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Zelluläre Seneszenz ist ein Prozess, der aus einer Vielzahl von Stressfaktoren resultiert und zu einem Zustand des irreversiblen Wachstumsstillstands führt. Seneszente Zellen exprimieren verschiedene Faktoren, die als Seneszenz assoziierter sekretorischer Phänotyp (SASP) bekannt ist. Dazu zählen unter anderem proinflammatorische Zytokine, Wachstumsfaktoren und Matrix Metalloproteasen. Da viele dieser Moleküle proinflammatorisch sind, kann die SASP-Produktion zu Inflammationen führen. Bei chronischer Expression führt dies zu alters-bedingten Erkrankungen. Man kann zurzeit jedoch nur diese Erkrankungen selbst behandeln und nicht dessen Auslöser. Die Frage wäre, ob es Pflanzen- oder Pilzextrakte gibt, die einen mildernden Effekt auf den SASP haben. Wie würde sich die SASP-Genexpression von seneszenten Zellen durch die Behandlung mit diesen Extrakten verändern und sind die Primer in diesem Fachgebiet verlässlich? Dazu wurden seneszente Fibroblasten den Extrakten des Reishi-Pilzes, der südafrikanischen Pflanze Sutherlandia Fruteszens, Quercetin und Gallussäure über einen Zeitraum von 14 Tagen ausgesetzt. Die Zellzahl und die RNA-Konzentrationen wurden bestimmt, um zu sehen, ob der Wachstumsarrest eingesetzt hatte. Zuletzt wurde, mittels qPCR, die Veränderung der Genexpression der behandelten Zellen mit den zuvor etablierten Primern untersucht. Durch die Kontrolle mit jungen unbehandelten Zellen konnte man im Vergleich sehen, dass der Wachstumsarrest in allen Versuchen sehr wohl eingesetzt hatte. Die Ergebnisse zeigten, dass die südafrikanische Pflanze nicht sehr viel Einfluss auf die Genexpression nahm. Quercetin hatte nachweislich die besten Ergebnisse erzielt und zeigte dämpfende Effekte auf manche Faktoren des SASP. Die Pilzextrakte hatten zwar keine sehr herausstechenden Effekte auf den SASP, jedoch war schon eine veränderte Genexpression zu sehen. Dieses Themengebiet steht zwar noch am Anfang ihrer Erforschung, zeigt jedoch versprechende Aussichten auf erfolgreiche Behandlungen von seneszenten Zellen. Background: Cellular senescence is a process that results from a variety of stress factors und leads to a state of irreversible growth arrest. These cells secrete various factors known as the senescence-associated secretory phenotype (SASP). These include pro-inflammatory cytokines, growth factors and matrix metalloproteases. Because many of these molecules are pro-inflammatory, SASP production can potentially lead to chronic inflammation. This is believed to play an important role in the pathogenesis of various degenerative, metabolic and age-related diseases. However, only those diseases that develop due to senescence can currently be treated, since a study on healthy people would not be feasible without a confirmed diagnosis. Research questions: The aim of this study was to find potential mushroom and plant extracts, that have a mitigating effect on the SASP. Particularly this thesis aimed to analyze how the SASP gene expression of senescent cells would change if treated with these extracts. Further we wanted to know, how reliable the primers in this field are. Methods: For this purpose, senescent fibroblasts were exposed to extracts of the Reishi Mushroom, the South-African plant Sutherlandia Frutescens, Quercetin and Gallic acid over a period of 14 days. Cell number and RNA levels were measured to see if the growth arrest had set in. Finally using qPCR, the change in SASP gene expression of the treat cells were examined with the previously established primers. Results: In comparison with young, untreated cells, it was possible to see that growth arrest was established in all experiments. The results showed that the South-African plant did not have much influence on the gene expressions of the genes used. Quercetin had been shown to produce the best results and showed inhibiting effect on some SASP factors. Although the mushroom extracts did not have any noticeable effect on the SASP, an altered gene expression could be seen. Discussion: Although this topic is still in the early stages of research, it shows promising prospects for successful treatment of senescent cells before the development of senescent-associated diseases.

Malaria ist eine der global bedeutendsten Infektionskrankheiten. Als Goldstandard zum Nachweis einer Malariainfektion gilt die Mikroskopie. Diese Methode birgt Probleme durch den nicht flächendeckenden Zugang zu Elektrizität vor allem in den Hauptendemiegebieten der Erkrankung und aufgrund der großen Expertise, die für das richtige Erkennen der Infektionen bei dieser Diagnostikmethode vorausgesetzt wird. Im letzten Jahrzehnt konnte durch die Einführung von Schnelltests die Rate von Personen, die auf Malaria getestet werden, entscheidend erhöht und damit auch die Behandlung dieser Personen ermöglicht werden. Nach Einführung und breiter Nutzung dieser Schnelltests wurden in mehreren Studien falsch-negative Testergebnisse beschrieben. Als Gründe werden zu niedrige Parasitämien und Schnelltests geringer Qualität genannt, bis hin zu Parasitenstämmen, die das nachzuweisende Protein HRP2 nicht mehr exprimieren. Die WHO hat daraufhin empfohlen, die Prävalenzen der hrp2- und hrp3-Gendeletionen zu bestimmen. Im Rahmen dieser Arbeitsgruppe wurde dazu ein 4plex-qPCR-Protokoll entwickelt, welches in einem einzigen Schritt eine Aussage über das Vorhandensein der Gene hrp2 und hrp3 trifft, gleichzeitig durch das Gen cytochrom b hochsensitiv eine Infektion mit dem P. falciparum nachweist und durch das single copy gene β tubulin eine interne Qualitätskontrolle ermöglicht. Bei dem ersten 4plex-qPCR_v1-Protokoll wurde von einer relativ hohen Rate an Kreuzreaktivität zwischen hrp2 und hrp3 ausgegangen, weshalb für die vorliegende Arbeit neue Primer und Sonden de-signt wurden und ein 4plex-qPCR-Protokoll der zweiten Generation etabliert und optimiert wurde. Mit diesem Protokoll wurden klinische Feldproben aus Lambaréné, Gabun, gemessen, die in vorherigen Messungen mit dem 4plex-qPCR_v1-Protokoll unklare Ergebnisse erbracht haben. Weiter konnte gezeigt werden, dass die Sensitivität des Nachweises einer hrp2- bzw. hrp3-Deletion mit dem 4plex-qPCR_v2-Protokoll entscheidend höher liegt als die Sensitivität, die mit der konventionellen PCR zu erreichen ist. Für weitere epidemiologische Studien zur Prävalenzbestimmung der Deletionen empfiehlt sich daher die Me-thode der qPCR. Das 4plex-qPCR_v2-Protokoll wird von nun an innerhalb dieser Arbeitsgruppe für die weitere Detektion von hrp2- und hrp3-Deletionen in Lambaréné, Gabun, verwendet.

