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Entkopplerproteine sind mitochondriale Transportproteine (uncoupling proteins, UCPs) der inneren Mitochondrienmembran. Das Entkopplerprotein UCP3 wurde bereits 1997 entdeckt, dennoch ist seine Funktion bis heute nicht bekannt. In der vorliegenden Arbeit wurden Dsungarische Hamster untersucht, denen aufgrund einer Punktmutation im UCP3-Gen das UCP3-Protein im braunen Fettgewebe (brown adipose tissue, BAT) fehlt. Primäres Ziel dieser Arbeit war, durch die Charakterisierung der Hamster, neue Erkenntnisse über die Funktion von UCP3 zu gewinnen. Die anatomische Untersuchung der Hamster zeigte, dass die Mutanten schwerer und länger als die Wildtyphamster sind. Dabei haben sie weniger Körperfett und einen größeren fettfreien Körpermassenanteil. Letzterer ist vermutlich durch die Körperlänge begründet. Überdies konnte bei den Mutanten eine deutlich erhöhte Futteraufnahme festgestellt werden. Es ist jedoch offen, ob die Hyperphagie Folge eines erhöhten Energieverbrauchs ist. Um diesen zu bestimmen, werden Stoffwechselmessungen benötigt. Um zu überprüfen, ob die UCP3-Mutation im braunen Fettgewebe unabhängig von systemischen Einflüssen besteht, wurden Primärzellkulturen brauner Adipozyten angelegt. In Wildtypzellen konnte zunächst gezeigt werden, dass die Expression der UCP3-mRNA im BAT über die Aktivierung der Kernrezeptoren PPAR und PPAR induziert werden kann. Darin zeigt sich eine Gewebespezifität der UCP3-Expression, die in der Skelettmuskulatur, anders als im BAT, über PPAR und reguliert wird. Die Aktivierung des UCP3-Gens über Transkriptionsfaktoren, die den Fettstoffwechsel regulieren, unterstützt eine potentielle Funktion von UCP3 im Fettstoffwechsel. In der Primärkultur ausgehend von braunen Präadipozyten der Mutanten konnte in den Zellen keine UCP3-mRNA nachgewiesen werden. Dennoch wurde eine normale Proliferation, Differenzierung und Morphologie der Zellen beobachtet. Auch auf elektronenmikroskopischen Aufnahmen wies das braune Fettgewebe der Mutanten keine morphologischen Auffälligkeiten auf. Offenbar hat UCP3 keine Entwicklungs- oder Vitalität-fördernde Funktion. Trotz einer normalen PPAR -mRNA Expression in den Mutantenzellen, konnten diese auch nach Stimulation mit PPAR -Aktivatoren nicht zur Expression von UCP3 veranlasst werden. Dies zeigt, dass die Mutation in den braunen Adipozyten unabhängig von extrazellulären Einflüssen wirkt. Dadurch können die isolierten braunen Adipozyten der Mutanten für weitere Studien der UCP3-mRNA-Expressionsregulation verwendet werden. Um zu untersuchen, ob UCP3 in der Lage ist, die mitochondriale Atmung zu entkoppeln, wurden Mitochondrien aus dem braunen Fettgewebe isoliert und deren Atmung gemessen. Das mitochondriale Protonenleck der Mutantenmitochondrien war sowohl bei der entkoppelten als auch bei der gekoppelten state-4-Atmung nicht verkleinert. Auch die maximale Atmungsrate zeigte, dass die Leistungsfähigkeit der Mitochondrien der Mutanten normal ist. Der Vergleich von Mitochondrien mit und ohne UCP3 zeigte also, dass UCP3 nicht als Entkoppler der mitochondrialen Atmung fungiert. Da für UCP3 eine Funktion als Schutz der Mitochondrien vor Radikalen postuliert wurde, wurde deren Wirkung auf die mitochondriale Atmung untersucht. Eine Aktivierung von UCP3 und UCP1 durch Radikale konnte weder bei Mutanten- noch bei Wildtypmitochondrien festgestellt werden. Dies ist jedoch vermutlich auf die Kaltakklimatisation der Versuchstiere und der damit übereingehenden hohen Konzentration antioxidanter Enzyme zurückzuführen. Die bisher untersuchten Aspekte des Phänotyps des Dsungarischen Zwerghamsters mit UCP3-Defizit im braunen Fettgewebe sind keiner der bisher aufgeworfenen Funktionshypothesen eindeutig zuzuordnen. Dennoch kann festgestellt werden, dass sowohl die unveränderte Größe des Protonenlecks als auch die Abwesenheit von Fettleibigkeit sowie die Hyperphagie