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Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung von fluoreszenten Farbstoffnanopartikeln, welche als Label in einem Immunoassay eingesetzt werden und die Signalintensität und Sensitivität des Assays steigern sollten. Dafür wurden systematische Verkapselungsstrategien für verschiedene neutrale und ionische/ geladene Farbstoffe untersucht und systematische Untersuchungen zu Einflussgrößen wie Nanopartikelgröße, Biokonjugation und Farbstoffbeladungskonzentration durchgeführt. Es wurden zwei unterschiedliche Partikelsysteme hergestellt und in Bezug auf ihre reproduzierbare Herstellung und spätere Eignung für den Einsatz als Nanopartikellabel in Immunoassays systematisch untersucht. Dabei stellten sich aufgrund ihrer Stabilität, ihrer einfachen und reproduzierbaren Herstellung, ihrer engen und definierten Größenverteilung, ihrer ausreichend funktionellen Oberflächengruppen und durch die Möglichkeit die Farbstoffmenge im NP präzise einzustellen, farbstoffbeladene Polystyrolpartikel als besonders geeignet heraus. Für die Anbindung von SAv an amino- und carboxyfunktionalisierte Polystyrolnanopartikel wurden zwei verschiedene Kopplungssmethoden, die Anbindung über EDC/ sulfo-NHS und über einen heterobifunktionellen PEG-Linker, getestet. Beide Kopplungsstrategien sind geeignet, um Streptavidin an die Partikeloberfläche zu binden unter Vermeidung von NP-Aggregation. Die Mengen an partikelgebundenem SAv wurden mit Hilfe des BCA- und Biotin-FITC-Assays bestimmt. Da beide Assays vorrangig für die Quantifizierung von Proteinen in Lösung entwickelt wurden, mussten beide Assays erst auf mögliche Wechselwirkungen mit Farbstoffen und der Partikelmatrix sowie Störeinflüsse durch die Partikelstreuung und spektrale Interferenzen mit den Kodierungsfarbstoffen untersucht werden. Dabei konnte gezeigt werden, dass einige Farbstoffe den Kupfer(II)-BCA-Komplex reduzieren und es folglich zu einer Überbestimmung von Streptavidin kommt. Weiterhin konnten Farbstoffe wie meso-Tetraphenylporphyrin identifiziert werden, die mit Streptavidin wechselwirken und dadurch die Biotin-Anbindung stark beeinträchtigen, so dass es bei der Biotin-FITC-Titration zu einer Unterbestimmung von funktionalem Streptavidin kommt. Durch das Anbinden von SAv über einen PEG-Linker konnte die NP-Oberfläche abgeschirmt werden, so dass die Wechselwirkungen von an der NP-Oberfläche befindlichem meso-Tetraphenylporphyrin mit SAv reduziert und die Funktionalität von Streptavidin erhalten werden konnte. Zudem wurde eine Methode entwickelt, um die Partikelstreuung bei der Absorptionsmessung zu korrigieren. Streptavidinfunktionalisierte, gefärbte Nanopartikel wurden anschließend in einem Immunoassay zum Nachweis von CRP getestet. Dazu wurden vier Qualitätsparameter (EC50-Wert, Detektionslimit (LOD), dynamischer bzw. relativer dynamische Bereich, Güte des Fits (R2)) aufgestellt, anhand derer die Assays in Bezug auf eine Steigerung der Sensitivität und Signalintensität untersucht wurden. Zudem wurden vier weitere Parameter wie Detektionsprinzip (Detektion von fluoreszenten Nanopartikeln versus Farbstofffreisetzung), Nanopartikelgröße, Farbstoffbeladung und Art der Streptavidinanbindung untersucht, welche einen Einfluss auf die Sensitivität und Signalintensität besitzen. Diese mit Cumarin 153-beladenen PS NP zeigten, dass bei der Verwendung hochbeladener Partikel höhere Fluoreszenzintensitäten durch die Extraktion des Farbstoffes mit Ethanol erreicht werden können. Zudem konnte gezeigt werden, dass die Größe des Nanopartikels einen Einfluss auf spezifische und unspezifische Wechselwirkungen mit der Mikrotiterplatte sowie den daran adsorbierten Proteinen hat, was bei 500 nm Partikeln zu einem ungewollt höheren Untergrundsignal führte und zu einer geringen spezifischen Bindung. Der Einsatz PEGylierter Nanopartikel im Immunoassy konnte keine reproduzierbaren Ergebnisse liefern. Anhand verschiedener Beladungskonzentrationen konnte gezeigt werden, dass die Größe des Fluoreszenzsignals der farbstoffbeladenen Partikel das Signal hauptsächlich von der Quantenausbeute und der Anzahl der eingequollenen Farbstoffe und speziell für Cumarin 153 kaum vom molaren dekadischen Extinktionskoeffizienten abhängt und das Signal nicht bei der größten Beladungsmenge maximal wird. Wird der Farbstoff aus den Partikeln extrahiert, hängt die Signalintensität nur noch von der Anzahl der