Search

Ο Σακχαρώδης Διαβήτης τύπου 2 (ΣΔτ2) αποτελεί μια χρόνια μεταβολική πολυπαραγοντική διαταραχή που χαρακτηρίζεται από υψηλά επίπεδα γλυκόζης αίματος και συνδέεται με την ινσουλινοαντοχή ή/και με τη διαταραχή στους μηχανισμούς έκκρισης της ινσουλίνης. Κατά την τελευταία δεκαετία, πάνω από 60 μελέτες σάρωσης ολόκληρου του γονιδιώματος (Genome-Wide Association Studies-GWAS) αποκάλυψαν την παρουσία περισσότερων από 250 νουκλεοτιδικών πολυμορφισμών (Single Nucleotide Polymorphism-SNPs) που φαίνεται πως συνεισφέρουν στην αύξηση του κινδύνου εμφάνισης ΣΔτ2, με μικρή όμως επίδραση. Δεδομένου ότι η κατανόηση των πολυγονιδιακών νοσημάτων επιχειρείται σήμερα διαμέσου της συνδυαστικής μελέτης του μεταγραφώματος και του επιγενώματος, σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής τέθηκε η μελέτη του μοριακού προφίλ των ασθενών με ΣΔτ2 διαμέσου γενετικών και επιγενετικών δεικτών καθώς και η σχέση αυτών με συγκεκριμένους κλινικοπαθολογικούς και προδιαθεσικούς παράγοντες της νόσου, εφαρμόζοντας υψηλής ανάλυσης, σύγχρονες μεθοδολογίες αλληλούχησης και ποσοτικοποίησης γονιδίων. Αρχικός στόχος της διατριβής τέθηκε η μελέτη των επιπέδων έκφρασης 24 γονιδίων, τα οποία ήταν ήδη γνωστό από μελέτες GWAS οτι εμφανίζουν SNPs που σχετίζονται με τον αυξημένο κίνδυνο εμφάνισης ΣΔτ2. Τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων αυτών επιλέχθηκε να μελετηθούν στο περιφερικό αίμα καλά χαρακτηρισμένων ασθενών με ΣΔτ2 και υγιών δοτών. Τα αποτελέσματα ανέδειξαν ότι οι ασθενείς με ΣΔτ2 εμφανίζουν διαφορικά επίπεδα έκφρασης συγκεκριμένων μεταγράφων των γονιδίων CAPN10, KCNQ1, CDK5, CDKN2A, THADA και IGF2BP2, συγκρινόμενοι με τους υγιείς δότες. Τα επίπεδα έκφρασης των παραπάνω μεταγράφων συσχετίστηκαν επιπλέον με συγκεκριμένες κλινικοπαθολογικές παραμέτρους της νόσου και μάλιστα με διαφορετικό πρότυπο μεταξύ των ομάδων. Επόμενος στόχος της παρούσας διδακτορικής διατριβής τέθηκε η διερεύνηση των μηχανισμών ρύθμισης της έκφρασης των γονιδίων που εμφάνισαν διαφορικά επίπεδα έκφρασης μεταξύ των ομάδων διαμέσου της μελέτης των miRNAs, που επιβεβαιωμένα πειραματικά στοχεύουν τα γονίδια αυτά, και του προφίλ μεθυλίωσης των υποκινητών τους. Από τα αποτελέσματα αυτά προέκυψε ότι το περιφερικό αίμα των ασθενών με ΣΔτ2 χαρακτηρίζεται από μειωμένα επίπεδα έκφρασης των miRNAs: let-7b-5p, miR-1-3p, miR-24-3p, miR-34a-5p, miR-98-5p, miR133a-3p και miR-125b-5p, συγκρινόμενο με εκείνο των υγιών δοτών. Ακόμη, τα επίπεδα έκφρασης των miRNAs που εμφάνισαν διαφορικά επίπεδα έκφρασης μεταξύ υγιών και ασθενών με ΣΔτ2 συσχετίστηκαν (θετικά ή αρνητικά) με τα επίπεδα έκφρασης των mRNAs-στόχων τους καθώς και με συγκεκριμένες κλινικοπαθολογικές παραμέτρους της νόσου και μάλιστα με διαφορετικό πρότυπο μεταξύ των ομάδων. Τέλος, η μελέτη του προφίλ μεθυλίωσης των υποκινητών των γονιδίων διαφορικής έκφρασης ανέδειξε οτι το γονίδιο CDK5 στους ασθενείς με ΣΔτ2 εμφανίζει μια τάση αύξησης του μέσου όρου του ποσοστού μεθυλίωσης στις υπό μελέτη θέσεις με σημαντικότερες διαφορές στη θέση της κυτοσίνης -271 (ως προς τη θέση έναρξης της μεταγραφής), συγκριτικά με τους υγιείς δότες. Τα παραπάνω αποτελέσματα περιγράφουν μια -ειδική για το ΣΔτ2- γενετική και επιγενετική «υπογραφή» στο περιφερικό αίμα των ασθενών με ΣΔτ2, η οποία θα μπορούσε να συνδέεται με τους υποκείμενους παθοφυσιολογικούς μηχανισμούς που εμπλέκονται στην ανάπτυξη του ΣΔτ2 και υποδηλώνει την