Die aquatische Umwelt kann zur Entwicklung und Verbreitung von klinisch bedeutsamen Antibiotikaresistenzgenen (ARG) beitragen. Das Potenzial der aquatischen Umwelt als Reservoir für ARG in Gebieten, die anthropogen beeinflusst sind, wurde bereits in einigen Studien beschrieben. Die Zusammenhänge zwischen dem Erwerb von Resistenzen durch Umweltbakterien und der rapiden Entwicklung multiresistenter Keime im klinischen Bereich müssen jedoch noch detaillierter aufgeschlüsselt werden, um konkrete Übertragungswege erkennen zu können und so gezielt gegen die alarmierende Entwicklung vorzugehen. Dafür wurde zum einen ein Monitoring verschiedener Bereiche in der Umwelt, wie Oberflächenwässer und Sedimente, durchgeführt. Proben chinesischer und deutscher Trinkwasser-Reservoirs weisen ähnliche Muster von Resistenzgen-Vorkommen auf, was die globale Relevanz der aquatischen Umwelt als Quelle für Antibiotikaresistenzen unterstreicht. Um Risiken durch die Verbreitung von Resistenzen durch Umweltbakterien, freie DNA oder Phagen besser abwägen zu können, wurde eine Methode entwickelt, um ARG speziell in diesen Fraktionen nachzuweisen und diese als mögliche Distributoren für ARG zu identifizieren. Für erste Oberflächenwässer, die mit diesen Methoden untersucht wurden, konnte gezeigt werden, dass Resistenzen gegen Sulfonamide (sul1 und sul2), sowie β-Laktame (blaTEM) eine Relevanz in Phagen und in frei vorliegender DNA aufweisen. Da sich mikro- und molekularbiologische Methoden stets ergänzen, wurde der Fokus sowohl auf Polymerasekettenreaktion (PCR)-basierte Methoden zum Nachweis von ARG, als auch auf kulturbasierte Verfahren zum Nachweis von Umwelt-relevanten antibiotikaresistenten Bakterien (ARB) aus Umweltproben gelegt. Durch diese auf R2A-Medien mit geringem Nährstoffgehalt basierenden Kulturverfahren konnte gezeigt werden, dass β-Laktam-Resistenzen (gegen Cephalosporine der 3. Generation und die Reserveantibiotika-Gruppe der Carbapeneme) unter oligotrophen Umweltbakterien in deutschen Oberflächenwässern bereits weit verbreitet sind. Somit konnten die Ergebnisse dieser Arbeit die Vermutung stützen, dass Umwelt-relevante Bakteriengattungen zur Verbreitung von Antibiotikaresistenzen beitragen. Da für die Entwicklung neuer Strategien zur Vermeidung der Ausbreitung von Antibiotikaresistenzen meist die menschliche Gesundheit im Fokus liegt, ist auch die Elimination von ARG und ARB aus Oberflächenwässern ein entscheidender Schwerpunkt der aktuellen Forschung, um eine Gefährdung der Exposition durch Trinkwässer auszuschließen. Deshalb wurden auch im Rahmen dieser Arbeit Trinkwasseraufbereitungsanlagen beprobt und auf Antibiotikaresistenzen untersucht. Dabei standen Proben aus China und Deutschland zur Verfügung, durch die die Effizienz verschiedener Behandlungsverfahren hinsichtlich der Entfernung von Resistenzen evaluiert werden konnte. Hierbei konnten deutliche Unterschiede zwischen der ARG-Eliminationseffizienz deutscher und chinesischer Wasserwerke beobachtet werden, wobei ARG-Rückstände nach der Wasserbehandlung nur in den am Tai See (Nähe Shanghai) lokalisierten Wasserwerken feststellbar waren, was auf vergleichsweise höheren Einträgen von Abwässern aus Industrie, Agrarwirtschaft und urbanen Ballungsräumen zurückzuführen ist. Die Entwicklung und Anwendung quantitativer Long-Amplikon PCR Methoden zum Nachweis vollständiger Resistenzgene (darunter sul1 und blaTEM) konnten die Reduktion der ARG durch reaktive Behandlungsverfahren wie Chlorung, UV-Bestrahlung und Ozonung hierbei besser abbilden als die konventionellen qPCR Methoden, mit denen eine Überschätzung der Genkopienzahl wahrscheinlich ist. Innovative Layer-by-Layer-Membrantechnologien konnten zudem auf den Rückhalt von ARG untersucht werden. Ihr Potential für die Anwendung in der Trinkwasseraufbereitung konnte sowohl im Labor- als auch im Pilotmaßstab bestätigt werden.

