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In den letzten Jahrzehnten haben sich die Maßnahmen zur Tilgung der Klassischen Schweinepest bei Wildschweinen weiterentwickelt. In der vorliegenden Arbeit wird der aktuelle Status der Bekämpfungsstrategie der Klassischen Schweinepest in Rheinland-Pfalz in dem Zeitraum von 2005 bis 2011 beschrieben und ausgewertet. Die dabei durchgeführten offiziellen Kontrollmaßnahmen basierten auf folgenden drei Schwerpunkten:Jagdliche MaßnahmenDas erste Ziel bei der Bekämpfung der Klassischen Schweinepest mittels jagdlicher Maßnahmen ist die ganzjährige, intensive Bejagung zur Bestandsreduktion. Eine geringe Schwarzwilddichte verhindert eine rasche Verbreitung des Virus der Klassischen Schweinepest. Das zweite Ziel der jagdlichen Maßnahmen ist die verstärkte Bejagung von Frischlingen, die für das Virus der Klassischen Schweinepest am empfänglichsten sind. Das dritte Ziel ist die verstärkte Bejagung von weiblichen Tieren, um die Zuwachsträger der Wildschweinpopulation zu reduzieren. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen allerdings, dass das angestrebte Ziel nicht erreicht wird. Es wird zwar eine geringe Erhöhung der Jagdstrecke verzeichnet, aber weder ein verstärkter Frischlingsanteil noch ein erhöhter Anteil weiblicher Tiere wird in der Jagdstrecke verzeichnet. Trotz ausgearbeiteter Leitlinien für Jäger werden die jagdlichen Maßnahmen nicht ausreichend praktiziert. Orale Immunisierung Ziel der oralen Immunisierung ist die Erhöhung immuner Tiere in der Schwarzwild-population, um die Verbreitung des KSPV zu verhindern. Es wird dreimal im Jahr (Frühjahr, Sommer, Herbst) eine Doppelauslage der attenuierten Lebendvakzine vom C-Stamm im Abstand von 14 Tagen vorgenommen. Diese Impfstrategie führt zu einer serologischen Prävalenz von durchschnittlich 57 %. Obwohl dies ein zufriedenstellendes Ergebnis darstellt, gibt es bei der oralen Immunisierung auch eine Schwachstelle. Es werden überwiegend bei Überläufern und bei adulten Wildschweinen Antikörper nachgewiesen. Das bedeutet, dass die Impfstrategie in Bezug auf die Immunisierung von Frischlingen noch verbessert werden muss. Serologische und virologische ÜberwachungDie serologischen und virologischen Untersuchungen ermöglichen eine Überwachung des Impferfolges und bilden die Basis für epidemiologische Untersuchungen. Zur Zeit ist keine Markervakzine für Wildschweine auf dem Markt, die eine Differenzierung von Impfvirusantikörpern und Feldvirusantikörper ermöglicht. Nicht nur in Impfgebieten erwiesen sich die Untersuchungen als nützlich, sondern auch in den Monitoringgebieten. In den Regionen Eifel und Westerwald sind kurz vor den Nachweisen des Virus der Klassischen Schweinepest bereits Antikörper festgestellt worden. Daraus folgt, dass ein Monitoring in KSPV-freien Gebieten wichtig für die Früherkennung eines Ausbruchs ist. Dadurch können schneller Maßnahmen zur KSP-Bekämpfung eingeleitet werden. Auch die Untersuchungen in den Intensivmonitoringgebieten sind sinnvoll. Dadurch kann der Aktionsradius der Wildschweine beobachtet werden und eine Kontrolle für aufgehobene Impfgebiete ist gegeben. Zusammenfassend kann die aktuelle KSP-Bekämpfungsstrategie in Rheinland-Pfalz basierend auf den drei oben genannten Schwerpunkten als erfolgsversprechend gewertet werden. Dabei sei anzumerken, dass nur eine konsequente Einhaltung aller drei Maßnahmen zum Erfolg führen kann. Verbesserungen in der Durchführung der jagdlichen Maßnahmen, eine Optimierung der Immunisierung der Frischlinge und die Entwicklung einer Markervakzine, die eine Differenzierung von Impfvirusantikörpern und Feldvirusantikörpern ermöglicht, wäre zukünftig noch wünschenswert., In the past decades the measures to eliminate Classical Swine Fever among wild boars have been further developed. This study describes the control strategy for fighting the Classical Swine Fever Virus in Rhineland-Palatinate in the years 2005-2011 and evaluates their effectiveness. The official control measures were based on the following three main pillars:Hunting Measures The main aim in the fight against Classical Swine Fever focused on the reduction of wild boar population through intensive year-round hunting. A low and reduced wild boar population avoids a fast expansion of the Classical Swine Fever Virus. Especially hunting of young boars was recommended as they are very prone to get the Classical Swine Fever