Search

Human p14.5 perchloric acid-soluble protein (PSP) is a member of family (YER057c/YJGF family) of small proteins. The highly conserved throughout evolution proteins are characterized as multifunctional proteins comprised of ~ 80 homologues exhibiting varying degrees of sequence homology from 38% to 93%. The proteins involved in different cellular pathways of lower and higher eukaryotes. The biological role of these proteins is not yet well characterized. Human p14.5 protein is homologue of UK114 protein extracted from goat liver and characterized as tumor antigen. Antibodies against UK114 mediate in vitro complement-depended cytolysis of human cancer cells. This suggests that the expression of human p14.5 protein on the cells membrane might be an event related to neoplasmic transformation. The involvement of PSP into cellular growth and proliferation was discussed in several recent studies. All presented research findings demonstrate that human p14.5 gene acts as human cancer antigen and is involved into cellular proliferation events. Human p14.5 gene has been characterized by a differentiation-dependent mRNA and protein expression based on the observation of a low expression in a variety of liver and kidney tumor cells and a high expression in fully differentiated cells. At the beginning of the research study only kDNA sequence of human p14.5 gene was available. No data were available about human p14.5 gene full structure, coding protein p14.5 structure, biological functions... [to full text]

Immobilized enzymes are a common tool in modern biotechnology and diagnostics. Such enzymes often have a wider pH and temperature limits of operation and enhanced thermostability. They are easy to use and can be adapted for multiple use, for that reason their market is rapidly growing. Another widely used tool in biotechnology - magnetic particles. Their synthesis is easy, the produced particles are homogeneous and correct size. Magnetic particles used in the experiments had differently modified hydrophobic and hydrophilic surfaces. Direct coupling - enzyme immobilization onto the magnetic particles through the tosyl or epoxy groups, which results in a covalent bond between the magnetic bead and the primary amine of the enzyme (https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/Surface_Activated_Dynabeads.PDF). Indirect coupling – immobilization of biotinylated enzyme on magnetic particles coated with streptavidin, which comprises a non-covalent complex (https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/Dynabeads_Streptavidin_Products_and_Applications.pdf). Polymerase and nuclease were selected for the experiments. Specific and functional activities, multi-use of coupled enzymes were studied during the experiments. It was found that bound enzymes show significantly lower specific activity. Nuclease is more likely directly couple to magnetic beads with hydrophobic surface, and polymerase – indirectly to magnetic beads with hydrophilic surface. Nuclease retained specific activity after re-use, while polymerase lost it.

Tiriant DNR ir RNR, neretai svarbu prijungti įvairius reporterinius ar giminingumo žymenis griežtai apibrėžtose (sekos) vietose – t.y. specifiškai. Tam galima pasitelkti fermentus metiltransferazes (MTazes). Natūraliai jos naudoja kofaktorių AdoMet, tačiau gali būti aktyvios ir su sintetiniais jo analogais, turinčiais ilgesnes nei metil- pernešamas grandines. Jei šios grandinės turi galines funkcines grupes, prie jų vėliau cheminių reakcijų pagalba galima prijungti norimus žymenis. Tam itin patogi azidų-alkinų cikloprijungimo (AAC), dar vadinama „click“, reakcija. Šiame darbe parodyta, kad DNR citozino-5 MTazė HhaI (variantas Q82A/Y254S/N204A) efektyviai katalizuoja sekai specifinę heks-2-inil- grandinių, turinčių galines alkinil- arba azido- grupes, pernašą nuo sintetinių kofaktorių ant DNR. Naudojant šią MTazės-kofaktorių sistemą bei AAC, visą specifinio DNR žymėjimo procesą galima atlikti netgi ląstelių lizate. RNR žymėjimui ištirtas archėjų RNR 2‘-O-MTazės C/D ribonukleoproteininio komplekso aktyvumas su sintetiniais kofaktoriais. Parodyta galimybė sintetiškai keičiant kreipiančiąją RNR, prop-2-inilgrupės pernašą nukreipti į norimas įvairių substratinių RNR sekos vietas ir po to AAC reakcijos pagalba prijungti fluoroforą. Taigi, sukurtas naujas molekulinis įrankis, leidžiantis be suvaržymų pasirinkti norimą pažymėti RNR seką. Šios naujos specifinio nukleorūgščių žymėjimo galimybės gali būti pritaikytos biochemijos, biomedicinos, nanotechnologijų ir kitose tyrimų srityse... [toliau žr. visą tekstą] Investigation of RNA and DNA function often requires sequence-specific incorporation of various reporter and affinity probes. This can be achieved using AdoMet-dependent methyltransferases (MTases) as they can be active with synthetic AdoMet analogues equipped with transferable chains larger than the methyl group. These chains usually carry reactive groups that can be further chemically appended with required reporters. For this, azide-alkyne 1,3-cycloaddition (AAC), also called “click”, reaction is particularly attractive. This work shows that the HhaI cytosine-5 DNA MTase (variant Q82A/Y254S/N204A) catalyzes efficient sequence-specific transfer of hex-2-ynyl side chains containing terminal alkyne or azide groups from synthetic cofactor analogues to DNA. Both the enzymatic transfer and subsequent “click” coupling of a fluorophore can be performed even in cell lysates. For RNA labeling, the activity of an archaeal RNA 2‘-O-MTase C/D ribonucleoprotein complex (RNP) with synthetic cofactors was investigated. It was shown that synthetically reprogrammed guide RNA sequences can be used to direct the C/D RNP-dependent transfer of a prop-2-ynyl group to predetermined nucleotides in substrate RNAs. Followed by AAC this can be used for programmable sequence-specific labeling of a variety of RNA substrates in vitro. These new possibilities for specific labeling of nucleic acids can be adopted in biochemistry, biomedical, nanotechnology, etc. research.