Histomonas meleagridis, ein parasitäres Protozoon, verursacht die Schwarzkopfkrankheit bei Puten und Hühnern, was zu wirtschaftlichen Verlusten führt. Frühere Behandlungen wurden in der EU und USA verboten und es gibt derzeit keine Behandlung für die Krankheit. Daher werden derzeit Studien zur Schaffung eines potenziellen Impfstoffs durchgeführt. Die Verbesserung der Kultivierung von H. meleagridis ist ein wichtiger Aspekt dieser Forschung. In dieser Studie sollte untersucht werden, ob die Zugabe von Bacillus licheniformis in Form eines probiotischen B-Act (Huvepharma, Belgium) zum Kulturmedium die Kultivierung der Protozoen verbessert. Die Ergebnisse bestätigten diese Hypothese, es gab einen signifikanten Anstieg der H. meleagridis-Zellzahlen mit einem Medium, das 108 CFU/ ml B. licheniformis Zellen enthielt. Die Anzahlen der für die Kultivierung essentiell E. coli wurde ebenfalls gemessen, um festzustellen, ob sie durch B-Act verändert wurden. Das zweite Ziel war es zu untersuchen, in welche Richtung das g6116-Gen von H. meleagridis transkribiert wird, indem sein Genom durch qPCR analysiert wird. Im Rahmen dieser Studie wurden die Vorarbeiten zur Bestimmung der optimalen Primer-, Template- und Probe-Konzentrationen untersucht. Als optimale Bedingungen für weitere qPCR Reaktionen haben sich 500 nM Primer, 10 ng/µl Template und 100 nM Probe herausgestellt. Histomonas meleagridis, a parasitic protozoan, causes blackhead disease in turkeys and chicken, which gives rise to economic losses. Previous treatments have been banned in the EU and USA and there is currently no treatment for the disease. Therefore, studies to create a potential vaccine are undergoing. Improving the cultivation of H. meleagridis is an important aspect of such research. In this study, one aim was to investigate if adding Bacillus licheniformis in form of a probiotic B-Act (Huvepharma, Belgium) to the culture medium will improve the cultivation of the protozoa. The results confirmed this hypothesis, there was a significant increase in H. meleagridis cell numbers with a medium containing 107 CFU/ml of B. licheniformis cells. The numbers of E. coli, which is essential for cultivation, were also measured to see if it is changed by B-Act. The second aim was to investigate in which direction the g6116 gene of H. meleagridis is transcribed by analyzing its genome by qPCR. In the frame of this study the preparatory work of determining the optimal primer, template and probe concentrations were investigated. Optimal conditions for further qPCR reactions were found to be 500 nM of primer, 10 ng/µl of template and 100 nM of probe.

Bevor ein zellbasiertes GTMP erstmalig beim Menschen angewendet werden kann, müssen verschiedene notwendige nicht-klinische Studien durchgeführt werden. Wichtig ist hier u.a. die Untersuchung der Biodistribution im Tiermodel. Diese umfasst die Verteilung, das Engraftment, die Persistenz, die Eliminierung und gegebenenfalls die Expansion der humanen Zellen in verschiedenen Organen, meistens im Mausmodel. Deshalb wurde eine qPCR-basierte Analysenmethode entwickelt, mit der humane genomische DNA innerhalb von muriner genomischer DNA bestimmt werden kann, und entsprechend den regulatorischen Richtlinien der European Medicines Agency und des International Council for Harmonisation validiert. Anschließend wurde diese Methode innerhalb einer präklinischen worst-case Szenario Biodistributionsstudie angewendet. Das Ziel dieser Studie war die Untersuchung des Biodistributionsprofils von genetisch modifizierten Blood Outgrowth Endothelial Cells von Hämophilie A Patienten 24 Stunden und sieben Tage nach intravenöser Applikation einer Dosis von 2x106 Zellen. Die Isolation, genetische Modifikation und die Expansion der Zellen sollte entsprechend den Richtlinien der Guten Herstellungspraxis durchgeführt werden. Hierbei ist die Auswahl und Anwendung geeigneter und essentieller Rohstoffe wichtig. Gleichermaßen ist die Durchführung einer definierten Qualitätskontrollstrategie notwendig und die Patientenzellen sollten nur innerhalb von nicht-klinischen Studien eingesetzt werden, wenn alle Akzeptanzkriterien erfüllt wurden. Die Validierung der qPCR-Methode zeigte eine hohe Genauigkeit, Präzision und Linearität innerhalb des Konzentrationsintervalls von 1:1x103 bis 1:1x106 humanen zu murinen Genomen. Bei Anwendung dieser Methode für die Biodistributionsstudie konnten nach 24 Stunden humane Genome in vier der acht untersuchten Mausorgane bestimmt werden. Nach sieben Tagen konnten in keinem der acht Organe humane Genome nachgewiesen werden..., The mandatory non-clinical study scheme prior to the first administration of a cell-based gene therapy medicinal product (GTMP) to human subjects includes and requires investigation of the biodistribution, comprising mobilization, persistence, and clearance, of the GTMP in a relevant animal model. Therefore, a qPCR-based method to determine the amount of human DNA in mouse DNA was developed and validated according to the guidelines of the European Medicines Agency and the International Council for Harmonisation. Furthermore, a preclinical worst-case scenario study was performed, in which this method was applied to investigate the biodistribution of 2x106 intravenously administered, genetically modified blood outgrowth endothelial cells from hemophilia A patients after 24 hours and seven days. The isolation, genetic modification and expansion of cells should be performed according to the guidelines on Good Manufacturing Practice. Here, the selection and application of appropriate and necessary raw materials is important. Likewise, the performance of a defined quality control program is mandatory and cells should only be applied within non-clinical studies if they passed all acceptance criteria. The validation of the qPCR method demonstrated high accuracy, precision, and linearity for the concentration interval of 1:1x103 to 1:1x106 human to mouse genomes. The application of this method in the biodistribution study resulted in the detection of human genomes in four out of the eight investigated organs after 24 hours. After seven days, no human DNA was detected in the eight organs analyzed. This biodistribution study provides mandatory data on the toxicokinetic safety profile of an actual cell-based medicinal product candidate. This is a prerequisite for designing and performing the subsequent toxicity studies necessary to ensure patient safety and permit moving the medicinal product towards a first-in-human clinical trial.

