Search

Το Μυελοδυσπλαστικό Σύνδρομο (ΜΔΣ) αποτελεί μια ετερογενή ομάδα κλωνικών αιματολογικών διαταραχών με κοινό χαρακτηριστικό τη μη αποδοτική αιμοποίηση που οδηγεί σε ανθεκτικές κυτταροπενίες και συχνή εκτροπή προς Οξεία Λευχαιμία (ΟΛ). Η παράδοξη συνύπαρξη ενός πληθωρικού ή νορμοκυτταρικού μυελού των οστών και κυτταροπενιών στην περιφέρεια έχει αποδοθεί στην αυξημένη απόπτωση προγονικών και ώριμων αιμοποιητικών κυττάρων του μυελού των ασθενών αυτών. Παρ'όλ'αυτά, αιτιοπαθογενετική σχέση της υπέρμετρης απόπτωσης με την ανεπαρκή κλωνογόνο ικανότητα των προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων του μυελοδυσπλαστικού μυελού δεν τεκμηριώνεται επαρκώς από τα υπάρχοντα ερευνητικά δεδομένα. Αντίθετα, αδιαμφισβήτητη είναι η συσχέτιση της κατάργησης των μηχανισμών του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου στο προχωρημένο ΜΔΣ με την εκτροπή της νόσου προς ΟΛ. Η αυξημένη έκφραση αντιαποπτωτικών πρωτεϊνών όπως οι Bcl-2, Bcl-xL, IAPs, survivin έχει προταθεί ότι υποστηρίζει την πρόοδο της νόσου και την επακόλουθη λευχαιμική εξέλιξη. Οι Heat Shock Proteins αποτελούν θεμελιώδεις πρωτεΐνες, ως προς τις αποφάσεις των κυττάρων σχετικά με την επιβίωση ή το θάνατό τους. Η Hsp73, ένα σταθερά εκφραζόμενο μέλος, και οι Hsps 72 και 27, δύο ισχυρά επαγόμενες από ποικίλα στρεσσογόνα ερεθίσματα πρωτεΐνες, είναι τρεις από τις πιο σημαντικές Hsps εκδηλώνοντας πολυδιάστατη αντι-αποπτωτική δράση και παρέχοντας ισχυρή κυτταροπροστασία. Σε αρκετά είδη συμπαγών όγκων αλλά και αιματολογικών κακοηθειών έχει δειχθεί υπερέκφραση των Hsps, ενώ έχει προταθεί ακόμη και αιτιοπαθογενετική σχέση της διαταραχής της έκφρασης των πρωτεϊνών αυτών με την ογκογένεση. Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η εκτίμηση του βαθμού της απόπτωσης στα προγονικά και ώριμα κύτταρα μυελού ασθενών με ΜΔΣ και η περαιτέρω διερεύνηση της ουσιαστικής συνεισφοράς του φαινομένου στην ανεπαρκή κλωνογόνο ικανότητα των προγονικών κυττάρων και, κατ' επέκταση, στη μη αποδοτική αιμοποίηση που χαρακτηρίζει το σύνδρομο. Εν συνεχεία, διερευνήθηκαν οι αποπτωτικές μεταβολές κατά την πρόοδο της νόσου οι οποίες συσχετίσθηκαν με την έκφραση των αντι-αποπτωτικών Heat Shock Proteins. Η έκφραση των Hsps 72, 27 & 73 μελετήθηκε υπό συνθήκες ηρεμίας (βασική έκφραση, ΒΕ), ενώ ελέγχθηκε η επαγωγιμότητα των Hsps 72 και 27 κατόπιν εφαρμογής θερμικού shock ή ο-αποπτωτικής διέγερσης με συνδυασμό κυτταροκινών (TNFα+IFNγ). Η προσδιοριζόμενη έκφραση των Hsps συσχετίσθηκε, κατόπιν, με την απόπτωση και το στάδιο της νόσου. Η παρούσα μελέτη επιβεβαιώνει την παρουσία αυξημένης απόπτωσης τόσο στα ώριμα CD34- όσο και στα προγονικά CD34+ κύτταρα του μυελού ασθενών με ΜΔΣ με αξιοσημείωτη ετερογένεια να διέπει τα αποτελέσματα ακόμη και μεταξύ ασθενών της ίδιας κατά FAB κατηγορίας νόσου. Τα επίπεδα ανιχνευόμενης απόπτωσης υπερείχαν σημαντικά στο μυελό των ασθενών με "πρώιμη" (RA και RARS) έναντι εκείνων με "προχωρημένη" (RAEB και RAEB-t) νόσο, ενισχύοντας τη θεωρία της κατάργησης των αποπτωτικών μηχανισμών κατά την πρόοδο της νόσου. Μετά από 24 ώρες υγρής καλλιέργειας, το ποσοστό των ανιχνευόμενων πρώιμων αποπτωτικών CD34+ κυττάρων μυελού ασθενών με ΜΔΣ μειώθηκε σημαντικά. Προκειμένου να διερευνηθεί η πραγματική συμβολή της απόπτωσης στη μη αποδοτική αιμοποίηση του ΜΔΣ in vitro, αποπτωτικά και μη αποπτωτικά προγονικά CD34+ φρέσκα κύτταρα μυελού διαχωρίστηκαν με τη μέθοδο του Κυτταροδιαχωρισμού ενεργοποιούμενου από φθορισμό και τοποθετήθηκαν σε βραχείας διάρκειας