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L’endotossina è una tossina microbica, parte integrante della membrana esterna della parete di batteri Gram-negativi che viene rilasciata completamente con la lisi del batterio. È costituita da sub-unita’ molecolari che hanno dimensioni comprese tra 10.000 e 20.000 Daltons, mentre le aggregazioni hanno dimensioni di circa 100.000 Daltons. Un esempio tipico di endotossina è rappresentato dal lipopolisaccaride (LPS) che è presente nella membrana esterna dei batteri Gram-negativi. Le endotossine sono le principali responsabili delle conseguenze cliniche delle infezioni da batteri gram-negativi. Infatti, l’endotossina è ritenuta responsabile della patogenesi della sepsi, dello shock settico e della conseguente malattia multiorgano (MOF) (1). A causa della sua natura particolarmente aggressiva e multifattoriale, la sepsi conduce rapidamente a morte e costituisce la principale causa di decesso nelle terapie intensive non coronariche di tutto il mondo. Da qui la necessità, per la cura della sepsi, di rimuovere e/o disattivare le endotossine dal corpo del paziente prima che la malattia degeneri. Infatti, in relazione alla presenza di endotossina nel sangue si innesca una complessa attivazione immunologica che coinvolge vari sistemi biologici (immunitario e reticoloendoteliale) e una serie di mediatori, liberati principalmente dall’attivazione di macrofagi, monociti e altre cellule. Inoltre, le endotossine sono contaminanti frequenti del DNA plasmidico estratto dai batteri e di tutti quei prodotti che sono estratti e/o sono venuti a contatto con essi. Le endotossine devono essere rimosse da questi prodotti per evitare reazioni infiammatorie nel corso delle applicazioni in vivo, quali ad esempio la terapia genica. Dal punto di vista terapeutico, negli ultimi anni hanno assunto un ruolo rilevante una classe di proteine e/o peptidi (e loro derivati) che, come prodotti dell’immunità innata, sono in grado di legare e neutralizzare componenti della parete batterica tra cui l’LPS. I peptidi che sono in grado di neutralizzare questo tipo di processo vengono oggi definiti con un termine ampio quale quello di Host Defense Peptide (HDP). Quest’ultima classe di proteine sono di particolare interesse in quanto oltre all’attività antimicrobica diretta, sono in grado di potenziare la risposta immunitaria dell’organismo, promuovendo in vitro varie risposte di difesa (ad es. migrazione di leucociti, maturazione delle cellule dendritiche) e contribuendo così al potenziamento della risposta immunitaria adattativa. Queste proteine sono generalmente caratterizzate dall’avere un peso molecolare compreso tra 2 ed 80 kDa e in maniera preferenziale, contenenti amino-acidi caricati positivamente (da qui il termine di proteine cationiche) (2). Le proteine denominate non specific Lipid Transfer proteins (ns-LTPs) sono piccole molecole proteiche particolarmente stabili di approssimativamente 10 KDa solitamente presenti in tutti gli organismi vegetali sino ad oggi studiati (3). Tali proteine sono accomunate dalla capacità di promuovere, in vitro, il trasferimento di molecole lipidiche attraverso membrane anche se, studi recenti, hanno dimostrato che esse sembrano svolgere una funzione protettiva in quanto capaci di agire come peptidi ad attività antimicrobica. In alcune specie vegetali è stata dimostrata una loro capacità allergenica come nel caso delle Rosaceae Prunoideae (pesca, albicocca, prugna), Pomoideae (mela) e le Urticacee quali la Parietaria (4). La tecnologia del DNA ricombinante ha permesso l’isolamento di vari allergeni della famiglia delle proteine ns- LTPs, tra questi quelli della Parietaria denominati Parj1 e Parj2. In particolare, sono state ad oggi isolate due isoforme dell’allergene Parj1 denominate (secondo la nomenclatura internazionale) Parj1.01 e Par1.02 (5, 6). Tali isoforme differiscono essenzialmente per la presenza di una regione di 37 aminoacidi presente esclusivamente nell’isoforma Parj1.01 (7). Caratterizzazione di un peptide in grado di legare LPS batterico Una analisi in silico condotta mediante l’algoritmo messo a disposizione dall’Antimicrobial Peptide Database ha messo in evidenza che la porzione carbossiterminale del Parj1.01 presenta caratteristiche biochimiche peculiari. Tale regione presenta una carica netta totale positiva (+5) e una elevata percentuale di residui di prolina suggerendo che tale peptide possa avere la capacità di agire come peptide ad attività antimicrobica. I dati riportati in Tabella 1 descrivono la diversa capacità delle due isoforme ricombinanti dell’allergene maggiore Parj1 (Parj1.01 e Parj1.02) di legare LPS di origine batterica. I dati mostrati evidenziano come l’isoforma Parj1.01 presenti una spiccta capacità di legare LPS. Tabella 1. Saggi di determinazione della quantità di endotossina endogena Quantità di proteina analizzata Positività al LAL test rParj1.01 rParj1.02 1 μg

Nell’AMP ”Isola di Ustica” l'instaurazione del regime di protezione, e quindi del divieto di prelievo, ha provocato un aumento della densità del riccio edule Paracentrotus lividus (Lam.) con conseguenze negative sulle comunità algali. L’intenso pascolo di questi echinidi regolari ha infatti trasformato la fascia superficiale sommersa in un barren ground, area a bassa complessità e diversità. Una buona stima della sex ratio operativa (OSR) di P. lividus può chiarire aspetti importanti della dinamica di popolazione di questa specie ed essere di notevole aiuto in una logica di intervento gestionale. Scopo del lavoro è stato quello di valutare la OSR della popolazione di P. lividus presente nell’AMP “Isola di Ustica”. I valori della OSR sono stati registrati in due siti della zona C, C1 e C2, ed in un sito della zona A. I valori della OSR registrati nella zona A e C1, sono dei valori prossimi a 0.5 e quindi ci indicano che esiste una situazione di equilibrio tra i due sessi e di “benessere” della specie. La OSR registrata nella zona C2 (pari a 0.6) rivela invece uno squilibrio tra i due sessi a favore di quello maschile. Questo risultato prospetterebbe la possibilità di un ulteriore incremento numerico della popolazione.

NF-kB è un fattore di trascrizione eucariotico e ubiquitario che regola l’espressione di geni coinvolti in molteplici processi cellulari come la risposta immunitaria, la flogosi, l’apoptosi, la crescita cellulare e lo sviluppo embrionale. Le proteine appartenenti alla famiglia di NF-kB sono p65, c-Rel, RelB, p50 e p52. Tali proteine svolgono la funzione di fattori trascrizionali legando specifiche consensus del DNA (consensus kB) sotto forma di omo - eterodimeri. Ogni membro della famiglia di NF-kB è caratterizzato dalla presenza di un dominio, altamente conservato, il “Rel Homology Domain” (RHD). Nel RHD sono stati mappati i sottodomini di dimerizzazione, interazione con gli inibitori (IkB), traslocazione nucleare e legame al DNA. In condizioni basali i dimeri di NF-kB sono mantenuti nel citoplasma dagli inibitori IkB. La presenza di uno stimolo specifico induce il rilascio di NF-kB e la traslocazione al nucleo, dove lega sequenze promotrici e regola l’espressione dei geni target. Tra i diversi complessi di NF-kB, il p65/p50 è sicuramente il più abbondante nelle cellule e conseguentemente anche il più studiato. In uomo e in topo è stata scoperta un’isoforma di p65, chiamata p65(-1). Questa variante di splicing contiene un nuovo esone (chiamato esone -1), localizzato a monte del primo esone (esone 0) ad oggi conosciuto del gene RelA, codificante per p65. La trascrizione dell’esone -1 induce un evento di splicing tra gli esoni -1 e 1, determinando la contemporanea escissione dell’esone 0, Conseguentemente la p65(-1) presenta un RHD più piccolo rispetto a quello della controparte wild type. Numerose analisi hanno evidenziato differenze funzionali tra le proteine p65 e p65(-1), in alcuni meccanismi cellulari come l’attività trascrizionale sulle consensus kB, la regolazione dell’apoptosi e l’attivazione del recettore