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My scientific interest is focused on the field of cellular electrical activity, ranging from the study of intracellular enzymatic processes to the characterization of new generation of drugs. For this purpose I also used the most powerful techniques of investigation, including patch-clamp technique, fluorescence imaging, and surface plasmon resonance (SPR) spectroscopy. Moreover, to shed light on complex molecular mechanisms, unconventional strategies were employed, requiring sometimes the realization of specific devices not commercially available. In particular my PhD thesis includes two different scientific projects: the biophysical characterization of antimicrobial peptides and the modulation of visual phototransduction in vertebrate cones. In the first project, the patch-clamp technique was employed to study the pore forming properties of synthetic cecropin-melittin hybrid peptide (CM15), alamethicin F50/5 and its synthetic analog [L-Glu(OMe)7,18,19] under strict physiological conditions. These short peptides selectively permeabilize the bacteria plasma membrane leading to their lyses and death: they are therefore a source of antibacterial molecules, and inspiration for novel and more selective drugs. I pursued this study by recording the ion current through the channels formed by these peptides, once inserted in the membrane of photoreceptor rod outer segment membrane (OS) isolated from frog retinae. The peptides were applied to (and removed from) the extracellular OS side in ~50 ms with a computer-controlled microperfusion system, so that the ion channel characteristics (as its selectivity, blockade and gating) and the dynamics of pore formation could be precisely assessed. On the basis of the electrophysiological recordings obtained, it was demonstrated that, different than alamethicins, CM15 produced voltage-independent membrane permeabilisation, repetitive peptide application caused a progressive permeabilisation increase, and no single-channel events were detected at low peptide concentrations. Collectively, these results indicate that CM15 form pores according to a toroidal model. Moreover, in order to understand the divalent-cation dependency of [L-Glu(OMe)7,18,19] binding to the lipid bilayer at the molecular level, the electrophysiological experiments were paralleled with experiments employing SPR spectroscopy. Results indicate the presence of Ca2+ in the external solution increases the probability of formation of smaller and more stable [L-Glu(OMe)7,18,19] pores. The second project of this thesis concerns the investigation of the physiological role of the neuronal calcium sensor zGCAP3 in the photrasduction cascade. This study was pursued through the simulation of an over expression and a knock-down of this protein, by delivering it, or its monoclonal antibody, into zebrafish cone cytosol, while recording their photoresponses with the patch-clamp technique. The intracellular protein delivery was attained via the patch pipette, by ejecting the proteins out of a tube inserted into the pipette lumen. A microperfusion system was employed to apply the desired exogenous molecules with a precise timing. However, the long tapered shape of the pipette shank make it very difficult to perfuse efficiently the cell with this strategy. For this reason a pressure polishing setup was assembled to enlarge the patch pipette shank, through the calibrated combination of heat and air pressure. This allowed to insert quartz or plastic tubes in the pipette lumen very close to its tip. In order to obtain a substantial and specific silencing of the zGCAP3s in zebrafish cones, surface plasmon resonance experiments were performed to allow the selection of a monoclonal antibody with strong affinity for zGCAP3 and low cross interaction with other components of the phototransduction cascade. Results showed that the perfusion with GCAP3 did not altered significantly the light response, while he anti-zGCAP3 incorporation in the cytosol caused the progressive photoresponse fall, followed by the progressive fall of saturating flash response amplitude, probably due to the progressive GC inhibition. The unexpected lack of an effect of zGCAP3 incorporation in the cone cytosol, suggests that the endogenous number of zGCAP3 is saturating, i.e. their number is equal or above the number of their target molecules (guanylate cyclase), therefore any further increase of zGAP3 in the cytosol is uneffective.