DNA-Methylierung und dessen Involvierung in der Genregulation spielt eine wichtige Rolle bei menschlichen Krankheiten wie Krebs und genetischen Imprinting-Störungen wie dem Prader-Willi und dem Beckwith-Wiedemann-Syndrom. DNA-Methylierung kann mithilfe von verschiedenen Methoden nachgewiesen werden. In dieser Arbeit wurde die Eignung der Nanopore-basierten Sequenzierungstechnologie von Oxford Nanopore Technologies für die Bestimmung von DNA-Methylierung getestet. Die Nanopore Sequenzierungstechnologie bietet eine DNA-schonende Alternative im Gegensatz zu gängigen Methoden zum Nachweis von DNA-Methylierung. Ein weiterer Vorteil besteht in der einfacheren Handhabung des Sequenziergeräts und die einfache Probenvorbereitung, wodurch es auch abseits von hoch spezialisierten Laboren verwendet werden kann. Zunächst wurde die Verwendung von 11 Primern für die Amplifikation von kurzen Targets im menschlichen Genom getestet und die Amplikons erfolgreich mit dem Oxford Nanopore MinION Sequenziergerät sequenziert. Im zweiten Ansatz wurden BSP-Primer verwendet, um die gleichen Zielregionen wie im ersten Ansatz von Bisulfit-konvertierter DNA zu amplifizieren. Methylierung von Cytosin konnte so festgestellt werden, allerdings konnte nicht für alle BSP-Primer Produkte generiert werden und die Verteilung der Anzahl der Reads unterhalb der Targets war unausgewogen. In einem weiteren Versuch wurde die Read-Verteilung in einem akzeptablen Bereich ausbalanciert, indem die DNA-Konzentration jedes Produkts vor der Sequenzierung auf die gleiche Menge eingestellt wurde. DNA methylation and its involvement in gene regulation plays a vital part in human diseases such as cancer and genetic imprinting disorders like Prader-Willi and Beckwith-Wiedemann syndrome. DNA methylation can be detected using various methods. In this thesis, the suitability of Oxford Nanopore Technologie's nanopore-based sequencing for the determination of DNA methylation was tested. Nanopore sequencing offers a less DNA-damaging sequencing possibility, in contrast to common methods for the detection of DNA methylation. Another advantage of the sequencer is the easier handling and the simple sample preparation, which allows for sequencing away from highly specialised laboratories. First, the usage of 11 primers for the amplification of short-target regions in the human genome was tested and the amplicons successfully sequenced by the Oxford Nanopores MinION sequencing device. In the second approach, BSP primers were used to amplify the same target regions of bisulfite converted DNA. This way, methylation of Cytosines could be detected but only a few of these primers could amplify their targets and the distribution of the number of reads for the targets was unbalanced. In a further attempt the read distribution was in an acceptable range equalized among the targets by setting the DNA concentration of each amplicon to the same before sequencing.

Die Stechmücken-Population in Österreich ist in den letzten Jahren durch invasive Arten (zum Beispiel (z. B.) Aedes japonicus, Japanische Buschmücke) erweitert worden, sodass diese bereits zu dieser heimischen Population zählen. Da die morpho-logische Beurteilung für eine rasche und eindeutige Arten-Identifizierung oft nicht ausreicht, sollte ein Real-Time Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) Verfahren entwickelt werden. Dazu wurden verschiedene Primer von Stechmücken-spezifischen Barcode-Regionen (Cytochrom c Oxidase 1, 16S, ITS2) an in Österreich gesammelten Stechmücken sowie an in Laboren gezüchteten Stechmücken (z. B. Aedes aegypti) getestet. Von den selbstdesignten Primer- und Sonden-Systemen haben sich zwei für das COI-Gen entworfene als besonders aussichtsreich erwiesen, um unterschiedliche Stechmückenarten identifizieren zu können. Da diese beiden Systeme jedoch noch nicht zusammen in einer qPCR-Reaktion verwendet werden können, sind weitere Anpassungen notwendig. In recent years the mosquito population in Austria has been affected by invasive species (for example (e.g.) Aedes japonicus, Japanese Bush Mosquito) so that they already part of this native population. Since the morphological assessment is often insufficent for a quick and precise identification of the species, the aim was to develop a Real-Time polymerase chain reaction (qPCR) method should be developed. For this purpose different primers of mosquito-specific barcode regions (Cytochrome c Oxidase 1, 16S, ITS2) were tested on mosquitoes collected in Austria as well as on mosquitoes bred in laboratories (e. g. Aedes aegypti).Two of the self-designed primer and probe systems for the COI-gene have proven to be particularly promising in order to be able to identify different mosquito species. However, since these two systems cannot be used together in a qPCR reaction, further adaptations are necessary. Verfasserin: Carina Zerbe Abweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des Verfassers Masterarbeit FH JOANNEUM 2021

Tumorspezifische Nukleinsäuren von Tumorzellen können als Biomarker für prognostische, diagnostische und prädiktive Zwecke in humanem Blut verwendet werden. Die Probleme bei der Detektion von tumorspezifischen Nukleinsäuren im Blut sind mögliche Tumorheterogenität und geringe Konzentrationen an Tumor-DNA vor einem großen Hintergrund an Wildtyp-DNA. Für die Detektion der tumorspezifischen Mutationen BRAF V600E, PTEN T167A und NRAS Q61L im Melanom wurden drei dPCR-Assays für Singleplex- und Multiplexanwendungen entworfen. Neben der Entwicklung der dPCR-Assays wurde ein Detektionslimit für die Mutation BRAF V600E in Vorversuchen mit DNA von Zelllinien ermittelt. Diese Studie zeigt die Funktionstüchtigkeit der Assays PTEN und BRAF mittels qPCR und das mit dPCR ermittelte Detektionslimit für BRAF V600E. Die hier präsentierte Methode ist in der Lage geringe Konzentrationen mutierter DNA vor einem Hintergrund von mindestens 4.000 Wildtyp-DNAs zu detektieren. Tumor-specific nucleic acids derived from tumor cells can be used as biomarkers for prognostic, diagnostic and predictive purposes in the blood of patients. The problems with the detection of tumor-specific nucleic acids in the blood are possible tumor heterogeneity and low concentrations of tumor DNA against a large background of wild-type DNA. For the detection of the tumor-specific mutations BRAF V600E, PTEN T167A and NRAS Q61L in melanoma, three dPCR assays for singleplex and multiplex applications were designed. In addition to the development of the dPCR assays, a detection limit for the BRAF V600E assay was determined in preliminary tests with DNA from cell lines. This study shows the functionality of the PTEN and BRAF assays using qPCR and the detection limit for BRAF V600E determined using dPCR. The method presented here is able to detect low concentrations of mutated DNA against a background of at least 4,000 wild-type DNAs.

