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Trabalho Final de Mestrado para obtenção do grau de Mestre em Engenharia Química e Biológica A enzima azoredutase PpAzoR de Pseudomonas putida tem uma elevada capacidade de clivagem da ligação azo dos corantes, em condições de anaerobiose. No entanto, é do conhecimento que as aminas aromáticas formadas apresentam, em alguns casos, níveis mais elevados de toxicidade do que a verificada para os corantes iniciais. A utilização da enzima CotA-lacase de Bacillus subtilis que oxida vários substratos, incluindo aminas aromáticas, em condições de aerobiose, foi usada para transformar as aminas aromáticas, resultantes da ação da PpAzoR. Nesta dissertação, o objetivo foi a identificação e caracterização dos produtos formados pela ação sequencial das enzimas PpAzoR e CotA-lacase sobre oito corantes azo (AR266, DB38, DR80, MB3, MB9, MB17, RB5 e RY145) utilizando HPLC e 1H RMN. Para tal, após transformação das células de Escherichia coli, foram obtidas as estirpes recombinantes a superproduzir as enzimas PpAzoR e CotA-lacase, que foram purificadas, e as respetivas atividades determinadas. As velocidades de descoloração para a PpAzoR com os corantes selecionados foram determinadas. Foram realizadas reações em larga escala sendo que, num primeiro passo, os corantes foram degradados por ação da PpAzoR, produzindo-se as aminas aromáticas correspondentes e, sequencialmente foi adicionada CotA-lacase. O objetivo último deste trabalho é o desenvolvimento de novas estratégias para produzir compostos de elevado valor acrescentado a partir de efluentes contendo corantes, contribuindo deste modo para a criação de uma economia circular e uma inteligente e eficiente utilização de recursos. Os produtos da reação dos DR80, MB3, MB17, MB9 e RY145 com a azoredutase PpAzoR foram identificados como aminas aromáticas. No entanto verificou-se, em todos os casos, a ausência inesperada de pelo menos uma amina nas misturas reacionais, o que se pode prender com alguns fatores, como o desarejamento insuficiente ou o tratamento de amostras para análise por RMN. Na análise dos produtos resultantes da ação da CotA-lacase sobre as aminas aromáticas, verificou-se que algumas destas são substrato desta enzima, levando à produção de fenazinas e orto-quinonas. Estes compostos podem ser utilizados em numerosas aplicações, como indústrias de tintas de cabelo, farmacêutica ou de diagnóstico. Abstract: The azoreductase PpAzoR from Pseudomonas putida has the ability to cleave the azo bond of azo dyes, under anaerobic conditions. However it is know that the aromatic amines produced exhibited, in some cases, high levels of toxicity. The laccase CotAlaccase from Bacillus subtilis oxidize several substrates, including aromatic amines under aerobic conditions. Therefore, this enzyme was used to transform the aromatic amines, resulting from the PpAzoR activity and it was found that this activity lowers significantly the toxicity of the products. In this thesis, the aim was to identify and characterize the products of the mult i-step enzymatic reactions with eight different synthetic azo dyes (AR266, DB38, DR80, MB3, MB9, MB17, RB5 and RY145) using HPLC and 1H NMR. To this end, after transformation of Escherichia coli cells, the recombinant strains to overproduce the enzymes were obtained. After purification steps, the enzymatic activity for both enzymes, PpAzoR and CotA-laccase, were determined and the decolourisation rates forPpAzoR with the selected dyes were also determined. Large-scale reactions were carried out, where in a first step, the dyes have been degraded by the action of PpAzoR, yielding the corresponding aromatic amines, and sequentially CotA-laccase was added. The final goal is the development of new strategies to produce high-value compounds from underutilized dye-containing wastewater effluents, contributing for the creation of a circular economy and for the smart and efficient use of resources. In reaction using DR80, MB3, MB9, MB17 and RY145 dyes, aromatic amines have been identified. However the absence of at least one of the amines in the reaction mixtures was noticed, most likely related with the insufficient deaeration or the procedures followed in the sample treatment for NMR analysis. In the analysis of products resulting from the CotA-laccase activity, it was found that some aromatic amines act as substrate for this enzyme, leading to the formation of phenazines and orto-quinones. These are compounds that are currently used in a number of applications in industries of compounds for hair dying, pharmaceutical and diagnosis.

