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Die MST1-Kinase und das Nore1A-Effektorprotein sind zwei Signalproteine, die durch Homo- und Heterodimerisierung in Ras-vermittelten pro-apoptotischen Signalwegen eine zentrale Rolle spielen. Die Dimerisierung erfolgt über ihre jeweilige C-terminale coiled-coil SARAH-Domäne. Ziel dieser Arbeit war es, das auf molekularer Ebene vorliegende kinetische Gleichgewicht zwischen den verschiedenen MST1 und Nore1A Dimerkomplexen quantitativ zu untersuchen. Hierzu wurden die schnellen und langsamen Assoziations- und Dissoziationskinetiken der Komplexbildung der verschiedenen Dimere mittels Stopped-Flow, Temperatur-Sprung Relaxation und Fluoreszenzspektroskopie bestimmt. Basierend auf den somit gewonnenen kinetischen und thermodynamischen Parametern der verschiedenen Dimere ist abschließend eine detaillierte Beschreibung der Stabilität und Lebensdauer der unterschiedlichen Dimere sowie deren Einfluss auf die von ihnen gesteuerten Signalwege möglich.

Die Aggregation einer ganzen Reihe von verschiedenen Proteinen steht in einem engen Zusammenhang mit verschiedenen Krankheiten, wie z.B. Alzheimer. Obwohl die dafür verantwortlichen Proteine sich in ihrer Ausgangsstruktur und ihrer Sequenz unterscheiden, zeigen sie alle die strukturelle Veränderung zu β -Faltblatt-reichen fibrillären Aggregaten mit der charakteristischen cross-β-Struktur. Der zugrunde liegende Mechanismus verläuft über mehrere Stufen, indem sich instabile präfibrilläre Oligomere über fibrilläre Vorstufen schließlich zu amyloiden Fibrillen zusammenlagern. Die mechanistischen Details sind nur wenig verstanden und viele verschiedene Strategien zur Entwicklung von Inhibitoren gegen die amyloide Aggregation sind bisher verfolgt worden. In den meisten Fällen binden die chemisch diversen Verbindungen an bereits aggregierte Formen des amyloidogenen Proteins in der β-Faltblattkonformation. Das Screening von Substanzbibliotheken und das rationale Design führt in den meisten Fällen zu Inhibitoren die an die aggregierte Spezies binden und die weiter Polymerisation durch die Blockierung der Addition weiterer Monomere unterbinden. Zahlreiche Studien in der Entwicklung peptidbasierter Inhibitoren gehen von amyloiden Kernsequenzen der jeweiligen Proteine aus, da sie dafür bekannt sind, an sich selbst zu binden. Peptidbasierte Inhibitoren binden meist an das amyloidogene Peptidrückgrat in β-Faltblattkonformation. Einmal gebunden, blockieren diese Inhibitoren das Fibrillenwachstum durch sterische Effekte, elektrostatische Abstoßung oder durch das Unterbinden der Ausbildung von Wasserstoffbrückenbindungen. Doch diese Strategie kann möglicherweise die Menge an präfibrillären Oligomeren erhöhen, welche als wesentliche toxische Spezies des Amyloidbildungsprozesses diskutiert werden. Daher sind alternative Ansätze notwendig. Der Übergang vom löslichen Monomer in β-Faltblatt-reiche Spezies ist hierbei der entscheidende Schritt. Einige natürliche amyloidogene Peptidsequenzen bergen ebenfalls Elemente einer α-Helix oder bilden während des Aggregationsprozesses helikale Intermediate. Die Stabilisierung der helikalen Konformation zur Vermeidung des entscheidenden Schritts ist daher ein viel versprechender Ansatz in der Inhibition. Im Rahmen dieser Arbeit werden Studien beschrieben, die das Potential dieser Strategie anhand von Modellpeptiden demonstrieren. Der Ansatz beruht auf helikalen peptidischen Inhibitoren, die designt worden sind, die amyloidogenen Modellpeptide in einem helikalen Komplex zu stabilisieren und auf diese Weise den Übergang zur β-Faltblattkonformation und daraus folgend die Bildung von amyloiden Fibrillen zu inhibieren. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass helikale peptidische Inhibitoren in der Lage sind, bereits gebildet amyloide Fibrillen wieder aufzulösen., The formation of amyloid aggregates is responsible for a wide range of diseases, for example Alzheimer’s disease. Although the amyloid forming proteins have natively different structures and different sequences, all undergo a structural change to form amyloid aggregates that have a characteristic cross-β-structure. The mechanism is a multistep process in which unstable prefibrillar oligomers assemble via fibrillar intermediates into amyloid fibrils. The mechanistic details of this process are poorly understood and different strategies to develop inhibitors of amyloid formation are followed to date. In most cases, chemically diverse compounds bind to an elongated form of the protein in a β-strand conformation and thereby exert their therapeutic effect. The screening of libraries of small molecules and the rational design leads in most cases to inhibitors that bind to aggregated species and prevent further polymerization by blocking the addition of peptide monomers. Numerous studies in the development of peptide based amyloid aggregation inhibitors have taken the core sequence of the target peptide as a lead as it is already known to bind to itself. The peptide based inhibitors were designed to bind to the peptide backbone in β-sheet conformation. They block further elongation by steric effects, electrostatic repulsion, or inhibition of the formation of hydrogen- bonds. However, blocking fibril formation with this strategy could increase the amount of prefibrillar oligomeric forms, which are thought to be the toxic species in the amyloid formation process. Therefore, alternative approaches are necessary. The conversion from the soluble monomeric form into β-sheet rich aggregated morphologies appears to be the key event. Several naturally occurring amyloidogenic peptides that form β- sheet rich fibrils harbor also an α-helix in the primary structure or appear to form helical intermediates during amyloid formation under certain conditions. Therefore, one promising approach is the stabilization of the helical conformation to prevent the key-event, the conversion to β-sheet and the formation amyloids. This thesis presents the investigation of the potential of this approach using model peptides. The approach consists of a helical inhibitor peptides which are designed to engage amyloid forming model peptides in a stable helical arrangement, thus to prevent rearrangement into a β-sheet conformation and the subsequent formation of amyloid-like fibrils. Moreover, the helix forming peptide is able to disassemble mature amyloid-like fibrils.