Virus. Additionally hunting female wild boars is required because they play an important role in the reproduction. However, the present results demonstrate that the expected aims have not been met. Hunting rates have only increased at a low extent. Neither an increased number of killed young boars nor the preference of female wild boars was implemented. Despite of the regulatory guidelines for hunters the mentioned hunting measures were not sufficiently exercised.Oral ImmunizationA further aim of the control strategies is the oral immunization. The distribution of Classical Swine Fever Virus should be stopped by increasing the number of immune wild boars. Three times a year (spring, summer, autumn) live vaccine (origin C) was placed twice within a fortnight. This has led to a serological prevalence of 57 % on average. Even though this is a satisfactory result, there also exists a weakness regarding the oral immunization. Mainly adult boars and renegades were screened positive for the Classical Swine Fever Virus antibodies. Consequently the immunization strategy still needs to be improved in regard to young boars.Serological and Virological MonitoringSerological and virological examinations allow a monitoring of the vaccination success. They create the basis for the epidemiological analysis. Currently there is no marker vaccine commercial available that allows a differentiation between vaccination and field antibodies. Not only in the immunization areas but also in the monitoring areas these examinations have been useful. In the region Westerwald antibodies were detected shortly before a positive Classical Swine Fever Virus test result. Hence it follows that monitoring in Classical Swine Fever Virus-free areas is important as an early warning system for Classical Swine Fever Virus outbreaks. Measures to fight the Classical Swine Fever Virus can be faster initiated. Also monitoring in the intensive monitoring areas seems reasonable in order to observe the movements of the wild boars and to keep control in previous vaccination areas. Summarized it is demonstrated that the current CSF control strategy in Rhineland-Palatinate based on the three mentioned pillars is promising. The consequent adherence and execution of all three measures is crucial for the overall success. Further improvements in the execution of the hunting measures, an improvement of the immunization of young boars as well as the development of a marker vaccine could even enhance the success in the future.

Advances in the development of plant-based oral vaccines are generally hampered by insufficient and varying antigen accumulation as well as the low immunogenicity of most subunit vaccines. The latter is on the one hand caused by the sensitivity of soluble antigens to proteolytic degradation in the gastro-intestinal tract (GIT), and on the other hand by the inability to activate mechanisms of innate immunity and reduced uptake by intestinal immune cells. The aim of this study is to increase protein accumulation in the plant model systems N. tabacum cv. Petit Havana SR1 and Nft51 as well as the transcytotic antigen uptake by intestinal M cells. This should be realized by membrane anchoring of the model antigens HVR1 and MPT64 of Hepatitis C virus and Mycobacterium tuberculosis by genetic fusion to truncated versions of the constant region of the human T-cell receptor beta-chain (TCRbeta). N-terminal fusion of the cholera toxin B subunit (CTB), a high affinity ligand of the ubiquitous mammalian cell surface receptor ganglioside GM1, should mediate a selective adhesion and antigen uptake by cells of the intestinal epithelium. The influence of TCRbeta-based membrane anchor variants, differing with respect to the length of the constant extracellular domain, on plant productivity was compared to the secreted soluble antigen. These include three versions, one with the extracellular domain of the TCRbeta removed completely (TCR), and a second version comprising the complete hinge region (TCRCys). A final version without the N-terminal cysteine residue (TCRhinge), which is involved in the formation of an intermolecular disulfide bridge between the alpha- and beta-chain of the authentic TCR complex, should allow the evaluation of the influence of a potential homo-dimerization of two truncated beta-chains on antigen yield. Heterologous targeting to the plant cell membrane led to a positive effect