ύπαρξη πολύπλοκων μηχανισμών που ρυθμίζουν τη γονιδιακή έκφραση και μπορούν επίσης να εμπλέκονται με τη σειρά τους στην παθογένεια της νόσου. Type 2 Diabetes mellitus (T2D) is a chronic metabolic disorder which is characterized by high blood glucose levels and associated with insulin resistance and/or insulin deficiency. During the last decade, over 60 Genome Wide Association Studies (GWAS) revealed more than 250 Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) related to T2D or glycemic traits, with rather modest effect sizes in the disease risk. Due to the fact that the understanding of polygenic human diseases is attempted nowadays through the study of the transcriptome and epigenome, the aim of this thesis was to investigate the molecular profile of T2D patients through the study of genetic and epigenetic markers and explore possible associations with disease parameters and risk factors, applying high-throughput and highly sensitive molecular methodologies of RNA sequencing and quantification of gene expression levels. Initially, we focus on the study of the expression profile of 24 T2D susceptibility genes which are known from GWAS studies that bear SNPs associated with T2D development and/or characteristics of the disease. The expression profile of these genes was evaluated in the peripheral blood of well characterized T2D patients and healthy individuals. The results revealed that T2D patients exhibit differential expression patterns of specific transcript variants of the T2D susceptibility genes CAPN10, KCNQ1, CDK5, CDKN2A, THADA, and IGF2BP2, compared to healthy individuals. Furthermore, the mRNA levels of the transcript variants also correlated with certain clinicopathological parameters of the disease with different patterns between the two groups: T2D patients and healthy individuals. The next aim of this thesis was to investigate the regulation mechanisms of gene expression through the study of miRNAs which are experimentally validated to target the differentially expressed genes and to study the methylation profile of these genes in the peripheral blood of T2D patients and healthy individuals. These results revealed that the peripheral blood of T2D patients is characterized by decreased expression levels of the miRNAs: let-7b-5p, miR-1-3p, miR-24-3p, miR-34a-5p, miR-98-5p, miR133a-3p and miR-125b-5p, compared to healthy individuals. Furthermore, the expression levels of these miRNAs correlated (positively or negatively) with the expression levels of their mRNA-targets as well as with certain clinicopathological parameters of the disease, even with different patterns between the groups. Finally, the study of methylation of the -differentially expressed- genes revealed that T2D patients exhibited general higher percentage of methylation in the promoter region of the gene CDK5, with statistically significant results for the position -271 (regarding Transcription Start Site), compared to healthy individuals. The data of this thesis revealed a T2D- specific genetic and epigenetic «signature» in the peripheral blood of T2D patients which can be related to the underlying pathophysiological mechanisms involved in the development of the disease and suggest the presence of complex molecular mechanisms that can regulate gene expression and can also be involved in the pathogenesis of the disease.