Ebola virus and Marburg virus make up the family Filoviridae. Due to their singlestranded RNA genome in negative orientation, they belong to the order Mononegavirales. Filoviruses cause a severe hemorragic fever in humans and non-human primates with fatality rates up to 90%. Because of the severe illness, and the fact that there is no specific treatment or vaccination, they are classified as BSL-4 pathogen. The Nucleocapsid is built by the non-segmented RNA-genome, the nucleoprotein NP, the viral polymerase L, the polymerase-cofactor VP35 and VP30. Subject of this study is a coiled coil domain within NP and its influence on various functions of NP. First the role of the coiled coil domain in the interaction of NP with VP30 and VP35 was investigated by immunofluorescence analysis. NP-mutants without coiled coil 3D-structure or without coiled coil domain were still able to interact with VP35, but not with VP30. This could be due to two binding domains on NP for VP35. Binding of VP30 to NP is either mediated directly by the coiled coil or requires a 3D confirmation determined by the NP coiled coil. Furthermore, this study is focussing on the influence of the coiled coil domain on NPNP interaction and self assembly of NP. By immunofluorescence analysis it could be proofed that the formation of NP inclusion bodies (inclusions) depends on a functional coiled coil. Knock-out mutants could still be recruited to inclusions build by NPwt, suggesting that the loss of the coiled coil domain only causes a partly loss of the ability for self-interaction. With an complementation assay it could be shown that the coiled coil domain is sufficient to mediate NP-NP interactions. NP forms helices that are supposed to be the framework of the nucleocapsids. Analysis of NP-helices by electron microscopy suggested that the ability to form helices also depends on an intact coiled coil domain or the presence of NPwt. NP mutants alone were not able to assemble to helices. Oligomerization mediated by the coiled coil domain or an interaction with RNA influenced by this domain could be reasons for these findings. The last part of the study is dedicated to the influence of the NP coiled coil domain on viral transcription. In an iVLP assay a dominant negative effect of NP with deleted or mutated coiled coil domain could be observed. This in probably due to a defect of NP with deleted or mutated coiled coil in encapsidation the virus sepecific minigenome that serves as template for the viral polymerase complex which is also indicated by the altered NP helices formation., Das Ebolavirus (EBOV) bildet mit dem Marburgvirus die Familie der Filoviren, die aufgrund ihres einzelsträngigen, negativ orientierten RNA-Genoms der Ordnung der Mononegavirales zugeteilt werden. Filoviren verursachen beim Menschen und bei nicht-menschlichen Primaten ein schweres hämorrhagisches Fieber mit einer Mortalitätsrate bis zu 90%. Deshalb und weil es bisher keine spezifische Therapie und keine Impfung gibt, werden Filoviren als Pathogene der Sicherheitsstufe 4 eingestuft. Der Nukleokapsidkomplex des EBOV besteht aus dem nicht-segmentierten RNAGenom sowie dem Nukleokapsidprotein NP, der viralen Polymerase L, dem Polymerase-Ko-Faktor VP35 sowie VP30 besteht. Gegenstand dieser Arbeit ist eine Coiled-Coil-Domäne innerhalb des NP, deren Einfluss auf verschiedene Funktionen des NP untersucht werden sollte. Hierfür wurde die Rolle der Coiled-Coil bei der Interaktion mit VP30 und VP35 analysiert. NPMutanten, die entweder keine Coiled-Coil-3D-Struktur oder gar keine Coiled-Coil mehr aufwiesen, konnten hier zwar noch mit VP35, aber nicht mehr mit VP30 interagieren. Die Gründe hierfür sind vermutlich, dass VP35 mehrere Bindungsstellen besitzt und VP30 entweder im Bereich der Coiled-Coilbindet oder die durch die Coiled-Coil vermittelte Konformation des NP benötigt. Weiterhin befasst sich diese Arbeit mit der Rolle der Coiled-Coil-Domäne bei der NPNP- Interaktion und dem self assembly. Immunfluoreszenzanalysen ergaben, dass die Bildung von NP-Einschlusskörpern, so genannter inclusions, von der Coiled-Coil- Domäne abhängt. Coiled-Coil-defiziente Mutanten können aber noch durch NPwt in inclusions rekrutiert werden, die Fähigkeit zur Selbstinteraktion ist also nur eingeschränkt. Mittels eines Complementation Assays konnte gezeigt werden, dass die Coiled-Coil-Domäne allein ausreichend für eine NP-NP Bindung sein kann. Immunelektronenmikroskopischen Analysen konnten zudem zeigen, dass die Bildung von NP-Helices, welche das Gerüst der Nukleokapside darstellen, ebenfalls nur bei intakter Coiled-Coil-Domäne oder in Gegenwart von NPwt möglich ist. Eine Rolle könnte hierbei entweder eine durch die Coiled-Coil-Domäne vermittelte Oligomerisierung des NP oder RNA-Interaktion spielen, welche zur Bildung von Helices wichtig ist. Im letzten Teil der Arbeit wurde der Einfluss Coiled-Coil-Domäne auf die virale Transkription untersucht. Hierbei zeigte sich im iVLP-Assay, dass eine nicht intakte Coiled-Coil einen dominant negativen Effekt auf die Transkription hat. Dies ist vermutlich dadurch bedingt, dass ohne intakte Coiled-Coil keine NP-Helices gebildet werden können und so auch keine regulären Nukleokapside, welche für die Polymerase als Matrize zur Transkription und Replikation dienen.