Fragestellung: Die Pathophysiologie der Osteoarthrose (OA) ist durch Entzündungsprozesse sowie den Abbau extrazellulärer Matrix gekennzeichnet. Wir beschäftigen uns mit der Frage, ob glykobiologische Mechanismen (wie die Interaktion von zellulären Glykanen mit glykan-bindenden Proteinen)[zum vollständigen Text gelangen Sie über die oben angegebene URL], Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2019)

Die erworbene Aortenklappendegeneration ist eine chronisch progrediente Erkrankung, für die es derzeit keine Früherkennungsmaßnahmen gibt. Auch ist es noch nicht möglich, den Verlauf zu verlangsamen oder gar ganz aufzuhalten. Bei der Diagnose einer Aortenklappenstenose besteht die einzige kurative Option in dem interventionellen oder operativen Ersatz der erkrankten Herzklappe. Die Kenntnis der zugrundeliegenden inflammatorischen Mechanismen könnte Ansatzpunkte für eine Therapie liefern. Die Initiationsphase der Aortenklappenerkrankung ähnelt der Entstehung von Atherosklerose. Die vorliegende Studie untersuchte daher, ob vergleichbare Regulationsmechanismen auch bei der Aortenklappendegeneration nachgewiesen werden können. Das Primärziel der Arbeit war der Nachweis eines Unterschiedes in der Genexpression von Indolamin-2,3-dioxygenase 1 (IDO 1). Dies ist ein Enzym, das über das Absenken der lokalen Tryptophanspiegel eine immunmodulatorische Wirkung zeigt. Als Sekundärziel sollte ein Unterschied in der Genexpression von weiteren Zielgenen, die bereits in Zusammenhang mit der Atherosklerose stehen, nachgewiesen werden. Es wurde auch untersucht, inwiefern sich die Bikuspidalität einer Aortenklappe auf die Genexpression auswirkt. In die Studie wurden 48 Patienten im Zeitraum von Juli 2016 bis Mai 2017 eingeschlossen. Es handelte sich um 38 Patienten in der biologischen Gruppe „Verkalkt“ und zehn Patienten in der biologischen Gruppe „Insuffizient“. Nach Entnahme im Operationssaal wurde die Ribonukleinsäure (RNA) der Aortenklappen stabilisiert und bei -80 °C bis zur Verarbeitung gelagert. Das Klappenmaterial wurde nach dem Auftauen homogenisiert und die RNA extrahiert. Diese wurde einer Qualitätskontrolle unterzogen und auf Integrität und Reinheit geprüft. Über eine Reverse Transkription wurde komplementäre DNA (cDNA) hergestellt. Aufgrund der geringen Menge an extrahierter RNA wurde vor der quantitative Echtzeit-Polymerasekettenreaktion (qPCR) eine Präamplifikationsreaktion durchgeführt. Die entsprechenden Kontrollversuche im Rahmen der qPCR wurden laut den Leitlinien „Minimal Information for Publication of Quantitiative Real-Time PCR Experiments“ (MIQE) durchgeführt. Im Anschluss an die qPCR wurden die Proben noch über die von Kossa-Färbung, die Mineralisationsvorgänge sichtbar macht, angefärbt. Die Datenanalyse erfolgte über die Berechnung des Expressionsunterschiedes (2-∆Ct) und über eine Korrelationsanalyse (Kendall‘s Tau). Die verkalkten Aortenklappen besaßen im Vergleich zu den insuffizienten Aortenklappen eine höhere Klappenöffnungsfläche und einen größeren maximalen Druckgradienten. Trikuspide Aortenklappen wiesen eine geringere Klappenöffnungsfläche und einen höheren maximalen Druckgradienten als bikuspide auf. Im Vergleich zu den insuffizienten Herzklappen waren bei den verkalkten Proben nur die Expressionslevel der Zielgene Matrixmetalloproteinase 1 (MMP1) und Tenascin C (TNC) signifikant erhöht. Es fiel auf, dass es bei Patienten mit verkalkten Aortenklappen bei den meisten Zielgenen, insbesondere auch bei IDO1, einige Ausreißerproben gab, deren Expressionslevel sehr hoch ausfielen. Zwischen bikuspiden und trikuspiden Aortenklappen gab es keine signifikanten Unterschiede. Die Korrelationsanalyse erbrachte signifikante Korrelationen fast aller Zielgene der verkalkten Proben. Die histologische Färbung nach von Kossa zeigte für alle insuffizienten Proben kleinste Mineralisationsherde. Ein Hauptproblem dieser Arbeit lag an der Schwierigkeit, gesundes Kontrollgewebe zu sammeln, da sich bei den vermeintlich nicht verkalkten, insuffizienten Proben im Nachhinein mikroskopisch kleine Kalziumablagerungen zeigten. Dennoch sind die verwendeten Aortenklappen durch Unterschiede im Grad der Kalzifizierung gekennzeichnet, worauf, auch in Einklang mit der bestehenden Literatur, die Expressionsunterschiede von MMP1 und TNC zurückzuführen sind. Ein Expressionsunterschied von IDO1 wurde im Unterschied zur Atherosklerose nicht nachgewiesen, was entweder auf das Kontrollgewebe zurückzuführen ist, oder darauf, dass die Rolle dieses Enzyms für die Aortenklappendegeneration weniger zentral ist. Allerdings weisen einige Ausreißerwerte, sowohl bei IDO1 als auch bei den anderen Parametern darauf hin, dass in einer Subgruppe der verkalkten Herzklappen die angenommenen Stoffwechselwege eine Rolle spielen. Die Bedeutung inflammatorischer Stoffwechselwege bei der Erkrankung der Aortenklappe wurde auch über die hochsignifikant positiven Korrelationen untermauert. Um die Hypothesen dieser Arbeit weiter zu stärken, sollte in zukünftigen Studien das Kontrollgewebe mikroskopisch definiert werden und die Probenanzahl erhöht werden.