Η μοντελοποίηση των ταμιευτήρων πετρελαίου και των πετρελαϊκών συστημάτων, η οποία οδηγεί στην εκτίμηση των αποθεμάτων τους σε υδρογονάνθρακες, απαιτεί την εισαγωγή κινητικών δεδομένων της θερμικής διάσπασης του κηρογόνου για την ανακατασκευή της γενεολογικής τους ιστορίας. Στις περισσότερες βιομηχανικές μελέτες η ταχύτητα αντίδρασης και ο παράγοντας συχνότητας προσδιορίζονται βιβλιογραφικά, περιγράφοντας κηρογόνα παρόμοιας προέλευσης και περιβάλλοντος εναπόθεσης. Έχει αποδειχθεί ότι αυτή η προσέγγιση οδηγεί σε σημαντικές ανακρίβειες. Εναλλακτικά, οι αντιδράσεις θερμικής διάσπασης μπορούν να μελετηθούν με πειράματα θερμικής βαρυτομετρίας (TG) με διαφορετικούς ρυθμούς θέρμανσης, ώστε να προσεγγιστούν οι συνθήκες γέννησης υδρογονανθράκων, επιτρέποντας τον προσδιορισμό της θερμικής ενέργειας που χρειάζεται η γέννηση των υδρογονανθράκων κάτω από διαφορετικές γεολογικές συνθήκες. Είναι ευρέως αποδεκτό ότι η διαδικασία της πυρόλυσης στην ανάλυση Rock-Eval (RE) αποτελεί την πρότυπη βιομηχανική μέθοδο προσδιορισμού του τύπου και του επιπέδου ωρίμανσης του κηρογόνου. Επίσης η καμπύλη S2 στην πυρόλυση RE μπορεί να χρησιμοποιηθεί στην παραγωγή της κινητικής της αντίδρασης. Η μέθοδος παρέχει γρήγορα και αξιόπιστα δεδομένα πυρόλυσης και υπολογίζει με ακρίβεια τις κινητικές παραμέτρους. Η κινητική της θερμικής διάσπασης του κηρογόνου περιγράφεται σαν μια σειρά ανεξάρτητων και παράλληλων σχεδόν μη αναστρέψιμων αντιδράσεων πρώτης τάξης και εκφράστηκαν από μια κατανομή της ενέργειας ενεργοποίησης και του παράγοντα συχνότητας. Αυτή η παραδοχή μοιάζει υπεραπλουστευμένη. Παρ’ όλα αυτά υποστηρίζεται στη φύση από παρατηρήσεις της ωρίμανσης του μητρικού πετρώματος. Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκε μια ομάδα δεκαεννέα μητρικών πετρωμάτων, γνωστής ηλικίας και σχηματισμού, για να αποδείξει την ικανότητα της ανάλυσης Rock-Eval να παρέχει ακριβή κινητικά δεδομένα, σύμφωνα και με τα δεδομένα της μεθόδου TGA, και συγκρίσιμα με δεδομένα που προκύπτουν από χρονοβόρα και ακριβά εργαστηριακά πειράματα πυρόλυσης. Τα δεδομένα που προέκυψανα από τις παραπάνω αναλύσεις αποτέλεσαν το σετ εισαγωγής στο πρόγραμμα KINETICS 05. Τα κινητικά δεδομένα των δειγμάτων που εξετάστηκαν δημοσιεύθηκαν. Τα κινητικά δεδομένα επεξεργάστηκαν περεταίρω με ένα αλγόριθμο ιεραρχικής ταξινόμησης ώστε να ληφθούν συμπεράσματα σχετικά με τον τρόπο που πρέπει να επεξεργαστούν τα δείγματα. Επιπλέον εξετάστηκε η επίδραση του περιεχομένου του δείγματος (ανόργανο περιεχόμενο, παρουσία βιτουμενίου), χρησιμοποιώντας προεπεξεργασμένα με υδροχλωρικό οξύ δείγματα καθώς δείγματα στα οποία είχε εκχυλιστεί το βιτουμένιο με οργανικούς διαλύτες. Οι τεχνικές που προτείνονται προσφέρουν πολύτιμα δεδομένα για τις ιδιότητες του πετρώματος. Τα κινητικά δεδομένα που προκύπτουν από την TGA παρέχουν πολύτιμες πληροφορίες για τη σύσταση του δείγματος, ειδικά εάν συνδιαστούν και με τα αποτελέσματα της ανάλυσης XRD. Τα αποτελέσματα της ανάλυσης RE υποδεικνύουν ότι η γεωμετρία της κορυφής S2 μπορεί να αποκαλύψει το επίπεδο ωρίμανσης του μητρικού πετρώματος. Τέλος ο αλγόριθμος της ιεραχικής ταξινόμησης κατέταξε τα δείγματα με βάση το αυξανόμενο επίπεδο ωρίμανσης, το μειούμενο το πετρελαϊκό δυναμικό και βασίστηκε στο σχηματισμό από τον οποίο προέρχεται το κάθε δείγμα., Basin and petroleum system modeling, which leads to the assessment of hydrocarbons’ resources, requires kerogen thermal transformation kinetics as input for the reconstruction of generation history. In most industrial studies reaction rates and frequency factors are selected from literature data, describing kerogens of similar origin and environment of deposition. It has been shown that this approach leads to significant inaccuracies. Alternatively, thermal decomposition reactions may be studied with thermal gravimetry (TG) experiments at various heating rates to approximate hydrocarbon generation processes allowing