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Im Rahmen dieser Dissertation wurden Exomanalysen bei fünf Kindern und Jugendlichen mit bis dahin ungeklärten Entwicklungsstörungen durchgeführt. Die Exome der Patient*innen wurden mittels NGS Technologie sequenziert und mit Hilfe bioinformatischer Analyseprogramme ausgewertet. Ergänzend wurde die Zuhilfenahme einer internen Referenzgruppe erprobt. Bei einem Patienten mit globaler Entwicklungsstörung, aber nur sehr diskreter Ausbildung von Hirnfehlbildungen, konnte eine mit großer Wahrscheinlichkeit ursächliche, neu aufgetretene pathogene Variante im \(\it TUBB3\)-Gen (c.689C>T, p. (Ser230Leu)) festgestellt werden. In Relation zu anderen Betroffenen mit einer Mutation im \(\it TUBB3\)-Gen liegt bei dem hier identifizierten Patienten ein eher milder Verlauf vor, was ein sehr weites phänotypisches Spektrum für \(\it TUBB3\)-Mutationen unterstreicht. Mittlerweile ist die Exomanalyse Bestandteil der Routinediagnostik geworden, wobei die Nutzung einer in die Software implementierten Referenzgruppe sinnvoll ist.

Nach Auswertung von 1082 Patientenfällen hatdie Internationale Arbeitsgemeinschaft für die HFE-Gen-H63D-Forschung (International HFE Gene H63D Mutation Research Consortium) nun eine weitere klinische Variante des klassischen H63D-Syndroms (im Folgenden als H63D Syndrom Typ-1 bezeichnet) definiert: Das H63D-Syndrom Typ-2.Seine Merkmale und sein klinisches Bild werden in diesem ersten vorläufigen Papier über das H63D-Syndrom Typ-2 vorgestellt.

Das Parkin-koregulierte Gen PACRG teilt sich einen bidirektionalen Promotor mit dem PRKN-Gen, welches für die E3 Ubiquitin-Ligase Parkin kodiert. Mutationen im Parkin-Gen sind assoziiert mit einer autosomal-rezessiven Form der neurodegenerativen Erkrankung Morbus Parkinson. Die Daten aus dieser Arbeit zeigen, dass PACRG, wie bereits für Parkin gezeigt, dazu in der Lage ist, die Aktivität des TNF\(\alpha\)-induzierten NF-\(\kappa\)B-Signalwegs durch Interaktion mit LUBAC zu erhöhen. Dieser Einfluss ist auf eine Interaktion von PACRG mit LUBAC zurückzuführen, welche dazu führt, dass die Autoinhibition von HOIP aufgehoben wird und mehr M1-Ubiquitin-Ketten gebildet werden. Die Daten deuten auf eine mögliche Rolle des NF-\(\kappa\)B-Signalwegs in der Entstehung von Morbus Parkinson hin und helfen, die bei dieser Krankheit auftretenden Entzündungsprozesse besser zu interpretieren.

Fragestellung: Für Weichgewebssarkome (STS), eine heterogene Gruppe seltener maligner Tumoren, fehlen effektive klinische Prognosemodelle und molekulargenetische Angriffspunkte für neue zielgerichtete Medikamente. Methodik: Von 256 STS-Patienten aus der The Cancer Genome Atlas (TCGA)-Datenbank [zum vollständigen Text gelangen Sie über die oben angegebene URL]

Die Laktathomöostase hat einen hohen Stellenwert im Spitzen- und Breitensport, unter anderem aufgrund der weit verbreiteten Laktat-Leistungsdiagnostik. Die Regulation der Laktathomöostase, sowie die durch Training verursachten Veränderungen, sind jedoch auf molekularer Ebene bisher nur unzureichend untersucht. Das maßgeblich am Laktatstoffwechsel beteiligte Enzym ist die Laktatdehydrogenase (LDH). Die verschiedenen Isoformen des tetrameren LDH-Komplexes unterscheiden sich in ihrer Zusammensetzung der verfügbaren Untereinheiten. Untereinheit M (muscle subunit) katalysiert die Reduktion von Pyruvat zu Laktat, Untereinheit H (heart subunit) die Oxidation von Laktat zu Pyruvat. Entsprechend ihrer Zusammensetzung katalysiert die LDH somit vorzugsweise den Aufbau bzw. Abbau von Laktat. Auf mRNA-Ebene (messenger ribonucleid acid) wird die M-Untereinheit durch das LDH-A Gen kodiert, die H-Untereinheit durch das LDH-B Gen. In Studien an Mäusen, bei denen durch muskelspezifische Überexpression von PGC-1α (Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha) ein ausdauertrainierter Phänotyp imitiert wurde, konnte gezeigt werden, dass sich die LDH-A (Laktatdehydrogenase-A) Expression gegenüber Wildtypmäusen verringerte und die LDH-B (Laktatdehydrogenase-B) Expression steigerte und so die Laktathomöostase beeinflusst wird. Ergänzend hierzu konnten wir auf die Ergebnisse der Querschnittsstudie, Studienteil I der BAM-Studie (Belastungs- und Anpassungsmanagement im Spitzensport), zugreifen, die eine höhere Expression von LDH-A bei untrainierten Probanden sowie im Vergleich einen höhere LDH-B bei ausdauertrainierten jungen männlichen Probanden fand. Diese Ergebnisse dienten als Grundlage zur Generierung der bearbeiteten Hypothese: Auch beim Menschen steigt durch regelmäßiges Ausdauertraining die PGC-1α Expression, was zu einer Reduktion von LDH-A und Steigerung der LDH-B Expression in der Skelettmuskulatur führt und somit zu einer Abnahme der LDH-A/LDH-B-Ratio. Diese Veränderung ist durch Krafttraining nicht auslösbar, sodass eine verringerte LDH-A/LDH-B-Ratio ein Trainingsmarker für ausdauertrainierte Muskulatur ist. Mittels unserer Cross-over-Trainingsstudie, Studienteil II der BAM-Studie, wurde der Einfluss von Ausdauer- bzw. Krafttraining, sowie einer akuten Belastung im Kraftraum und auf dem Fahrradergometer auf die PGC-1α, LDH-A und LDH-B Expression im Muskelgewebe untersucht. Die Probanden absolvierten ein 8-wöchiges Ausdauer- oder Krafttraining, gefolgt von einer 3-monatigen Pause und einer zweiten Trainingsphase in der bisher noch nicht trainierten Trainingsmodalität. Vor Trainingsbeginn, nach erfolgter Akutbelastung, nach 3 Wochen Training und am Ende des Trainingsprogrammes wurden Muskelbiopsien entnommen. In diesen Muskelproben wurde mittels qPCR (quantitative real-time Polymerasekettenreaktion) die Menge an PGC-1α, LDH-A und LDH-B bestimmt. Durch die Akutbelastung kam es zu einer Expressionssteigerung von PGC-1α. Die PGC-1α Ruheexpression wurde, im Gegensatz zum Krafttraining, durch Ausdauertraining signifikant gesteigert und nahm im weiteren Trainingsverlauf weiter zu. Die LDH-A Expression wurde durch sämtliche Trainingsreize bei den untrainierten Probanden zunächst gesteigert. LDH-B war nicht durch eine akute Belastung beeinflussbar. Im Trainingsverlauf erhöhte sich die LDH-B Expression durch Ausdauer- wie auch Krafttraining signifikant, ausgeprägter jedoch durch Ausdauertraining. Die von uns vor Studienbeginn als Zielparameter definierte LDH-A/LDH-B-Ratio war spezifisch für die durch Ausdauertraining ausgelösten Veränderungen der LDH Gene im Skelettmuskel. Es kam zu einer hochsignifikanten Reduktion der Ratio während der Ausdauertrainingsphase. Durch Krafttraining oder eine akute Belastung wurde die Ratio nicht beeinflusst. Mittels Western Blot konnten wir auch auf Proteinebene eine Zunahme des LDH-B Proteins nach Absolvierung des ersten Trainingsblockes nachweisen. Die Proteinratio von LDH-A zu LDH-B reduzierte sich durch das Ausdauertraining bei der Mehrzahl der Probanden und war am Ende des Ausdauerblockes meist geringer als zum Ende des Krafttrainingsblockes. Zusammenfassend konnte durch unsere Untersuchungen gezeigt werden, dass eine akute körperliche Belastung Einfluss auf die Genexpression von PGC-1α und LDH-A, nicht jedoch auf LDH-B hat. Im Bereich der Ruheexpression führte lediglich Ausdauertraining zu einer Expressionssteigerung von PGC-1α. LDH-A steigerte sich durch beide Trainingsmodalitäten zunächst, LDH-B wurde durch Ausdauertraining ausgeprägter gesteigert als mittels Krafttraining. Am spezifischsten für die durch Ausdauertraining ausgelösten Veränderungen im Skelettmuskel war die Ratio der Expression von LDH-A zu LDH-B. Diese nahm im Trainingsverlauf ab, durch eine akute Belastung wurde sie nicht beeinflusst. Dieser Zusammenhang zwischen Zunahme der Ausdauerleistungsfähigkeit und Abnahme der LDH-A/LDH-B-Ratio bildet die Grundvoraussetzung um die Ratio als Marker für die Trainingssteuerung nutzen zu können. Zur Klärung des genaueren Zusammenhanges und Evaluation, ob es ab einem bestimmten Leistungsniveau zu einer Plateaubildung kommt, sind weitere Untersuchungen notwendig. Einen anderen interessanten Ansatz zur Nutzung der oben beschriebenen Erkenntnisse bilden neue Forschungsergebnisse, die eine Relevanz der LDH im Tumorstoffwechsel beschreiben und zukünftig die Bedeutung der Laktathomöostase in der Medizin auch außerhalb der Sportmedizin und Trainingssteuerung erhöhen werden.