Die alpha-helikale coiled coil-Struktur ist eines der am häufigsten in der Natur vorkommenden Faltungsmotive, dass an einer Vielzahl von wichtigen Prozessen wie der viralen Membranfusion, der DNA Reparatur, der Muskelkontraktion und der Transkription beteiligt ist. De novo entworfene coiled coil-Peptide eignen sich aufgrund ihrer amphiphilen Natur und der bekannten Designprinzipien hervorragend als Modellsysteme für größere und komplexere biologisch relevante Proteine. Im Rahmen dieser Arbeit wurden de novo entwickelte coiled coil-Peptide verwendet, um verschiedene Aspekte der Proteinfaltung zu untersuchen. In Teil 1 wurde die kontextabhängige Bedeutung von Wasserstoffbrückenbindungen im Peptidrückgrat auf die Strukturbildung und Stabilität von Proteinen untersucht. Hierfür wurden Amidbindungen durch Esterbindungen ersetzt, um systematisch einzelne Wasserstoffbrücken zu eliminieren. Die thermodynamische Analyse der Depsipeptide, sowie die Moleküldynamik-Simulationen, zeigten, dass der Einfluss der Wasserstoffbrücken auf die Stabilität der Quartärstruktur in großem Maße von der Polarität der jeweiligen Umgebung abhängt. Im hydrophoben Milieu der Proteinumgebung sind die Wasserstoffbrücken wesentlich stärker als in solvatisierten Regionen des Proteinrückgrates. In Teil 2 wurde der Einfluss der multiplen O-Glykosylierung auf die Faltung und Stabilität der coiled coil-Struktur untersucht. Hierfür wurden in eine 26 Aminosäuren lange Peptidsequenz systematisch ein bis sechs β-D-Galactosereste über die Serinseitenketten in den Positionen b, c und f des Heptads eingeführt. Aufgrund der geometrischen Vorgabe des Heptad- Wiederholungsmusters können die Liganden in einem definierten Abstand zueinander präsentiert werden. Die Studie zeigte, dass die O-Glykosylierung mit β-D-Galactose ohne signifikante Stabilitätsverluste toleriert wird und das coiled coil-Faltungsmotiv daher großes Potential als multivalente Gerüststruktur hat. Um weite Rezeptorabstände zu überbrücken und die Valenz des coiled coil-basierten Gerüstes zu erhöhen, wurde ein fasernbildendes coiled coil-System entwickelt. Dieses besitzt eine einheitliche, aus Lysinresten bestehende elektrostatische Wechselwirkungsdomäne, die ein Überlappen der Helices ermöglicht. Anhand von coiled coil-basierten Modellpeptiden wurde in Teil 3 der Einfluss der O-Glykosylierung auf die Amyloidaggregation studiert. Hierfür wurden ein bis drei β-D-Galactosereste in verschiedene Positionen der Sequenz eingeführt. Die mehrfache Glykosylierung konnte die Amyloidbildung inhibieren, wohingegen die einfache Glykosylierung positionsabhängig nur zu einer Verzögerung der Amyloidbildung führte., The alpha-helical coiled coil folding motif is one of the most common in nature, and is involved in many important biological processes including virus-host cell membrane fusion, DNA repair, muscle contraction, and transcription. De novo designed peptides that form coiled coils are suitable model systems for larger and more complex biologically relevant proteins because of their amphiphilic nature and well-known design principles. In this thesis, de novo designed coiled coil-forming peptides were used to investigate several aspects of protein folding. Part 1 describes the context-dependent relevance of backbone hydrogen bonds in protein folding and stability. For this purpose, amide bonds were replaced with ester bonds to systematically eliminate specific hydrogen bonds. Thermodynamic analysis and molecular dynamics simulations showed that the contribution of main chain hydrogen bonds to quaternary structure stability largely depends on the environment. In accordance with small molecule studies in solution, main chain hydrogen bonds are significantly stronger in the interior of the hydrophobic interface than they are in the solvent exposed aqueous regions of the coiled coil. The influence of multiple O-glycosylation on the folding and stability of coiled coils was the focus of part 2 of this thesis. One to six β-D-galactose residues were introduced as monosaccharides into a 26 amino acid peptide sequence via the serine side chains in positions b, c, and f of the heptad. The carbohydrate ligands are presented in a defined relative distance due to the geometric constrains of the heptad repeat. The study showed that O-glycosylation with β-D-galactose is well-tolerated and does not result in significant destabilization. Therefore, the coiled coil folding motif shows potential as a multivalent scaffold. Furthermore, to bridge long receptor distances and to extend the valence of the coiled coil-based scaffold, a fiber-forming coiled coil system was developed. In this system, the electrostatic recognition domain is composed exclusively of lysine residues, which enhances overlap between the helices. Part 3 describes the use of coiled coil-based model peptides to investigate the influence of O-glycosylation on amyloid formation. One to three β-D-galactose residues were introduced at different sites in the peptide sequence. Multiple glycosylation results in complete inhibition of amyloid formation. Interestingly, single glycosylation slows down the aggregation process in a manner that depends on the position in the peptide sequence.

Fluorierte Aminosäuren stellen wertvolle Bausteine für die Konstruktion neuartiger Peptid- und Proteinstrukturen dar. Die einzigartigen Eigenschaften des Fluoratoms sowie das Fehlen dieses Elements im Pool der kanonischen Aminosäuren erlauben eine Vielzahl interessanter Anwendungen dieser Moleküle. Die häufig beobachtete Erhöhung der Proteasestabilität von Peptiden infolge des Einbaus fluorierter Aminosäuren sowie die höhere Hydrophobie und der damit verbundene Anstieg der Membranpermeabilität machen diese Verbindungen zu attraktiven Bausteinen für die Entwicklung pharmazeutischer Wirkstoffe. Allerdings sind die Möglichkeiten des gezielten Einsatzes fluorierter Aminosäuren für das Design peptidbasierter Wirkstoffe aufgrund der nach wie vor lückenhaften Kenntnisse bezüglich ihrer biologischen Eigenschaften stark eingeschränkt. Besonders die Wechselwirkungsmöglichkeiten mit natürlichen Aminosäuren in einer nativen Proteinumgebung sind bisher nur wenig untersucht. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein paralleles coiled coil-Heterodimer entworfen, welches die Untersuchung des Wechselwirkungsverhaltens fluorierter Aminosäuren innerhalb einer natürlichen Proteinumgebung erlaubt. Ausgehend von diesem Peptidmodell wurde ein Phage Display-basiertes Screeningsystem entwickelt, um die bevorzugten Wechsel-wirkungspartner fluorierter Aminosäuren zu bestimmen und detaillierte Informationen über die Interaktionsmöglichkeiten dieser Reste zu erhalten. Hierfür wurden die zu untersuchenden nicht- natürlichen Aminosäuren in einen Peptidstrang (Screeningpeptid) des Modellsystems eingebaut, während im gegenüberliegenden Peptidstrang (Bibliothekspeptid) die direkt mit der substituierten Aminosäure wechselwirkenden Aminosäurepositionen randomisiert wurden. Nachdem die Bindung zwischen dem Screeningpeptid und dem auf der Phagenoberfläche präsentierten Bibliothekspeptid gezeigt werden konnte, wurden auf Grundlage der coiled coil- Wechselwirkung aus der Bibliothek die besten Bindungspartner für das Screeningpeptid isoliert. Das entwickelte Verfahren wurde an verschiedenen kanonischen Aminosäuren erfolgreich getestet und schließlich für die Bestimmung bevorzugter Wechselwirkungspartner fluorierter Aminosäuren angewendet. Untersucht wurden dabei die bereits zuvor in der Arbeitsgruppe von Prof. Koksch verwendeten Aminosäuren Difluorethylglycin, Difluorpropylglycin und Trifluorethylglycin. Obwohl diese Aminosäuren deutliche Unterschiede in Raumanspruch und Polarität aufweisen, konnte gezeigt werden, dass diese in den untersuchten Substitutionspositionen die gleichen Wechselwirkungspartner bevorzugen wie die natürlichen hydrophoben Aminosäuren Leucin bzw. Valin., Fluorinated amino acids represent useful building blocks for the construction of novel peptide and protein structures. The unique properties of fluorine and its absence from the pool of canonical amino acids offer a wide range of applications. Due to the observation that fluorinated amino acids often enhance the proteolytic stability as well as the hydrophobicity and membrane permeability of peptides, these building blocks are interesting tools for drug design. However, the directed application of fluorinated amino acids in the development of peptide based drugs is limited by the narrow knowledge of the biological properties of fluorinated building blocks. Particularly, the interactions with natural amino acids within a native protein environment are poorly investigated. In this thesis a parallel coiled coil heterodimer was designed, which enables the investigation of the interaction properties of fluorinated amino acids within a native protein environment. Based on this model a phage display based screening system was developed to determine preferred interaction partners of fluorinated amino acids and to achieve detailed information of possible interactions of these residues. Accordingly, the non canonic amino acids were incorporated at a central a- or d-position of one of both peptide strands (screening peptide) while in the opposite peptide (library peptide) the positions which directly interact with the substituted amino acids were randomized. Binding between screening peptide and the library peptide displayed on the surface of bacteriaphage M13 was shown and a peptide library of sufficient size was constructed. Based on the coiled coil interaction the best binding partners for the screening peptide were selected out of the pool of potential interaction partners. First, the selection strategy was tested and optimized using the unsubstituted screening peptide. The sensitivity of the selection procedure was successfully tested using different canonical amino acids and the procedure was applied to the selection of preferred interaction partners of fluorinated amino acids. Thereby, difluoroethylglycine, difluoropropylglycine and trifluorglycine, which were used in the group of Professor Koksch before, were investigated. However, even though significant differences in steric demand and polarity were shown for these amino acids before, no differences regarding preferred interaction partners were observed. Incorporated within the hydrophobic core of a α-helical coiled coil, the fluorinated amino acids investigated in this thesis prefere the same binding partners as native hydrophobic amino acids such as leucine and valine which naturally occur in these positions.