Farbstoffe ab. Screening-Experimente mit den Farbstoffen Cumarin 153, Nilrot, meso-Tetraphenylporphyrin, Lumogen R F305, Itrybe und Eu(TTFA)3(phen) zeigten, dass mit Cumarin 153 die besten Ergebnisse erzielt werden. Die anderen Farbstoffe schienen partiell die Anbindung der NP an den Immunkomplex zu stören oder zeigten verstärkte Lösch- und Aggregationseffekte. Beim Vergleich des entwickelten partikelbasierten Immunoassays mit einem ELISA lagen die EC50-Werte des Partikelassays um einen Faktor von 10 höher. Dies liegt eventuell an der schlechteren Bindung der Partikel an den Immunkomplex. Eine Steigerung der Nachweisstärke des partikelbasierten Immunoassays könnte eventuell durch eine Optimierung der Partikelgröße erreicht werden. Der Einsatz von kleineren Partikeln könnte die Sensitivität des partikelbasierten Immunoassays weiter steigern. Eventuell ist die Anbindung kleinerer Nanopartikel besser. Zudem ist ihr Platzbedarf kleiner, weshalb mehr Immunkomplexe je NP detektiert werden. Obwohl sie wesentlich weniger Farbstoffe tragen, könnte es ein Optimum zwischen der Anzahl der Farbstoffe und der NP-Größe sowie dem Platzbedarf geben, um möglichst sensitiv mit einem hohen Signal Analyten nachweisen zu können. Zudem sind nach den Untersuchungen zu unspezifischen und spezifischen Wechselwirkungen bei kleineren Polystyrolnanopartikeln noch geringere unspezifische Wechselwirkungen zu erwarten. Ein weiterer Ansatz könnte die Herstellung eines katalytischen Systems sein. Sofern ein Katalysator in Polystyrolpartikel eingequollen werden kann und anschließend ebenfalls ein Substrat umsetzt, könnte die Anzahl der detektierten Farbstoffe je Analyt noch weitaus größer ausfallen und so schon sehr geringe Mengen an Analyt detektieren, was ggf. die Sensitivität des Assays steigert., The aim of the present work was the development of fluorescent nanoparticles, which could be used as label in an immunoassay to enhance the signal intensity and sensitivity. Therefore, systematic encapsulation strategies with varying neutral and ionic/ charged dyes were performed to identify influencing parameters like nanoparticle size, bioconjugation, and dye loading concentration. Two different types of particle systems were assessed in more detail in terms of their reproducible production and their applicability as nanoparticle label. Due to their stability, simple and reproducible production, narrow and defined particle size distribution, and availability with different surface functional groups together with the possibility to incorporate a precise amount of dyes, dye loaded polystyrene nanoparticles were identified as a suitable particle system. For the covalent coupling of streptavidin (SAv) on amino and carboxy functionalized polystyrene nanoparticles, required for assay development and antibody conjugation, two different conjugation strategies were tested, the coupling via EDC/ sulfo-NHS chemisty and via heterobifunctional PEG linker. Both coupling strategies are suitable to bind Streptavidin on the nanoparticle surface without nanoparticle aggregation. The amount of particle-bound SAv was quantified using the BCA and Biotin-FITC assay. The former assay provides the total amount of protein without information on its function whereas the latter measures solely the amount of functional, biotin-binding protein. As both assays are designed for quantification of SAv in solution, both assays had to be tested for interactions with dyes and the particle matrix and for influences from particle scattering and absorption as well as well fluorescence of the embedded dyes. It was shown that some dyes like certain coumarins can reduce the BCA copper(II) complex and as a result yield an overdetermination of SAv with the BCA assay. Furthermore, dyes like meso-tetraphenylporphyrine were identified, that affect SAv strongly, and as a result, lead to an underdetermination of SAv with the Biotin-FITC assay. In this respect, also a method was developed to consider particle scattering in absorption measurements. Coupling of SAv via PEG linker leads to a shielding of the nanoparticle surface, thereby reducing interactions between meso- tetraphenylporphyrine located close to or at the nanoparticle surface with SAv and preserving the functionality of SAv. SAv-functionalized, dye loaded nanoparticles were subsequently used as labels in a Sandwich immunoassay to determine c-reactive protein (CRP) and compared