratamento com heparina diminuiu o número de células E8 infectadas, porém, aumentou as taxas de replicação intracelular do parasito nos astrócitos humanos. A marcação para heparina foi discreta na maioria dos fibroblastos de embrião de galinha enquanto que, na cultura de retina, a grande maioria das células apresentou forte marcação. Astrócitos estimulados com IFN-y mostraram aumento significativo no índice global de infecção, mas houve produção de nitritos somente em níveis basais nas células estimuladas. Células de retina E8 e astrócitos humanos foram mais susceptíveis à infecção por T. gondii que fibroblastos possivelmente pela distribuição diferencial de heparina na superfície dessas células facilitando a invasão pelo T. gondii. A inibição da replicação de T. gondii por IFN-y em astrócitos humanos parece ser independente de mecanismos envolvendo a produção de nitritos. Doutor em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

Orientador: Alexandre Leite Rodrigues de Oliveira Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Durante o curso da encefalomielite autoimmune experimental ocorre uma grave redução das funções motoras e sensitivas. Esses eventos têm sido classicamente atribuídos ao processo desmielinizante da doença. Em ratos, os sinais clínicos da doença desaparecem 5 dias após completa tetraplegia, indicando que o processo desmielinizante não é a única causa da rápida evolução da doença. Assim sendo, investigamos as alterações sinaptológicas e o processo inflamatório induzidos pela encefalomielite autoimune experimental (EAE) em motoneurônios medulares e sua relação com o surto e remissão da doença. Para esse estudo, foram utilizados ratos Lewis, fêmeas de 7 semanas. Os animais foram induzidos à EAE por meio de dose única de proteína básica de mielina emulsificada com adjuvante completo de Freund e sacrificados no 13º dia após indução (surto grau 3) e no 26º dia (remissão da doença). Também, para investigar a possibilidade de que o tratamento com acetato de glatirâmer, uma droga imunomoduladora baseada na estrutura de aminoácidos da proteína básica de mielina, interfira no processo de plasticidade sináptica, os animais foram induzidos à EAE, tratados com AG diariamente e sacrificados após 2 semanas. Os grupos experimentais foram divididos em: estudo da aposição sináptica durante surto e remissão da doença e tratamento dos animais induzidos à EAE com AG. Assim, os espécimes foram processados para análise através de imunohistoquímica e microscopia eletrônica de transmissão. Nossos resultados indicaram que os componentes gliais (astrócitos e microglia), estimulados pela inflamação, desempenham papel ativo no processo de retração sináptica em motoneurônios alfa. Apresentamos evidências de que a eliminação de terminais sinápticos contribui para a perda da função motora observada no curso da doença e que o imunomodulador AG não só possui efeito antiinflamatório, mas também influencia diretamente na plasticidade de elementos neurais no microambiente medular. Reforçam, também, que um processo agudo de inflamação pode colaborar diretamente para a recuperação e sobrevivência neuronal, uma vez que as células inflamatórias produzem citocinas e fatores neurotróficos no microambiente medular Abstract: During the course of experimental autoimmune encephalomyelitis, a massive loss of motor and sensitive function occurs, which has been classically attributed to the demyelination process. In rats, the clinical signs disappear within 5 days following complete tetraplegia, indicating that demyelination might not be the only cause for the rapid evolution of the disease. The immunomodulador glatiramer acetate (GA) has been shown significantly reduce the seriousness of the symptoms during the exacerbation of the disease. However, little is known about its effects on the spinal motoneurons and on their afferents. The present work investigated the occurrence of experimental autoimmune encephalomyelitis-induced changes of the synaptic covering of spinal motoneurons during exacerbation and after remission and investigated whether GA has a direct influence on synapse plasticity and on the deafferentiation of motoneurons during the course of EAE in rats. Lewis rats were subjected to EAE associated with GA or placebo treatment. The animals were sacrificed after fifteen days of treatment. For the both cases the spinal cords was processed for immunohistochemical analysis (IH) and electron transmission microscopy. The terminals were typed with transmission electron microscopy as C-, F- and Stype. Immunohistochemical analysis of synaptophysin, glial fibrillary acidic protein and the microglia/macrophage marker F4/80 were also used in order to draw a correlation between the synaptic changes and the glial reaction. The ultrastructural analysis showed that, during exacerbation, there was a strong retraction of both F- and S-type terminals. In this sense, both the covering as well as the length of the remaining terminals suffered great reductions. However, the retracted terminals rapidly returned to apposition, although the mean length remained shorter. A certain level of sprouting may have occurred as, after remission, the number of F-terminals was greater than in the control group. The immunohistochemical analysis showed that the peak of synaptic loss was coincident with an