1. Introduzione I neuroni dopaminergici (DA) della substantia nigra pars compacta (SNc) sono tra i più studiati nel sistema nervoso centrale per la loro implicazione nella malattia del Parkinson. Essi presentano un ampio corredo di correnti voltaggio-dipendenti, tra le quali emerge una tipica corrente attivata da iperpolarizzazione, la Ih. Diversamente dalla maggior parte delle cellule nervose, i neuroni dopaminergici della SNc presentano una attività spontanea regolare dopo isolamento o riduzione degli input sinaptici, e non è, quindi, sorprendente che numerosi lavori abbiano indagato il ruolo della Ih nell'attività spontanea. Tuttavia il ruolo della Ih non è stato ancora ben compreso, dal momento che il blocco di questa corrente non sembra comportare nessuna alterazione significativa della frequenza di scarica. Abbiamo, allora, riesaminato il problema studiando la corrente h, in fette sottili di cervello, in condizioni sperimentali che si differenziano dalla maggior parte degli studi precedenti per tre aspetti fondamentali: i) abbiamo utilizzato topi transgenici che esprimono una proteina reporter (GFP) sotto il promotore tirosina idrossilasi (TH), per identificare i neuroni DA della SNc; ii) abbiamo effettuato le registrazioni elettrofisiologiche a 37°C; iii) abbiamo eseguito la maggior parte degli esperimenti in condizioni di patch perforato al fine di lasciare inalterato l’ambiente fisiologico intracellulare. 2. Risultati Il nostro primo obiettivo è stato quello di effettuare un'analisi dettagliata della dipendenza della cinetica e dell’ampiezza della Ih dalla temperatura. Il protocollo di attivazione della corrente h prevedeva una serie di comandi iperpolarizzanti della durata di 4s e le registrazioni erano effettuate a 27°C e 37°C. Abbiamo calcolato che il coefficiente di temperatura (Q10) per la variazione di ampiezza della corrente h è pari 3,73, mentre i valori di Q10 relativi alle velocità di attivazione e deattivazione sono rispettivamente pari a 10,8 e 3,17. Il V50 è di -94,9 ± 1,07 mV a 27°C (n = 13) e -84,2 ± 1,31 mV a 37°C (n = 18). Abbiamo, successivamente, esaminato la modulazione da parte dei nucleotidi ciclici in condizioni di patch perforato a 37°C, in presenza di forskolina (10 μM), un attivatore della adenilato ciclasi, e IBMX (0.1 mM), un inibitore delle fosfodiesterasi, i quali, insieme, inducono un aumento della concentrazione intracellulare di adenosina monofosfato ciclico (cAMP). In queste condizioni abbiamo registrato un aumento dell'ampiezza Ih (da -178,53 ± 23,48 pA in condizioni di controllo a -227,01 ± 34,17 pA con forskolina a -130 mV, n = 8), uno spostamento del V50 di + 4,80 ± 0,68 mV (n = 8) e una riduzione delle costanti di tempo di attivazione di circa il 25%. Dato che questa modulazione è il risultato di un’interazione diretta del cAMP con il canale, abbiamo studiato gli effetti sulla Ih di diversi neurotrasmettitori accoppiati a proteine Gi o Gs, in particolare abbiamo testato la dopamina, la serotonina (5-HT) e la noradrenalina (NA). Il quinpirolo, un agonista dei recettori dopaminergici D2 (30 μM, dopo 3 minuti di applicazione nel bagno), ha indotto una diminuzione dell'ampiezza della Ih del 15% a -130 mV (n = 6), mentre il sulpiride, un antagonista dei recettori dopaminergici D2 (20 μM), ne ha determinato un aumento (n = 5). L'effetto sulla Ih della 5HT (100 μM), dopo 3 minuti di applicazione nel bagno, è stato una riduzione dell’ampiezza del 20% (n = 5); al contrario, l'applicazione nel bagno della NA (100 μM), ne ha indotto un aumento di circa il 12% (n = 8). Infine, abbiamo analizzato il ruolo della corrente h sull’autoritmicità. L'ivabradina (10 μM), bloccante del Ih, ha determinato una marcata iperpolarizzazione (circa -10 mV), che di fatto ha silenziato le cellule; tuttavia, questo effetto sull’attività spontanea era indiretto, poiché se la membrana era ripolarizzata, l’autoritmicità si ripristinava. 3. Conclusioni Gli studi eseguiti a temperatura ambiente sul ruolo e le proprietà della corrente h nei neuroni dopaminergici della SNc sono scarsamente informativi perché, in queste condizioni sperimentali, la corrente è sottovalutato in ampiezza, velocità e, in ultima analisi, nella sua capacità di svolgere alcun ruolo a potenziali fisiologici. Le registrazioni elettrofisiologiche a 37°C, invece, restituiscono un profilo più accurato e veritiero della Ih. La modulazione della corrente h ad opera di sistemi a secondo messaggero, un processo scarsamente esplorato nei neuroni dopaminergici della SNc, sembra essere rilevante, e suggerisce l'esistenza di diversi pathways importanti per il controllo dell’eccitabilità neuronale. La corrente h è, in ultima analisi, molto importante nell’autorimicità perché stabilizza il potenziale di membrana di riposo dei neuroni dopaminergici della SNc in uno stato depolarizzato, ma non ricopre un ruolo di principale nell’attività pacemaker. Questi risultati sono interessanti perché aprono nuove prospettive sul ruolo del canale HCN nei neuroni dopaminergici della substantia nigra pars compacta.