Mit DMIF1 wurde erstmals in Dictyostelium ein zur Familie der mitochondrialen F1F0-ATPase-Inhibitoren zählendes Homolog gefunden. Diese verhindern die letale ATP-Verarmung durch Hemmung der ATP-Hydrolyse, der Umkehrreaktion der ATP-Synthase, die bei Zusammenbruch des Membranpotentials abläuft. Das helicale, hochgeladene DMIF1-Monomer hat eine N-terminale Targeting-Domäne, die den Transfer des im Zytoplasma gebildeten Precursors in die Mitochondrien bewirkt, wo das reife Protein durch Abspalten der Domäne nach einem modifizierten R-2-Motiv durch die Protease MPP entsteht. Sterische Störung der Targeting-Domäne durch die Fusion an GFP führt zum Transfer in die pericentrosomale Region, wo das ungefaltete Protein in Aggresomen degradiert wird. Die C-terminale Coiled coil-Domäne dient potentiell der Assemblierung zum inhibitorisch aktiven Dimer, helicale Bereiche der inhibitorischen Region zur Bildung des inaktiven Tetramers. Gemäß Restriktions- und Sequenzanalyse-Daten ist ein bisher nicht charakterisiertes homologes Protein DMIF2 wahrscheinlich. The DMIF1 protein found in Dictyostelium is homologous to members of the F1F0-ATPase inhibitory protein family. Those inhibitors protect cells from uncontrolled ATP hydrolysis and thus from letal ATP deprivation. Activation of the hydrolysis pathway, the reversed function of F1F0, is caused by membrane potential breakdown. The helical, highly charged DMIF1 protein monomer contains an N-terminal targeting domain to transfer the precursor, synthesized in the cytoplasm, to mitochondria. In the matrix the targeting domain is cleaved off by a mitochondrial protease MPP following an R-2 processing motif. Sterical blocking of the targeting domain by the reporter protein GFP fused to DMIF1 N-terminus targets the protein to aggresomes in the pericentrosomal region, where the unfolded protein is degradated. The inhibitory active homodimer is built by mutual interaction of the C-terminal Coiled-coil domain, whereas a helical part of the inhibitory do-main serves as an interaction region to assemble the inactive homotetramer. According first data from re-striction enzyme digestion experiments and DNA sequence analysis a putative inhibitory protein DMIF2, homologous to DMIF1, is presumed.

Den Schwerpunkt dieser Arbeit bildet die Messung von Biegesteifigkeiten an Mikrotubuli unter standardisierten Bedingungen mit Hilfe einer optischen Falle. Dabei wurde sowohl die Wirkung des Nukleotides AMP-PNP nach erfolgter Polymerisation mit GTP, als auch der Einfluß von Konstrukten des Motormoleküles Kinesin aus dem Organismus Neurospora crassa als Bindepartner, untersucht. Für eine dichte Belegung (Dekoration) des Mikrotubulus mit Kinesinkonstrukten wurden diese mit AMP-PNP in rigor gebunden. Dabei kamen drei verschiedene Konstrukte zum Einsatz. Neben dem dimeren Vollängen-Protein ein stark verkürztes Konstrukt, das nur noch aus der katalytischen Domäne besteht und daher monomer ist, sowie ein Konstrukt, das das Scharnier enthält und daher dimerisiert. Durch AMP-PNP wurde die Biegesteifigkeit mehr als verdoppelt (von 2,3 * 10-24 Nm2 auf 6,1 * 10-24 Nm2). Im Vergleich der Biegesteifigkeiten zwischen der Referenz (AMP-PNP) und gebundenem Konstrukt läßt sich kein statistisch relevanter Unterschied feststellen. Im Vergleich der Konstrukte untereinander sind jedoch deutliche Unterschiede der Wirkung auf die Mikrotubuli zu sehen. So weist das verkürzte dimere Konstrukt eine Tendenz auf, die Biegesteifigkeit zu reduzieren (4,2 * 10-24 Nm2), während sowohl die Bindung des monomeren Konstruktes (9,2 * 10-24 Nm2) als auch das Vollängen-Konstrukt (11,6 * 10-24 Nm2) die Mikrotubuli tendenziell steifer macht. Neben diesen Messungen wurden Strukturuntersuchungen am Schwanzbereich des Kinesin durchgeführt. Dabei bestand die Zielsetzung darin, die Stabilität und Lage von superhelikalen Sequenzabschnitten zu bestimmen. Als Instrument hierzu wurde ein Kraftspektrometer verwendet. Eigens für diese Untersuchungen wurden Titin-Kinesin-Chimären kloniert. Die Titin-Domänen wurden wegen ihrer leichten Identifizierbarkeit in Meßkurven gewählt. Zudem sind sie kraftspektroskopisch gut erforscht. Eine räumlich aufgelöste Messung der Stabilität von superhelikalen Strukturen war wegen eines starken Haftens des Kinesinschwanzes auf der Unterlage nicht möglich. Es konnte jedoch eine Obergrenze für die Stabilität der superhelikalen Strukturen von 15 pN bestimmt werden. Des weiteren konnte ein nicht näher charakterisiertes, aus wenigen Aminosäuren bestehendes, Strukturelement identifiziert werden, das bei einer Kraft von etwa 30 pN aufbricht. The main focus of the thesis is set on the measurement of bending stiffnesses of microtubuli with an optical trap under standardized conditions. The effect of the presence of the nucleotide AMP-PNP after polymerization with GTP was as well examined as different constructs of the motor molecule kinesin of the organism Neurospora crassa as a binding partner. In order to get a dense occupation (decoration) of the microtubulus the constructs were bound in rigor by the nucleotide AMP-PNP. Three different constructs were used. Besides the dimeric complete protein a monomeric construct solely consisting of the catalytic domain was used. The third construct consisted of the catalytic domain as well as a hinge domain and thus was dimeric. The presence of AMP-PNP lead to an more then two-fold increase in the rigidity from 2.3 * 10-24 Nm2 to 6.1 * 10-24 Nm2. In comparison to the rigidity of the reference (AMP-PNP) no statistically relevant difference is detectable with bound constructs. Comparison of the different constructs to one another shows clearly distinguishable differences in the effect on the microtubules. The truncated dimeric construct shows a tendency to weaken the bending stiffness (4.2 * 10-24 Nm2) while both the monomeric construct (9.2 * 10-24 Nm2) and the complete protein (11.6 * 10-24 Nm2) tend to increase the rigidity of microtubules. Additional to these measurements structural examinations of the kinesin tail were carried out. The target was to spot the stability and position of coiled-coil stretches in the sequence. The used method was atomic force spectrometry. Especially for these investigations chimaera of titin and kinesin were cloned. Titin domains were chosen because they were already well investigated with the force spectrometer and they are easy to identify in the measurements. Spacially resolved measurements of the stability of coiled-coil structures was not possible due to the strong adhesion of the kinesin tail to the surface. An upper limit of the stability of coiled-coil structures could be determined though and was fixed at 15 pN. Additionally a small and not further characterized structure consisting of only a few amino acids could be identified. It ruptures at a force of about 30 pN.