to a classical ELISA using an enzyme-functionalized detection antibody and the colorimetric substrate 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine. For the particle-based immunoassay, the biotinylated detection antibody was functionalized with these dye-stained, SAv-functionalized nanoparticles. Four quality parameters (average effective concentration (EC50), limit of detection (LOD), dynamic range/ relative dynamic range (DR/ RDR), and goodness of fit (R2)) were chosen that allowed to evaluate the immunoassays in terms of signal intensity enhancement and sensitivity. In this respect, also the influence of the principle of signal generation (detection of fluorescent nanoparticles versus dye extraction and measurement of dissolved dye molecules) as well as the influence of nanoparticle size, dye loading concentration, and SAv conjugation chemistry were studied. These studies showed an influence of nanoparticle size on the specific and unspecific interactions of SAv with the microtiter plate and the adsorbed proteins, accounting for the higher background signal and low specific binding observed for 500 nm-sized nanoparticles. The use of PEGylated nanoparticles in immunoassays provided no reproducible results. Initially performed screening tests with the different staining dyes Coumarin 153, Nile Red, Lumogen R F305, Itrybe and Eu(TTFA)3(phen) showed that Coumarin 153 gives the best results. The other dyes seem to hinder partially the binding of the nanoparticles on the immune complex or showed more fluorescence quenching or aggregation effects. Subsequently performed systematic studies, focusing on mainly on Coumarin 153-stained nanoparticles, revealed that the signal size clearly depended on dye properties like the fluorescence quantum yield as well as on the amount of incorporated dye molecules and a signal enhancement could be demonstrated for the dye extraction approach. A comparison of the developed particle-based immunoassay and an ELISA revealed a 10-fold higher EC50 value for the particle-based immunoassay. This could be due to a less good binding of the particles on the immune complex. Most likely, an increase of the signal intensity/ sensitivity of the particle-based immunoassay could be achieved by further optimization of the particle size and it is anticipated that the use of smaller particles could increase the sensitivity of the particle-based immunoassay. Although smaller nanoparticles can incorporate only a lower amount of dyes, there seem to be an optimum between the amount of incorporated dyes, the nanoparticle size, and the required space (a big nanoparticle could hide more unlabeled immune complexes, than a small nanoparticle) to quantify analytes sensitively with a high signal. Furthermore, unspecific adsorption is expected to be lower for smaller particles. An alternative approach to enhance the sensitivity of particle-based assays could present the use of a catalytic system. In this case, a catalyst could be incorporated into the nanoparticles, which then turns a substrate into a colored or fluorescent product after extraction of the catalyst.

Das clostridiale C2-Toxin gehört zur Familie der binären ADP-ribosylierenden Toxine. Es besteht aus der Enzymkomponente C2I sowie der Translokationskomponente C2II. Die N-terminale Adaptordomäne C2IN interagiert mit der aktivierten Translokationskomponente C2IIa und wird anschließend durch die Bindung von C2IIa an den zellulären Rezeptor endozytotisch aufgenommen. Auf Basis der Adaptor Domäne C2IN konnten bereits verschiedene Fusionsproteine erfolgreich in eukaryote Zellen transportiert werden. Die Herstellung solcher Fusionsproteine ist mit einem hohen zeitlichen und technischen Aufwand verbunden. Durch die Verbindung von C2IN mit dem Protein Streptavidin ist ein neuartiges Transportsystem entstanden. Streptavidin bindet das Vitamin Biotin nicht kovalent mit hoher Affinität. Dies erlaubt eine Kopplung verschiedenster biotinylierter Substanzen an das Transportsystem C2IN-Streptavidin und erlaubt diesen über das Transportsystem den Aufnahmemechanismus des C2-Toxins zu nutzen. In der hier veröffentlichten Arbeit gelang die Etablierung eines Protokolls zur affinitätschromatographischen Aufreinigung des Transportsystems C2IN-Streptavidin, der Nachweis einer intakten Biotinbindung sowie der erfolgreiche spezifische Transport eines biotinylierten Fluorophors in eukaryote Vero-Zellen.