dei glucocorticoidi (GR). Pertanto l’obiettivo di questa tesi è di caratterizzare il ruolo di p65(-1) attraverso tre approcci: il primo in vitro, il secondo ex vivo e il terzo in vivo. Allo scopo di analizzare il ruolo come fattore trascrizionale di p65(-1), sono stati realizzati saggi luciferasi, usando alcuni promotori artificiali e naturali come NF-kB-Luc (nuclear factor kB) CRE-Luc (elementi di risposta all’cAMP), AP1-Luc (elementi di risposta di AP1), SRE-Luc (elementi di risposta al siero), HSE-Luc (elementi di risposta alle proteine da shock termico), pANXA-1-Luc (annessina 1) e pIL-6-Luc (interleuchina 6). Inoltre, le attività di p65(-1) sono state analizzate sia in termini di omodimero sia in termini di eterodimero con le proteine p65 o p50. Un’ulteriore analisi di espressione è stata condotta sulle cellule del sangue periferico umano (PBMC), in cui si dimostra che l’espressione del messaggero è sempre presente nei campioni analizzati. Inoltre i nostri dati dimostrano la presenza di profili di espressione differenti tra gli individui considerati. Infine per identificare le funzioni biologiche della nuova isoforma, vogliamo ingegnerizzare un topo KO per p65(-1). In particolare in questa sede presentiamo le possibili strategie analizzate e la realizzazione di un clone per la ricombinazione omologa per ingegnerizzare un topo transgenico caratterizzato dalla mancata espressione di p65(-1), senza alterare le funzioni di p65. Nuclear Factor-κB (NF-κB) are ubiquitous transcription factors that in mammals regulate many biological process including inflammation, immunoregulation, apoptosis, cell growth and cell proliferation. NF-kB family members include RelA (p65), c-Rel, RelB, p50 and p52. These proteins exert their functions by binding as homodimers or heterodimers to specific DNA target sites (kB consensus). NF-kBs are defined by an highly conserved amino acid domain the Rel Homology Domain (RHD), in which lie sequences for dimerization, binding to inhibitors (IkB), nuclear translocation and DNA binding. In basal conditions, NF-kB is localized in the cytoplasm complexed with its inhibitor IkB. Upon receipt of a specific signal, NF-kB is released from IkB and translocates to the nucleus to control gene expression. A new isoform of p65, named p65(-1), have been discovered in human and mouse. This isoform contains an unknown exon (named exon –1) located upstream to the first known exon of RelA, coding for p65. Transcription of the exon -1 leads to an alternative splicing between exon -1 and exon 1, thus skipping exon 0. By consequence p65(-1) has a smaller RHD than p65. Many evidences show that p65(-1), compared to p65, has different biochemical properties in some cellular mechanism like transcriptional activity on kB consensus, apoptosis and regulation of the glucocorticoid receptor (GR) activation. Therefore the aim of this study is to characterize the function of p65(-1) by an in vitro, ex vivo and an in vivo approach. In order to test the transcriptional role of p65(-1) we have analyzed the transactivation of p65(-1) using both artificial and natural promoter regions, linked with the pathway of NF-kB. We have performed luciferase assays with NF-kB-Luc (nuclear factor kB) CRE-Luc (cAMP response element), AP1-Luc (AP1 response element), SRE-Luc (serum response element), HSE-Luc (heat shock protein response element), pANXA-1-Luc (annexina 1) e pIL-6-Luc (interleuchin 6) to study the activity of p65(-1) and we have also analized p65(-1) activity with p65 or p50 under the same conditions. We have also studied p65(-1) expression on human peripheral blood mononuclear cells (PBMC); it is shown that the expression of mRNA is always present in the analyzed samples. In addition, our data demonstrate different expression profiles between individuals considered. We are also engineering a mouse p65(-1)-/-. Here we show the strategy we used to engegnire the homologous recombination vector to knock out p65(-1) expression without affecting p65 functions