ημιστερεές καλλιέργειες, όπου ελέγχθηκε η σχετική κλωνογόνος ικανότητά τους. Τόσο τα αποπτωτικά όσο και τα μη αποπτωτικά CD34+ κύτταρα των ασθενών με ΜΔΣ επέδειξαν εξίσου ανεπαρκή ανάπτυξη in vitro, υποδεικνύοντας ότι η παρουσία απόπτωσης δεν επηρεάζει σημαντικά τη συμπεριφορά των κυττάρων στην καλλιέργεια. Η βασική ενδοκυττάρια έκφραση των αντιαποπτωτικών Hsps 27, 72 και 73 βρέθηκε σημαντικά αυξημένη στο μυελό ασθενών με ΜΔΣ. Η υπερέκφραση των Hsps αφορούσε κυρίως τα ολικά μονοπύρηνα κύτταρα του μυελού των ασθενών, ενώ τα προγονικά CD34+ κύτταρα δεν επέδειξαν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα των υπό μελέτη πρωτεϊνών. Επιπλέον, η εφαρμογή θερμικού shock οδήγησε επιτυχώς στην επαγωγή των Hsps 27 και 72 στο μυελό ασθενών και μαρτύρων, προσεγγίζοντας όμως υψηλότερα τελικά επίπεδα έκφρασης στο μυελό των ασθενών. Tόσο η βασική όσο και η εκ θερμικού stress επαγόμενη έκφραση της Hsp72 βρέθηκε σημαντικά ενισχυμένη στα μονοπύρηνα κύτταρα του μυελού ασθενών με "προχωρημένου τύπου" ΜΔΣ, ενώ σημαντικά θετική συσχέτιση τεκμηριώθηκε μεταξύ της έκφρασης ηρεμίας των τριών Hsps και του ποσοστού των βλαστών του μυελού των ασθενών. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ενδεχόμενο ρόλο της υπερέκφρασης των Hsps στην ευνοϊκή επιλογή και εξάπλωση των κλωνικών κυττάρων και, συνεπακόλουθα, στην πρόοδο της νόσου. Η συνδυασμένη επίδραση κυτταροκινών σε κύτταρα φυσιολογικών μυελών οδήγησε σε σημαντική μείωση της έκφρασης της Hsp72, ενώ στο 36% των ασθενών παρατηρήθηκε αύξηση της έκφρασης της Hsp72. Τέλος, αρνητική ήταν η συσχέτιση της βασικής ή επαγόμενης έκφρασης των Hsps με την αυτόματη ή προκλητή απόπτωση σε ολικά ή προγονικά κύτταρα μυελού ασθενών με ΜΔΣ, επιβεβαιώνοντας τον κυτταροπροστατευτικό τους ρόλο. Συνοψίζοντας, τα ευρήματα της παρούσας μελέτης επιβεβαιώνουν την παρουσία αυξημένης απόπτωσης στο μυελό των ασθενών με ΜΔΣ, ιδιαίτερα πρώιμου τύπου. Τα πρώιμα αποπτωτικά προγονικά κύτταρα επιδεικνύουν δυνατότητα διαφυγής από τον κυτταρικό θάνατο και σχετική λειτουργική ανάνηψη κατά την απομάκρυνσή τους από το προαποπτωτικό μικροπεριβάλλον του μυελού. Εναλλακτικά, πρόκειται για κύτταρα που, εξ'αιτίας αποτυχίας του αποπτωτικού μηχανισμού να περατωθεί, υφίστανται "ατελή απόπτωση" και διασώζονται, φέροντα όμως δυνητικά ογκογόνες μεταλλάξεις. Η γενική αντίληψη, πάντως, που καθιστά την απόπτωση ως την αιτία της μη αποδοτικής αιμοποίησης του συνδρόμου κλονίζεται, καθώς αποπτωτικά και μη αποπτωτικά προγονικά κύτταρα διαθέτουν παρόμοια κλωνογόνο ικανότητα, in vitro; φαίνεται ότι επιπρόσθετες ενδογενείς ανωμαλίες περιορίζουν το κλωνογόνο δυναμικό αποπτωτικών και μη προγονικών κυττάρων. Η υπερέκφραση Hsps που τεκμηριώθηκε στο μυελό ασθενών με ΜΔΣ ενδεχομένως υποστηρίζει την διαδικασία κακοήθους εξαλλαγής μέσω της σιωπηρής συσσώρευσης μεταλλάξεων στα κύτταρα του κλώνου. Επιπλέον, τα αυξημένα επίπεδα των αντι-αποπτωτικών αυτών πρωτεϊνών θα μπορούσε να ευθύνεται για την προτεινόμενη ατελή απόπτωση των κυττάρων του μυελοδυσπλαστικού μυελού. Όπως προκύπτει από τη σημαντική συσχέτιση της έκφρασης των Hsps τόσο με το ποσοστό βλαστών όσο και με το στάδιο της νόσου, τα υπερεκφράζοντα ώριμα με τα αντίστοιχα προγονικά τους παθολογικά κύτταρα, ενέχοντας πλεονέκτημα επιβίωσης έναντι των φυσιολογικών στο προ-αποπτωτικό μικροπεριβάλλον του δυσπλαστικού μυελού, φαίνεται ότι επιλέγονται και επικρατούν κατά την πρόοδο της νόσου. Σε ένα τέτοιο υπόστρωμα αντίστασης στην απόπτωση ένα επιγενετικό συμβάν που αναστέλλει