der Mutanten gegen eine Entkopplerfunktion von UCP3 sprechen. Der geringe Körperfettgehalt und die Hyperphagie adulter Hamster könnten als Anzeichen einer beeinträchtigen Nährstoffverwertung und als Verbindung zwischen UCP3 und dem Fettstoffwechsel gedeutet werden. Auch die Steuerung der UCP3-mRNA-Expression über PPARs, die in der Regulation des Fettstoffwechsels involviert sind, deutet in diese Richtung. Bemerkenswert ist, dass bei den Hamstern im Gegensatz zu den UCP3-knockout-Mäusen ein veränderter Phänotyp gefunden werden konnte, während der Phänotyp der Mäuse weitestgehend unauffällig ist. Der UCP3-Verlust hat also in verschiedenen Spezies nicht die gleiche Auswirkung., Uncoupling proteins (UCPs) are mitochondrial carrier proteins of the inner mitochondrial membrane. Uncoupling protein 3 (UCP3) was already discovered in 1997, nevertheless, its function has been unknown till today. Within the present thesis hamsters were investigated, which lack the UCP3 protein in brown adipose tissue (BAT) due to a single nucleotide mutation within the UCP3 gene. Primary aim of this work was to gain new insight about UCP3 by characterisation of these hamsters. The anatomic examination of the hamsters showed that mutants are heavier and longer than wildtype hamsters. At the same time they have less body fat and a bigger amount of fat free body mass. The later is probably based on body length. The hamsters’ bigger habitus could be interpreted as consequence of a positive energy balance during growth. On the other hand the stable body composition throughout a longer time period points to a balanced energy balance in adult hamsters. The difference between young and adult animals can possibly be explained with a change of UCP3’s physiological impact with age. Moreover, an increased food intake of the mutants was measured. Hyperphagia and decreased body fat could refer to a higher energy need. Alternatively the hyperphagia of the mutant hamsters might indicate a poorer nutritional assimilation. It’s unknown though, if the hyperphagia is a result of increased energy consumption. To determine the mutants’ energy consumption, metabolic rate measurement would be needed. Primary cell culture was established to test if the UCP3 mutation in brown adipose tissue exists independently of systemic influences. First UCP3 mRNA expression was stimulated in wildtype cells. It was shown that UCP3 mRNA expression in brown adipose tissue is inducible via activation of core receptors PPAR and PPAR . This is a tissue specific difference between the regulation in brown adipose tissue and in skeletal muscle, where UCP3 expression is regulated differently from BAT by PPAR and . The activation of the UCP3 gene with transcriptional factors that regulate the fat metabolism support a potential function of UCP3 within the fat metabolism. In primary cell culture derived from mutant brown adipocytes no UCP3 mRNA could be detected. Nevertheless normal proliferation, differentiation and morphology of cells were observed. Also, electron microscopic photos did not show any abnormal morphology of mutant brown adipose tissue. Apparently UCP3 has no development or vitality promoting function. Despite normal PPAR mRNA expression in mutant cells, it wasn’t possible to induce UCP3 expression with PPAR activators. This shows that the mutation in brown adipocytes works independent of extra cellular influences. Thus it is possible to use isolated brown adipocytes from mutant hamsters for future studies about the regulation of UCP3 mRNA expression. To examine whether UCP3 is capable to uncouple mitochondrial respiration, brown fat mitochondria were isolated and its respiration was measured. In brief, mitochondrial respiration is not affected by the lack of UCP3. Particularly in mutant mitochondria the proton leak was not reduced during uncoupled as well as coupled state-4-respiration. Also, the maximal