Many well-established methods for antioxidant capacity (CAO) determination are described in literature for a wide samples variety, and these only two methods DPPH• and ABTS•+ exploring radicals as spectrophotometric probes for analytical purpose. However, these methods have some limitations such as slower kinetic, solvent polarity effect, hydro and lipophilicity of compounds, chemical cost, among others. Thus, the aim of this study was the development an alternative spectrophotometric method for CAO determination in beverages exploring cation radicals derived from aromatic amines: DMPD, DEPD, EHPD and EHMPD. The chemical and physical parameters of the method were optimized for DEPD such as amine model and after these steps the optimal conditions was applied for other aromatic amines. The spectrophotometric method proposed was based on aromatic amines oxidation by Fe(III) ions (pH = 4.0) leading to corresponding purple color cation radical with max = 500 nm (DEPD•+) and 510 nm (DMPD•+, EHPD•+ and EHMPD•+). After the radical formation the addition of an antioxidant compound lead to color reduction intensity of solution, proportional to the antioxidant concentration in the medium. In the optimization method the allowing parameters was evaluated: time of the cation radical generation and reaction of different species, pH, reactants and buffer concentration, amine and Fe(III) ratio and organic solvents and counter ions effect. To reactivity radicals cation generated evaluated was employed the EC50 values (ability to inhibit 50% of their radical) of 17 compounds (phenolic, thiolic, glycosylated and reducing salt). The lower EC50 values were obtained for phenolic compound (caffeic acid, tannic acid and L-dopa) and higher for N-propyl gallate, rutin and N-acetylcysteine. Electrochemical studies using cyclic voltammetry and theoretical quantum calculations of amines evaluated were performed for a better processes understanding. For the aromatic amines cathode (Epc) and anodic (Epa) potential were obtained in five sweep speeds, and the voltammetric profile showed quasi-reversible redox process. The electrostatic potential map, HOMO and LUMO energies were calculated indicating the possible reactive sites to oxidation reactions. The main analytical figures were calculated using gallic acid (GA), tannic acid (TA), ascorbic acid (AA) and quercetin (QC) (for DEPD•+), for the other probes AG only was used as reference, except EHMPD•+, which was employed trolox (TR). In the method with DEPD amine AG presented the narrower (0.10 - 1.25 mg L-1) and ascorbic acid (0.50 - 7.5 mg L-1) the widest linear range, the values of limit of detection (LOD) varied from 0.0002 mg L-1 (AG) to 0.002 mg L-1 (AT), while the relative standard deviation (RSD) ranged from 0.9 to 9.2%. The spectrophotometric probes DMPD•+, EHPD•+, EHMPD•+ showed linear ranges variables being the widest to EHMPD•+ (0.50 - 5.0 mg L-1 at TR equivalent) and closer to the DMPD•+ (0.2 to 1.2 mg L-1 at GA equivalent). The values of RSD obtained were all less than 2.0% indicating good analytical precision. The methods developed were applying in wines, teas and infusions samples (14≤ N ≤ 30) and the data obtained compared with Folin-Ciocalteu (FC), Folin-Denis (FD), ABTS and DPPH methods. Linear correlation analysis at the level of 95% confidence was employed for results comparison and was observed good agreement and correlation coefficient r > 0.9000, and the correlations between EHMPD and ABTS (r = 0.8797) and EHMPD and FC (r = 0.8415) showed that the lower linear coefficients. Thus, the method developed exploring the radical cations of aromatic amines as spectroscopic probes proved simple, accurate and consistent with other assays for determination of total phenolic compounds and antioxidant capacity. