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Orientadores: Marcos Antonio Machado, Ronaldo José Durigan Dalio Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A citricultura brasileira ocupa lugar de destaque no cenário mundial, onde o Brasil, atualmente, é um dos maiores produtores de laranja e principal exportador de suco concentrado. Em meio aos patógenos causadores de doenças em citros, destaca-se as espécies de "Phytophthora". A podridão de raiz e a gomose do tronco, provocadas pelo oomiceto "Phytophthora parasitica", é uma das mais graves doenças que acometem culturas de citros no âmbito mundial. Nas últimas décadas, avanços em genômica de patógenos revelaram uma quantidade muito grande de moléculas efetoras que possuem função fundamental na infecção. Sabe-se que os oomicetos patógenos de plantas e, principalmente as espécies de "Phytophthora", secretam proteínas efetoras para manipular as defesas das plantas, o que viabiliza a infecção e colonização. Os efetores citoplasmático Crinkler (CRN) formam uma família grande e diversa de proteínas secretadas, e identificadas de uma vasta gama de genomas de oomicetos sequenciados. Trifoliata ("Poncirus trifoliata") e tangerina Sunki ("Citrus sunki"), dois porta-enxertos amplamente utilizados na citricultura, apresentam interação de resistência e suscetibilidade com "P. parasitica", respectivamente, o que os torna modelos adequados para o estudo de mecanismos entre o patógeno e seus hospedeiros. As bases moleculares dessas interações permanencem pouco conhecidas. O presente trabalho objetivou identificar moléculas efetoras de P. parasitica envolvidas na interação com "P. trifoliata" e "C. sunki". Buscou-se também caracterizar funcionalmente proteínas efetoras da família Crinkler (CRNs) e elucidar alguns dos mecanismos dessas espécies em resposta a essas moléculas. Os algoritmos de GeNorm e NormFinder foram utilizados para avaliar os melhores genes de referência. Os genes mais estáveis para RT-qPCR análise de expressão em "P. trifoliata" foram GAPC2 e F-BOX, enquanto EGIDH e GAPC2 foram mais adequados para "C. sunki". A expressão ao longo do tempo de vários genes relacionados com a defesa de plantas foi avaliada em associação com o progresso da doença, resposta de hipersensibilidade e expressão de efetores de "P. parasitica". Efetores do tipo elicitinas, NPP1, CBEL, RxLR e CRN foram identificados como tendo sua expressão regulada positivamente em resposta a infecção em "C. sunki" (genótipo suscetível). Para detectar a presença de ROS foi utilizado DAB (3,3'-diaminobenzidina). A partir dos ensaios com DAB observou que "C. Sunki" responde ativando as principais vias de sinalização de defesa, resultando em resposta de hipersensibilidade (HR) e necrose. Apesar de forte, esta resposta de defesa não é eficiente para deter a invasão de "P. parasitica", provavelmente devido ao seu estilo de vida hemibiotrófico. Durante a infecção de "P. trifoliata" os efetores CRN, RxLR, CBEL, NPP-1 e Elicitina foram fortemente expressos em "P. parasitica", porém não induziram nenhuma modulação da imunidade, sugerindo um tipo de resistência não-hospedeiro, em que a planta se baseia em barreiras bioquímicas e anatômicas pré-formadas. Foram encontrados 80 candidatos a efetores Crinkler (CRN) no genoma de "P. parasitica". Alguns CRNs são exclusivos de "P. parasitica" IAC_01/95.1. Os níveis de expressão de efetores CRNs de P. parasitica na interação com "C. sunki" e "P. trifoliata" apresentaram expressão diferencial ao longo de 3, 6, 12, 24, 48, e 96 horas após infecção nos dois genótipos estudados. As análises de expressão gênica envolvendo efetores Crinkler demonstram um mecanismo finamente regulado de expressão de CRNs em "P. parasitica" em resposta a diferentes hospedeiros. Após agroinfiltração em "N. benthamiana", foi observado que o efetor PpCRN7 tem atividade epistática (sinérgica) quando co-infiltrado com elicitina INF-1 ao potencializar a reação de hipersensibilidade (HR), já PpCRN20 é supressor de HR. Os efetores PpCRN7 