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γδ T-Lymphozyten stellen eine numerisch kleine T-Zellsubpopulation dar, deren Funktionen Zytokinproduktion, Zytotoxizität, Antigenpräsentation, Produktion von AMPs, Erkennung von PAMPs durch Mustererkenungsrezeptoren und regulatorische Wirkung umfassen. Aufgrund der Verteilung von γδ T-Zellpopulationen in verschiedenen Geweben des Menschen war eine differentielle Chemokinrezeptorexpression zu vermuten und konnte in der vorliegenden Arbeit bestätigt werden. Dabei wurde die Expression von CCR4 als ein charakteristisches Merkmal für Vδ1 vs. Vδ2 γδ T-Zellen identifiziert. Desweiteren konnte ein differentielles Expressionsmuster von CCR6 und CCR9 mit den Lokalisationen von γδ T-Zellen aus Blut, Synovialflüssigkeit und Darmgewebe korreliert werden. Zur schnellen Erkennung von Pathogenen verfügen γδ T-Zellen neben dem T-Zellrezeptor auch über Mustererkennungsrezeptoren wie TLRs. Vorhergehende Studien hatten zudem erste Hinweise auf eine Expression des Mustererkennungsrezeptors NOD2 beschrieben. Die Expression des NOD2-Proteins in γδ T-Zellen konnte erstmalig in der vorliegenden Arbeit nachgewiesen werden. Weiterhin wurden über den TZR aktivierte γδ T-Zellen mit dem NOD2-Liganden MDP-LD im Vergleich mit dessen MDP-DD-Isomer stimuliert. Hochrein isolierte γδ T-Zellen zeigten eine verstärkte Freisetzung von CCL3/MIP-1α und IFN-γ, während in PBMZ befindliche γδ T-Zellen eine schwächere Proliferation nach Stimulation mit MDP-LD vs. MDP-DD aufwiesen. Nach Aktivierung setzen γδ T-Zellen Zytokine wie IFN-γ, TNF-α und CCL5/RANTES, aber auch antimikrobielle Peptide wie LL-37 frei. In der vorliegenden Arbeit wurden γδ T-Zellen mit dem Überstand adhärent wachsender Ps. aeruginosa stimuliert um die nachfolgende Expression von Zytokinen und AMPs zu untersuchen. Dabei konnte eine induzierbare Expression der Zytokine IFN-γ und CCL20/MIP-3α festgestellt werden. Eine ebenfalls stimulierbare antimikrobielle Aktivität von γδ T-Zellen ließ sich z.T. auf die Produktion und/oder Freisetzung von Granulysin, Granzym B, HBD-1 und Elafin zurückführen. In der vorliegenden Arbeit wurden Aspekte von γδ T-Lymphozyten im Hinblick auf ihre Lokalisation und die Erkennung und Bekämpfung von Pathogenen näher untersucht. Die vorliegenden Ergebnisse haben somit einen Beitrag zu einem tieferen Verständnis der Bedeutung von humanen γδ T-Zellen in der frühen Immunantwort erbracht. γδ T cells represent a numerical small T cell subset displaying functional activity including cytokine production, cytotoxicity, antigen presentation, production of antimicrobial peptides, recognition of PAMPs by pattern recognition receptors and regulatory functions. According to the distribution of γδ T cell subsets in different human tissues, a differential expression of chemokine receptors was expected and could be confirmed in the present study. The expression of CCR4 was identified as a characteristic feature of Vδ1 vs. Vδ2 γδ T cells. Furthermore, a differential expression pattern of CCR6 and CCR9 was correlated with the localizations of γδ T cells from blood, synovial fluid and intestine. For rapid recognition of pathogens, γδ T cells are equipped with not just the T cell receptor, but with pattern recognition receptors including TLRs. Additionally, previous studies had described preliminary evidences for an expression of the pattern recognition receptor NOD2. In the present study, the expression of the NOD2-protein was described for the first time. Furthermore, T cell receptor activated γδ T cells were treated with the NOD2-ligand MDP-LD in comparison to the MDP-DD-isomer. Stimulated with MDP-LD vs. MDP-DD, highly purified γδ T cells showed a stronger release of CCL3/MIP-1α and IFN-γ, while γδ T cells within peripheral mononuclear blood cells exhibited an attenuated proliferation. After activation, γδ T cells release cytokines such as IFN-γ, TNF-α and CCL5/RANTES as well as antimicrobial peptides like LL-37. In the present study, γδ T cells were stimulated by the supernatant of adherent Ps. aeruginosa in order to investigate the consecutive expression of cytokines and antimicrobial peptides. An inducible expression of the cytokines IFN-γ and CCL20/MIP-3α was observed. The similarly inducible antimicrobial activity of γδ T cells was attributed partly to the production and/or release of granulysin, granzyme B, human β-defensin 1 and elafin. In the present study, aspects of γδ T lymphocytes concerning their localization and the recognition of and the defense against pathogens were examined. The presented results have contributed to a deeper insight into the early immune response of human γδ T cells.

