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In dieser Arbeit wurde eine neue hochauflösende optische Nahfeld-Sonde für die optische Rasternahfeldmikroskopie (SNOM) an fluoreszierenden Proben entwickelt. Fluoresierende Proben werden normalerweise mit Apertursonden im Beleuchtungsmodus abgebildet. Damit läßt sich typischerweise eine optische Auflösung von 50-100 nm erreichen. Apertursonden sind flach und haben deshalb oft eine sehr schlechte topographische Auflösung. Eine höhere optische Auflösung kann durch Ausnutzung der Feldkonzentration an einer Metallspitze erreicht werden - und dies bei gleichzeitiger hoher Topographieauflösung. Die Streusonde, eine Metallspitze, die mit einem durch Linsen fokussierten Laserstrahl beleuchtet wird, ist jedoch für die Detektion der Fluoreszenz einzelner Moleküle schlecht geeignet: Der beugungsbegrenzte Laserfokus verursacht eine starke Hintergrundsbeleuchtung, die zu starkem Photobleichen und einem schlechten Signal-zu-Rauschverhältnis führt. Daher wurde bei der hier entwickelten Sonde eine kurze Metallspitze am Rand einer Apertur über die Nahfelder der Apertur beleuchtet. Es konnte gezeigt werden, daß diese Nahfeld-Sonde die speziellen Vorteile der beiden bisher gängigen Sondentypen, nämlich die hohe optische und topographische Auflösung der Streusonde mit dem hohen Signal-zu-Rausch-Verhältnis der Apertursonde miteinander vereint. Es ist daher möglich, das Fluoreszenzlicht einzelner Farbstoffmoleküle mit hoher Ortsauflösung zu messen. Als Testobjekt wurden DNA-Stränge abgebildet, an deren Enden einzelne Cy-3 Moleküle gebunden sind. Abgebildete Cy-3 Moleküle zeigen orientierungsabhängige Fluoreszenzmuster mit Details, deren Halbwertsbreite nur 10 nm beträgt. Die Form der Fluoreszenzmuster kann durch ein einfaches Modell erklärt werden, das seinerseits auf Modellen für die Feldverteilung unter einer Spitze und für die Fluoreszenzunterdrückung an einer Metalloberfläche („quenching“) beruht. Mit diesem Modell kann durch Anpassen der Parameter die Position und Orientierung einzelner detektierter Farbstoffmoleküle bestimmt werden. Dabei kann die laterale Position der Farbstoffmoleküle im optischen Bild mit einer Genauigkeit von weniger als 1nm ermittelt werden. Der laterale Versatz des topographischen Bildes zum optischen Bild ist kleiner als die Auflösungen der Bilder. Dementsprechend ist mit dieser Sonde das zeitgleiche Messen eines topographischen und optischen Signals an einem Punkt möglich. Diese hervorragenden Eigenschaften der neuen Sonde versprechen ganz neue Möglichkeiten für Einzelmolekülexperimente, insbesondere in der molekularen Strukturbiologie. In this thesis a novel highly resolving optical near-field probe for scanning near-field optical microscopy (SNOM) of fluorescent samples was designed. Normally, fluorescent samples are imaged by aperture probes in illumination mode. Typically, an optical resolution of 50-100 nm can be achieved. As aperture probes are flat they often provide only a very poor topographical resolution. A higher optical resolution can be attained by taking advantage of the field concentration at a metal tip – and this with simultaneous high topographical resolution. The scattering probe - a metal tip, which is illuminated by a laser beam focused by lenses – is only poorly suited for the detection of single molecules: the diffraction limited laser focus causes in a strong background illumination resulting in strong photo bleaching and in a low signal to noise ratio. Therefore, for the optical near-field probe designed here, a small metal tip is positioned on the rim of an aperture and illuminated by the near fields of this aperture. It could be shown, that this near-field probe combines the special advantages of the common probe types, namely the high optical and topographical resolution of a scattering probe with the high signal to noise ratio of an aperture probe. This allows to detect light of single fluorescent molecules with high spatial resolution. As test sample, DNA strands have been imaged, to the ends of which single Cy-3 molecules are bound. Imaged Cy-3 molecules show patterns in the measured lateral fluorescence distribution, which depend on the orientation of the dipole moment of the dye molecule and which have peaks with a full width at half maximum of only 10 nm. The shape of these patterns can be explained by a simple model basing in turn on models of the field distribution below a tip and of the fluorescence quenching at a metal surface. Fitting this model to measured fluorescence patterns provides the position of the imaged dye molecules and the orientation of their excitation dipole moment. In doing so, the lateral position of a dye molecule in the optical image can be determined to an accuracy better than 1 nm. The lateral shift between the topographical and optical images is smaller than the resolution in these images. Accordingly, it is possible to measure simultaneously a topographical and optical signal at the same point with this probe. These excellent properties of the novel probe promise new possibilities for single molecule experiments, especially in molecular structural biology.