The interdisciplinary projects in bioinorganic and bioorganic chemistry of the Department of Chemistry, University of Basel led to the preparation of new systems that mimic biologically important processes and to the discovery of compounds from natural sources which are very promising with respect to medical applications. The advances in these areas are reported here.

Molecular imaging enables to assess disease-associated processes at the cellular and molecular level. Nuclear medicine techniques are already available in the clinical routine. Besides these techniques, intensive research has been performed in the field of ultrasound. The development of target-specific ultrasound contrast agents in combination with modern imaging systems transformed ultrasound to a capable molecular imaging technique. It has been shown that the expression of disease-associated endothelial receptors can be assessed using targeted microbubbles, demonstrating its high value in the diagnosis of several diseases. The broad availability of suitable ultrasound systems promises a wide utilisation in the clinical routine, once clinically approved contrast agents are available. This review summarizes the basics and the current status of molecular ultrasound imaging.

Im Rahmen des EU-Projektes BE 97-428 (ULISA) wurde die nt-Sequenz der VH-/VL-Regionen der mAK gegen humanes H-FABP (IT13B8/E6) und CEA (2-4.4, 3-55.4) aufgeklärt. Funktionelle Fab- und scFv-Fragmente des mAK IT13B8/E6 wurden exprimiert und via ELISA detektiert. Bei Untersuchung des Klons IT13B8 wurde ein nicht-produktives VH-Gen entdeckt. Die Produktion der scFv-Fragmente erfolgte im Vektor pASKscFvIT1 ohne vorangehende SOE-PCR. Funktionelles CSav wurde zur Produktion von scFv-CSav-Fragmenten exprimiert. Zur Detektion der I-PCR-Produkte wurde ein PCR-ELISA-Verfahren optimiert. Der Nachweis von Pi mittels Enzymbiosensor erfolgt über Maltosephosphorylase (mapA) aus Lactobacillus brevis. Die ermittelte nt-Sequenz umfasst ca. 98,5 Prozent des nativen mapA-Gens. MALDI-TOF-Analyse ergab, dass der C-Terminus des mapA weitere 10-12 AS aufweist. Mittels der nt-Sequenz und Röntgenkristallographie wurde die Tertiärstruktur der mapA ermittelt und Hinweise auf den molekularen Katalysemechanismus erhalten.

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit semisynthetischen Enzymen, das heißt Enzymen, deren katalytisch aktives Zentrum zuvor in einem chemischen Modifikationsschritt in ein Protein eingebaut wurde. Hierdurch kann eine Kombination der Eigenschaften homogener und enzymatischer Katalysatoren erreicht werden. Im Verlauf der Dissertation wurden verschiedene Methoden zur selektiven chemischen Modifikation von Proteinen mit katalytisch aktiven Übergangsmetallkomplexen untersucht, unter anderem die Anbindung mit auf Organophosphorverbindungen basierenden Suizidsubstraten sowie die (Strept)Avidin-Biotin-Technologie, die sich als das geeignetste Verfahren erwies. Zur Umsetzung einer kombinatorischen Optimierungsstrategie des modular aufgebauten Proteinliganden erfolgte des weiteren die Miniaturisierung und Parallelisierung zweier asymmetrischer Übergangsmetallkatalysen sowie die Entwicklung mehrerer Multi- Parallelreaktorsysteme.