the thermal energy required for hydrocarbon generation under differing geological conditions to be inferred. Rock-Eval (RE) analytical pyrolysis method has been widely accepted as industry standard method in petroleum exploration studies to identify kerogen type and maturation level; while RE pyrolysis curve (S2) may be used to generate reaction kinetics. The method provides pyrolysis data in a rapid and sensitive way to obtain and as it has been shown, it estimates accurately the kinetic parameters. The kinetics of the thermal decomposition of kerogen are typically described as a series of independent and parallel 1st order quasi-irreversible reactions and expressed by a distribution of activation energy with a single fixed frequency factor. This assumption seems to be oversimplified; nevertheless, it is supported by observations of the source rock maturation in nature. In this work, a sample set of nineteen source rocks of known formation and age were used to demonstrate the ability of the RE method to provide accurate kinetic data, along with TGA method, comparable to the ones obtained from time-consuming and costly laboratory pyrolysis experiments. The data obtained by RE analysis and TG analysis were used as input for the software KINETICS 05. Kinetic data for the examined samples is reported. The kinetic data were further treated by a hierarchical clustering algorithm in order to draw conclusions regarding the way the samples should be treated. Furthermore, the influence of the matrix (inorganic content, presence of bitumens) was studied, using samples pretreated respectively, by HCl treatment and organic solvent extraction. The techniques proposed offer valuable insight into the properties of the rock. Kinetic data derived from TGA provide valuable information on the composition of the sample, especially if they combined with XRD analysis data of the same sample. The results of RE kinetic analysis indicate that the geometry of S2 peak may reveal the level of maturation of the source rock. Finally, the clustering algorithm sorted the samples based on increasing level of maturation, decreasing hydrocarbon petroleum potential and based on the formation each sample came from.

H αλόγιστη απόρριψη των αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων στο περιβάλλον προκαλεί σοβαρά προβλήματα παγκοσμίως. Πολλά από αυτά όπως π.χ. τυρόγαλα περιέχουν θρεπτικά συστατικά τα οποία μπορούν να χρησιμοποιηθούν από μικροοργανισμούς προς παραγωγή προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας. Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκε ο ζυμομύκητας Kluyveromyces marxianus για την ζύμωση συνθετικού μέσου με λακτόζη συγκέντρωσης ανάλογης με εκείνη του τυρογάλακτος (~5% w/v) προς παραγωγή αιθανόλης. Προσδιορίσθηκαν οι βέλτιστες φυσικοχημικές συνθήκες και τα αποτελέσματα έδειξαν ότι σε pH 7 και 30οC επιτυγχάνεται μέγιστη ταχύτητα ζύμωσης και συγκέντρωση αιθανόλης. Στις ίδιες συνθήκες, μέτρηση του ρυθμού πρόσληψης λακτόζης επισημασμένης με 14C από τον μικροοργανισμό έδειξε ότι αυτός σχετίζεται άμεσα με την κινητική της ζύμωσης. Τhe indiscriminate disposal of agro waste in the environment causes serious problems worldwide. However, many of them for example whey, contain nutrients which can be used by microorganisms in order to produce products with high value. In this study is being used the yeast Kluyveromyces Marxianus for the fermentation of synthetic substrate of lactose with lactose concentration similar to that of the whey (~5% w/v) for ethanol production. Having determined the optimal physicochemical conditions and the results showed that at pH 7 and 30οC achieved a maximum speed of fermentation and ethanol concentration. Under the same conditions, measuring the rate of uptake of 14C-labeled lactose by the microorganism showed that this is directly related to the kinetics of fermentation