Duisburg, Essen, Univ., Diss., 2003 Mit einem optischen Nahfeldmikroskop (Scanning Near-Field Optical Microscopy / SNOM) können die optischen Eigenschaften einer Oberfläche genauer aufgelöst werden als mit jedem klassischen Mikroskop. Kernpunkt eines optischen Nahfeldmikroskops ist eine sehr kleine Lichtquelle – klein im Vergleich zur Wellenlänge des verwendeten Lichtes –, die in einem Abstand von wenigen nm über die Oberfläche gerastert wird. Ausschlaggebend für das gute Auflösungsvermögen eines optischen Nahfeldmikroskops ist ein evaneszenter und ein propagierender Anteil der elektromagnetischen Welle im Bereich der Oberfläche, weshalb ein optisches Nahfeldmikroskop nicht dem beugungsbeschränkten Auflösungsvermögen eines klassischen Mikroskops von ca. unterliegt. Mit einem Scherkraftmikroskop kann die Voraussetzung eines optischen Nahfeldmikroskops – ein sehr kleiner Abstand zwischen Lichtquelle und Probenoberfläche – verifiziert werden. Dabei ist die Lichtquelle ein Teil eines Systems, das eine resonante Schwingung parallel zur Probenoberfläche ausführt. Jede Scherkraft, die – bei kleinem Abstand – von der Oberfläche auf das System ausgeübt wird, verändert das Schwingungsverhalten, das gemessen werden kann. Auf diese Weise kann gleichzeitig mit den optischen Eigenschaften der Probe ebenfalls die Topographie der Probe gemessen werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden eine Apertur-SNOM und zusätzlich ein Scherkraftmikroskop konzipiert und aufgebaut. Das Scherkraftmikroskop basiert auf einer Stimmgabel als resonant schwingende Einheit, an der die Lichtquelle des optischen Nahfeldmikroskops befestigt ist. Die Lichtquelle wird aus einer Glasfaser gebildet, indem ein Ende der Glasfaser mit der Methode des „Tube-Etching“ zunächst zu einer Spitze geätzt und anschließend – bis auf das äußere Ende – in einem Aufdampfprozess mit einer lichtundurchlässigen Aluminiumschicht bedeckt wird. Auf diese Weise war es möglich einen Apertur-Durchmesser von ca. 150nm zu erreichen. Dieses Ausmaß bestätigen Messungen mit dem optischen Nahfeldmikroskop, bei denen zwei unterschiedliche Testproben untersucht wurden. Mit einer sogenannten Fischer-Probe als Testprobe konnte das Auflösungsvermögen, das eng mit dem Apertur-Durchmesser korreliert ist, auf ca. 150nm abgeschätzt werden. Eine weitere Probe, die erstmals als Testprobe eingesetzt wurde, besteht aus einer auf ein transparentes Substrat aufgebrachte Aluminium-Stufenkannte, zur Verwirklichung eines hohen Transmissionskontrastes an dem Ort der Kante. Dadurch war es möglich, die Apertur der verwendeten SNOM-Spitze auf unter 225nm abzuschätzen. Innerhalb von Fluoreszenzmessungen wurde der Farbstoff Pyridine 2 untersucht. Dabei ermöglichte das mit dem optischen Nahfeldmikroskop gemessene Fluoreszenzverhalten eine Zuordnung der gleichzeitig gemessenen Topographie. Dadurch konnte gezeigt werden, dass die in der Topographie erhöhten Strukturen aus Pyridine-2-Molekülen aufgebaut sind und dass insbesondere zwei unterschiedliche Strukturarten je nach Präparationstechnik möglich sind. Verdunstet gelöstes Pyridine 2 auf einem Glassubstrat, so entstehen ca. 0.5µm ? 2µm ausgedehnte und ca. 350nm hohe Strukturen, die wahrscheinlich kristallines Pyridine 2 sind. Dagegen werden beim Spin-Coating als Präparationstechnik zusammenhängende, untereinander ähnliche Strukturen gebildet, die mit einer Höhe von ca. 5nm jedoch wesentlich flacher als die kristallinen Strukturen sind und aufgrund ihrer Höhe nur aus wenigen Lagen Pyridine 2 zusammengesetzt sein können. Der Hintergrund der wirkenden Kraft ist beim Scherkraftmechanismus nicht vollständig geklärt. Um der Ursache der wirkenden Kräfte einen Schritt näher zu kommen, wurde in dieser Arbeit ein neuartiges Experiment aus zwei gekoppelten Scherkraftmirkoskopen vorgestellt und erprobt. Dieses Experiment zeigt verschiedene Zusammenhänge, die einerseits auf einen Wasserfilm auf der Probenoberfläche hindeuten. Dies wird aus der Art der gemessenen Kräfte ersichtlich, die in Form von Reibungskräften mit der Annäherung der SNOM-Spitze auf die Oberfläche einsetzen. Gestützt wird diese Annahme durch die Tatsache, dass diese Reibungskräfte mit dem Entfernen der Spitze von der Oberfläche nicht langsam, sondern – wie die Messungen zeigen – ab einer bestimmten Entfernung sehr schnell auf Null abnehmen. Dieses Verhalten kennzeichnet das Abreißen einer Wasserbrücke zwischen Spitze und Probenoberfläche und belegt dadurch die Existenz eines Wasserfilms, der einen wesentlichen Einfluss auf die wirkenden Scherkräfte besitzt. Neben den Reibungskräften konnten andererseits elastische Kräfte nachgewiesen werden, wenn die Spitze durch den Wasserfilm hindurch mechanischen Kontakt mit der Probenoberfläche eingeht. Die gemessenen elastischen Kräfte können nicht auf dem in der Literatur diskutierten Klopfmechanismus beruhen, da die Stärke dieser Kräfte mit dem Abstand zwischen Spitze und Oberfläche nur sehr schwach variiert. Anstelle des Klopfmechanismus wird deshalb von einem kontinuierlichen Kontakt der Spitze mit der Oberfläche ausgegangen, mit dem eine elastische Verformung der Spitze einhergeht.