Titelblätter #### Inhaltsverzeichnis #### 1\. Einleitung 1 #### 2\. Zielsetzung 17 #### 3\. Methoden 18 #### 4\. Ergebnisse 48 #### 5\. Diskussion 97 #### 6\. Zusammenfassung 110 #### 7\. Literaturverzeichnis 112 #### 8\. Anhang 118, Das überaus große Interesse an der Identifikation von Protein-Protein Wechselwirkungen gipfelte bereits Mitte der 80er Jahre mit dem 'Phage Display' in einem ersten Selektionssystem. Die Anfang der 90er Jahre aufkommende Methode zur in vitro Selektion von Nukleinsäuren, welche die schnelle Generierung von Aptameren und Ribozymen ermöglicht, verdeutlichte die enormen Vorteile und Möglichkeiten eines in vitro Systems, die von den zur Verfügung stehenden Bibliotheken mit bis zu 1016 verschiedenen Molekülen herrühren. Da Proteine im Gegensatz zu Nukleinsäuren eine größere Palette an strukturellen und katalytischen Eigenschaften in der Biologie bereitstellen und wesentlich intensiver in der Diagnostik, Therapie und bei industriellen Applikationen verwendet werden, bestand großes Interesse in der Entwicklung von Methoden zur in vitro Selektion von Proteinen. Ein Ende der 90er Jahre entwickelter Ansatz ermöglicht die in vitro Selektion und Evolution von Proteinen durch Kopplung des Genotyps, in Form der mRNA, mit dem Phänotyp, in Form des Proteins und erhielt den Namen 'Ribosome Display'. Diese Arbeit beschreibt die Selektion streptavidinbindender Peptide, sowie die Entwicklung der dafür benötigten Technologien. Streptavidin wurde als Zielmolekül ausgewählt, da eine Vielzahl von kommerziell erhältlichen Streptavidinkonjugaten eine breite Anwendung in den Biowissenschaften finden. Basierend auf einem zellfreien, prokaryontischen Translationssystem erfolgte die Etablierung des 'Ribosome Display' anhand eines Modellsystems, dessen Grundlage erstmals kein Antikörper, sondern ein His-tag, also ein einfaches Affinitätspeptid war. Es wurden zwei Nukleinsäure kodierte Peptidbibliotheken generiert, wobei der randomisierte Anteil in einem Fall aus 16 NNS-Codons besteht und die 'Loopstruktur' des Chymotrypsin- Inhibitors 2 aus dem Gerstenkorn kodiert. Die zweite Bibliothek umfaßt 15 NNS- Codons und kodiert den N-Terminus des fettsäurebindenden Proteins (FABP) aus Rinderherz. Aus der kombinatorischen FABP-Bibliothek konnten mit Hilfe des 'Ribosome Display' nach sieben in vitro Selektionsrunden streptavidinbindende Peptide isoliert werden. Klonierung und Sequenzierung ergaben eine Reihe unterschiedlicher Peptide, die sich im wesentlichen in zwei Gruppen unterteilen ließen. Bei der größeren Gruppe handelt es sich um Peptide mit einem HPQ-Motiv, das bereits aus anderen Arbeiten bekannt ist. Bei der anderen Gruppe handelt es sich um völlig neuartige Peptide, die am N-terminus ein DVEAW-Motiv aufweisen. Aus dieser Gruppe geht der beste Binder mit der Sequenz DVEAWLDERVP-LVET und einem Kd-Wert von etwa 84 nM hervor, der sich zudem hervorragend als Affinitätspeptid zur Aufreinigung rekombinanter Proteine eignet. [if !supportEmptyParas] [endif], The great interest in the identification of protein-protein interactions culminated in the first selection system which was phage display in the middle of the eighties. Beginning of the nineties a method for the in vitro selection of nucleic acids was introduced, which enables the rapid generation of aptamers and ribozymes and highlighted the enormous advantages and possibilities of an in vitro system stemming from the large initial libraries with up to 1016 different members. Because proteins in contrast to nucleic acids carry out a wider range of structural and catalytic roles in biology and are much more extensively used in diagnostic, therapeutic, and industrial applications, great interest has been generated in the development of methods for the in vitro selection of proteins. At the end of the nineties a method for the in vitro selection and evolution of proteins was developed and designated ribosome display. This work describes the selection of streptavidin-binding peptides and the development of the required technologies. Streptavidin was chosen as target molecule, because a large number of commercial available streptavidin-conjugates is widely used in the field of life science. A cell-free, prokaryotic translation system was the basis for establishing the ribosome display technique and took place with help of a model system. For the first time such a model system was based on a simple affinity tag, namely His-tag and not an antibody. Two nucleic acid encoded peptide libraries had been generated. The random portion of the one library consisted of 16 NNS-codons and encodes the loopstructure of the chymotrypsin inhibitor 2 from barley seeds. The other library contained 15 NNS-codons and encodes the N-terminus of the fatty acid binding protein (FABP) from bovine heart. It was possible to isolate streptavidin-binding peptides from the combinatorial FABP-library after seven rounds of in vitro selection. Cloning and sequencing revealed a number of different peptides which could be divided in two groups. The larger group involves peptides with a HPQ-motif which is known from other selections. The other group involves totally new peptides with a DVEAW-motif at their N-terminus. Out of this group the best binder evolves with the sequence DVEAWLDERV-PLVET and a Kd value of about 84 nM. This peptide is outstandingly suitable as an affinity peptide for the purification of recombinant proteins. [if !supportEmptyParas] [endif]