increased macro- and microglial reaction. Interestingly, although the GA treatment preserved synaptophysin labelling, it did not significantly reduce the glial reaction, indicating that inflammatory activity was still present. Our results suggest that the major changes occurring in the spinal cord network during the time course of the disease may contribute significantly to the origin of the clinical signs as well as help to explain their rapid recovery and that the immunomodulator GA has a direct influence on the stability of nerve terminals in the spinal cord, which in turn may contribute to its neuroprotective effects during the course of multiple sclerosis Doutorado Anatomia Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Maria Alice da Cruz-Hofling Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: A barreira hematoencefálica (BHE) é a principal estrutura controladora da manutenção da homeostase do SNC. A perda da integridade da BHE em respostas inflamatórias do SNC, desencadeada por agentes neurotóxicos, têm sido associadas ao desenvolvimento de sinais neurológicos. O veneno da aranha Phoneutria nigriventer (PNV) produz sinais e sintomas excitatórios em humanos e sua ação neurotóxica sugere habilidade potencial em alterar a permeabilidade da BHE. Nesse trabalho, o PNV foi utilizado como ferramenta para avaliar a susceptibilidade da BHE em diferentes regiões anatômicas cerebrais de ratos. Após injeção sistêmica do PNV (0.85 mg/Kg in 0.5 ml), os ratos anestesiados foram perfundidos 1, 2 e 5 h após a injeção, com solução fixadora à qual foi adicionado traçador extracelular eletron-opaco. Córtex motor fronto-parietal, substância cinzenta periaquedutal, núcleos da base e amigdala foram dissecados e processados para microscopia eletrônica de transmissão. O estado funcional da BHE foi avaliado considerando evidências do vedamento da barreira (edema vasogênico e extravasamento do traçador) e a resposta de elementos do tecido circunjacente (astrócitos, terminais sinápticos, populações de células). Além disso, foi investigada a expressão das proteínas GFAP, o principal filamento intermediário dos astrócitos, proteína S100, uma família de proteínas ligantes de cálcio e as citocinas pró-inflamatórias, IFN-? e TNF-a, através de marcação imunohistoquímica, no hipocampo e cerebelo. Logo após a administração do PNV, os animais mostraram sinais indicativos de envolvimento do SNC, SNP e SNA. Nossos resultados mostraram que todas as regiões analisadas apresentaram sinais morfológicos de reação defensiva, tais como migração de micróglia perivascular reativa, pés-vasculares astrocitário edemaciados e macrófagos ativos circulantes. Entretanto, apenas o córtex motor fronto-parietal mostrou número significante de vasos afetados em relação aos controles e às outras áreas anatômicas (1 h p.i.). Nos grupos controle, uma expressão basal de GFAP e S100B foi mantida inalterada durante os períodos de observação, enquanto nenhuma produção fisiológica das proteínas TNFa e INF? ocorreu. Por outro lado, a análise dos grupos tratados com PNV mostrou que, variavelmente, todas as proteínas investigadas aumentaram sua expressão no cerebelo e hipocampo ao longo do tempo após a injeção do veneno. O aumento da GFAP no cerebelo foi mais precoce e mais forte do que no hipocampo. Essa gliose mais evidente no cerebelo, provavelmente justifica estudos prévios, onde o extravasamento do traçador foi menor nessa região do que hipocampo, demonstrando assim, uma maior resistência da BHE do cerebelo. Outros mecanismos moleculares envolvidos poderiam ser a expressão de citocinas pró-inflamatórias TNFa e INF?, cuja modulação diferente em hipocampo e cerebelo de animais tratados com PNV, poderia também ter papel nas diferenças de permeabilidade da BHE vistas em ambas as áreas após PNV. Nosso trabalho dá suporte à hipótese de que os sinais e sintomas apresentados pelos animais durante o intervalo de tempo, após a injeção de PNV e o sacrifício, refletem alterações fisiológicas em curso, que por sua vez se revela ao nível histológico e ultraestrutural no desigual envolvimento da BHE nas diferente regiões cerebrais analisadas. Os vasos do córtex motor fronto parietal foram mais afetados pelo PNV, do que as demais regiões, confirmando a existência de diferenças regionais na capacidade do tecido local de mediar eventos requeridos para que ocorram as alterações da permeabilidade da BHE e para a invasão de populações celulares. O veneno de Phoneutria nigriventer representa uma importante substância natural, cuja complexa composição pode ser explorada em relação à ação de drogas que agem no SNC Abstract: The blood¿brain barrier (BBB) is of pivotal importance to maintain homeostasis of the CNS, as it closely regulates the composition of the interstitial fluid in the brain. The loss of BBB integrity in CNS inflammatory responses triggered by neurotoxic agents has been associated with the development of neurological signs. Phoneutria nigriventer armed spider venom (PNV) produces excitatory signals and symptoms in humans, and its recognized neurotoxic action suggests a potential ability to alter BBB permeability. In this work, the PNV was used as tool to analyzing the BBB susceptibility of different rat brain anatomic regions. After PNV systemic injection (0.85 mg/ Kg in 0.5 ml) the rats were perfused at 1, 2 and 5 h