Insgesamt zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass für eine erfolgreiche Interaktion der KCNQ Untereinheiten der carboxyterminale Bereich der Kanäle verantwortlich ist. Sowohl die homomere, als auch die heteromere Assemblierung der KCNQ Kanäle wird dabei durch die beiden coiled coil Domänen im Bereich der si-Domäne vermittelt, wobei die zweite coiled coil Domäne einen verstärkten Einfluss auf die Heteromerisierung der KCNQ Kanäle ausübt. Untersuchungen zur Assemblierung des heteromeren KCNQ2/KCNQ3 Kanals ergaben eine verstärkte Oberflächenexpression, die eventuell in Zusammenhang mit einem gesteigerten Transport an die Zelloberfläche steht und daher möglicherweise durch die zweite coiled coil Domäne der KCNQ Kanäle vermittelt wird. In der Nähe der zweiten coiled coil Domäne von KCNQ5 befindet sich eine putative PKA abhängige Phosphorylierungsstelle, von der daher vermutet wurde, dass diese einen Einfluss auf die Assemblierung von KCNQ5 oder auf den heteromeren Kanal KCNQ3/KCNQ5 ausüben könnte. Jedoch konnte durch in vitro Experimente zur putativen PKA abhängigen Phosphorylierung von KCNQ5 keine selbige beobachtet werden. Elektrophysiologische Untersuchungen ergaben dagegen für den durch Punktmutation veränderten Kanal von KCNQ5 mit einem Glutamatrest an Stelle der putativen PKA Phosphorylierung einen verstärkten Strom, so dass möglicherweise andere Phosphorylierungen oder bisher unbekannte Modifikationen von KCNQ5 für den beobachteten Effekt verantwortlich sind. Darüber hinaus konnte für KCNQ3 ein zusätzlicher 65 Aminosäuren großer carboxyterminaler Bereich identifiziert werden, der ebenfalls für einen verstärkten Strom des im Rahmen dieser Arbeit untersuchten chimären Kanals mit dem Proteinrückgrat von KCNQ4 und dem C-Terminus von KCNQ3 verantwortlich ist. Die Ursache für diese verstärkten Ströme ist noch ungeklärt, basiert aber möglicherweise auf einer ebenfalls erhöhten Oberflächenexpression des chimären KCNQ3/KCNQ4 Kanals. Für zusätzliche in vivo Untersuchungen zur endogenen Stöchiometrie heteromerer KCNQ2/KCNQ3 Kanäle wurden spezifische Antikörper benötigt, die endogenes KCNQ2 und KCNQ3 erkennen. Die neu synthetisierten polyklonalen Antikörper gegen KCNQ2 und gegen KCNQ3 erkannten nur das in COS-7 Zellen überexprimierte Protein von KCNQ2 und KCNQ3. Für Membranpräparate aus dem Gehirn von Mäusen, sowie für die neuronale Zellkultur NG-10815 konnte dabei jedoch kein endogenes KCNQ2 oder KCNQ3 nachgewiesen werden. Untersuchungen an KCNQ1/KCNQ3 Chimären ergaben im Gegensatz zu den verstärkten Strömen der KCNQ3/KCNQ4 Chimären, dass die Porenregion von KCNQ3 vermutlich regulierend auf die in Xenopus Oozyten beobachteten Ströme wirkt. Hingegen bewirkt die Porenregion von KCNQ1 einen verstärkten Strom für injizierte Xenopus Oozyten. Chimären von KCNQ2, KCNQ4 und KCNQ5, bei denen die Pore gegen die Porenregion von KCNQ1 mit der bereits bekannten N-Glykosylierungsstelle ausgetauscht wurde, zeigten ebenfalls in elektrophysiologischen Experimenten deutlich verstärkte Ströme im Vergleich zu den unveränderten Kanälen von KCNQ2, KCNQ4 und KCNQ5. Obwohl eine N-Glykosylierung von KCNQ1 im Western Blot für transfizierte COS-7 Zellen nicht beobachtet wurde, könnte daher dennoch eine N-Glykosylierung von KCNQ1 für den stromverstärkenden Effekt der Porenregion von KCNQ1 verantwortlich sein. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass das Benzodiazepin R-L3 nicht nur stimulierend auf KCNQ1, sondern ebenfalls auf KCNQ5 wirkt. Jedoch scheint der heteromere Kanal von KCNQ5 und KCNQ3 nicht von R-L3 beeinflusst zu werden. Elektrophysiologische Untersuchungen für KCNQ2, KCNQ3 und KCNQ4, sowie des heteromeren Kanals von KCNQ2 und KCNQ3 ergaben keine signifikante Veränderung nach Behandlung mit R-L3. Zusammenfassend konnte in elektrophysiologischen und in pharmakologischen Untersuchungen zu spannungsabhängigen KCNQ Kanälen gezeigt werden, dass der carboxyterminale Bereich entscheidend für die erfolgreiche Assemblierung von KCNQ Kanälen ist und dass neben KCNQ1 die weitere Untereinheit KCNQ5 mit Hilfe von R-L3 stimuliert werden kann.