INHALTSVERZEICHNIS Deckblatt \- Impressum persönlicher Dank 1 Inhaltsverzeichnis 5 2 Einleitung 9 3 Schrifttum 10 4 Material und Methoden 24 5 Ergebnisse 43 6 Diskussion 75 7 Zusammenfassung 89 8 Summary 92 9 Referenzen 31 10 Abkürzungsverzeichnis 107 11 Publikationen und Kongressbeiträge 111 12 Danksagung 114 13 Lebenslauf 115 14 Erklärung 116, Expression und Regulation von CXCR3 und CXCR4 während der terminalen B-Zelldifferenzierung B-Zellen können nach Antigenkontakt in sekundär lymphatischen Organen weiter zu Plamazellvorläufern differenzieren. Ein Teil der entstandenen Plasmablasten kann später im Knochenmark oder entzündetem Gewebe akkumulieren. Bei der Maus spielt der Chemokinrezeptor CXCR4 eine wichtige Rolle bei der Akkumulation der Plasmablasten im Knochenmark. Die Liganden von CXCR3 werden in entzündetem Gewebe gebildet und können Plasmablasten dorthin dirigieren. In dieser Arbeit wurde die Expression und Regulation der Chemokinrezeptoren CXCR3 und CXCR4 während der Ausdifferenzierung von humanen Gedächtnis-B-Zellen zu Plasmazellen sowie deren Expression auf B-Zellpopulationen verschiedener lymphatischer Organe analysiert. B-Zellen wurden über das Oberflächenmolekül CD19 definiert, Gedächtnis-B-Zellen konnten über die Expression von CD27 von den naiven B-Zellen abgegrenzt werden. Plasmablasten und Plasmazellen sind CD19(+)/CD38(++)/CD20(-). Es konnte durchflusszytometrisch in mehr als zehn Experimenten gezeigt werden, dass CXCR3 nicht von naiven B-Zellen, jedoch von einem Teil der Gedächtnis-B-Zellen exprimiert wird. CXCR4 wird von der Mehrheit aller B-Zellen des Bluts ausgeprägt. Eine genauere Analyse der CXCR3-ausprägenden Gedächtnis-B-Zellen ergab in mehr als zehn Experimenten verglichen mit z.B. IgG2 eine signifikante Assoziation der Co-Expression von CXCR3 mit IgG1 (p98 % aufgereinigt und in > 25 Experimenten mit der konstitutiv CD40L-exprimierenden T-Zelllinie EL4B5 für drei Tage in Anwesenheit von rekombinatem IL-2 und IL-10 co-kultiviert. Anschließend wurden die EL4B5-Zellen entfernt und die B-Zellen für fünf weitere Tage mit IL-2 und IL-10 zu Zellen mit dem Plasmazellphänotyp CD38(++)/CD20(-) weiter stimuliert. Die Antikörpersekretion wurde im ELISpot-Assay überprüft. Die durchflusszytometrische Analyse der CXCR3- und CXCR4-Expression erfolgte am dritten und achten Tag der Kultur. Mit Staphylococcuc aureus Cowan I und CpG 2006 konnten B-Zellen in Anwesenheit von IL-2 und IL-10 T-Zell-unabhängig über den B-Zellrezeptor respektive Toll-like-receptor 9 zu Antikörper- sezernierenden Zellen aktiviert werden. Für die Analyse der Regulation von CXCR3 wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten inflammatorische sowie Th1- und Th2-Zytokine zugefügt. B-Zellen regulierten die Expression von CXCR3 hoch, wenn sie mit dem Th1-Zytokin IFN-g während der ersten drei Tage der Aktivierung co-stimuliert wurden, dies konnte in acht Experimenten nach Aktivierung mit EL4B5-Zellen und in fünf Experimenten nach CpG-Stimulation gezeigt werden. In vivo befinden sich die B-Zellen während dieser frühen Phase der Aktivierung co-lokalisiert mit den T-Zellen innerhalb eines Lymphknotens. Mit der Zugabe des Th2-Zytokins IL-4 sowie mit verschiedenen inflammatorischen Interleukinen konnte die Expression von CXCR3 nicht beeinflusst werden. In sechs parallel durchgeführten Chemotaxis-Assays konnte gezeigt werden, dass mit der Zugabe von IFN-g in Assoziation mit der CXCR3-Expression auch die Frequenz der gegen den CXCR3 Liganden CXCL9 migrierenden Zellen signifikant anstieg (p, Regulation of CXCR3 and CXCR4 expression during terminal differentiation of memory B cells into plasma cells During antigenic stimulation at non-mucosal sites, the formation of plasma cells takes place in secondary lymphoid tissues. Later, a fraction of these cells can accumulate in bone marrow or inflamed tissues. In mice expression of CXCR4 is important for plasma cell accumulation in the bone marrow. Ligands for CXCR3 are expressed in inflamed tissues and can mediate plasma cell homing to those sites. In this study the expression and regulation of the chemokine receptors CXCR3 and CXCR4 during terminal differentiation of human memory