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L'NGF è un fattore neurotrofico che viene sintetizzato a partire da un precursore, il proNGF. In letteratura è tutt'ora discusso il ruolo biologico di proNGF, se pro-apoptotico o neurotrofico. Inoltre esistono due varianti proteiche di proNGF originate da splicing alternativo: il proNGF-A di 34 kDa e il proNGF-B di 25 kDa. La distinzione tra le due varianti è però poco discussa in letteratura. Esperimenti condotti nel laboratorio di afferenza suggeriscono che queste due isoforme proteiche possano avere attività biologica differente. Inoltre esperimenti preliminari hanno messo in evidenza la possibilità che tali varianti possano avere pattern di interazione recettoriale differenti. Al fine di indagare ulteriormente questa ipotesi abbiamo messo a punto ed utilizzato un sistema di co-precipitazione del complesso ligando-recettore da utilizzare in esperimenti in vitro in cui cellule HeLa sovra-esprimenti i recettori di interesse sono stimolate con ligandi (proNGF-A e proNGF-B) ricombinanti ottenuti in laboratorio. In questa tesi sono stati messi a confronto due metodi di precipitazione con due matrici differenti al fine di scegliere il metodo ottimale. Sono state utilizzate una resina a base di sefarosio a cui sono stati coniugati in maniera covalente anticorpi anti-NGF e una matrice Nichel-Sepharose. La prima sfrutta il legame degli anticorpi con la porzione del proNGF corrispondente alla proteina matura, la seconda sfrutta invece una peculiarità dei ligandi utilizzati, che possiedono una coda di poli-istidine (utilizzata come tag) all'estremità C-terminale, che è in grado di legare ad alta affinità il Nichel coniugato alla matrice. Da queste analisi è emerso che il metodo di precipitazione migliore per i nostri scopi è quello attraverso la matrice Nichel-Sepharose. Successivamente la tecnica così messa a punto è stata impiegata per indagare il pattern di interazione recettoriale della variante di proNGF-B. Con questo sistema è stato possibile confermare i dati già presenti in letteratura riguardanti l'interazione del proNGF-B con il dimero recettoriale p75NTR-sortilina. La stessa tipologia di indagine, utilizzata per studiare il proNGF-A, ha evidenziato che la variante mutata proNGF-A A73Y/KGRG da noi utilizzata è in grado di legare il recettore TrkA mentre non è chiaro se sia in grado di legare p75NTR. In conclusione i nostri dati, seppur aggiungendo interessanti informazioni a quanto già pubblicato non chiariscono completamente né quali siano i legami preferenziali delle diverse varianti di proNGF con i recettori TrkA, e/o p75NTR e/o sortilina, né se le molecole ricombinanti prodotte in laboratorio siano totalmente adatte ad analisi di questo tipo, viste le mutazioni a cui sono state sottoposte e la possibilità che queste possano in qualche modo interferire con un corretto challenge recettoriale.

L'NGF maturo (mNGF) è un importante fattore neurotrofico prodotto a partire da due varianti di splicing che generano due diversi precursori: il proNGF-A ed il proNGF-B. In cellule PC12 stimolate con proNGF-A e proNGF-B purificati dalle ghiandole sottomandibolari di topo, si osserva un effetto rispettivamente neurotrofico e pro-apoptotico. Inoltre, la disregolazione del rapporto fisiologico tra le due varianti è stata osservata in un modello di encefalopatia diabetica. Queste evidenze suggeriscono un diverso ruolo biologico attribuibile alle due varianti di proNGF. Il processo di conversione proteolitica del proNGF-A in proNGF-B e/o in mNGF, che sembra essere irrilevante in vivo, è invece presente nei diversi sistemi di espressione eterologa utilizzati per produrre il proNGF e rende difficile studiare le possibili differenze nell'attività biologica dei due precursori. Nonostante in letteratura siano già stati descritti proNGF ricombinanti, nessun lavoro si è concentrato nel confronto dei differenti profili biologici delle due proteine. Inoltre, il proNGF-B è attualmente l'unica variante prodotta tramite un sistema batterico, in cui la proteina non subisce le modifiche post-traduzionali che normalmente avvengono in un sistema eucariotico, rendendo di difficile confrontabilità il comportamento biologico di tale proteina rispetto a quella nativa. In questa tesi, si è cercato di caratterizzare le varianti di proNGF umano ricombinante resistenti al taglio proteolitico da parte di proconvertasi, allo scopo di mettere a punto un futuro sistema di espressione eucariotico e di purificazione di proNGF-A. Cellule HeLa sono state trasfettate con plasmidi (proNgf-A wt, proNgf-A KG-RG, proNgf-A A73Y/KG-RG), contenenti diverse sequenze native di proNGF-A, precedentemente sottoposte a mutagenesi nei siti di taglio potenziale da parte di endoconvertasi. Successivamente, sono state condotte analisi allo scopo di verificare che le mutazioni introdotte fossero funzionali e per studiare il tipo di conversione proteolitica e secrezione delle proteine d'interesse, sia in condizioni di