Der spannungsabhängige Kaliumkanal EAG1 besitzt eine carboxyterminale 40 Aminosäuren lange Domäne, die für die Assemblierung von vier alpha-Untereinheiten zu einem funktionellen Kanal verantwortlich ist. Die Zielsetzung dieser Arbeit war zunächst die Analyse der Sekundärstruktur dieser Assemblierungsdomäne, sowie die Identifikation weiterer Ionenkanäle, die im Carboxyterminus eine strukturelle Homologie zur Assemblierungsdomäne des EAG1- Ionenkanals zeigen. Darüber hinaus sollten Aussagen über die Bedeutung der Domäne für die Funktion des jeweiligen Ionenkanals getroffen werden. Computergestützte Analysen der Sekundärstruktur ergaben, dass strukturell konservierte homologe Domänen in den Familien der durch zyklische Nukleotide gesteuerten Kationenkanälen (CNG), in den spannungsabhängigen kaliumselektiven Kanälen (neben EAG, auch in ELK, ERG und KCNQ), in den calciumabhängigen Kaliumkanälen (SK, IK), in den nicht selektiven Kationenkanälen (PKD) und in den Calciumkanälen (TRP) zu finden sind. Diese Ionenkanäle zeigen in computergestützten Analysen Domänen, mit einer hohen Wahrscheinlichkeit zur Ausbildung einer Coiled-Coil Struktur im Caboxyterminus. Im zweiten Teil ging es darum, die berechnete Sekundärstruktur experimentell zu belegen. Dazu wurden die caboxyterminal gelegenen Proteinbereiche mit einer Möglichkeit zur Ausbildung eines Coiled-Coils exemplarisch von den Kanälen EAG1, EAG2 und ERG1 als Peptide synthetisiert und analysiert. Anhand von Gelfiltrationsexperimenten und Lichtstreuung wurde die Stöchiometrie der Peptid-Assemblierung als Tetramerisierung identifiziert. Mittels Zirkulardichroismus-Spektroskopie konnte ein hoher alpha-helikaler Strukturanteil und eine außerordentliche Stabilität gegenüber hitzedenaturierenden Bedingungen gezeigt werden. Aus diesen Daten kann, in Übereinstimmung mit computergestützten Analysen der Aminosäuresequenz, geschlossen werden, dass die Peptide zu tetrameren Coiled-Coils assemblieren. In Analogie kann diese Art der Zusammenlagerung ebenfalls für die alpha-Untereinheiten der Ionenkanäle angenommen werden, für die in computergestützten Analysen eine hohe Wahrscheinlichkeit zur Ausbildung eines Coiled-Coils berechnet werden konnte. Die dafür verantwortliche Domäne wurde als „Tetramerisierende Coiled-Coil“ (TCC) Domäne benannt und kann als generelles Strukturmotiv angenommen werden. Im dritten Teil wurde ein auf Oberflächen-Plasmonresonanz basierender Proteininteraktionstest entwickelt, der es ermöglicht, die Kinetik der Tetramerisierung in Echtzeit zu verfolgen. Für die Peptide, deren Aminosäuresequenz der TCC-Domäne eines funktionellen Ionenkanals entsprach, konnte eine Ausbildung homomerer Komplexe gezeigt werden. Eine stabile heterologe Interaktion konnte nur zwischen den aus einer Proteinunterfamilie stammenden Domänen EAG1 und EAG2 gemessen werden. Dagegen interagierten diese Peptide nicht mit der Interaktionsdomäne aus ERG1. Die TCC-Domäne ist demnach in der Lage, die Spezifität der Bindung zu bestimmen. Aufbauend auf den Ergebnissen der Sekundärstrukturanalyse stand nun die Bedeutung der TCC-Domäne für die Funktionalität des jeweiligen Ionenkanals im Zentrum dieser Arbeit. In weiteren Experimenten konnte gezeigt werden, dass der Austausch einer hydrophoben Aminosäure gegen eine polare Aminosäure innerhalb des Coiled-Coils drastische Auswirkungen auf die Funktion dieser ca. 40 Aminosäuren langen Domäne hatte. Diese Peptide lagen nur noch zu einem geringen Anteil als Tetramere vor und wiesen eine deutlich geringere Stabilität gegenüber hitzedenaturierenden Bedingungen auf. Im Proteininteraktionsassay äußerte sich der Einfluss des Austausches in einer rascheren Assoziations- und Dissoziationsphase im Vergleich zu den tetrameren Coiled-Coil Peptiden. In vivo durchgeführte elektrophysiologische Messungen an Ionenkanalkonstrukten bestätigten die physiologische Relevanz der TCC-Domäne. Die Abwesenheit dieser Domäne in HERG1 führte zu einem Verlust der Funktion des Ionenkanals. Diese konnte jedoch durch Klonierung der entsprechenden TCC-Domäne des EAG1-Ionenkanals in den HERG1-Ionenkanal wieder hergestellt werden. Das Ionenkanalkonstrukt, bestehend aus dem HERG1-Kanal mit der TCC-EAG1 Domäne konnte, im Gegensatz zu dem HERG1 Wildtyp, funktionelle Heteromultimere mit EAG1 alpha- Untereinheiten bilden, so dass ein Ionenkanal mit veränderten Eigenschaften elektrophysiologisch beschrieben werden konnte. Die Relevanz der TCC-Domäne für die Funktionalität des Ionenkanals wird auch durch natürlich vorkommende Mutationen belegt. Diese beeinflussen die Struktur und damit die Funktion der TCC-Domäne. In Datenbanken des humanen Genoms konnten 38 Mutationen in sieben verschiedenen Genen identifiziert werden, die die Struktur der Coiled-Coil Domäne der resultierenden Ionenkanäle beeinflussen. Diese Mutationen äußern sich in zahlreichen phänotypischen Krankheitsbildern.