in both a transient and a transgenic approach. Quantification by GM1-ELISA demonstrated a 185.4- or 25-fold increase in accumulation respectively after fusion of CTB-HVR1 to TCRCys, and a correct assembly of the CTB domains into the functional pentameric GM1-binding form. In comparison to CTB-HVR1 a less stabilizing effect was observed for CTB-MPT64, with a 1.6- or 19.7-fold increase in accumulation. After direct comparison of the variants TCRhinge and TCRCys, it could be concluded that the stabilizing effect was significantly enhanced by the homo-dimerization of two truncated TCRbeta-chains. The functionality of TCRCys in tobacco was confirmed by laser scanning confocal microscopy, comparative analyses of the cellular release of soluble and TCRCys-membrane-anchored antigens into the culture supernatants of transgenic BY- 2 suspension cells, and membrane isolation, making use of the C-terminal reporter protein GFP. The generated data gave some indication of a relatively unstable membrane anchoring, potentially due to the positively charged lysine residue in the transmembrane domain, which is neutralized by the opposite charged amino acid residues of the invariant CD3 chains in the native TCR complex. In spite of sufficient length of the transmembrane domain of TCRbeta for anchoring the antigens in the cell membrane, results from confocal microscopy couldnt clearly discriminate between a temporary or final localization in membranes of the ER and the Golgi apparatus. Transgenic leaf material of the CTB-HVR1-TCRCys-producing line N. tabacum cv. Petit Havana SR1, possessing the best relationship between nicotine content and antigen concentration, was applied orally to mice in the form of feed pellets containing leaf material processed to different degrees. Independent of the preparation variant and the intranasal co-administration of the mucosal adjuvants BPPCysPEG (modified MALP-2) or PQS-PEG specific antibody responses against CTB and HVR1 could neither be detected on local (sIgA), nor on systemic level (IgG). The following reasons for the absence of specific immune responses are discussed: Inefficient uptake of CTB-HVR1-TCRCys across the intestinal epithelium, inability of monomeric CTB fusions to assemble into functional pentamers in the microenvironment of plant membranes, insufficient antigen dose, proteolytic degradation in the GIT, inaccessibility of relevant epitopes, induction of oral tolerance, suppression of immune function by nicotine, and the ineffectiveness of the mucosal adjuvants, because of an application in distinct mucosal tissues. In this study it was demonstrated that a heterologous targeting of model antigens to the plant cell membrane by fusion to the membrane anchor variant TCRCys is capable of increasing antigen yields in tobacco to levels, which are in principle adequate for an oral administration of unprocessed plant material. The development of an effective plant-based oral vaccine however, requires not only the selection of a suitable production system but also the optimization of the vaccination strategies.

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Auswertung eines wissenschaftlichen Feldversuches zur oralen Immunisierung (o.I.) von Wildschweinen gegen Klassische Schweinepest (KSP) in Mecklenburg-Vorpommern. Das Immunisierungsgebiet wurde hierbei als Impfgürtel um das gefährdete Gebiet angelegt, wobei in bestimmten Bereichen in das infizierte Gebiet hinein immunisiert wurde. Teile der drei Landkreise Güstrow, Müritz und Ostvorpommern (OVP) mit jeweils verschiedenem Ausgangsstatus bezüglich der Verseuchung mit KSPV wurden hierbei näher untersucht. Gegenstand der Betrachtungen sind die ersten vier Immunisierungen, welche jeweils im Abstand von etwa einem halben Jahr erfolgten. Es wurden der Antikörperstatus von im Immunisierungsgebiet gestreckten Wildschweinen bestimmt sowie spezielle Organe auf das Vorhandensein von KSPV eingehend untersucht. Weiterhin wurde in ausgewählten Knochen des gestreckten Schwarzwildes der Nachweis von Oxytetracyclin (OTC) geführt, welches dem Köder als Markersubstanz beigegeben war. Nach einem vielversprechenden Beginn der o.I. mit Antikörperprävalenzen von 35,5% in der 1. Immunisierungsperiode (IP) bzw. 42,1% in der 2. IP kam es zu einem Rückgang der Antikörperbefunde auf zunächst 37,5% in der 3. IP und schließlich 27,1% in der 4. IP, dessen Ursachen diskutiert werden. Bei den Alttieren