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Existem na literatura muitos métodos bem estabelecidos para a determinação da capacidade antioxidante (CAO) em uma variedade de amostras, dois deles empregando reações com radicais como sondas espectrofotométricas, DPPH• e ABTS•+. No entanto, tais métodos apresentam algumas limitações como cinética lenta, efeito de solventes, polaridade dos compostos, custo dos reagentes, entre outros aspectos. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi desenvolver um método espectrofotométrico alternativo para determinação da CAO em bebidas empregando radicais cátions derivados das aminas aromáticas: DMPD, DEPD, EHPD e EHMPD. Os parâmetros químicos e físicos do método foram otimizados para a amina DEPD e aplicados às outras aminas. O método espectrofotométrico proposto foi baseado na oxidação das aminas aromáticas pelo Fe(III) (pH = 4,0) levando à formação dos respectivos cátions radicais de coloração púrpura e, com máx de 500 nm (DEPD•+) e 510 nm (DMPD•+, EHPD•+ e EHMPD•+). Após a sua formação, os radicais produzidos apresentavam redução da intensidade da coloração proporcional à concentração de compostos antioxidantes no meio. Os parâmetros tempo de geração e reação do radical, pH, concentração dos reagentes e da solução tampão, proporção amina e Fe(III), efeito de solventes orgânicos e contra-íons foram otimizados. Para avaliar a reatividade dos radicais cátions gerados, foram calculados os valores de EC50 (capacidade de inibir 50% do respectivo radical) para 17 compostos diferentes (fenólicos, tiólicos, glicosilados e sais redutores). Os menores valores de EC50 foram obtidos para os compostos fenólicos (ácido cafeico, ácido tânico e L-dopa) e os maiores para N-propilgalato, rutina e N-acetilcisteína. Para um melhor entendimento dos processos envolvidos foram realizados estudos eletroquímicos empregando voltametria cíclica e cálculos teórico-quânticos das aminas avaliadas. Os potenciais catódicos (Epc) e anódicos (Epa) das aminas foram obtidos em cinco velocidades de varredura, e o perfil voltamétrico indicou tendência quase-reversível para o processo redox. Os mapas de potencial eletrostático e as energias dos orbitais HOMO e LUMO foram calculados, indicando os possíveis sítios reativos em reações de oxidação. As principais figuras de mérito foram calculadas empregando ácido gálico (AG), ácido tânico (AT), ácido ascórbico (AA) e quercetina (QC) (para o DEPD•+), para as demais sondas foi utilizado apenas AG como referência, exceto para a EHMPD•+, para qual sem empregou trolox (TR). Em relação ao método com a amina DEPD, a faixa linear mais estreita foi obtida para o AG (0,10 – 1,25 mg L-1) e a mais ampla para o ácido ascórbico (0,50 – 7,50 mg L-1), os valores de limite de detecção (LOD) variaram de 0,0002 mg L-1 (para AG) a 0,002 mg L-1 (para AT), enquanto o desvio padrão relativo (RSD) variou de 0,9 a 9,2%. As sondas DMPD•+, EHPD•+ e EHMPD•+ apresentaram faixas lineares variáveis, sendo a mais ampla para EHMPD•+ (0,50 – 5,0 mg L-1 em equivalente de TR) e a mais estreita para o DMPD•+ (0,2 – 1,2 mg L-1 em equivalente de AG). Os valores de RSD obtidos foram todos inferiores a 2,0% indicando boa precisão analítica. O método foi aplicado às amostras de vinhos, chás e infusões (14 ≤ N ≤ 30) e os resultados foram comparados aos métodos de Folin-Ciocalteu (FC), Folin-Denis (FD), ABTS e DPPH. Os resultados obtidos foram submetidos a uma análise de correlação linear para um intervalo de 95% de confiança, mostrando-se concordantes e com coeficiente de correlação r >0,9000 para a maioria dos ensaios, sendo as correlações entre EHMPD e ABTS (r = 0,8797) e EHMPD e FC (r = 0,8415) as que apresentaram os menores coeficientes. Dessa forma, o método desenvolvido explorando os radicais cátions das aminas como sondas espectrofotométricas mostrou-se simples, preciso e concordante com outros ensaios para determinação de compostos fenólicos totais e capacidade antioxidante.