Die Proteine der TRP-Familie bilden Kationenkanäle, die an verschiedenen sensorischen und zellbiologischen Prozessen beteiligt sind. Strukturell zeigen sie eine Ähnlichkeit zu den Kaliumkanälen, die eine tetramere Struktur aufweisen. Man nimmt deshalb an, dass sich jeweils vier monomere TRP-Proteine zu einem funktionellen tetrameren Ionenkanal zusammenlagern. Ein tetramerer Aufbau war zu Beginn dieser Arbeit nur für TRPV1 angedeutet worden. Durch welche Interaktionsdomänen eine Multimerisierung vermittelt wird, und ob es phylogenetisch konservierte Signale und Mechanismen dafür gibt, war unbekannt. Da sich aber verschiedene Mitglieder der TRP-Familie hinsichtlich ihrer zytoplasmatischen Proteinmotive stark unterscheiden, liegt die Vermutung nahe, dass ihre Tetramerisierungssignale unterschiedlich sind. In dieser Arbeit wurden Homomultimerisierungsdomänen der beiden Proteine TRPV6 und TRPM8 identifiziert und untersucht und es wurde gezeigt, dass beide Proteine Tetramere bilden können. TRPV6 ist vermutlich an der intestinalen und transplazentalen Resorption von Kalzium beteiligt, TRPM8 spielt wahrscheinlich eine Rolle bei der Kälteperzeption durch das somatosensorische System. Beide Kanäle zeigen außerdem eine verstärkte Expression in malignen Formen des Prostatakarzinoms, und zumindest für TRPV6 scheint die verstärkte Kanalexpression mit einer verstärkten Proliferation zu korrelieren. Das Verständnis der jeweiligen Strukturen und Signale, die den funktionellen Kanal-Zusammenbau vermitteln, würde nicht nur erlauben das Zusammenlagern der TRP-Proteine zu Kanälen zu verstehen, sondern könnte zukünftig auch eine Bedeutung für die Entwicklung neuer Pharmaka haben. Zur Identifizierung und Analyse der Proteindomänen wurden verschiedene Methoden eingesetzt: Die mit dem Hefe-Zwei-Hybrid-System verwandten Systeme Bacteriomatch® und Bacteriomatch®II wurden etabliert, weiterentwickelt und zur Analyse von homo- und heterotypischen Proteininteraktionen angewendet. Außerdem wurden markierte Ionenkanal-Fusionsproteine mit TRPV6 bzw. TRPM8 ko-immunpräzipitiert. Identifizierte Proteindomänen wurden anschließend gezielt mutiert und die mutierten Proteine auf ihre Fähigkeit untersucht, Proteinkomplexe und funktionelle Ionenkanäle zu bilden. Weiter wurden in dieser Arbeit Heteromultimerisierungen von TRPV6 mit anderen Mitgliedern der TRPV-Unterfamilie untersucht. In verschiedenen Experimenten konnte TRPV6 nicht mit TRPV2, TRPV3 und TRPV4 ko-immunpräzipitiert werden. Mit TRPV1 wurde dagegen eine schwache Interaktion beobachtet; TRPV5 wurde in dieser Arbeit nicht untersucht. Ein weiterer Schwerpunkt der Arbeit war die Suche nach unbekannten Interaktionspartnern von TRPV6. Da zu Beginn dieser Arbeit außer Calmodulin keine mit TRPV6 interagierenden Proteine bekannt waren, sollten neue Proteine, die mit dem TRPV6-Carboxyterminus interagieren, mit einem Bakterien-Zwei-Hybrid-System identifiziert werden. Zu diesem Zweck wurde zuerst eine cDNS-Bibliothek aus humaner Plazenta hergestellt und mit dem Bacteriomatch®-System durchsucht; danach wurde eine cDNS-Bibliothek aus humanem Pankreas von Mensch mit dem Bacteriomatch®II-System durchsucht. Mit beiden Bibliotheken konnten jedoch keine spezifisch interagierenden Proteine gefunden werden. Proteins of the TRP family form cation channels involved in many different sensory and cellular processes. Regarding their structure, they display some similarities to voltage gated potassium channels, which exhibit a tetrameric structure. It is thus assumed that four monomeric TRP proteins assemble to form a functional tetrameric ion channel. At the beginning of this work, a tetrameric structure was postulated only for TRPV1. It was unknown which interaction domains mediate a multimerisation and whether there are conserved signals and mechanisms for TRP channel assembly. The fact that cytoplasmatic protein motifs differ especially between members of different TRP family subgroups leads to the assumption that their tetramerisation signals are different. In the framework of this thesis, homomultimerisation domains of the two TRP proteins TRPV6 and TRPM8 were identified and it was shown that both proteins can form tetramers. TRPV6 is most likely involved in intestinal and placental absorption of calcium, TRPM8 presumably plays a role in cold perception via the somatosensoric system. Both ion channels are overexpressed in malignant forms of prostata cancer, and at least in case of TRPV6, expression of TRPV6 transcripts seems to correlate with enhanced proliferation. Knowledge of structures and signals responsible for the assembly of functional channels would not only permit the understanding of the formation of TRP ion channels, but could also be of interest for the development of new pharmaceuticals. Several methods were used to identify and analyse interacting protein domains: the two systems Bacteriomatch® and Bacteriomatch®II, which are conceptually similar to yeast two hybrid systems were established, refined and applied to analyse homo- and heterotypical protein interactions. Furthermore, tagged ion channel fusion proteins were co-immunoprecipitated with TRPV6 and TRPM8 respectively. After identification, protein interaction domains were mutated by directed point mutagenesis and tested for their ability to form protein complexes and functional ion channels. Moreover, heteromultimerisations of TRPV6 with other members of the TRPV-subfamily were investigated in the course of this thesis. In repeated experiments, TRPV6 could not be co-precipitated with TRPV2, TRPV3 and TRPV4, whereas there was a weak interaction with TRPV1; TRPV5 was not tested. Another aim of this thesis was the identification of unknown proteins interacting with TRPV6. Since there were no known proteins interacting with TRPV6 other than calmodulin when this thesis was started, a screen for new interaction partners with the carboxyterminal region of TRPV6 was performed using a bacterial two hybrid system. For this purpose, a cDNA library was synthesized from human placenta and screened by using the Bacteriomatch®-System; moreover, a cDNA library from human pancreas was screened by using Bacteriomatch®II-System. However, no real interacting partners for TRPV6 could be identified in either screen.