war der Anteil serologisch positiver Wildschweine ab der 2. IP relativ stabil. Er lag insgesamt zwischen 50 und 70%, wobei sich die in der 2. IP noch weit auseinander liegenden Werte von 33,3% adulter Antikörperträger im Landkreis (LK) Müritz und 88,9% derselben im LK Güstrow bis zur 4. IP hin allmählich anglichen. Nach den ersten vier IP waren von den Alttieren des LK Güstrow 72,7%, des LK Müritz 60% und des LK OVP 57,1% serologisch positiv. Bei den Überläufern wurden in der 2. und 3. IP Antikörperprävalenzen von ca. 50% gefunden, während sie in der 4. IP nur noch knapp 30% betrugen. Dieser Rückgang ist durch die schlechten Ergebnisse der o.I. im LK OVP mit nur ca. 18% serologisch positiven Überläufern verschuldet. Die größten Schwankungen sind bei den Frischlingen zu verzeichnen, die in der 1. und 3. IP Antikörperprävalenzen von ca. 40% aufwiesen (Ausnahme 3. IP in OVP mit nur 12%). Dagegen beeinträchtigen bei denen zum Zeitpunkt der Impfköderauslagen im Frühjahr noch neugeborenen Frischlingen eine Reihe von Faktoren die aktive Immunisierung, so daß in der 2. und 4. IP nur 3 bis 4% serologisch positiv waren. Trotz der rückläufigen Tendenz bei den Antikörperergebnissen gegen Ende der ersten vier Immunisierungsperioden konnte aber das Ziel, die Ausbreitung der KSP über den Immunisierungsgürtel hinaus zu verhindern, erreicht werden. Virusfunde traten während der o.I. in allen drei Landkreisen auf, doch nach der 4. Immunisierung waren die Landkreise Müritz und OVP virusfrei. Die Virusinzidenzen lagen über alle vier IP für den LK Güstrow bei 4,2%, für den LK Müritz bei 2,8% und für den LK OVP bei 1,3%. Insgesamt 64% der virologisch positiven Wildschweine waren Frischlinge. Die Anwendung des Markers OTC konnte in diesem Feldversuch nicht überzeugen und liefert nur einen gewissen Anhaltspunkt über Aussagen zur Herkunft der gefundenen Antikörper. Die o.I. wird als ein geeignetes Verfahren zur Erhöhung des Immunstatus im Bestand und zur Minderung des Infektionsdruckes im Rahmen der Bekämpfung der KSP beim Schwarzwild eingeschätzt. Sie ist allerdings mit hohem logistischen Aufwand verbunden und einer Reihe von Einflußfaktoren unterworfen, welche nicht immer ausgeschaltet werden können. Wesentlich ist, daß die o.I. nur zusammen mit einer verstärkten Bejagung der Wildschweine, vor allem der Frischlinge, effektiv ist. Vor allem in Gebieten mit sehr hoher Schwarzwilddichte ist ansonsten keine Verminderung des Infektionsdruckes und schnelle Beendigung des Seuchengeschehens zu erwarten. Als Ergänzung zum Feldversuch der o.I. wurden drei tierexperimentelle Untersuchungen durchgeführt, welche der Beantwortung von aufgetretenen Fragen zur Wirksamkeit der Immunisierung dienen sollten. Diese wurden an Hausschweinen durchgeführt. Ein Versuch beschäftigte sich mit der frühestmöglichen Feststellung des Auftretens von Antikörpern im Blut immunisierter Hausschweine bei gleichzeitiger Überprüfung der Impfvirusausscheidung. Ein Nachweis von KSPV- spezifischen Antikörpern ist danach frühestens in der 2. Woche nach o.I. zu erwarten, wobei alle Tiere erst gegen Ende der 3. Woche eindeutig positiv waren. Impfvirus wurde nur bei einem Tier am 7. d p.v. gefunden. In einem weiteren Versuch wurde die o.I. gleichzeitig mit einer intranasalen Infektion mit hochvirulentem KSPV in geringer Dosis durchgeführt. Während es bei einigen Hausschweinen zu einem milderen Verlauf der Schweinepest gegenüber der Kontrollgruppe kam, reagierten andere bei gleichzeitiger o.I. und Infektion wesentlich heftiger, erkrankten und verendeten früher als die Schweine der Kontrollgruppe. Im dritten Versuch kam ein schwachvirulentes Schweinepestvirusisolat aus unserem Immunisierungsgebiet zum Einsatz, welches ebenfalls zeitgleich mit dem oralen Impfstoff appliziert wurde. Bei den vakziniert-infizierten Hausschweinen der Versuchsgruppe traten lediglich kurzzeitig sehr milde, unspezifische klinische Symptome auf, während bei denen der Infektionskontrollgruppe neben abgemilderten respiratorischen und gastrointestinalen Symptomen bei zwei Tieren auch ein tödlicher Krankheitsverlauf mit bakteriellen Komplikationen zu verzeichnen war. Diese Laboruntersuchungen lieferten wertvolle Hinweise über bestimmte Abläufe, die bei oraler Immunisierung in einem infizierten Gebiet auftreten können bzw. zur erfolgreichen Seuchenbekämpfung beachtet werden müssen. Eine weitreichende Virusdiagnostik ist im Zusammenhang mit