In the quaternion formulation, the problem of optimal reorientation of the orbital plane of a spacecraft (SC) is considered. The control (acceleration from the vector of the jet thrust orthogonal to the plane of the orbit) is limited in magnitude. It is necessary to minimize energy costs for the reorientation of the plane of the spacecraft orbit. An actual special case of a problem when the spacecraft orbit is circular, and control assumes constant values in certain sections of the active motion of the spacecraft is considered. An original genetic algorithm for finding the trajectories of optimal spacecraft flights is constructed. No information about the unknown initial values of the conjugate variables is required when we apply this method. Examples of the numerical solution of the problem are given for the case when the difference between the initial and final orientations of the spacecraft orbit equals to a few degrees in angular measure. In this case, the final orientation of the plane of the spacecraft orbit corresponds to the orientation of the orbital plane of the satellites of the Russian GLONASS orbital grouping.

Die Hereditären Motorisch Sensiblen Neuropathien bilden eine genetisch und klinisch heterogene Gruppe von Erkrankungen. Insgesamt sind über 60 Gene für HMSN beschrieben. Im Rahmen der Arbeit sollte untersucht werden, ob und wie häufig Mutationen in den Genen \(\it NEFL\), \(\it GARS\), \(\it RAB7\) und \(\it BICD2\), ursächlich für eine HMSN sind. Bei 189 HMSN Patienten wurde eine Mutationsanalyse der Gene mittels Schmelzkurvenanalyse durchgeführt. Proben mit auffälligen Schmelzkurven wurden im Folgenden sequenziert und die gefundenen Sequenzvariationen mit Hilfe von Prädiktionsprogrammen evaluiert. Die Mutationsanalyse der Gene ergab keine neuen sicher oder möglicherweise pathogenen Sequenzvarianten. Insgesamt scheinen Mutationen in den Genen \(\it NEFL\), \(\it GARS\), \(\it RAB7\) daher tatsächlich nur sehr selten ursächlich für eine HMSN zu sein, was sich weitgehend mit aktuellen Literaturangaben deckt.

Das Familienstellen, das Stellen von Familienkonstellationen, das auch als System- Aufstellung bezeichnet wird, stellt ein therapeutisches Verfahren dar, das seit den 1970er Jahren immer mehr Zuspruch und Anwendung in der Psychiatrie findet und inzwischen auch in Unternehmen eingesetzt wird, um Entscheidungen in komplexen Situationen und in sich permanent wandelnden Kontexten zu treffen oder den Sand im Getriebe ausfindig zu machen, der die Betriebsabläufe stört. Der vielfach angemerkte Erfolg des Familienstellens bringt die Herausforderung von wissenschaftlichen Erklärungen mit sich, wobei in diesem Beitrag Vorschläge gemacht werden, die sich vor allem in der Quantenphysik umschauen und bei der Epigenetik bedienen. Es gehört zu den spannenden Fragen der Gegenwart, wie man „Von der Quantenphysik zum Bewusstsein“ und damit zu den Einflüssen der Familienkonstellation auf den Einzelnen in der Gruppe kommt. Eine wichtige Rolle spielt dabei das Konzept der Energie, deren Eigenschaft, unzerstörbar zu sein, mehr Aufmerksamkeit im humanen Bereich verdient, als ihr bisher zugestanden wird.

Es wurde untersucht in welcher Häufigkeit kausal pathogene Mutationen in den 17 Exons des FMR1-Gens, bei einem Kollektiv aus 508 mental retardierten Jungen vorkommen. Methode: Die Schmelzkurvenanalyse (High-Resolution-Melting, HRM) wurde erstmals zur Mutationsanalyse des FMR1-Gens genutzt. Auffällige Proben wurden durch direkte DNA-Sequenzierung evaluiert. Ergebnis: Es konnten neben zwölf bekannten Polymorphismen fünf neue Sequenzvarianten ermittelt werden. Die Mutation c.1444G>A in Exon 14 mit der Aminosäureaustausch Gly482Ser wird durch in silico-Analysen als potentiell pathogen eingestuft. Die Fehlsinn-Mutation c.1601G>A führt in Exon 15 zum Austausch Arg534His in der RGG-Box Proteindomäne des Genprodukts. Diskussion: Die Arbeit bestätigt, dass in größeren Patientengruppen mittels HRM neue Mutationen des FMR1-Gens gefunden werden. Im Patientenkollektiv konnten mit einer Häufigkeit von 0,59 % möglicherweise kausal pathogenen Punktmutationen im FMR1-Gen identifiziert werden.

Im Laufe des Lebens erkrankt in Deutschland etwa jede achte bis zehnte Frau an einem Mammakarzinom. Etwa 10 % dieser Erkrankungsfälle stellen dabei hereditäre Mammakarzinome dar. Mit BRCA1- und dem Fanconi Anämie-Gen BRCA2 (FANCD1) sind zwei Gene bekannt, deren Keimbahnmutation einen Großteil der bekannten hereditären Mammakarzinome ausmacht. Trotzdem sind ca. die Hälfte der genetischen Ursachen des familiären Mammakarzinoms nicht bekannt. Neben Genmutationen können auch epigenetische Veränderungen, z.B. die Methylierung der DNA die Expression von Genen beeinflussen. In der vorliegenden Arbeit wurde mit Hilfe der Bisulfit-Pyrosequenzierung das DNA-Methylierungsmuster regulatorischer Regionen von BRCA- und den Fanconi Anämie-Genen untersucht, um zu klären, ob es einen Zusammenhang zwischen epigenetischen Veränderungen dieser Gene und dem familiären Mammakarzinom gibt. Das Untersuchungskollektiv bestand aus 26 familiären Mammakarzinomproben und acht Mammakarzinomzelllinien. Das Tumorgewebe der untersuchten Mammakarzinome lag in Form von Formalin fixiertem und in Paraffin eingebettetem Gewebe vor. Als Kontrolle der DNA-Methylierung des Tumorgewebes wurde gesundes kryokonserviertes Brustdrüsengewebe verwendet. Zusätzlich wurde das Methylierungsmuster des Blutes der Mammakarzinom-Patientinnen untersucht, um die konstitutionelle DNA-Methylierung dieser Gene zu bestimmen. Insgesamt konnten im Rahmen dieser Arbeit sieben der 13 untersuchten Fanconi Anämie-Gene erfolgreich analysiert und ausgewertet werden. Es konnte gezeigt werden, dass fünf der Fanconi Anämie-Gene (FANCC, FANCD2, FANCL, FANCJ (BRIP1) und FANCN (PALB2)) kein gegenüber gesundem Brustdrüsengewebe verändertes Methylierungsmuster in den untersuchten familiären Mammakarzinomen und Mammakarzinomzelllinien aufwiesen. Mit FANCA und FANCB konnten in der vorliegenden Arbeit zwei Fanconi Anämie-Gene identifiziert werden, die ein differentielles DNA-Methylierungsmuster in familiären Mammakarzinomen aufweisen. Das FANCA-Gen wies in 10 von 24 (41,7 %) der untersuchten Tumoren und vier von acht (50 %) Mammakarzinomzelllinien eine Hypomethylierung der Promotorregion auf. Eine von acht Mammakarzinomzelllinien (12,5 %) wies eine Hypermethylierung auf. Für das FANCB-Gen zeigten acht von 18 (44,4 %) der Tumoren eine Hypermethylierung der untersuchten Promotorregion. Acht der 18 (44,4 %) Tumoren und 75 % der Mammakarzinomzelllinien wiesen dagegen eine Hypomethylierung auf. Im Blut der untersuchten Patientinnen konnte vereinzelt ein im Vergleich zu gesunden Probanden verändertes Methylierungsmuster der Promotorregion des FANCA- und FANCB-Gens beobachtet werden. Eine Korrelation dieser Methylierungsunterschiede mit den Methylierungsdaten der entsprechenden Tumoren konnte nicht belegt werden. Insgesamt konnten in dieser Arbeit Veränderungen des Methylierungsmusters der Fanconi Anämie-Gene FANCA und FANCB beobachtet werden, die bei der Entstehung und/oder Progression des familiären Mammakarzinoms eine wichtige Rolle spielen könnten. In Zukunft sollte an Hand weiterer Untersuchungen die funktionelle Bedeutung der epigenetischen Veränderungen dieser beiden Gene näher untersucht werden, um zu klären, inwieweit ein verändertes Methylierungsmuster als zusätzlicher prognostischer Marker verwendet werden kann.