post-injection (p.i.) with fixative solution to which had been added an electro-opaque extracellular tracer. Frontal-Parietal Motor Cortex, Periaqueductal Gray Matter, Base Nucleus and Amygdala were dissected and processed for routine transmission electron microscopy. The functional state of the BBB was evaluated considering evidences of the tightness of the barrier (vasogenic edema and tracer extravasation) and the response of elements of circumjacent tissue (astrocytes, synaptic endings, cells population). Besides, it was investigated the expression of the GFAP, the major intermediate filament of astrocytes, S100 protein, a family of calcium-binding proteins, and IFN-? and TNF-a pro-inflammatory cytokines, through imunohistochemistry labeling, in the hippocampus and cerebellum. Soon after PNV dministration the animals showed clinical signs indicative of peripheral, autonomic and central nervous system involvement. Our findings showed that all regions analyzed presented morphological signs of defensive reaction, such as migrating reactive perivascular microglia, swollen astrocytes end-feet and circulating active macrophages. However, only FPMC showed significant number of affected vessels in relation to controls and the other anatomic areas (1 h p.i.). A basal expression of GFAP and S100 was maintained unaltered along the periods of observation, whereas none physiologic production of TNFa and INF? proteins has occurred in control groups. In contrast, analysis of the PNV-treated groups showed that all investigated proteins variably enhanced its expression along the time-course after venom injection in cerebellum and hippocampus. The increase of GFAP in cerebellum is more precocious and stronger than in hippocampus. A more prominent reactive gliosis by cerebellum over hippocampus would be supposedly one of the molecular events underlying the previous findings showing to be cerebellum BBB more resistant to leakage than hippocampus. Other possible molecular mechanism involved would be the expression of proinflammatory TNFa and INF? cytokines, whose different modulation in cerebellum and hippocampus of PNV-treated animals could be also involved in differences of permeation of BBB seen in both areas. Our study further support the idea that the symptomatic interval after systemic P. nigriventer spider venom injection is characterized by sequential physiologic changes that are reflected in histological and ultrastructural preparations and reveal that BBB impairment is unequal in different anatomical brain areas. The Fronto-Parietal Motor Cortex vessels are more targeted for PNV, confirming the existence of regional differences in the capacity of the local tissue of mediating the events required for the changes of BBB permeability and for cell invasion. Phoneutria nigriventer venom represents an important natural substance, whose complex composition should be explored in terms of CNS acting drugs Mestrado Farmacologia Mestre em Farmacologia

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:58Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-06-23Bitstream added on 2014-06-13T19:36:21Z : No. of bitstreams: 1 godoy_gs_me_jabo.pdf: 837932 bytes, checksum: 779e6f97dccb483745e767a59be1738c (MD5) Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) Os astrócitos são células nervosas que participam da patogenia de diversas neuropatias que acometem os animais domésticos. Nas aves, a principal doença neurológica é a Encefalomalácia Nutricional causada pela deficiência de vitamina E. Com o objetivo de se estudar o comportamento do astrócitos, pelo exame imunoistoquímico, na patogenia da Encefalomalácia Nutricional em Gallus gallus domesticus, foi realizada a tentativa de indução desta doença. Utilizou-se para isto rações contendo deficiência de vitamina E no suplemento vitamínico-mineral e fontes de gordura oxidadas. Nos experimentos realizados não se obteve sucesso na indução da Encefalomalácia Nutricional, porém, em casos naturais reavaliados, constatou-se que os astrócitos participam na patogenia apresentando astrogliose e astrocitose nas áreas lesionadas e ao redor de vasos sangüíneos (barreira hemato-encefálica). Portanto, conclui-se que os astrócitos participam na patogenia da Encefalomalácia Nutricional em Gallus gallus domesticus e que, a etiologia da doença não é atribuída somente à deficiência de vitamina E na dieta. The astrocytes are nervous cells which participate in the pathogenesis of various neuropathies of domestic animais. In poultry; the main neurologic disorder is Nutricional Encephalomalacia, caused by vitamin E deficiency. With the aim to study the behavior of astrocytes in the Nutricional Encephalomalacia pathogenesis in Gallus gallus domesticus, by immunohistochemistry, a trial of induction of the disorder was realized. Low vitamin E and oxidized oi! rations were prepared. There was no success in the experimental induction of Nutricional Encephalomalacia, however, in re-evaluated naturally occurring cases, it could be observed that astrocytes undergo astrogliosis and astocytosis in the lesioned area and around blood vessels (hemato-encephalic barrier). Altogether, it may be concluded that astrocytes participate in the pathogenesis of the poultry's Nutricional Encephalomalacia, and that the disorder is not only caused by diets with the lack of vitamin E.