B cells into plasma cells was analyzed. B cells were defined as CD19 positive cells. Memory B cells could be distinguished from naïve B cells by the expression of CD27. Plasmablast and plasma cells are CD38(++)/CD20(-). By flow cytometry it could be shown in more than ten experiments that CXCR3 is absent on naive B cells, but is expressed on a fraction of memory B cells. CXCR4 is expressed by the great majority of all B cells. To specify the CXCR3 expressing memory B cells in more than 10 experiments a significant correlation of the co-expression of CXCR3 and IgG1 could be shown which was absent in the case of CXCR4. In six samples the greater part of bone marrow plasmablasts expressed CXCR4, whereas CXCR3 was mainly expressed on plasmablasts of blood of eleven donors and inflamed secondary lymphoid organs like in seven tonsils and three samples of inflamed mucosa of the gut. These expression pattern leads to the assumption that in humans CXCR4 and CXCR3 are also involved in homing into the bone marrow or inflamed tissue, respectively. To analyse the regulation of the expression of CXCR3 and CXCR4 during differentiation of memory B cells, human B cells were T dependently and T independently activated into plasma blasts with various methods. Therefore purified B cells were co-cultured with the constitutively CD40L expressing cell line EL4B5 in the presence of IL-2 and IL-10. After three days the EL4B5 cells were depleted and the B cells further cultured for five more days with IL-2 and IL-10 by reaching the plasma cell phenotype CD38(++)/CD20(-). Secretion of antibodies was tested in ELISpot assay. The expression of CXCR3 and CXCR4 was studied on day 3 and day 8. B cells were activated T independently by Staphylococcus aureus Cowan I or CpG 2006 by triggering the B cell receptor or toll-like receptor 9, respectively. For the analysis of the regulation of CXCR3 inflammatory as well as Th1 and Th2 derived cytokines were added at various time points. In 13 experiments it could be shown that B cells up-regulated CXCR3 when co-stimulated with the Th1 cytokine IFN-g during the first three days of culture. In the course of an immune response in vivo, before day 3 after antigenic challenge, B cells are found in the lymph nodes adjacent to T helper cells. The addition of the Th2 cytokine IL-4 as well as various inflammatory cytokines did not alter the frequency of CXCR3 expressing cells. In correlation IFN-g could also enhance the frequency of migrating plasma blast towards the CXCR3 ligand CXCL9 shown insix chemotaxis assays . During their differentiation into plasma cells, five experiments showed that CXCR3(+) and CXCR3(-) memory B cells remained stable in the expression of this receptor. Indicating that once induced in memory B cells, CXCR3-Expression remains part of the individual cellular memory. The results presented in this study suggest that the following scenario is at least one mechanism leading to the accumulation of plasma cells within inflamed tissues. Th1 cells can stimulate activated B cells specific for the same antigen to express CXCR3, thus supporting their accumulation within the adjacent inflamed tissue (Fig.24). Plasma cell homing to bone marrow is a specific feature of T-dependent immune responses. As it could be shown in more than three experiments that differentiation of CXCR4(-) B cells is generally accompanied with the expression of this chemokine receptor, the expression of CXCR4 is not a T dependent phenomenon. Although CXCR4 is crucially involved in accumulation of plasma blasts in the bone marrow, these results indicate that the accumulation is not modulated about CXCR4, exclusively. Whereas there was no regulatory factor found for the expression of CXCR4, CXCR3-Expression was induced, precisely. The identification of IFN-g as an inducing factor for expression of CXCR3 and it s ligands leads to better understanding of the accumulation of plasma cells in chronically inflamed tissue. On the long run this migration could be inhibited and function as therapy for autoimmune diseases as systemic lupus erythematosus or rheumatoid arthritis.

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