Die Alzheimer Demenz und der Morbus Parkinson als häufigste neurodegenerative Erkrankungen führen zu schwerer Behinderung, zu Pflegebedürftigkeit und meist über Komplikationen zum Tod. Ihr langer Verlauf stellt für Betroffene, Angehörige sowie für das Gesundheitssystem eine enorme Belastung dar. Da die Ätiologie der Alzheimer Demenz und des Morbus Parkinson sowie der meisten neurodegenerativen Krankheiten im Einzelnen nicht bekannt sind und phänotypische Überschneidungen auftreten, sind die Möglichkeiten der eindeutigen Diagnosestellung häufig eingeschränkt oder erst postmortal möglich. Um eine Therapie bei Auftreten der ersten klinischen Symptome zu beginnen oder eine Voraussage der Erkrankungen zu ermöglichen, ist eine sensitive und validierte Frühdiagnostik nötig. Ziel der vorliegenden Arbeit war deshalb, auf der Genebene potentielle pathogenetische Verbindungen, mögliche diagnostische Markerproteine sowie Zusammenhänge zum zeitlichen Verlauf beider Krankheiten zu identifizieren. Dafür wurde mit der Real-Time Polymerasekettenreaktion die Expression von 44 Genen anhand von post mortem Gehirngewebe von Patienten mit Alzheimer Demenz, Morbus Parkionson im Vergleich zu Gesunden aus den vier Hirnregionen Hippocampus, Gyrus frontalis medialis, Gyrus temporalis medialis und Kleinhirn untersucht. Im Resultat zeigen die Gene mit einer statistisch signifikant veränderten Expression, z. B. Glutamattransporter, olfaktorische Rezeptoren oder vakuoläre Sortierungsproteine, bei beiden Erkrankungen gehäuft gleichsinnige Änderungen. Anhand dieser Ergebnisse ist eine kausale Verknüpfung des veränderten Genmetabolismus mit der ablaufenden Neurodegeneration zu vermuten. Zusätzlich wird die Hypothese gemeinsamer pathogenetischer Mechanismen beider Erkrankungen untermauert. Zusammenhänge der Genexpression zum zeitlichen Verlauf der Erkrankungen werden nur vereinzelt belegt, bekräftigten dann aber die Annahme einer Assoziation zu den degenerativen Prozessen. Die Identifizierung eines spezifischen Biomarkers für eine der beiden Erkrankungen war ein Ziel der vorliegenden Arbeit. Aufgrund seiner Expressionsänderung im Hippocampus bei Patienten mit Alzheimer Demenz könnte das BACE1-Gen (Beta site APP cleaving enzyme 1), das dort eine signifikante Expressionsabnahme zeigt, als solcher für dieses Patientenkollektiv diskutiert werden. Die häufig in dieser Arbeit im Hippocampus detektierten, signifikanten Expressionsänderungen, weisen zudem auf eine besondere Affektion dieser Hirnregion bei der Alzheimer Demenz als auch beim Morbus Parkinson hin. Des Weiteren werden in der vorliegenden Arbeit im Kleinhirn, einer Hirnregion, in der bei beiden Erkrankungen scheinbar kaum oder keine pathologischen Prozesse ablaufen, gehäuft und dann ähnliche Änderungen der Genexpression gemessen, die für eine Beteiligung des Kleinhirns bei beiden Krankheiten sprechen, deren Bedeutung bislang unklar ist., Alzheimer dementia and Parkinson disease are the most common neurodegenerative diseases. They lead to severe disability and mostly cause death through secondary complications. Their long latency is a big burden for the patients, their families and the health care system. The etiology of the most neurodegenerative diseases including Alzheimer dementia and Parkinson disease is largely unknown and there are phenotypical overlaps that limit the diagnostic options. Sensitive and validated diagnostic tools are necessary to start the appropriate therapy early and to make meaningful predictions. This thesis aims to find genes which can act as diagnostic marker proteins, show pathogenetic commonalities and potential correlations to the chronological sequence of the described diseases. 44 genes were analysed with real time polymerase chain reaction of post mortal tissue of the temporal and frontal cortex, the hippocampus and cerebellum from patients with Alzheimer dementia and Parkinson disease compared to a control group. Genes with statistical significant changes in expression between test subjects and controls as the olfactory receptor gene, the glutamate transporter gene or the vacuolar sorting protein gene often show similar changes in both diseases. These results show a connection between the changed gene expression and the progress of the neurodegenerative process in both diseases. In addition these results support the theory of common pathogenetic pathways in both diseases. Correlations to the chronological sequence of both diseases were confirmed just in individual cases but corroborate the connection to the ongoing neurodegenerative process. Furthermore this thesis aims to identify a diagnostic biological marker. Due to the expression profile of the BACE1 gene in the hippocampus of patients with Alzheimer dementia this gene can be seen as a potential biological marker for this group of patients. The frequently measured changes of gene expression profiles in the hippocampus show the particular significance of this brain region in the Alzheimer dementia and Parkinson disease. Furthermore this thesis shows numerous and similar changes of gene expression profiles for both diseases in the cerebellum, a region which demonstrates nearly no pathological processes in Alzheimer dementia and Parkinson disease. The significance of the findings is yet unknown and requires further research.