respiration rate showed a normal mitochondrial efficiency in mutant mitochondria. In conclusion the comparison of mitochondria with and without UCP3 indicates that UCP3 does not function as an uncoupler of mitochondrial respiration. Since a function of UCP3 was postulated as a protector of mitochondria against radicals by means of uncoupling, the effect of radicals on mitochondrial respiration was examined. No activation of UCP3 and UCP1 by radicals was detected, neither in mutant nor in wildtype mitochondria. This is probably attributed to the cold acclimation of animals which led to higher concentrations of antioxidant enzymes in brown fat mitochondria. Phenotypic aspects of Djungarian hamsters with UCP3 deficiency examined so far are not definitely assignable to any hypothesises for the function of UCP3 suggested so far. Nevertheless it can be stated, that the unchanged size of the proton leak as well as the absence of obesity and the mutant’s hyperphagia contradict an uncoupling function for UCP3. Low body fat content and hyperphagia of adult hamsters could be interpreted as an indication of an impaired nutrient utilization and as a connection between UCP3 and fat metabolism. The control of UCP3 mRNA expression via PPARs points also in this direction as PPARs are involved in the regulation of fat metabolism. It is remarkable, that UCP3 deficient hamsters in contrast to UCP3 knockout mice display an altered phenotype whereas the mouse phenotype is largely unobtrusive. Thus, the loss of UCP3 in different species doesn’t have the same consequence.

In the first part of the present work a possible function of UCP2, UCP3 and UCPx, as proton transporters or uncoupling proteins were analysed. For the analysis a new assay was set up, to show a possible influence of transient expressed uncoupling proteins on mitochondrial respiration of HEK293 cells. Because UCP1 is up to now the only funcional characterized memeber of the protein family, the assay was tested with UCP1 transfected HEK293 cells. The expression and incorporation of UCP1 and UCP3 into the mitochondria were proved by western blot analysis. The measurement of O2 consumption showed less coupling of respiration in UCP1 transfected cells compared to control cells after inhibition of the ATP synthase with oligomycin. After addition of the fatty acid palmitate the respiration of UCP1 transfected cells were significantly increased, whereas control cells showed no increase of respiration in presence of fatty acids. By this the expression of functional UCP1 has been confirmed. UCP2, UCP3 and UCPx transfected cells neither showed an increased of uncoupled respiration in presence of oligomycin nor could be activated by addition of palmitate. A with UCP1 comparable uncoupling function of UCP2, UCP3 and UCPx could not be confirmed. Additionally a possible regulative or inhibitory influence of the mitochondrial folate transporter SOUP on UCP induced uncoupling were investigated after coexpression of SOUP with either UCPx or UCP1. Coexpression of SOUP and UCPx did not effect the mitochondrial respiration. Also the coexpression of SOUP and UCP1 did not influence UCP1 induced uncoupled respiration. In the second part of the present work a possible regulative function of UCP3 in fatty acid metabolism was analysed in hamsters which show a tissue specific lack of UCP3 in brown adipose tissue due to an unknown mutation. For the analysis wildtype and mutant hamsters were fasted for 48 h, exposed to 5°C for seven days or kept at 23°C with food ad libitum (control group). Geneexpression of UCP3 and keyenzymes of fatty acid metabolism were analysed in wildtype and mutant hamsters to confirm a possible impairement of fatty acid metabolism due to the lack of UCP3. Beyond UCP3 the mRNA expression of the mitochondrial thioesterase I (MTE-I) and the carnitine palmitoyl transferase I (CPT-I) were analysed. In brown adipose