Baigiamojo darbo tikslai – nustatyti neefektyvios žmogaus virusų glikobaltymų raiškos mielėse priežastis ir sukurti mielių kamienus su integruotais žmogaus ląstelių sekrecinio kelio genais bei ištirti jų įtaką glikobaltymų sintezei ir brendimui mielėse. Darbo eigoje pirmą kartą buvo aprašytos tymų viruso hemagliutinino (TVH) sintezės galimybės mielėse Saccharomyces cerevisiae ir Pichia pastoris. Parodyta, kad mielių ko-transliacinio baltymų perkėlimo į endoplazminį tinklą (ET) ir ET baltymų sulankstymo mechanizmai nėra pritaikyti sudėtingų virusinių baltymų brendimui, todėl klasikinės mielių rūšys ir standartiniai rekombinantinių baltymų raiškos ir gryninimo protokolai nėra tinkami diagnostikai ir vakcinų kūrimui reikalingo TVH baltymo gavimui. Proteominė S. cerevisiae ląstelių, sintetinančių TVH baltymą, analizė leido nustatyti kad, TVH sintezė mielėse sukelia neseniai literatūroje aprašytą citoplazminį nesusivyniojusių baltymų atsaką (UPR-cyto). Pagrindinis šiame darbe aprašyto atsako į stresą požymis yra ypatingai didelių baltymų agregatų, kurių šerdį sudaro TVH ir mielių eEF1A baltymai, susidarymas. Žmogaus tipo ko-transliacinį baltymų pernešimą į ET mielių ląstelėse bandyta atkurti perkeliant žmogaus SRP, Sec61 kompleksų ir TRAM1 baltymus, o siekiant sukurti tinkamas TVH baltymo brendimui sąlygas, mielių ląstelių ET buvo sintetinami pagrindiniai žmogaus ląstelių ET šaperonai – BiP, kalretikulinas, kalneksinas, PDI ir ERp57. Nors šiame darbe nepavyko sukurti mielių... [toliau žr. visą tekstą] The aims of the study were to determine the reasons for unsuccessful expression of measles virus hemaglutinin (MeH) in the yeast cells and to generate a stable yeast strains with integrated genes of protein secretory pathway of human cells and to examine influence of coded human proteins on MeH maturation. For the firs time, overexpression of MeH in yeast S. cerevisiae and P. pastoris was described. It was demonstrated that mechanisms of cotranslational translocation into the endoplasmic reticulum (ER) and protein maturation in the ER of yeast cells are not adapted to deal with for such complex virus glycoproteins. Proteomic analysis revealed, that overexpression of human virus surface protein precursors induces cytosolic unfolded protein response (UPR-cyto) in the yeast S. cerevisiae. A key feature of this response is the formation of extremely large aggregates involving macromolecular structures of eEF1A. Efficient mammalian like cotranslational translocation pathway was attempted to reconstitute in yeast cells by transferring human SRP, Sec61 complexes and TRAM1 protein. Human chaperones BiP, clanexin, calreticulin, ERp57 and PDI were transferred to the yeast cells to create suitable environment for maturation of MeH in the ER. Even though yeast strains, able to produce biologically active MeH protein, were not generated during this study, results show, that humanization of yeast secretory pathway, designed for producing active virus glycoproteins, is possible.