A facultative Staphylococcus arlettae bacterium, isolated from an activated sludge process in a textile industry, was able to successfully decolourize four different azo dyes under microaerophilic conditions (decolourization percentage >97%). Further aeration of the decolourized effluent was performed to promote oxidation of the degradation products. The degradation products were characterized by FT-IR and UV–vis techniques and their toxicity with respect to Daphnia magna was measured. The amine concentrations as well as the total organic carbon (TOC) levels were monitored during the biodegradation process. The presence of aromatic amine in the microaerophilic stage and its absence in the aerobic stage indicated the presence of azoreductase activity and an oxidative biodegradation process, respectively. TOC reduction was ∼15% in the microaerophilic stage and ∼70% in the aerobic stage. The results provided evidence that, using a single Staphylococcus arlettae strain in the same bioreactor, the sequential microaerophilic/aerobic stages were able to form aromatic amines by reductive break-down of the azo bond and to oxidize them into non-toxic metabolites., The authors would like to thank the Portuguese Foundation of Science and Technology (FCT) for providing the grant to Andrea Zille (SFRH/BPD/24238/2005), and the Brazilian Foundation for the Coordination of the Improvement of University Graduates of the Ministry of Education (CAPES) and the National Research Counsel (CNPq) for providing the grants to Elisangela Franciscon.

A degradação do antimicrobiano digluconato de clorhexidina (DGCH) durante armazenamento ou processamento térmico pode formar a 4-cloroanilina (CA), um composto potencialmente carcinogênico. Conseqüentemente, o uso deste sanitizante para descontaminação de carcaças de frangos representa uma fonte de risco para o consumidor, devendo ser avaliada a presença da CA no produto tratado. Um método foi desenvolvido para determinação de resíduos de CA em tecidos de frangos. Após a extração com diclorometano, foi feita a limpeza do extrato em cartucho C18 e quantificação por cromatografia gasosa-espectrometria de massas (CG-EM), sem derivação. A recuperação média (89,2% - CV 9,9%.) e o limite de detecção (1,8ng/g) foram considerados satisfatórios para os propósitos do estudo. Em amostras tratadas com DGCH e não submetidas a processamento térmico, a quantidade de CA detectada foi relativamente baixa, e provavelmente se originou da solução de tratamento. A fritura e a cocção em forno convencional resultaram em níveis elevados de CA, enquanto que a cocção em panela de pressão não alterou os níveis de CA presentes na amostra crua. Em vista destes resultados e, considerando-se o potencial tóxico da CA, recomenda-se que estes dados sejam levados em consideração quando avaliada a utilização de DGCH como sanitizante de carcaças em abatedouros de aves. The degradation of the antimicrobial agent chlorhexidine digluconate (CHDG) during storage or thermal process originates 4-chloroaniline (CA), a compound which is potentially carcinogenic. As the use of this sanitizing agent to decontaminate poultry carcasses in processing plants may represent a risk to the consumers, it is important to search for the presence of CA residues in the treated products. A method was developed to quantify CA in poultry tissues. After dichloromethane extraction, the extract was cleaned on a C18 cartridge and the quantitation was performed, without derivatization, by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). The mean recovery (89.2% - CV 9.9% ) and detection limit (1.8ng/g), were satisfactory for the purposes of the study. Analysis of samples treated with CHDG, before thermal processing, resulted in low CA levels, which probably originated from the treating solution. Frying and cooking in conventional oven resulted in relatively higher levels of CA, while cooking under pressure did not change the residual levels when compared to the raw samples. In view of these results and taking into consideration the toxic potential of CA, the data generated by this study should be considered in the case of use of chlorhexidine as poultry carcasses sanitizing agent.