Fragestellung: Ein Baustein der modernen Knochendefekttherapie ist der gezielte Einsatz von biologischen Aktivatoren wie Bone Morphogenetic Protein-2 (BMP-2) und BMP-7 oder Insulin-like Growth Factor-1 (IGF-1) zur osteogenen Stimulation von mesenchymalen Stammzellen (MSC), die die Grundlage der knöchernen[zum vollständigen Text gelangen Sie über die oben angegebene URL], Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2018)

Fragestellung: Die autologe Spongiosaplastik stellt den Goldstandard in der Behandlung therapierefraktärer Knochendefekte dar. Allerdings unterscheiden sich die osteogenen Eigenschaften von mesenchymalen Stammzellen (MSC) signifikant in Abhängigkeit vom Herkunftsgewebe: MSC aus Knochenmark[zum vollständigen Text gelangen Sie über die oben angegebene URL], 59. Kongress der Deutschen Gesellschaft für Handchirurgie

Als Energieträger mit Potential für Power-to-Gas-Applikationen kann Biogas einen entscheidenden Beitrag zu den drängendsten Fragen der Energiewende leisten: Mobilität, Speicherung von Energie und Netzstabilität. Häufig ist die Biogasproduktion finanziell nicht selbsttragend und die Nachhaltigkeit und Umweltverträglichkeit wird unterschiedlich bewertet. Wichtige Ansatzpunkte zur Optimierung des Biogasprozesses sind Anlagenflexibilisierung, Systemintegration, Power-to-Gas und die Optimierung der biologischen Prozesse. Als Beitrag hierzu werden in der vorliegenden Arbeit, mit Fokus auf der Anlaufphase, die Entwicklung und Dynamik der mikrobiellen Gemeinschaft aus Biogasprozessen, anhand von Betriebsparametern und Stoffwechselprodukten betrachtet. Darüber hinaus wird der Einfluss verschiedener Fütterungsintervalle zur Flexibilisierung, der Einfluss von Metalloiden aus dem Gärsubstrat auf den Biogasprozess, sowie die Relevanz des Austrags von Mikroplastikpartikeln in die Umwelt untersucht. Die Anlaufphase einer Biogasanlage wurde als hochdynamischer Entwicklungsprozess erwartet, der nach Etablierung der mikrobiellen Gemeinschaft zu einem stabilen Prozess führt und wichtige Erkenntnisse für weitere Forschungsarbeiten zur Prozessoptimierung liefert. Die Anlaufphase wurde an einer zweistufigen Anlage im Produktionsmaßstab über den Zeitraum von 240 Tagen verfolgt. Es konnte mittels Automatisierter Ribosomaler intergenischer Spacer Analyse (ARISA) gezeigt werden, dass sich der Untersuchungszeitraum in fünf deutlich getrennte Entwicklungsphasen unterteilt. Trotz anhaltend hoher Dynamik der mikrobiellen Population etablierte sich mit Erreichen der Endtemperatur nach ca. 30 Tagen eine stabile Gasproduktion. Im weiteren Verlauf stabilisierte sich die mikrobielle Population zunehmend und die Reaktionen auf veränderte Bedingungen nahmen ab. Die Untersuchung mittels Next-Generation-Sequenzierung (NGS) zeigte, dass die dominierenden Bakterien den Klassen Clostridia mit den Ordnungen Clostridiales und MBA08 sowie der Klasse Bacteroidia mit der Ordnung Bacteroidales entstammen. Die flexibilisierte Substratgabe wurde erprobt, um die Biogasproduktion an der Energienachfrage zu orientieren, Substrat und Speicherkapazität einzusparen, sowie günstige Einspeisebedingungen zu nutzen. Es wurde erwartet, dass variierende Fütterungsintervalle einen Prozess anstoßen, der über die Zeit zu einer Anpassung der Mikrobiologie führt. Proben der MicrobEnergy GmbH aus einem 200 L Reaktor, in dem über 700 Tage verschiedene Kombinationen aus Fütterungsintervallen und Raumbelastung erprobt wurden, wurden mit den Prozessparametern, Stoffwechselprodukten und der mikrobiellen Entwicklung (NGS)verknüpft. Es etablierte sich ein stabiler Prozess mit weitgehend konstantem CH4-Niveau während der Fütterungsphasen, der durch Substratminimierung eine Reduktion der Gasproduktion von bis zu 80 % innerhalb eines Tages ermöglichte. Wichtige Indikatorparameter für einen funktionierenden Prozess, wie Fettsäure- und Wasserstoffkonzentration, wiesen vor allem in der ersten Hälfte des Versuchs wiederholt erhöhte Werte auf, die sich jeweils nach spätestens drei Tagen wieder normalisierten. In Folge der Flexibilisierung erfolgte eine Neuordnung der Gemeinschaft, die über die letzten 160 Tage, trotz erneuter Änderung des Fütterungsintervalls und der Substratzusammensetzung, weitestgehend konstant blieb. Die dominanten Archaeen stammten aus der Ordnung Methanosarcinales. Im Laufe des Versuches lösten Vertreter der Klasse Methanosaetaceae Vertreter der Klasse Methanosarcinaceae ab. Die Hydrierung und Methylierung verschiedener Metalloide durch Mikroorganismen, ist auch unter anaeroben Bedingungen belegt. Es wurde vermutet, dass Metalloide, die durch das Gärsubstrat in Biogasanlagen gelangen und dort auf eine hochaktive mikrobielle Gemeinschaft treffen, Auswirkungen auf den Prozess und die entstehenden Produkte haben. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnten in allen 15 untersuchten Biogas- und Kläranlagen Metalloide, beispielsweise Arsenverbindungen, nachgewiesen werden. Die Auswirkungen auf den Prozess wurden anhand der Überführung auf einen Laborreaktor untersucht, indem Parallelansätze mit unterschiedlichen Konzentrationen (unbehandelt, 30 μM und 60 μM) von Arsen (As) versetzt wurden. In der Folge wurden für 14 Tage Arsenspezies in der Flüssig- und Gasphase analysiert und in Zusammenhang mit dem produzierten Gasvolumen, CH4-Gehalt, Essigsäure sowie der mikrobiellen Entwicklung (ARISA) beobachtet. Die Arsengabe führte zu einer konzentrationsabhängigen Hemmung des Prozesses, mit einem Einbruch der Gasproduktion sowie der Akkumulation von Essigsäure. Sämtliches As(III) wurde zu As(V) umgewandelt. Zudem fand eine Methylierung und im weiteren Verlauf auch eine Dimethylierung statt. In der Gasphase wurde ausschließlich Arsin (AsH3) sowie einfach methyliertes Arsin (MeAsH2) detektiert. Die mikrobielle Zusammensetzung veränderte sich mit der Gabe von Arsen nicht. Die Belastung durch Polymere, die in die Umwelt geraten, rückt immer weiter in den Fokus der Öffentlichkeit. Zunehmend wird ersichtlich, dass vor allem Kleinstpartikel (Mikroplastik) ubiquitär in der Umwelt vorkommen und bereits in die Nahrungskette eingedrungen sind. Es wurde angenommen, dass organische Dünger aus der Vergärung oder Kompostierung von Bioabfällen eine signifikante Eintragsquelle für Mikroplastik in die Umwelt darstellen. Um dies zu bewerten, wurden aus einer Kompostieranlage sowie aus 14 verschiedenen Biogasanlagen Partikel isoliert, quantifiziert und qualitativ bestimmt. Es konnte gezeigt werden, dass Anlagen aus landwirtschaftlichen Betrieben weitgehend unbelastet sind. In Anlagen zur Verwertung von biogenen Abfallstoffen wurden deutlich höhere Partikelzahlen festgestellt. Die größte Fraktion entfällt auf Partikel der Größenordnung 2-5 mm. Am häufigsten kommen Polymere auf Styrenbasis vor. Die meisten Partikel wurden in einer Anlage zur anaeroben Vergärung von gewerblichen Lebensmittelabfällen mit einer Anzahl von 752 Partikeln kg-1 TS nachgewiesen. Weiterführende Untersuchungen könnten zeigen, ob der Flexibilisierungsprozess durch den Einsatz von Reststoffen nachhaltiger gestaltet werden kann. Das Schadpotential volatiler Arsenverbindungen für weiterverwertende Prozesse kann mittels Sensoren zur Katalysator-Charakterisierung untersucht werden. Das Aufnahmepotential von Mikroplastik sollte durch die Inkubation mit Tierzelllinien oder anhand von Gewebepräparaten untersucht werden.