Die Xenotransplantation (XTx) porziner Zellen, Gewebe und Organe könnte den Mangel an humanen Spenderorganen überwinden. Problematisch für die Schwein-auf-Mensch-XTx ist die Existenz porziner endogener Retroviren (PERV), da PERV-A und PERV-B in vitro humane embryonale Nierenzellen infizieren können, weshalb es in vivo zu einer Zoonose kommen könnte. Hier wurde untersucht, ob porzine und humane APOBEC3 (A3)-Proteine eine PERV-Infektion inhibieren können, denn diese Familie der Cytosin-Deaminasen gehört zur zellulären intrinsischen Immunität und dient als effektiver Block gegen Retroviren und Retrotransposons. Die erhaltenen Daten zeigen, dass der poA3-Genlokus auf Chromosom 5 aus den Genen A3Z2 und A3Z3 besteht und für mindestens vier verschiedene mRNAs (A3Z2, A3Z3, A3Z2-Z3 und A3Z2-Z3 SVA) kodiert. Die porzinen A3s A3Z2, A3Z3 und A3Z2-Z3 wurden in PERV-Partikel verpackt und inhibierten die PERV-Replikation dosisabhängig. Für A3Z2 und A3Z2-Z3 konnte dabei ein Langzeiteffekt nachgewiesen werden. Der antiretrovirale Effekt war auf eine G-zu-A-Hypermutation zurückzuführen und erfolgte in einem Trinukleotidkontext (5'TGC für A3Z2 und A3Z2-Z3, 5'CAC für poA3Z3). Ebenso wiesen fast alle humanen A3-Proteine eine antiretrovirale Aktivität gegen PERV auf. Aufgrund dieser Resultate ist es möglich, dass humane und porzine A3s auch in vivo die PERV-Replikation inhibieren könnten, wodurch sich das Risiko einer PERV-Infektion im Zuge einer Schwein-auf-Mensch-XTx deutlich reduziert wäre. Xenotransplantation (XTx) of porcine cells, tissues and organs shows great promise to surmount the shortage of human donor material. One barrier for pig-to-human XTx is the existence of porcine endogenous retroviruses (PERV). Two classes PERV-A and PERV-B are able to infect human embryonic kidney cells in vitro suggesting that a xenozoonosis in vivo could occur. To assess the capacity of human and porcine cells to counteract PERV infections, we analyzed human and porcine APOBEC3 (A3) proteins. This family of cytidine deaminases contributes to the cellular intrinsic immunity and acts as potent inhibitor of retroviruses and retrotransposons. Our data show that the porcine A3 gene locus on chromosome 5 consists of the two single-domain genes A3Z2 and A3Z3. The two A3 genes encode for at least four different mRNAs: A3Z2, A3Z3, A3Z2-Z3 and A3Z2-Z3 SVA. Porcine and human A3s have been tested towards their antiretroviral activity against PERV using novel single-round reporter viruses. The porcine A3s A3Z2, A3Z3 and A3Z2-Z3 were packaged into PERV particles and inhibited PERV replication in a dose-dependent manner. The antiretroviral effect correlated with editing by the porcine A3s with a trinucleotide preference for (5'TGC for A3Z2 and A3Z2-Z3, 5'CAC for poA3Z3). These results strongly implicate that human and porcine A3s could inhibit PERV replication in vivo, thereby possibly reducing the risk of infection of human cells by PERV in the context of pig-to-human XTx.

In den vergangenen Jahren wurde vermehrt das Gen, welches für Catechol-O-Methyltransferase codiert, als starker Kandidat für ein erhöhtes Schizophrenierisiko diskutiert. Grund dafür ist die zentrale Rolle der Catechol-O-Methyltransferase beim Katecholaminabbau im menschlichen präfrontalen Cortex. Aufgrund der zunehmend akzeptierten Tatsache, daß die singuläre Betrachtung einzelner Marker bei der komplexen genetischen Textur von Kandidatengenen nur wenig zur Erhellung komplexer Erkrankungen beizutragen vermag (Licinio, 2003), untersuchten wir neben dem Val108/158Met-Polymorphismus (rs4680) vier weitere, die COMT-Gen-Region umspannende SNPs (rs2097603, rs740603, rs4818, rs165599) an einer Stichprobe von 459 Schizophrenen und 150 Kontrollpersonen. Zwar ergab sich für den Marker rs740603 auf Intron 1 eine signifikante Allel- (p = 0.0060) und Genotypassoziation (p = 0.019), der funktionelle Val108/158Met-Polymorphismus (rs4680) zeigte aber keinen signifikanten Zusammenhang mit der Erkrankung. Zudem fand sich in unserer Haplotypanalyse keine Markerkombination, die in überdurchschnittlichem Zusammenhang mit schizophrenen Psychosen stand. Für die Untergruppe der zykloiden Psychosen ließ sich bei einem p-Wert von 0.031 eine 4-Marker-Kombination ermitteln, die die SNPs rs740603, rs4818, rs4680 und rs165599 einschliesst und die Region von Intron 1 bis 3´-UTR umspannt. Zusätzlich ergab sich in der Subgruppe der zykloiden Psychosen ein geschlechtsspezifischer Effekt im Sinne eines signifikanten 3-Marker-Haplotypen (rs4818-rs4680-rs165599) (p = .0044) in der Gruppe der Frauen (n = 27) mit rs165599 als stärkstem Einzelmarker. Aufgrund des komplexen genetischen Zusammenhangs zwischen den untersuchten Markern und der Erkrankung sollte auch in der zukünftigen Forschung eine differenzierte Betrachtung der verschiedenen schizophrenen Zustandsbilder angestrebt werden, wie dies die Klassifikation nach Leonhard ermöglicht. Neben gewebsspezifischen Transkriptionsfaktoren könnten auch epigenetische Faktoren, wie die Cytosinmethylierung von CpG-Stellen in promotorregulierenden Regionen, einen Erklärungsansatz für die Entstehung schizophrener Störungsbilder darstellen., Since several years, the gene encoding catechol-O-methyltransferase (COMT) at chromosome 22q11 is discussed as a strong candidate for schizophrenia susceptibility due to its key function in degredation of catecholamines in the prefrontal cortex, a critical region of the human brain, involved in cognitive control processes, monitoring of information in working memory and in active judgments on information (Petrides, 2005). To test the association of the COMT gene locus with schizophrenia, we analysed five SNPs (rs2097603, rs740603, rs4818, rs4680, rs165599) spanning from the P2 promotor region (MB-COMT) to the 3´-UTR in 459 index cases, which fulfilled diagnistic criteria of schizophrenia according to DSM IV as well as 150 blood donors as population controls. According to differentiated psychopathology (Leonhard, 1999) probands were categorized into cycloid psychosis, unsystematic schizophrenia and systematic schizophrenia prior to genotyping. In intron 1 the marker rs740603 showed significant allele (p = 0.0060) and genotype (p = 0.019) association, but the functional Val105/158Met variant (rs4680) failed significant association with disease. Considering COMT haplotypes none of the marker combinations showed evidence for an association with schizophrenia. In the subgroup of cycloid psychosis we found 4-locus marker combinations rs740603-rs4818-rs4680-rs165599 associated with disease at p-level 0.031, spanning a region from intron 1 to the 3´-UTR. In conclusion, the genetic interaction of COMT SNPs and haplotypes and schizophrenia susceptibility appears complex across different populations and psychopathological phenotypes. Particularly structures potentially involved in mRNA expression levels need further scrutiny.

Bei Pankreaskarzinomen ist u.a. der TGF-\(\beta\)-Signalweg, an dem DPC4 beteiligt ist, dereguliert. Ziel der Arbeit war es, die Bedeutung von DPC4 und PSCA für Proliferation, Invasion und Migration von Tumorzellen durch die stabile virale Transduktion von Zelllinien mit shRNA-Expressionsvektoren in-vivo und in-vitro zu untersuchen. Hierzu wurde eine lentivirale Gentransfermethode etabliert. Durch die Transduktion der Zellen mit shRNA-exprimierenden Vektoren ließ sich die Expression von DPC4 und PSCA stabil supprimieren. Die Suppression von DPC4 erzielte eine Steigerung der Proliferations- und der Migrationsrate sowie der Invasivität. Die Suppression von PSCA reduzierte die Proliferationsrate in-vitro und die Tumorwachstumsgeschwindigkeit in-vivo. Erstmals konnte hier für PSCA ein proliferationsfördernder und tumorpromovierender Effekt direkt nachgewiesen werden. Dies zeigt die Bedeutung von PSCA als ein potentielles therapeutisches Target für das duktale Adenokarzinom des Pankreas.

Autosomal recessive polycystic kidney disease (ARPKD) is a severe inherited disorder with a proposed incidence of 1/20.000 live births. In 1994 the ARPKD gene was mapped to chromosome 6p21-cen. Two independent groups unraveled the PKHD1 gene in 2002. This study reports mutation screening by SSCP analysis of the exons 26-52 of the longest continuous open reading frame of the PKHD1 gene in 90 ARPKD families. It identifies 11 different mutations, 9 of them have not been reported previously. Of the observed changes, 2 were deletions/insertions und 7 were missense mutations. In addition to the reported mutations, 18 polymorphisms were observed; 14 of them have not been reported previously. The results of this study combined with the results of other mutation analysis of the exons 2-25 and 53-67 (Bergmann et al. 2003) make up a detection rate of 61% (2 underlying mutations were disclosed in 40 individuals (45%), 1 mutation in 30 cases (33%), no mutation could be found in 20 patients (22%)). In patients in whom only one or no mutation was found, it is likely that limitations of SSCP technique hampered detection of the second or any variant (gross deletions or genomic rearrangements are not detectable by SSCP). Preliminary genotype-phenotype correlations could be established for the type of mutation. The proportion of chain-terminating mutations was significantly higher in the severe group than in the moderately affected cohort. Survival past the immediate perinatal period required the presence of at least one amino acid substitution mutation, while the presence of two chain terminating mutations invariably resulted in perinatal lethality. The identification of PKHD1 gene provides the basis for direct mutation testing in prenatal diagnosis. However, mutation analysis in ARPKD poses special difficulties due to the huge size of the gene, multiple predicted splice variants and marked allelic heterogeneity.