τη διαφοροποίηση ενδέχεται να πυροδοτήσει τη λευχαιμική εκτροπή. Myelodysplastic syndrome comprises a heterogeneous group of clonal stem cell disorders characterized by ineffective hematopoiesis leading to refractory cytopenias and frequent evolution to acute myeloid leukemia (AML). The existing inconsistency between normal or hypercellular bone marrow and peripheral blood cytopenias remains a paradox that has been attributed to excessive intramedullary apoptosis. However, a causative relationship of apoptosis to the progenitor’s defective clonogenic growth has not been sufficiently demonstrated. On the other hand, it is widely accepted that abrogation of apoptotic control in advanced MDS favours the expansion of the malignant clone and contributes to the frequently observed evolution to acute myeloid leukaemia (AML). Enhanced expression of antiapoptotic proteins Bcl-2, Bcl-xL, IAPs, survivin has been proposed to contribute to elimination of apoptosis, disease progression and subsequent leukemic evolution. Heat Shock Proteins (Hsps) are fundamental for cell life and death decisions and essential for the coordination between proliferation, differentiation and apoptosis. Hsp73, one of the constitutively expressed Hsps, and Hsps 72 and 27, two strongly inducible by several stress stimuli proteins, are three of the most important Hsps. These three Hsps regulate programmed cell death by interfering with multiple key-regulatory points of the apoptotic cascade, acting as apoptosis inhibitors and conferring strong cytoprotection. Hsps 72 and 27 are overexpressed in a number of human cancers and haematological malignancies, while a causative relationship of these proteins to oncogenesis has even been proposed. The aim of our study was to determine the degree of programmed cell death in progenitor and mature bone marrow cells of MDS patients. Moreover, apoptosis' actual contribution to defective clonogenic capacity of MDS progenitors and, subsequently, to ineffective hematopoiesis in MDS was assessed. Furthermore, apoptosis modifications during disease progression were detected and correlated to the expression of antiapoptotic Hsps. Hsps 72, 27 and 73 intracellular expression was studied under conditions of tranquillity in bone marrow and progenitor cells of MDS patients, while the inducibility of Hsps 27 and 72 was further tested after application of an environmental type of stress (heat shock) and pro-apoptotic stimulation under combined cytokine treatment (TNFα+IFNγ). Finally, we determined an existing link between Hsps' levels, apoptosis and disease progression. Apoptosis was significantly augmented in both progenitor and mature bone marrow cell fractions from MDS patients. Apoptosis determined in the bone marrow of patients with "early" MDS (RA and RARS) significantly exceeded cell death levels detected in those with "advanced" (RAEB and RAEB-t) disease, supporting the theory of apoptosis' abrogation as the disease evolves. We should remark, however, that even inside the same FAB-category, a great heterogeneity existed in results. After 24 hours of liquid culture the percentage of early apoptotic progenitors in MDS BM significantly decreased. In order to determine apoptosis' actual contribution to defective clonogenic capacity of MDS progenitors, “apoptotic” and “non-apoptotic” bone marrow CD34+ cells were sorted by FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) and their differential clonogenic