Immunisierungsmaßnahmen unbedingt erforderlich., The current thesis deals with field studies on oral immunization of wild boar against classical swine fever (CSF) in Mecklenburg-Western Pomerania. The immunization zone was arranged as a cordon sanitaire around the defined infected area. In some regions immunization was done within infected areas as well. Parts of the three districts Güstrow, Müritz and Ostvorpommern with different status in the antigene incidence and antibody prevalence of the wild boar population were included in the studies. The evaluation of four immunization periods is the subject of this thesis. Immunizations were carried out every six months. Wild boar shot in the immunization cordon were investigated on their antibody response and some special organs were surveyed for virus of CSF thoroughly. Additionally different bones were examined for oxytetracycline (OTC), a marker contained in the bait matrix. After a very promising start with antibody prevalences of 35.5% in the first and 42.1% in the second immunization period (i.p.) we had to report a drop in antibody responses to 37.5% in the third and finally 27.1% in the fourth i.p.. The reasons of this development are discussed. From the second to the fourth i.p. the proportion of serological positive animals among adults was about 50 to 70%. Young wild boars showed antibody prevalences of about 50% in the second and third, but only about 30% in the fourth i.p. This drop is due to the bad results of only 18% serological positive young wild boars in Ostvorpommern. The fluctuations between the immunization periods were most conspicuous among the piglets. In the first and third i.p. the antibody prevalences were about 40%, but in the third i.p. only 12% in Ostvorpommern. At the time of the second and fourth i.p. in early spring some factors reduce the value of an active immunization in newborn piglets, for which reason only 3 to 4% of the piglets were serologically positive. Nevertheless we reached the main aim of the immunization, which was to prevent the spread of CSF beyond the cordon. In every district we found virus of CSF during the immunization periodes. The districts Müritz and Ostvorpommern were free of virus after the fourth immunization. The virus incidences were 4.2% in Güstrow, 2.8% in Müritz and 1.3% in Ostvorpommern. The main proportion of the virologically positive animals were represented by the piglets with 64%. We are not convinced of the usefulness of the OTC marker in these studies. It gives only little indication on the origin of antibodies. We regard oral immunization as a suitable method to improve the herd immunity and reduce risk of infection with CSF in wild boar. It needs a high logistic expenditure and is influenced by several factors. It is not possible to eliminate all of them. Both oral immunization and increased hunting of wild boar result in a reduced incidence of CSF. The intention is to eliminate the CSF epizootic faster this way. In addition to the field studies of oral immunization we carried out three animal experiments with domestic pigs to answer some of our questions on effectiveness of immunization. One experiment was about the first appearance of antibodies after oral immunization of domestic pigs against CSF and to detect the transmission or persistence of vaccine virus. A slight detection of antibodies was possible not before the second week, but clearly positive results were visible as late as 3 weeks after o.i. Vaccine virus could be found on day 7 p.v. in one piglet. In another one oral immunizaton and infection with a low dose of high virulent CSFV were carried out simultaneously. In vaccinated - infected domestic piglets we found both milder and more serious course of the disease with a faster deadly outcome then in piglets of the infection group. In the last experiment we used a low virulent CSFV isolate from the immunization area for simultaneous application with oral vaccine. In vaccinated - infected piglets clinical symptoms were very mild and short lasting, whereas two piglets of the infection group suffered from mild respiratory and gastrointestinal symptoms and one piglet died of CSF with bacterial complications. These investigations gave important clues on influences on oral immunization in a CSFV-infected population and on successful disease control. Thorough virus diagnostics is absolutely necessary in immunization areas.