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Reisfelder zeichnen sich durch Flutung während des Reisanbaus aus, was die Bildung von anoxischen Nischen begünstigt. In diesen Nischen findet der anaerobe Abbau von organischem Material bis hin zur Bildung von Methan durch methanogene Archaeen statt. Ein wesentlicher Teil des organischen Materials in Reisfeldern stammt von der Reispflanze selbst, welche Kohlenstoffverbindungen über ihr Wurzelsystem ausscheidet. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde der Einfluss der Reispflanze auf die mikrobielle Gemeinschaft im Boden untersucht. Die bakterielle Gemeinschaft unterschied sich dabei nur geringfügig in ihrer Zusammensetzung zwischen bepflanztem und unbepflanztem Reisfeldboden. Dabei zeigten unter anderem Geobacter und Opitutus eine höhere Abundanz im bepflanzten Boden. Während sich die Anzahl der Bakterien und der Archaeen im bepflanzten Boden verdoppelte, zeigte die Zusammensetzung der archaeellen Gemeinschaft wenig Veränderung. Zusammengefasst zeigten die Ergebnisse jedoch, dass die mikrobielle Gemeinschaft im Reisfeldboden stark an die Reispflanze und deren Wurzelexudation adaptiert ist. Aufgrund der stetig steigenden Weltbevölkerung ist ein Anstieg der Nachfrage für Ressourcen wie Wasser anzunehmen. Dies könnte eine eingeschränkte Verfügbarkeit an Wasser für den Reisanbau zur Folge haben. Alternative Anbaustrategien, die eine Reduzierung des Wasserverbrauchs im Vergleich zum konventionellen Reisanbau ermöglichen, rücken somit immer mehr in den Fokus. Der Fruchtfolgewechsel mit einer Pflanze wie Mais, die unter nicht gefluteten Feldbedingungen wächst, ist eine dieser Optionen. Der zweite Teil dieser Arbeit unterteilt sich daher in zwei Schwerpunkte: Unter Feldbedingungen wurde der Einfluss (I) der Wachstumsstadien der Reispflanze sowie (II) der von Feldbearbeitungsmaßnahmen wie der Dränage und dem Anbau von Mais unter nicht gefluteten Bedingungen auf die mikrobielle Gemeinschaft im Reisfeldboden untersucht. Dabei wurde gezeigt, dass sich die Wachstumsstadien der Reispflanze nur begrenzt auf die Zusammensetzung und Aktivität der Mikroben auswirkten. Im Gegensatz dazu führten Dränage und der Anbau von Mais zu einer Abnahme der Abundanz der Mikroben. Desweiteren zeigten verschiedene bakterielle Gruppen eine Reaktion auf die Feldbearbeitungsmaßnahmen indiziert durch eine erhöhte relative Abundanz in den nicht gefluteten Feldern. Diese unterteilten sich in zwei Gruppen: (I) aerobe Organismen wie Spartobacteria und Sphingobacteria und (II) Bakterien, die unter substratlimitierten Bedingungen wachsen, wie Bacteroidetes und Acidobacteria. Im Gegensatz dazu blieb die archaeele Gemeinschaft weitestgehend unbeeinflusst. Interessanterweise wurden innerhalb der Ordnung der Methanosarcinales eine große Anzahl an GOM Arc I Spezies gefunden, die potentiell zur anaeroben Methanoxidation fähig sind. Desweiteren, wurde während der nicht gefluteten Bedingungen beobachtet, dass der Ribosomengehalt pro Zelle auf einem hohen Niveau gehalten wurde. Dies wurde als Stressantwort aller anaeroben Archaeen und Bakterien auf die ungünstigen aeroben Bedingungen interpretiert. Im dritten Teil dieser Arbeit wurden der Verlauf des Fruchtfolgewechsels und dessen Einfluss auf die mikrobielle Gemeinschaft im Boden über einen Zeitraum von zwei weiteren Jahren verfolgt. Nach Einführung der Maiskultivierung in das Reisökosytem erfolgte ein jährlicher Fruchtfolgewechsel mit Reis (geflutet) in der Regenzeit und Mais (nicht geflutet) in der Trockenzeit. Alternativ wurde in beiden Jahreszeiten Reis unter gefluteten Bedingungen angebaut. Die bakterielle Gemeinschaft zeigte eine geringe Reaktion auf den Fruchtfolgewechsel. Eine stärkere Veränderung erfolgte in der archaeellen Gemeinschaft. Ausgehend von einer von methanogenen Archaeen dominierten Gemeinschaft in den gefluteten Reisfeldern entwickelte sich in den nicht gefluteten Maisfeldern eine überwiegend aus aeroben Thaumarchaeoten bestehende Gemeinschaft. Innerhalb der Thaumarchaeoten wurde die Gruppe Soil Crenarchaeotic Group angereichert, welche hauptsächlich von Ammoniumoxidierern (Candidatus Nitrososphaera) repräsentiert wurde. Dies deutet darauf hin, dass der Oxidation von Ammonium möglicherweise eine höhere Bedeutung in nicht gefluteten Boden zukommt. Desweiteren, zeigten auch hier die methanogenen Euryarchaeoten unter nicht gefluteten Feldbedingungen eine Stressreaktion in Form einer erhöhten Ribosomenzahl pro Zelle. Das erneute Fluten in der Regenzeit ermöglichte den Euryarchaeoten allerdings nicht, sich wieder zu erholen und ihre ursprüngliche Abundanz zu erreichen. Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen annehmen, dass die Reispflanze Einfluss auf die Mikroben im Reisfeldboden nimmt (erster Teil). Desweiteren führten Veränderungen in den Feldbearbeitungsmaßnahmen, wie Dränage und Fruchtfolgewechsel, zu einer schwachen kurzfristigen Reaktion der gesamten mikrobiellen Gemeinschaft (zweiter Teil) und einer stärkeren langfristigen Reaktion der methanogenen Archaeen (dritter Teil).