capacity was assessed in a short-term semisolid culture system. There was no correlation between apoptosis’ existence and culture performance, since non-apoptotic as well as apoptotic CD34+ bone marrow cells both exhibited similar defective growth. Basal intracellular expression of antiapoptotic Hsps 27, 72 and 73 was found significantly elevated in bone marrow cells of MDS patients. Hsps overexpression mainly involved total BMMC, while higher protein levels were also detected within patients’ progenitor bone marrow cells, but the differences noted did not attain statistical significance. Moreover, HS treatment provoked the effective induction of Hsps 27 and 72 in both MDS and normal subjects leading to the achievement of even higher final protein levels in the patients’ marrow, despite the already enhanced basal expression. Both basal and HS-induced Hsp72 expression were significantly enhanced in BMMC of MDS patients with advanced disease, while a positive correlation between all three Hsps basal expression and blast percentage was established in the patients' marrow. These findings suggest a probable role of Hsps overexpression in the favored selection and expansion of clonal cells, further hematopoiesis depression and disease progression. Combined pro-apoptotic treatment of normal BM cells caused a significant downregulation of Hsp72. On the contrary, BM cells from MDS patients responded by elevating the expression of cytoprotective Hsp72 in about 36% of cases. Finally, in accordance to the well-demonstrated cytoprotective role of Hsps, an inverse correlation was noted between spontaneous or induced apoptosis and Hsps basal or induced expression. In conclusion, our findings support the previous observations of increased apoptosis in MDS marrow, especially in "early" disease. Interestingly, early apoptotic MDS progenitors exhibit the potential to escape from apoptosis and even recover functionally, as shown in CFU-assays, when separated from the bone marrow microenvironment, the main source of pro-apoptotic signalling. Alternatively, these cells, due to intrinsic defects in cell death activated pathways, may undergo incomplete apoptosis and get rescued possibly carrying, though, potentially transforming mutations. However, apoptosis does not seem to be the only cause of impaired clonogenic growth in MDS, as apoptotic and non-apoptotic progenitors exhibit similar patterns of growth, both defective compared to normal. Apparently, additional intrinsic abnormalities limit the clonogenic potential of apoptotic and non-apoptotic progenitors. Augmented Hsps expression established in MDS marrow may support the underlying transformation process through the suppression and silent gathering of mutations, probably promoting viability and growth of otherwise mutant cells. Moreover, increased levels of anti-apoptotic Hsps may account for the proposed incomplete apoptosis of MDS marrow cells. Hsps appear to provide resistance against spontaneous or induced apoptosis to the overexpressing cell population. Hsps' positive correlation to blast count and disease stage implies that the overexpressing mature cells along with their abnormal progenitors, encompassing a survival advantage over normal cells in the pro-apoptotic MDS marrow, get selected and expanded during disease progression. On such a background of non-susceptibility to apoptosis a secondary event blocking differentiation could lead to leukaemic transformation.