In der vorliegenden Arbeit standen die an der Biosynthese der Cardenolide in Digitalis und Isoplexis beteiligten Enzyme _5-3ß-Hydroxysteroid-Dehydrogenase (3ß-HSD) und Progesteron-5ß-Reduktase (5ß-POR) im Mittelpunkt der Untersuchungen. Unter Verwendung von spezifischen Primern und DNAs bzw. cDNAs verschiedener Digitalis- und Isoplexis-Arten wurden die 5ß-POR Gene aus 19 Digitalis-Spezies, bzw. Subspezies und 4 Isoplexis-Spezies amplifiziert, kloniert und sequenziert. Sowohl die erhaltenen 5ß-POR Nukleotidsequenzen, sowie die daraus abgeleiteten Aminosäuresequenzenwiesen mit 96 % Homologie ein hohes Maß der Übereinstimmung auf. Alle klonierten 5ß-POR Sequenzen wurden in der Genbank NCI Database veröffentlicht. Die durchgeführte Southern-Blot-Analyse konnte die 5ß-POR in D. lanata als ein Mitglied einer kleinen Genfamilie identifizieren. Zur Aufklärung verwandtschaftlicher Beziehungen der Digitalisund Isoplexis-Arten wurde ein Phylogramm basierend auf den 5ß-POR Gensequenzen ausgewählter Digitalis- und Isoplexis-Spezies erstellt. Um die 5ß-POR aus D. lanata weiter charakterisieren zu können, wurde das Enzym als His-tag Fusions-Protein in E. coli heterolog überexprimiert (r5ß-POR). Bei optimalen Expressionsbedingungen war es möglich, die r5ß-POR in löslicher und funktioneller Form zu exprimieren. Die nativ His-tag gereinigte r5ß-POR wurde bezüglich ihrer Substratspezifität, kinetischen Parameter und biochemischen Eigenschaften charakterisiert. Zur Aufklärung der 3D-Struktur des Enzyms wurde sowohl r5ß-POR, als auch SeMet-r5ß-POR hergestellt. Unter Berücksichtigung der strukturellen und proteinchemischen Eigenschaften wurde die 5ß-POR der Enzym-Superfamilie der Short- Chain-Dehydrogenases/Reductases (SDR) zugeordnet. Zur Klonierung der 3ß-HSD wurden PCRs, bzw. RT-PCRs mit spezifischen Primern und DNAs, bzw. cDNAs verschiedener Digitalis- und Isoplexis-Arten durchgeführt. Es konnten die 3ß-HSD Gene aus 7 Digitalis-Spezies amplifiziert, kloniert und sequenziert werden. Die erhaltenen Nukleotidsequenzen waren, ebenso wie die daraus abgeleiteten 3ß-HSD Aminosäuresequenzen, zu 95 % homolog. Die klonierten 3ß-HSD Sequenzen wurden in der Genbank NCI Database veröffentlicht. Die 3ß-HSD aus D. lanata konnte als His-tag Fusions-Protein in E. coli funktionell überexprimiert werden (r3ß-HSD). Nach nativer His-tag Reinigung wurde die r3ß-HSD charakterisiert. Aufgrund der strukturellen und proteinchemischen Eigenschaften der 3ß-HSD konnte das Enzym, wie die 5ß-POR, als ein Mitglied der Short-Chain-Dehydrogenase/Reductase Superfamilie (SDR) eingeordnet werden. This thesis focused on the enzymes 5-3ß-hydroxysteroid dehydrogenase (3ß-HSD) and progesterone 5ß-reductase (5ß-POR), both involved in cardenolide biosynthesis in the genera Digitalis and Isoplexis. 5ß-POR genes from 19 Digitalis species/subspecies and 4 Isoplexis species were amplified, cloned and sequenced, using specific primers and corresponding DNA or cDNA, respectively. The nucleotide sequences as well as the deduced amino acid sequences showed a high degree of homology (96 %). All 5ß-POR sequences obtained were published in GenBank NCI Database. Southern blot analysis identified 5ß-POR from D. lanata to be a member of a small gene family. Using 5ß-POR genes of selected Digitalis and Isoplexis species, a phylogram was constructed, elucidating phylogenetic relationships between the genera Digitalis and Isoplexis. With a view to characterising 5ß-POR from D. lanata further, the enzyme was heterologously expressed in E. coli as a recombinant His-tagged protein (r5ßPOR). Optimised conditions for protein expression facilitated the expression of r5ß-POR in a soluble and functional form. The His-tagged r5ß-POR was purified under native conditions and afterwards characterised with regard to substrate specificity, kinetic constants and biochemical properties. To elucidate the 3-D structure of the enzyme, r5ß-POR as well as SeMet-r5ß-POR was produced. Taking the structural and biochemical properties of the enzyme into account, 5ß-POR was identified as a new member of the short-chain dehydrogenase/reductase family (SDR). With the purpose of cloning 3ß-HSD genes from Digitalis and Isoplexis, PCR/RTPCR amplifications were carried out using specific primers and DNA or cDNA of several Digitalis and Isoplexis species, respectively. In this process 3ß-HSD genes from 7 Digitalis species were successfully amplified, cloned and sequenced. The nucleotide sequences obtained as well as the amino acid sequences deduced showed a high degree of homology (95 %). All 3ß-HSD sequences have been published in GenBank NCI Database. Subsequent 3ßHSD from D. lanata was functionally expressed in E. coli as a recombinant His-tagged protein (r3ß-HSD). After purification of the recombinant enzyme under native conditions, r3ß-HSD was characterised. Structural and biochemical properties of the 3ß-HSD classified this enzyme, as in the case of 5ß-POR, as a member of the short-chain dehydrogenase/reductase family (SDR).