Das Synaptonemalkomplexprotein SYCP1 ist eine Strukturkomponente des Synaptonemalkomplexes (SC) von Saeugern, einer meiosespezifischen Struktur, die wesentlich fuer die Synapse, Rekombination und Segregation homologer Chromosomen ist. Der SC besteht aus zwei lateralen Elementen (LEs) und einer zentralen Region (CR), in deren Mitte das zentrale Element (CE) liegt. Dabei sind die LEs den Achsen der homologen Chromosomen aufgelagert und werden in der CR durch Transversalfilamente (TFs) mit dem CE verbunden. Im Protein SYCP1 (125 kDa) flankieren zwei nicht-helikale terminale Domaenen eine ausgedehnte zentrale „Coiled-Coil“-Domaene. Fuer diese Domaene wird angenommen, dass sie die die Kluft zwischen LEs und CE ueberbrueckt, wobei die C-Termini in den LEs verankert sind und die N-Termini im CE lokalisiert wurden. Um die molekulare Architektur des SC besser zu verstehen und die Bedeutung von SYCP1 für die Zusammenlagerung des SC aufzudecken, wurden die Polymerisationseigenschaften von SYCP1 erforscht. Dazu wurde das Protein in somatischen Zellen exprimiert. In diesem experimentellem Ansatz polymerisierte SYCP1 autonom zu filamentoesen Strukturen, welche sich auf ultrastruktureller Ebene als alternierende elektronendichte Balken offenbarten, die ueber TFs verbunden waren. Dieser Aufbau glich parallel aneinander gereihten Stapeln von SCs, so genannten Polykomplexen (PCs). Die Analyse der Orientierung der SYCP1 Molekuele innerhalb der PCs erwies, dass diese hochorganisiert vorliegen und die Organisation von SYCP1 innerhalb von PCs und SCs identisch ist. Folglich kann sich SYCP1 sogar in Abwesenheit anderer SC-Proteine zu Strukturen zusammenlagern, die der CR entsprechen und muss dementsprechend beim Aufbau der CR des SC den grundlegenden Faktor darstellen. Für eine genauere Analyse wurden ausgewaehlte Mutanten von SYCP1 exprimiert. Moleküle mit modifizierter Laenge der zentralen alpha-helikalen Domaene resultierten in der Bildung von PCs mit veränderter Weite der CR. Dies beweist, dass die „Coiled-Coil“-Domaene den Abstand der CR eines PC bestimmt und impliziert dieselbe Funktion in der SC-Bildung. Darueber hinaus wurde gezeigt, dass SYCP1 Molekuele mit Deletion des nicht-helikalen N-Terminus immer noch in der Lage sind, PCs zu bilden, diese Eigenschaft aber stark eingeschraenkt ist. Das bezeugt die Bedeutung des N-Terminus sowohl in der PC-Bildung als auch im Aufbau des CE von SCs, weist aber dabei auch dem vorderen Teil der „Coiled-Coil“-Domaene eine wichtige Rolle zu. Im Gegensatz dazu war bei Mutanten mit Deletion des nicht-helikalen C-Terminus die PC-Bildung vollstaendig blockiert, was auf eine große Bedeutung dieser Domaene fuer die Polymerisation hinweist. Ein weiterer Hauptgegenstand der Arbeit war die Charakterisierung von Bindungspartnern von SYCP1. Über Immungoldlokalisation auf Maushoden konnten die Proteine Syce1 und Cesc1 als erste ausschliessliche Komponenten des CE des SC bestimmt werden. Zusaetzlich wurde die Interaktion dieser Proteine mit dem N-Terminus von SYCP1 verifiziert. SYCP1 bildet also die Grundstruktur des CE aus und rekrutiert Syce1 und Cesc1., The synaptonemal complex protein 1 (SYCP1) is a structural component of the mammalian synaptonemal complex (SC), a meiosis-specific nuclear structure essential for synapsis, recombination and segregation of homologous chromosomes. The SC is a tripartite structure consisting of two lateral elements (LEs) and the central region (CR) with a central element (CE) in its middle. The LEs are attached to the axes of homologous chromosomes and are connected with the CE by transversal filaments (TFs). The protein SYCP1 (125 kDa) contains a long central á-helical domain, which is predicted to mediate dimerization in a parallel coiled-coil structure, flanked by two non-helical ends. The coiled-coil is thought to cross the gap between the LEs and the CE, the C-termini are anchored in the LEs and the N-termini have been localized to the CE. In order to better understand the molecular architecture of the SC and the role of SYCP1 in SC-assembly the polymerization properties of SYCP1 were investigated. To this end the protein was expressed in somatic cells. In this approach SYCP1 is able to form stable filamentous structures autonomously, which on the ultrastructural level represent alternating lines connected by TFs. This composition resembles multimeric SC-like complexes arranged in parallel, so called polycomplexes (PCs). By determining the orientation of SYCP1 molecules it was proven that PCs are highly ordered structures with the same arrangement of SYCP1 molecules as in SCs. These results demonstrate that SYCP1 is able to assemble into structures closely resembling the CR of SCs even in the absence of other SC-proteins, which signifies that SYCP1 is the primary determinant of SC assembly which in turn plays a key role in synapsis of homologous chromosomes. For a more detailed analysis, selected mutated constructs of SYCP1 were expressed. Mutations that modified the length of the central alpha-helical domain resulted in the formation of PCs consisting of repeat units of altered width, verifying that the coiled-coil domain determines the distance between the lines of the PC. This result implies the same function of this domain in SC assembly. Moreover, it was observed that SYCP1 molecules lacking the non-helical N-terminus are still able to form PCs, albeit at a strongly reduced level. This shows the importance of the N-terminus both in SYCP1 autoassembly and in the formation of the CE of SCs, but also implies a significant role of the N-terminal part of the coiled-coil domain. In contrast, when the non-helical C-terminus was deleted, filament formation was eliminated indicating a major role of the C-terminus in SYCP1 autoassembly. Another major topic of this work was the characterization of SYCP1 binding partners. By immunogold localization on mouse testis the proteins Syce1 and Cesc1 could be identified as the first exclusive components of the CE of SCs. Furthermore, the interaction of these proteins with the N-terminal region of SYCP1 was validated. Hence, SYCP1 forms the basic structure of the CE and recruits Syce1 and Cesc1.

This work describes the initial molecular characterization of a novel protein, p170, from the african claw frog Xenopus laevis. The cDNA encoding p170 was identified in a random manner when an expression library from X.laevis ovary was screened with an affinity purified antibody originally designed to recognize the replication factor cdc6. The original p170 cDNA fragment was completed by RACE ('rapid amplification of cDNA ends'), and the full length cDNA (4441bp) was found to encode a protein of 1335 aa related to certain cytoskeleton associated proteins. p170 has an extraordinary amino acid composition with a high content of leucine, glutamic acid and glutamine, but low content of proline and glycine. Secondary structure analysis of the p170 protein reveals that the protein has a high potential to form coiled coils. To allow a biochemical characterization of the p170 protein, two fragments were subcloned and expressed in E.coli to generate p170-specific antibodies by the immunization of rabbits. With these antibodies, immunofluorescence microscopy and biochemical cell fractionation experiments show that the p170 protein is preferentially localized in the cytoplasm of cultured Xenopus cells. The p170 protein is highly expressed in eggs and the p170 amount decreases during early development. Computer searches have shown that p170 is conserved in vertebrates, and homologues in human, mouse, cow, pig and zebrafish could be identified by expressed sequence tags (ESTs). On the basis of published sequence information the genomic organization of the complete human and mouse p170 genes could be determined The human p170 gene is located on Chromosome 1 and consists of 25 exons over a length of at least 107 kb. Further experiments are in progress to test the function of the p170 protein in cytoskeleton assemby.