Im Rahmen dieser Arbeit wurde die mRNA-Expression von aussichtsreichen Kandidatengenen spezifisch für DA Mittelhirnneurone von post-mortem Morbus Parkinson-Patienten im Vergleich zu nicht erkrankten Kontrollen untersucht. So sollten ursächliche oder möglicherweise kompensatorische Mechanismen im Zusammenhang mit der Pathogenese des Morbus Parkinson in individuellen dopaminergen Mittelhirnneuronen identifiziert oder validiert werden. Zunächst wurde dazu die Einzelzellmethodik weiterentwickelt und an die spezifischen Anforderungen zur Analyse von humanem post-mortem Material angepasst. Die Resultate der Genexpressionsanalyse dieser Studie basieren auf den kombinierten Techniken der kontaktfreien Lasermikrodissektion individueller Zellen von Ethanol-fixierten und cresylviolett gefärbten Mittelhirngewebeschnitten auf Polyethylen-Naphthalat-beschichteten Objektträgern mit anschließender cDNA-Synthese, sowie der Quantifizierung der mRNA-Levels via real-time qPCR. Diese kombinierte LMD und real-time qPCR Einzelzellmethodik wurde auf weitere murine Gewebearten erfolgreich angewandt und darüber hinaus für den Einsatz von anderen Objektträgern und die alternative PFA-Fixiertechniken sowie die parallele Analyse von regulatorischen miRNAs erweitert. Die Hauptbefunde dieser Arbeit sind orchestriert erhöhte mRNA-Levels von Genen, die mit Dopaminsynthese und -metabolismus assoziiert sind, in individuellen, humanen Neuromelanin-positiven DA Mittelhirnneuronen von PD-Patienten im Vergleich zu nicht an PD erkrankten Kontrollen. Diese Erhöhung geht mit ebenfalls in PD erhöhten mRNA-Leveln aktivitätsmindernder Kaliumkanaluntereinheiten einher, während aktivitätsfördernde Ionenkanaluntereinheiten keine Veränderung aufwiesen.

Basierend auf Beobachtungen über phänotypische Änderungen in Vollgeschwisterfamilien der Fichte,Picea abies, aus unterschiedlichen Kreuzungsumwelten wurde nach der geneti-schen Untersuchung mit EST-Markern eine kapillarelektrophoretische Untersuchung der DNA durchgeführt. Dabei wurden signifikante Unterschiede im Methylcytosin(mC)-Gehalt festgestellt. Messungen der mC-Gehalte nach Hitzeschock zeigten, den Einfluss der Um-weltbedingungen auf die Methylierung der DNA. Untersuchungen zur Dynamik wiesen signi-fikante Änderungen der mC-Gehalte die während früher ontogenetischer Stadien nicht je-doch nach Pathogenbefall nach. Die Expression von nach Sirococcus conigenus-Infektion induzierten Genen wurde mit Macroarrayhybridisierung und quantitativer PCR untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Fichte Gene aus unterschiedlichen Synthesewegen akti-viert. Based on the observations of phenotypic changes in full sib families of Norway Spruce,Picea abies produced under different environmental conditions the amount of 5-methyl cytosine content was determined using capillary electrophoresis after genetic analy-ses of plant and seed material using EST markers. Significant differences in the 5-methyl cytosine contetnt could be measured in the full sib families. Determination of 5-methyl cytosine content folowing heat shock treatment also revealed the environ-mental influence on DNA methylation. Analysis of the dynamic of DNA methylation showed significant changes during ontogentic stages but not folowing pathogen at-tack. Expression of infection induced genes following Sirococcus conigenus attack was monitored using Macroarray hybridisation and quantitative PCR. It could be demonstrated that Norway spruce reacts on pathogen attack by the activation of genes from several pathways.

Besonders in der Stammzellbiologie ist die stadienabhängige Expression von bestimmten Proteinen entscheidend für den Verlauf von Proliferation, Differenzierung und Zelltod (Apoptose). Ziel dieser Arbeit ist daher die Etablierung der Real-Time-PCR Methode für das Erstellen von Genexpressionsprofilen neuraler Stammzellen aus mRNA-Quantifizierungsanalysen. Da die Beobachtung auf mRNA-Ebene sowohl Translation als auch Transkription mit einbezieht, können Aussagen über bereits erworbene morphologische Merkmale(Strukturproteine, Enzyme) ebenso getroffen werden, wie über biochemische Vorgänge in der Zelle. Beispiele dafür sind molekulare Schaltmechanismen, Signaltransduktion oder molekulargenetische Prozesse, wie Transkriptionsaktivatoren und Suppressoren. Ein weiteres Ziel dieser Untersuchungen ist die Charakterisierung von humanen adulten neuralen Stammzellen unterschiedlicher Stadien. Dies ist unumgänglich, um Klonierungen und Zellsortierungen genetisch zu überprüfen und Aussagen über die Reinheit von Stammzellpopulationen treffen zu können.