Die opportunistische Hefe Candida albicans ist in der Lage durch ein koordiniertes Zusammenspiel bestimmter zellulärer Eigenschaften sich unterschiedlichen Umweltbedingungen anzupassen und unterschiedliche Nischen innerhalb des menschlichen Wirts zu kolonisieren. Die Sekretion hydrolytischer Enzyme, wie Proteinasen und Phospholipasen, stellt eine wichtige Eigenschaft des Pilzes dar, die als wesentlicher Faktor für die Aufrechterhaltung der Pathogenität von C. albicans angesehen wird. Ein Schwerpunkt der hier vorliegenden Studie ist die funktionale Charakterisierung des caPLB5-Gens, eines neuen Mitglieds der insgesamt 5 Mitglieder umfassenden Phospholipase-B-Genfamilie. Im Gegensatz zu den gut untersuchten sekretorischen PLBs caPlb1p and caPlb2p scheint das caPlb5-Protein GPI-verankert und letztlich zellwandgebunden zu sein. Mittels Northernexpressions-Studien ließen sich in verschiedenen C.-albicans-Stämmen und unterschiedlichen Wachstumsbedingungen caPLB5-spezifische Transkripte nachweisen. Während des Hefe-Hyphe-Wechsels in Lee’s Medium zeigte sich interessanterweise eine differentielle Regulation der Gene caPLB5, caPLB1 and caPLB2. Durch Sequenzanalyse einzelner caPLB5-Allele konnte die Anwesenheit zweier unterschiedlicher Allele in C. albicans bei verschiedenen Stämmen nachgewiesen werden. Die gezielte Geninaktivierung beider Allele in zwei verschiedenen Stämmen resultierte in einer attenuierten Virulenz, was sich im Mausmodell für systemische Infektion anhand des Kolonisationsgrads des Wirtsgewebes messen ließ. Die Phänotypen sowohl der Nullmutanten als auch der caPLB5-Revertanten belegen, dass die Phospholipase B caPlb5p für die vollständige Virulenz des Pathogens benötigt wird und dabei eine Rolle bei der in vivo Organbesiedlung spielt. Diese Arbeit präsentiert zudem die Isolierung und Charakterisierung des ATP-Binding-Cassette-(ABC)-Transporter-Gens caMLT1 aus C. albicans. CaMlt1p zählt zur MRP/CFTR-Unterfamilie ATP-bindender Transportproteine, eine Proteinkategorie, die in diesem Pilz bislang noch nicht beschrieben wurde. Energiebetriebene Transportproteine der ABC-Superfamilie schleusen eine Vielzahl unterschiedlicher Substrate aktiv durch biologische Membranen und erfüllen dabei wichtige Funktionen im zellulären Metabolismus und in der Entgiftung. Das caMlt1-Protein zeigt hohe sequenzielle und strukturelle Ähnlichkeiten zu den vakuolaren Efflux-Pumpen Ycf1p und Bpt1p von S. cerevisiae. Durch genomische Markierung mit dem grün fluoreszierenden GFP-Protein konnte caMlt1p in der vakuolaren Membran lokalisiert werden. Northernblothybridisierungen belegten die Induzierbarkeit der Gentranskripte durch die metabolischen Gifte Cadmium und CDNB, beides Substrate der scYcf1-Pumpe. Obwohl diese Untersuchungen darauf hindeuten, dass caMlt1p ein Ortholog von scYcf1p sein könnte, zeigte sich bei dem Komplementationsversuch einer scycf1-negativen S.-cerevisiae-Mutante mit einer caMLT1-Genkopie keine Reversion des sensitiven Phänotyps gegenüber Cadmium oder CDNB. Auch wiesen die in dieser Arbeit konstruierten, camlt1-negativen Mutanten in C. albicans, die zur Identifizierung potentieller caMlt1p-Substrate eingesetzt wurden, keinen hypersensitiven Phänotyp gegenüber CdCl2, CDNB oder irgendeiner anderen getesteten inhibitorischen Substanz auf. CaMlt1p ist demzufolge kein funktionales Homolog von scYcf1p. Als vakuolar lokalisiertes Protein weist caMLT1 ein für diese Proteingruppe typisches Transkriptionsprofil auf. Die mRNA-Expression erfolgt dabei wachstumsphasenabhängig mit der höchsten Geninduktion während des Diauxic-Shifts, wenn ein Mangel an Glucose (und anderen Nährstoffen) im Medium entsteht. Eine generierte camlt1-Nullmutante war interessanterweise in einem murinen Peritonitismodell in ihrer Fähigkeit die Leber zu invadieren drastisch reduziert. Durch Reintegration einer funktionalen caMLT1-Genkopie konnte der Virulenzdefekt aufgehoben werden. CaMlt1p scheint in die Fähigkeit von C. albicans involviert zu sein an intestinale Organe adhärieren und Gewebebarrieren penetrieren zu können, möglicherweise durch Einbindung des Transporters in Stressantwort- und Detoxifikationsmechanismen. Beide Gene, caMLT1 und caPLB5, wurden auf zweierlei Weise inaktiviert: mittels einer klassischen Mutagenesemethode für C. albicans (dem URA3-Blaster-System im Ura--auxotrophen Stamm CAI4) und durch Entwicklung eines neuen dominanten Selektionssysstems. Die dominante Selektion basiert dabei auf der genomischen Insertion einer Einzelkopie eines mutierten caIMH3-Allels (MPAR), das Transformanten Resistenz gegenüber Mycophenolsäure (MPA) verleiht. Dieses System ermöglicht die genetische Manipulation von C. albicans Wildtypstämmen, wodurch die mühselige Konstruktion auxotropher und oft avirulenter Stämme nicht mehr nötig ist., A coordinated interplay of certain traits enables the opportunistic yeast Candida albicans to adapt to different environmental conditions and to colonize different niches of the human host. Secretion of hydrolyzing enzymes, like proteinases and phospholipases, is an important characteristic of C. albicans which is considered to be integral to pathogenesis. This study focuses on the functional characterisation of the caPLB5 gene, a new member of the phospholipase B multigene family with five putative members. In contrast to the well characterized secretory PLBs caPlb1p and caPlb2p, the putative caPlb5-protein is likely to be GPI-anchored and ultimately bound to the cell wall. Northern expression studies showed caPLB5-specific transcripts in several strains of C. albicans under each growth condition tested. Interestingly, differential regulation of caPLB5, caPLB1 and caPLB2 could be detected during the yeast to hyphae transition in Lee’s medium. Sequence analysis of single caPLB5 allels resulted in the identification of two different alleles in several strains of C. albicans. The targeted gene disruption of both alleles in two different strains resulted in attenuated virulence as measured by host tissue colonization in a mouse model of systemic infection. The phenotypes expressed by null mutants and revertant strains of caPLB5 indicate that the phospholipase is required for complete virulence of this pathogen by playing a role for in vivo organ colonization. This study further presents the isolation and characterisation of the ABC-transporter gene caMLT1 in C. albicans belonging to the MRP/CFTR-subfamily of ATP-binding casette (ABC) transporters, a class of proteins so far not described in this fungus. Energy-driven transport proteins within the ABC-superfamily actively transport a wide variety of substances across biological membranes and fulfill important functions in cellular metabolism and detoxification. The protein encoded by the caMLT1 gene shows high similarities to the vacuolar efflux-pumps Ycf1p and Bpt1p of S. cerevisiae. Genomic tagging with the green fluorescent protein (GFP) revealed vacuolar membrane localization of caMlt1p. Northern hybridisation experiments documented the inducibility of gene transcripts by the metabolic poisons cadmium and CDNB, which are also substrates of the scYcf1-pump. While caMlt1p could be an orthologue of scYcf1p, complementation of a scycf1-negative S. cerevisiae mutant with a caMLT1-gene copy did not reverse the sensitive phenotype to these toxins. Moreover, the construction of camlt1-negative mutants in C. albicans allowed for screening of substrates putatively transported by caMlt1p. These null mutants showed no hypersensitive phenotype to neither CdCl2 nor CDNB or any other tested inhibitory substances, hence caMlt1p is not a functional homologue of scYcf1p. The caMLT1 mRNA expression pattern is typical for a vacuolar gene, showing an extensively growth phase dependent regulation with the highest gene induction during the diauxic transition when glucose (and other nutrients) becomes limited. Most interestingly, a generated mlt1 null mutant showed a dramatic reduction in liver invasion in a mouse peritonitis model. Reintegration of a functional caMLT1 gene copy reverted the virulence defect. CaMlt1p seems to be involved in the capability of C. albicans to adhere to the intestinal organs and penetrate tissue barriers putatively because of its involvement in mechanisms of stress response and detoxification. Both genes, caMLT1 and caPLB5, were inactivated by using a classical disruption method for C. albicans (the URA3-Blaster-system in Ura- auxotrophic strain CAI4) and by developing a new dominant selection system. Dominant selection is based on genomic insertion of a single copy of a mutated caIMH3 allel (MPAR) that renders transformants resistant to mycophenolic acid (MPA). Using this system, the cumbersome generation of auxotrophic strains, which are often avirulent, is obsolete, while C. albicans wild-type strains become amenable to genetic manipulation.