e PpCRN20 desencadeiam susceptibilidade em plantas e favorecem a colonização pelo patógeno Abstract: Brazilian citriculture occupies an outstanding place in the worldwide scenario, where Brazil, nowadays, is one of the largest producers of orange and the main exporter of concentrate juice. Among the pathogens that cause citrus diseases, "Phytophthora" species play an important role. Root rotteness and stem gummosis, caused by the oomycete "Phytophthora parasitica", is one of the most serious diseases affecting citrus crops in the world. In the last decades, advances in pathogen genomics have revealed a very large number of effector molecules that play a key role in infection. It is known that pathogenic oomycetes of plants, and especially "Phytophthora", secrete effector proteins to manipulate plant defenses and to make possible infection and colonization. Crinkler cytoplasmic effectors (CRN) form a large and diverse family of secreted proteins, and are identified from a wide range of sequenced oomycete genomes. Trifoliata ("Poncirus trifoliata") and Sunki tangerine ("Citrus sunki"), two rootstocks widely used in citrus cultivation, present tolerance and susceptibility in the interaction with "P. parasitica", respectively, making them suitable models for the study of mechanisms between the pathogen and their hosts. The molecular basis of these interactions remain not completely known. The present work had as goal to identify effector molecules of "P. parasitica" involved in the interaction with "P. trifoliata" and "C. sunki". It was also sought to characterize the effector proteins of the family Crinkler (CRN) and elucidate some of the mechanisms of these species in response to these molecules. The algorithms GeNorm and NormFinder were used to evaluate the best reference genes. The most stable genes for RT-qPCR expression analysis in "P. trifoliata" were GAPC2 and F-BOX, whereas EGIDH and GAPC2 were more suitable for "C. sunki". The expression over time of various genes related with the defense was evaluated in association with disease progress, hypersensitivity response and expression of effectors of "P. parasitica". Effectors of the type elicitins, NPP1, CBEL, RxLR and CRN were identified as having its expression regulated positively in response to infection in "C. sunki" (susceptible genotype). To detect the presence of ROS, it was used DAB (3,3'- diaminobenzidine). From the DAB assays it was observed that "C. sunki" responds by activating the main signal course of defense, resulting in hypersensitivity (HR) response and necrosis. Although strong, this defense response is not effective in stopping invasion of "P. parasitica", probably because of its hemibiotrophic lifestyle. During the infection of "P. trifoliata", the effectors CRN, RxLR, CBEL, NPP-1 and Elicitin were strongly expressed in "P. parasitica", but did not induce any manipulation of immunity, suggesting a type of non-host resistance, in which the plant bases on pre-formed biochemical and anatomical barriers. Were found 80 candidates for Crinkler effectors (CRN) in the genome of P. parasitica. Some CRNs are unique to "P. parasitica" IAC_01 / 95.1. The levels of expression of P. parasitica CRN effectors in the interaction with "C. sunki" and "P. trifoliata" showed differential expression over 3, 6, 12, 24, 48 and 96 hours after infection in the two genotypes studied. Gene expression analyzes involving Crinkler effectors demonstrate a finely regulated mechanism of expression of CRNs in "P. parasitica" in response to different hosts. After agro-infiltration in N. benthamiana, it was observed that the effector PpCRN7 has epistatic activity (synergistic) when co-infiltrated with elicitin INF-1 by potentiating the hypersensitivity (HR) reaction, but PpCRN20 was already a suppressor of HR. The effectors PpCRN7 and PpCRN20 trigger susceptibility in plants and make possible the colonization by the pathogen Doutorado Bioquímica Doutor em Biologia Funcional e Molecular FAPESP 465450/2014-2 CNPQ 2014/50880-4