rilascio costitutivo che stimolo-dipendente. Nel proNGF-A KG-RG, resistente alla conversione in mNGF, permane la trasformazione del proNGF-A in proNGF-B, confermando l'esistenza ed attività di tale modalità di processamento intracellulare. Inoltre, il proNGF-B prodotto si localizza in vescicole secretorie a rilascio costitutivo. Il plasmide proNgf-A A73Y/KG-RG è l'unico in grado di generare la produzione di un proNGF-A integro da parte delle cellule trasfettate. È stato osservato che il proNGF-A, il quale probabilmente si localizza in vescicole elletrondense di grandi dimensioni nel citoplasma cellulare, viene rilasciato solo in seguito alla stimolazione con sodio butirrato, per essere processato nello spazio extracellulare in diversi intermedi proteolitici. Dopo stimolazione con sodio butirrato e salbutamolo delle cellule trasfettate con proNgf-A KG-RG, si verifica la conversione extracellulare in mNGF, suggerendo la presenza di ulteriori siti di consenso per enzimi diversi rispetto alle pro-convertasi. Nel proNGF-A rilasciato in tali condizioni, invece, risulta assente questo tipo di conversione proteolitica. Dunque, i nostri dati dimostrano che le mutazioni inserite permettono di ottenere un proNGF-A integro ed utilizzabile per ulteriori studi di funzionalità in vitro e in vivo. Inoltre, il nostro lavoro identifica la presenza di distinti pattern di secrezione del proNGF; rispettivamente stimolo-dipendente per il proNGF-A e costitutivo per il proNGF-B. Questo avvalora ulteriormente l'ipotesi di due distinti ruoli biologici attribuibili ai due precursori di NGF e permette una maggiore comprensione delle caratteristiche fisiologiche delle due varianti.

Il ?-NGF (Nerve Growth Factor) è un fattore neurotrofico derivante da una pro-proteina, il proNGF. Quest'ultima esiste in quattro differenti varianti di splicing tra le quali le isoforme proNGF-A e proNGF-B si sono rivelate biologicamente attive. Negli ultimi anni sono state prodotte evidenze sperimentali circa la possibilità che le isoforme A e B possano avere attività biologica diversa, rispettivamente neurotrofica e neurotossica. Questi risultati tuttavia non hanno ancora avuto un ampio riscontro in letteratura, a causa della difficoltà oggettiva che esiste sia nel produrre in maniera selettiva, attraverso sistemi di espressione eterologhi, le due diverse varianti proteiche, sia nel discriminare la loro presenza all'interno di campioni biologici. Infatti, le due proteine condividono la gran parte della sequenza amminoacidica primaria, cosa che rende difficile la produzione di anticorpi specifici; inoltre, nei sistemi di sovra-espressione, contrariamente a quanto si osserva in vivo per le proteine native, è difficile prevenire la conversione del proNGF-A in proNGF-B. In questo elaborato abbiamo voluto studiare in maniera approfondita la sequenza primaria del proNGF-A con lo scopo di progettare, tramite l'utilizzo di software bioinformatici basati su algoritmi denominati reti neurali artificiali (ANN), delle mutazioni che consentissero di produrre, attraverso sistemi di sovra-espressione eucariotici, un'isoforma di proNGF-A integra ed utilizzabile in futuro per studiare selettivamente l'attività di questa variante proteica di proNGF. Attraverso l'approccio bioinformatico, seguito dalla costruzione di vettori plasmidici e dalla loro espressione in un sistema di espressione eucariotico, siamo riusciti inizialmente a generare un proNGF-A resistente all'azione delle pro-convertasi endocellulari che determinano la sua conversione in ?-NGF. Successivamente, grazie alla sostituzione specifica e mai descritta precedentemente di un'alanina in una tirosina in posizione 73, siamo riusciti a generare un proNGF-A che non venisse più convertito in proNGF-B. Questo proNGF mutante è stato denominato proNGF-A_A73Y. Attraverso l'analisi di lisati e mezzi cellulari provenienti da cellule HeLa sovra-esprimenti l'isoforma mutante abbiamo caratterizzato il profilo di espressione della proteina, e confermato la sua capacità di resistere ai diversi processi di conversione in intermedi a peso molecolare più basso. Infine, abbiamo messo a punto con successo una procedura di sovra-espressione, grazie al sistema baculovirus/sf9, ed un successivo protocollo di purificazione che ci ha consentito di isolare la proteina mutante. Il lavoro esposto in questo elaborato ha permesso di ottenere per la prima volta quantità consistenti della variante proteica proNGF-A, che potrà essere infine utilizzata per studi di farmacologia e fisiopatologia. In particolare, sarà possibile, alla luce di quanto precedentemente emerso studiando forme native della proteina, chiarire con maggior rigore gli effetti neuro-protettivi del proNGF-A, comparandoli a quelli noti del ?-NGF. Inoltre, sarà possibile studiare determinate peculiarità della proteina, emerse come indizi in analisi precedenti, che potrebbero rendere vantaggioso il suo utilizzo per sviluppare farmaci alternativi a quelli basati sull'isoforma matura.