Die Bedeutung von Mykosen hat wegen der wachsenden Zahl immunsupprimierter Patienten in den letzten Jahren immer mehr zugenommen. Diese erkranken häufig an oberflächlichen sowie lebensbedrohlichen systemischen Infektionen mit dem opportunistisch humanpathogenen Hefepilz Candida albicans, da der Keim, der oftmals als harmloser Kommensale auf den Schleimhäuten im Gastrointestinaltrakt gesunder Menschen vorkommt, vom geschwächten Immunsystem nicht mehr in Schach gehalten werden kann. In dieser Arbeit sollten bestimmte Gene von C. albicans, die in anderen Organismen als essentiell für deren Lebensfähigkeit bzw. Virulenz beschrieben wurden, als potentielle Zielstrukturen für die Entwicklung neuer Antimykotika charakterisiert werden. Das CMP1-Gen kodiert für die katalytische Untereinheit der konservierten Calcium/Calmodulin-abhängigen Phosphatase Calcineurin, die in der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae und in anderen Organismen verschiedene physiologische Prozesse reguliert und essentiell für die Virulenz des pathogenen Hefepilzes Cryptococcus neoformans ist. Um die Bedeutung von Calcineurin für das Überleben und die Virulenz von C. albicans zu untersuchen, wurden homozygote cmp1 knock-out-Mutanten sowohl in einem auxotrophen C. albicans-Laborstamm als auch, mit Hilfe eines neuen dominanten Selektionsmarkers, in einem prototrophen Wildstamm hergestellt. Die Mutanten erwiesen sich als hypersensitiv gegenüber Natrium, Calcium, Mangan und Lithium sowie gegenüber alkalischem pH-Wert. Darüber hinaus konnten die mutierten Zellen Membranstreß, der durch SDS- oder Fluconazol-Zugabe verursacht wurde, nicht tolerieren und waren unter diesen Bedingungen stark in ihrem Wachstum gehemmt. Andere wichtige Virulenzeigenschaften wie die Toleranz gegenüber Wirts-Körpertemperatur und die Fähigkeit zur Hyphenbildung zeigten sich durch die CMP1-Deletion in vitro nicht beeinträchtigt. Dennoch machte die Anwendung eines murinen Modells einer systemischen Candidose in vivo deutlich, daß die Mutanten sehr stark in ihrer Virulenz attenuiert waren. Der Virulenzdefekt war vermutlich zumindest zum Teil dadurch bedingt, daß die Calcineurin-defizienten Zellen im Gegensatz zum Wildtyp in humanem Serum nicht wachsen konnten und deshalb möglicherweise schlechter über die Blutbahn disseminieren konnten. Außer Calcineurin wurden in Kooperation mit einem Industriepartner drei weitere Gene, YML127, YPR143, und YML93, die in S. cerevisiae als essentiell beschrieben wurden und die keine signifikanten Homologien zu Vertebraten-Genen aufwiesen, in der C. albicans-Genomsequenz identifiziert und auf ihre Eignung als potentielle Targets hin untersucht. Die Funktion dieser Gene war zu Beginn dieser Arbeit unbekannt; vor kurzem wurde jedoch gezeigt, daß sie in S. cerevisiae eine Rolle beim Chromatin-Remodeling bzw. bei der rRNA-Prozessierung haben. Nachdem sich alle Gene auch in C. albicans als essentiell herausgestellt hatten, wurden konditional letale Mutanten hergestellt, in denen die Gene durch induzierbare Deletion mit Hilfe der site-spezifischen Rekombinase FLP aus dem Genom entfernt wurden. Dadurch wurde eine Population von Nullmutanten erhalten, in denen der terminale Phänotyp der Gendeletion analysiert werden konnte. Die funktionelle Analyse des YML127 (RSC9) Gens wies darauf hin, daß es in C. albicans eine ähnliche Funktion hat wie in der Bäckerhefe, in der das Rsc9-Protein ein Bestandteil des RSC-Protein-Komplexes ist, der die Struktur des Chromatins in Abhängigkeit von Zellzyklus und Umweltbedingungen umorganisiert und damit die Aktivität von Genen steuert. Mit Hilfe eines HA-Epitop markierten YML127-Gens konnte das Genprodukt im Zellkern von C. albicans lokalisiert werden. Die C. albicans yml127-Nullmutanten produzierten verlängerte, mehrfach knospende Zellen, was einen Verlust der Koordination zwischen Mitose und Zytokinese vermuten ließ. Die beiden Gene YPR143 und YML93 (UTP14) scheinen wie ihre homologen Vertreter in S. cerevisiae an der Prozessierung der ribosomalen RNA beteiligt zu sein. Heterozygote Mutanten wiesen eine Haploinsuffizienz auf, die sich in einer erhöhten Suszeptibilität gegenüber Hemmstoffen der rRNA-Synthese und der Ribosomenaktivität zeigte, und in den induzierten Nullmutanten akkumulierten Vorstufen der reifen rRNAs. In beiden Fällen führte die Gendeletion zu Anomalien im Zellzyklus; die ypr143-Mutanten wiesen eine vergrößerte unförmige Zellmorphologie auf, und die yml93-Mutanten bildeten große, rundliche Zellen. Die Ergebnisse dieser Arbeit erlauben nicht nur wichtige Einblicke in die Funktion der untersuchten Gene in essentiellen zellulären Prozessen, sondern zeigen auch deren Bedeutung für die Virulenz bzw. für das Überleben des humanpathogenen Hefepilzes C. albicans. Die entsprechenden Genprodukte sollten sich deshalb prinzipiell als Angriffspunkte für die Entwicklung neuer antimykotischer Medikamente eignen., The importance of fungal infections has steadily increased during the past decades due to the growing number of immunocompromised patients. These patients often suffer from superficial as well as life-threatening systemic infections with the opportunistic human pathogenic yeast Candida albicans, which is a harmless commensal on mucosal surfaces in many healthy people but cannot be controlled any more by a weakened immune system. On the other hand, virulence traits of the fungus also contribute to its pathogenicity, because they enable adaptation to different host niches. The success of medical treatment is limited by the emergence of resistance and by toxic side effects of antifungal drugs. Therefore, there is an urgent need to develop novel antimycotic agents. In this work selected C. albicans genes, which were known to be essential for viability or virulence in other organisms, were characterized as potential targets for the development of new antifungal drugs. The CMP1 gene encodes the catalytic subunit of the conserved calcium/calmodulin-dependent phosphatase calcineurin, which regulates a variety of physiological processes in the model yeast Saccharomyces cerevisiae and other organisms and is essential for virulence of the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans. To investigate the importance of calcineurin for survival and virulence of C. albicans, homozygous cmp1 knock-out mutants were constructed in an auxotrophic C. albicans laboratory strain as well as, using a new dominant selection marker, in a prototrophic wild-type strain. The mutants showed hypersensitivity to increased concentrations of ions and to alkaline pH. In addition, the mutated cells could not tolerate membrane stress resulting from SDS or fluconazole treatment and their growth was strongly inhibited under these conditions. Other characteristics that are important for virulence, like tolerance to the host body temperature and the ability to switch to a hyphal growth form, were not affected by the CMP1 deletion. Nevertheless, the mutants were avirulent in a murine model of systemic candidiasis. The virulence defect could be explained at least in part by the fact that, in contrast to the wild-type, the cmp1 mutants were unable to grow in human serum and therefore might have a reduced capacity to disseminate via the bloodstream. In addition to CMP1, three other genes, YML127, YPR143, and YML93, were selected in cooperation with an industrial partner from the available C. albicans genome sequence and evaluated as potential targets. These genes had been reported to be essential in S. cervisiae and they did not exhibit significant homology to mammalian genes. At the beginning of the present work the function of the three genes was unknown, but recently it was demonstrated that their counterparts in S. cerevisiae have roles in chromatin remodeling or rRNA processing. It was demonstrated that all three genes are also essential in C. albicans. Therefore, conditional lethal mutants were constructed in which the genes could be excised from the genome by inducible deletion using the site-specific FLP recombinase. In this way, populations of null mutants were obtained in which the terminal phenotype of the gene deletion could be analyzed. The functional analysis of the YML127 (RSC9) gene showed that it has a similar function in C. albicans as in S. cerevisiae, where the Rsc9 protein is a component of the RSC complex that remodels the structure of chromatin in a cell cycle dependent manner and in response to environmental conditions and thereby controls gene activity. Using an HA-epitope-tagged YML127 gene the Yml127 protein could be localized in the nucleus in C. albicans. The C. albicans yml127 null mutants produced elongated, multi-budded cells, pointing to a loss of coordination of mitosis and cytokinesis. The genes YPR143 and YML93 (UTP15) seem to be involved in the processing of the ribosomal RNA, like their counterparts in S. cerevisiae. Heterozygous mutants exhibited a haploinsufficient phenotype, which was evident from their hypersusceptibility to inhibitors of rRNA synthesis and ribosome activity, and the induced null mutants accumulated precursors of the mature rRNAs. In both cases the gene deletion resulted in cell cycle defects; the ypr143 null mutants produced enlarged, misshapen cells, and the yml93 mutants formed large, round cells. The results of this work not only provide valuable clues about the function of the investigated genes in essential cellular processes, but also demonstrate their importance for virulence and viability of the human pathogenic fungus C. albicans. In principle, the corresponding gene products should therefore be suitable targets for the development of novel antifungal drugs.