DNR citozino-5 metiltransferazės (MTazės) atpažįsta specifines DNR sekas ir katalizuoja metilgrupės pernešimą nuo kofaktoriaus AdoMet ant taikinyje esančio citozino. Šiame darbe nagrinėjami abu MTazių veikimo mechanizmo aspektai. Baltymų inžinerijos ir kryptingos evoliucijos metodais pašalinant vienos iš dviejų taikinio atpažinimo kilpų funkciją, MTazės HhaI atpažįstamas taikinys GCGC pakeistas į GCG. Dėl įvestų struktūros pakeitimų nauja unikalaus specifiškumo MTazė efektyviai katalizuoja ne tik metilo, bet ir didesnių grupių pernešimą nuo sintetinių kofaktoriaus analogų, ir gali tapti naudingu molekulinės biologijos įrankiu. Katalitinės reakcijos metu MTazės kilpa užsidaro, apglėbdama surištą DNR, o taikinio citozinas išsukamas iš DNR spiralės ir aktyvuojamas, kovalentiškai prisijungiant katalitiniam cisteinui. Šiems greitiems prieškatalitiniams procesams tirti buvo panaudotas naujas metodas, leidžiantis realiu laiku stebėti M.HhaI sąlygotą citozino išsukimą bei kovalentinę aktyvaciją, registruojant mažus UV absorbcijos pokyčius gamtinį substratą atitinkančioje DNR. Pirmą kartą parodyta, kad M.HhaI katalizuojamoje reakcijoje citozino išsukimas ir katalitinės kilpos užsidarymas vyksta sinchroniškai, o kovalentinė citozino aktyvacija ir metilgrupės pernešimas yra kinetiškai netapačios katalitinio ciklo stadijos. Kadangi naujasis metodas remiasi fundamentine nukleorūgščių savybe – hiperchrominiu efektu, todėl jis gali būti naudojamas ir kitų DNR bazę išsukančių baltymų... [toliau žr. visą tekstą] DNA cytosine-5 methyltransferases (MTases) recognize short DNA sequences and catalyze the transfer of the methyl group from the cofactor AdoMet to the C5-position of a target cytosine. In this work both these aspects of the MTase mechanism have been addressed. First, using rational protein design and directed evolution approaches the specificity of the HhaI MTase, GCGC, has been changed to GCG by functional elimination of one of the two target recognition elements. In addition, the introduced structural changes endowed the MTase with the ability to transfer extended groups from synthetic cofactor analogs, providing the first example of a dual specificity change in a DNA MTase. Second, the kinetics of fast pre-catalytic conformational transitions in the MTase and DNA has been investigated. A new method to follow the target cytosine flipping and its subsequent covalent activation has been proposed, which allows a direct real-time observation of these processes by monitoring associated UV absorbance changes in a chemically unperturbed DNA. These studies for the first time demonstrate that the flipping of the target cytosine and the closure of the catalytic loop in the enzyme occur simultaneously, whereas the covalent activation of the target cytosine and the transfer of the methyl group are temporally distinct steps in the catalytic cycle of M.HhaI. Since the new method is based on the general phenomenon of hyperchromicity, it is thus applicable for studies of other systems... [to full text]

DNA cytosine-5 methyltransferases (MTases) recognize short DNA sequences and catalyze the transfer of the methyl group from the cofactor AdoMet to the C5-position of a target cytosine. In this work both these aspects of the MTase mechanism have been addressed. First, using rational protein design and directed evolution approaches the specificity of the HhaI MTase, GCGC, has been changed to GCG by functional elimination of one of the two target recognition elements. In addition, the introduced structural changes endowed the MTase with the ability to transfer extended groups from synthetic cofactor analogs, providing the first example of a dual specificity change in a DNA MTase. Second, the kinetics of fast pre-catalytic conformational transitions in the MTase and DNA has been investigated. A new method to follow the target cytosine flipping and its subsequent covalent activation has been proposed, which allows a direct real-time observation of these processes by monitoring associated UV absorbance changes in a chemically unperturbed DNA. These studies for the first time demonstrate that the flipping of the target cytosine and the closure of the catalytic loop in the enzyme occur simultaneously, whereas the covalent activation of the target cytosine and the transfer of the methyl group are temporally distinct steps in the catalytic cycle of M.HhaI. Since the new method is based on the general phenomenon of hyperchromicity, it is thus applicable for studies of other systems... [to full text] DNR citozino-5 metiltransferazės (MTazės) atpažįsta specifines DNR sekas ir katalizuoja metilgrupės pernešimą nuo kofaktoriaus AdoMet ant taikinyje esančio citozino. Šiame darbe nagrinėjami abu MTazių veikimo mechanizmo aspektai. Baltymų inžinerijos ir kryptingos evoliucijos metodais pašalinant vienos iš dviejų taikinio atpažinimo kilpų funkciją, MTazės HhaI atpažįstamas taikinys GCGC pakeistas į GCG. Dėl įvestų struktūros pakeitimų nauja unikalaus specifiškumo MTazė efektyviai katalizuoja ne tik metilo, bet ir didesnių grupių pernešimą nuo sintetinių kofaktoriaus analogų, ir gali tapti naudingu molekulinės biologijos įrankiu. Katalitinės reakcijos metu MTazės kilpa užsidaro, apglėbdama surištą DNR, o taikinio citozinas išsukamas iš DNR spiralės ir aktyvuojamas, kovalentiškai prisijungiant katalitiniam cisteinui. Šiems greitiems prieškatalitiniams procesams tirti buvo panaudotas naujas metodas, leidžiantis realiu laiku stebėti M.HhaI sąlygotą citozino išsukimą bei kovalentinę aktyvaciją, registruojant mažus UV absorbcijos pokyčius gamtinį substratą atitinkančioje DNR. Pirmą kartą parodyta, kad M.HhaI katalizuojamoje reakcijoje citozino išsukimas ir katalitinės kilpos užsidarymas vyksta sinchroniškai, o kovalentinė citozino aktyvacija ir metilgrupės pernešimas yra kinetiškai netapačios katalitinio ciklo stadijos. Kadangi naujasis metodas remiasi fundamentine nukleorūgščių savybe – hiperchrominiu efektu, todėl jis gali būti naudojamas ir kitų DNR bazę išsukančių baltymų... [toliau žr. visą tekstą]