Submitted by Guilherme Lemeszenski (guilherme@nead.unesp.br) on 2013-08-22T18:50:37Z No. of bitstreams: 1 S0100-736X1999000300003.pdf: 466233 bytes, checksum: 53286c7fd4ad44ef146eaf887ecb5def (MD5) Made available in DSpace on 2013-08-22T18:50:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 S0100-736X1999000300003.pdf: 466233 bytes, checksum: 53286c7fd4ad44ef146eaf887ecb5def (MD5) Previous issue date: 1999-07-01 Made available in DSpace on 2013-09-30T19:41:42Z (GMT). No. of bitstreams: 2 S0100-736X1999000300003.pdf: 466233 bytes, checksum: 53286c7fd4ad44ef146eaf887ecb5def (MD5) S0100-736X1999000300003.pdf.txt: 22738 bytes, checksum: 1f0f601c49d3e572fa3fe17b76db28db (MD5) Previous issue date: 1999-07-01 Submitted by Vitor Silverio Rodrigues (vitorsrodrigues@reitoria.unesp.br) on 2014-05-20T13:15:53Z No. of bitstreams: 2 S0100-736X1999000300003.pdf: 466233 bytes, checksum: 53286c7fd4ad44ef146eaf887ecb5def (MD5) S0100-736X1999000300003.pdf.txt: 22738 bytes, checksum: 1f0f601c49d3e572fa3fe17b76db28db (MD5) Made available in DSpace on 2014-05-20T13:15:53Z (GMT). No. of bitstreams: 2 S0100-736X1999000300003.pdf: 466233 bytes, checksum: 53286c7fd4ad44ef146eaf887ecb5def (MD5) S0100-736X1999000300003.pdf.txt: 22738 bytes, checksum: 1f0f601c49d3e572fa3fe17b76db28db (MD5) Previous issue date: 1999-07-01 A proteína glial fibrilar ácida (GFAP), subunidade dos filamentos intermediários do citoesqueleto celular, está presente no citoplasma de astrócitos. Técnicas imunohistoquímicas com anticorpos primários anti-GFAP são geralmente empregadas para identificar astrócitos no sistema nervoso, permitindo verificar também sua hipertrofia. Vários estudos mostram a distribuição, a morfologia e a citoarquitetura de astrócitos em várias regiões do SNC do homem e de animais de laboratório. No entanto, em animais domésticos e, especialmente em equinos, poucas informações estão disponíveis. No presente trabalho, verificou-se a densidade e a morfologia de astrócitos imunorreativos à GFAP na substância branca da córtex cerebral de equinos com leucoencefalomalácia (LEM) comparando-se esses aspectos com o de equinos normais. Animais com LEM apresentaram hipertrofia de astrócitos em áreas próximas às lesões, representada pelo aumento do corpo celular, do núcleo e dos prolongamentos citoplasmáticos. O número de astrócitos apresentou-se reduzido e a imunorreatividade foi mais acentuada. Nos animais normais, verificou-se distribuição constante de astrócitos imunorreagentes com características de fibrosos. Alterações vasculares nos animais com LEM, como por exemplo degeneração de endotélio vascular, também foram observadas, podendo estar associadas às alterações astrocíticas. The glial fibrillary acidic protein (GFAP), subunit of the intermediary filaments of the cellular cytoskeleton, exists in the cytoplasm of astrocytes. Immunohistochemistry utilizing primary antibodies anti-GFAP is generally chosen to identify astrocytes in the central nervous system (CNS), allowing also to verify their hypertrophy. Several studies show the distribution, morphology and cytoarchitecture of the astrocytes in several areas of the CNS of humans and laboratory animals. However, in domestic animals, especially in horses, little information is available. In the present study the density and morphology of GFAP-immunoreactive astrocytes in the white matter of the cerebral cortex of horses with leukoencephalomalacia (LEM) has been compared with such aspects in normal horses. In animals with LEM hypertrophic astrocytes in areas close to the lesions were observed. There was enlargement of the perikarion, nucleus and the cytoplasmic extension. The astrocytes were reduced in number and the immunoreactivity was increased. In the normal animals constant distribution of immunoreactive cells characteristic of fibrous astrocytes was seen. Vascular changes in the animals with LEM, as for example degeneration of vascular endothelium, were also observed and could be correlated with the astrocytic alterations. Universidade Estadual Paulista Universidade Estadual Paulista