Autolysine, wie sie bei anderen Staphylokokken bereits bekannt waren, sollten bei \(\textit {S. xylosus}\) und \(\textit {S. cohnii}\) gefunden und charakterisiert werden. Es wurden mittels PCR-Cloning und Library screening zwei Gene gefunden. Das gefundene Gen in \(\textit {S. xylosus}\) wurde \(\it asx\) genannt und besteht aus Signalsequenz, Propeptid, 10 N-terminale Repeats, einer Amidase und einer Glucosaminidase, letztere getrennt durch drei lange Repeats. Bei S. \(\textit {S. cohnii}\) wurde das \(\it asc\)-Gen gefunden, welches sich im Aufbau nur durch 6 n-terminale Repeats anstatt 10 unterscheidet. Es ließt sich feststellen, dass die Spezies der Saprophyticus-Gruppe für diese Proteine eng miteinander verwandt sind. Durch Sequenzvergleiche und Vergleiche mit bekannter Literatur wurde auf mögliche Bedeutung und Funktion der verschiedenen Bausteine der Proteine geschlossen. Genaue Funktionsanalysen der einzelnen Proteine müssen dieser Arbeit folgen.

Autolysine, wie sie bei anderen Staphylokokken bereits bekannt waren, sollten bei S. xylosus und S. cohnii gefunden und charakterisiert werden. Es wurden mittels PCR-Cloning und Library screening zwei Gene gefunden. Das gefundene Gen in S. xylosus wurde asx genannt und besteht aus Signalsequenz, Propeptid, 10 N-terminale Repeats, einer Amidase und einer Glucosaminidase, letztere getrennt durch drei lange Repeats. Bei S. S. cohnii wurde das asc-Gen gefunden, welches sich im Aufbau nur durch 6 n-terminale Repeats anstatt 10 unterscheidet. Es ließt sich feststellen, dass die Spezies der Saprophyticus-Gruppe für diese Proteine eng miteinander verwandt sind. Durch Sequenzvergleiche und Vergleiche mit bekannter Literatur wurde auf mögliche Bedeutung und Funktion der verschiedenen Bausteine der Proteine geschlossen. Genaue Funktionsanalysen der einzelnen Proteine müssen dieser Arbeit folgen.

In diesem Beitrag wird dargestellt, auf welche Weise die bidirektionalen Beeinflussungen oder Transaktionen zwischen vier Niveaus (genetische Aktivität, neurale Aktivität, Verhalten und Umwelt) probabilistisch zu phänotypischen Variationen führen. Es wird ein Überblick über den derzeitigen Wissensstand hinsichtlich dieser Transaktionen in der pränatalen Entwicklungsperiode gegeben, wobei das Hauptaugenmerk auf die Risiken gerichtet ist, die sich daraus ergeben können. Nach einem kurzen Abriss der pränatalen Entwicklung wird näher auf die Mechanismen der genetischen Expression und das Problem des Verhältnisses zwischen Genotyp und Phänotyp eingegangen. Zuletzt folgt eine Beschreibung der funktionellen oder Verhaltensteratologie, die einen wichtigen Bestandteil der Entwicklungspsychopathologie bildet. Schlagwörter: Verhaltensteratologie - probabilistische epigenetische Theorie - pränataler Stress This paper describes the bi-directional influences or transactions between four levels (genetic activity, neural activity, behaviour and environment) that lead to the phenotypical variation, in a probabilistic way. We give an overview of the current scientific knowledge about these transactions in the prenatal life period and describe the inherent risks. Prenatal development is briefly described. We then consider the mechanism of genetic expression and the relationship between genotype and phenotype. Finally a description of recent developments and research findings is given of the discipline of behavioural teratology, which is related to the discipline of developmental psychopathology. Keywords: behavioural teratology - probabilistic epigenesis - prenatal stress

Die Superfamilie der Serpine (Serinprotease-Inhibitoren) umfasst neben inhibitorischen Serpinen auch nicht-inhibitorische Proteine. Eine geeignete Serinprotease spaltet die auf der Serpin-Oberfläche exponierte, reaktive Schleife (reactive centre loop, RCL) als Pseudosubstrat und wird dadurch inhibiert. Als Antagonisten der Serinproteasen sind die Serpine an der Regulation einer Vielzahl von physiologischen Prozessen beteiligt. In der vorliegenden Arbeit wurden phylogenetische Klassifikationen für die Serpine von Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster, Arabidopsis thaliana und Ciona intestinalis erstellt, die auf mehreren unabhängigen Kriterien basieren. Neben den Aminosäuresequenzen wurden auch die chromosomalen Lokalisationen und die Genstrukturen zur phylogenetischen Klassifikation der Serpine eingesetzt. Dazu wurden die in den Datenbanken zugänglichen Informationen zu Genstrukturen, EST- und cDNA-Sequenzen ausgewertet. Es zeigte sich, dass die zur Zeit annotierten Serpin-Genmodelle teilweise fehlerhafte bzw. unvollständige Exon-Intron-Strukturen aufweisen. Die Genmodelle wurden daher mit einer AGREP-Suchstrategie identifiziert und ihre Genstrukturen überprüft und gegebenenfalls vervollständigt. Die ergänzten und korrigierten Daten wurden mit den Baumrekonstruktions-Verfahren Maximum-Likelihood, Neighbor-Joining und Maximum-Parsimony klassifiziert und die so ermittelten Stammbäume mit den Exon-Intron-Strukturen und den chromosomalen Lokalisationen der Gene verglichen. Die vergleichende Analyse der Parameter "chromosomale Lokalisationen", "Exon-Intron-Strukturen" und "Aminosäuresequenzen" führte bei den Serpin-Genen von Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster und Ciona intestinalis zu einer weitgehend kongruenten, phylogenetischen Klassifikation der jeweiligen Serpine und ihrer Gene. Die Serpin-Gen-Analysen der vier Genome gewährten interessante Einblicke in die molekulare Evolution der Serpine und ihrer Gene. Es konnten molekulare Evolutionsprozesse, wie die Entstehung von Serpin-Pseudogenen, Hotspot-Diversifikation und alternatives Spleißen beobachtet werden. Im Rahmen dieser Arbeit konnten Serpin-Gene mit multiplen RCL-kodierenden Exon-Varianten in Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster und Ciona intestinalis identifiziert werden. Durch Spleißen wird eine Variante der mehrfach vorliegenden, spezifitäts-bestimmenden RCL-Exons an das gemeinsame Serpingrundgerüst angefügt. Diese Form des alternativen Spleißens stellt somit eine ökonomische Strategie zur Steigerung der funktionellen Vielfalt der Serpine dar. In der vorliegenden Arbeit wurde die Expression des Serpin-Gens Dm-Spn4 experimentell untersucht. Es gelang, insgesamt zehn unterschiedliche Dm-Spn4-Transkripte zu identifizieren, von denen acht unterschiedliche Protein-Isoformen abgeleitet werden konnten. Das alternative Spleißen und die Verwendung alternativer Transkriptionsstartpunkte bieten die Voraussetzungen zur Generierung von Protein-Isoformen mit unterschiedlicher zellulärer Lokalisation und Protease-Spezifität.

(de)ESI, compositional contrast, boron labelling, ferritin, double immunolabelling, oligonucleotide, slowscan CCD, Omega filter, SESAMe 1, field emission, Ill., graph. Darst

Data base searches resulted in the identification of five A. thaliana genes encoding putative phosphatidyltransferases. Functional expression studies showed that the two genes AC01563 and AL35540 encode phosphatidylinositol synthases, while the gene AF118223.2 appeared to encode a cardiolipin synthase. The two remaining genes AC004697.2 and AL132970.2 were identified as phosphatidylglycerophosphate synthase (PGPS) genes. The deduced amino acid sequences are highly conserved at their C-terminal ends but differ in their N-terminal ends. Where, PGPS1 (AC004697.2) unlike PGPS2 (AL132970.2) was found to have a transit peptide. Both recombinant enzymes were solubilized with Triton X-100 and subsequently purified in their catalytically active form. The biochemical characterization of the purified proteins as well as the membrane bound forms revealed that the two PGPS isozymes display similar properties with regard to pH-optima, detergent stimulation and cation dependence. In addition, the two isozymes were found to have comparable KM values for both substrates but they differ in their CDP-diacylglycerol species specificities due to their different VMAX values. The analysis of an A. thaliana mutant carrying a T-DNA insertion in the PGPS1 gene revealed that this gene is responsible for 70 % of the total PGPS activity in wild type plants. Furthermore the results suggest that PGPS1 is imported into both Mitochondria and plastids. Moreover, it seems likely that phosphatidylglycerol can be imported into mitochondria from the endomembranes of A. thaliana.