Hepatito B virusas (HBV) yra plačiai paplitęs žmogaus patogenas, bet iki šiol mažai ištirta jo šerdies baltymo (HBc), o ypač natūraliai aptinkamų mutantinių formų įtaka viruso dauginimuisi ir patogeniškumui. Šiame darbe mielių dviejų hibridų metodu atrinkti žmogaus kepenų baltymai, sąveikaujantys su laukinio tipo baltymu bei mutantais HBc1 ir HBc2. Su visomis tirtomis HBc atmainomis stipriausiai ir specifiškiausiai sąveikavo žmogaus baltymai GIPC1 ir GIPC2. Detaliau tiriant šias sąveikas nustatyta, kad HBc baltymo C-galas sąveikauja su GIPC1 ir GIPC2 baltymų PDZ domenais. HBc baltymo C-gale aptiktas PDZ domenų atpažįstamos sekos motyvas ir parodyta, kad šios sekos pokyčiai įtakoja HBc sąveiką su GIPC1 ir GIPC2. Vien su mutantais HBc1 ir HBc2 stipriausiai ir specifiškiausiai sąveikavo žmogaus baltymai FLJ20850 ir IKK (NEMO). Anksčiau netyrinėto nežinomos funkcijos žmogaus baltymo FLJ20850 raiška ir geno struktūra apibūdinta naudojantis bioinformatinėmis duomenų bazėmis. Detaliau tiriant mutantų sąveikas su FLJ20850 ir IKK buvo nustatytos baltymų sritys, apsprendžiančios tarpusavio sąveiką. IKK baltymas reguliuoja transkripcijos veiksnio NF-κB aktyvumą, todėl buvo tiriama ir mutanto HBc1 įtaka NF-κB aktyvumui žmogaus ląstelėse. Aptiktos baltymų sąveikos gali padėti geriau suprasti HBV dauginimosi ciklą bei patogeniškumą ir tapti naujų antivirusinių vaistų taikiniais. Hepatitis B virus (HBV) is a major human pathogen, but up to now little is known about its core protein (HBc) interactions with host proteins. The role of mutated HBc proteins in enhanced pathogenicity of mutant viruses is also unclear. In this work, the yeast two-hybrid system was employed to find human proteins interacting with HBV core mutants HBc1 and HBc2, as well as with the wild-type core protein. All HBc variants strongly and specifically interacted with human proteins GIPC1 and GIPC2. Common protein interaction domain PDZ in both GIPC1 and GIPC2 was identified as the region interacting with the C-end of HBc. A putative PDZ-interacting motif was identified at the C-end of the HBc protein, and variation of this sequence influenced determined interactions. Human proteins FLJ20850 and IKKγ (NEMO) strongly and specifically interacted with mutants HBc1 and HBc2 only. Gene structure and expression FLJ20850 protein, which was never before described in scientific literature, were analyzed bioinformatically. Detailed analysis of interacting protein pairs revealed regions, responsible for discovered interactions. IKKγ is known as an important regulator of transcription factor NF-kB, therefore HBc1 influence on NF-kB activity in human cells was evaluated experimentally. Determined protein interactions potentially add to understanding of HBV replication and pathogenicity and could serve as targets for developing of new antivirals.