tissue of mutant hamsters no UCP3 mRNA or protein were detectable by northern and western blot analysis. In wildtype hamsters the UCP3 mRNA expression in brown adipose tissue were similar in fasted, cold exposed and control animals. The UCP3 protein content in cold exposed hamsters showed a 3-fold increase, in fasted animals protein content were slightly deacreased compared to controls. Analysis of MTE-I mRNA expression in wildtypes and mutants revealed no coupled regulation of MTE-I and UCP3 expression in brown adipose tissue. Therefore both proteins are not functionally coupled, but their expression in this tissue depends obviously on fatty acid metabolism. Expression of CPT-I mRNA in brown adipose tissue of wildtype hamsters and mutants was similar. Therefore there seemst to be no impairement of regulation or an inhibition of fatty acid import into mitochondria of mutant hamsters. The capacity of fatty acid oxidation in brown adipose tissue of fasted, cold exposed or control wildtype and mutant hamsters were compared by measuring the CO2 production of tissue samples in vitro with oleate as substrate. Additionally β-oxidation were analysed by measuring the O2 consumption of isolated mitochondria of cold exposed animals of both phenotypes with palmitoyl carnitine as substrate. All measurements revealed no impairement of fatty acid oxidation due to the lack of UCP3 neither in tissue samples nor in isolated mitochondria. In conclusion, according to gene expression studies and in vitro measurements of fatty acid oxidation, no direct functional relation or regulative influence of UCP3 in fatty acid metabolism could be confirmed., Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde eine mögliche Funktion der mitochondrialen Transportproteine UCP2, UCP3 und UCPx als Protonentransporter bzw. Entkopplerproteine untersucht. Für diese Analysen wurde ein Testsystem etabliert, mit dem ein möglicher Einfluss der Entkopplerproteine auf die Atmung von HEK293-Zellen nach transienter Expression nachgewiesen werden konnte. Da UCP1 das bislang einzige funktionell charakterisierte Mitglied der Entkopplerproteinfamilie ist, wurde das Messverfahren zunächst mit UCP1 transfizierten HEK293-Zellen validiert. Die Expression und Inkorporation von UCP1 und UCP3 in die Mitochondrien von HEK293-Zellen wurde mittels Western-Blots bestätigt. Die Sauerstoffverbrauchsmessungen haben gezeigt, dass die UCP1 transfizierte Zellen nach Inhibition der ATP-Synthase durch Oligomycin eine geringere Kopplung der Atmung zeigten, als die Kontrollzellen. Nach Palmitatzugabe erhöhte sich die Atmungsrate der UCP1-Zellen signifikant. Diese fettsäureabhängige Aktivierung bestätigte die Expression von funktionsfähigem UCP1. Bei den Kontrollen erfolgte keine Steigerung der Atmung nach Fettsäurezugabe. Zellen die mit UCP2, UCP3 und UCPx transfizierten wurden, zeigten weder eine erhöhte entkoppelte Atmung in Anwesenheit von Oligomycin, noch eine durch Fettsäuren induzierte Entkopplung der Atmung. Eine mit UCP1 vergleichbare Entkopplerfunktion von UCP2, UCP3 und UCPx konnte damit nicht bestätigt werden. Des Weiteren wurde ein vermuteter regulatorischer bzw. inhibitorischer Einfluss des mitochondrialen Folat-Carriers SOUP auf die UCP vermittelte Entkopplung, nach Koexpression mit UCPx und UCP1 in HEK293-Zellen geprüft. Die Koexpression von SOUP mit UCPx oder UCP1 hatte allerdings keinen Einfluss auf die mitochondriale Atmung der Zellen bzw. auf die UCP1 vermittelte Entkopplung. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die mögliche Bedeutung von UCP3 als Regulator des mitochondrialen Fettsäurestoffwechsels in Dsungarischen Zwerghamstern untersucht, die aufgrund einer bislang unbekannten Mutation ein gewebespezifisches UCP3 Defizit im braunen Fettgewebe besitzen. Für die Analyse wurden Wildtyphamster und Mutanten sieben Tage kälteexponiert, 48 h gefastet oder unter Kontrollbedingungen bei 23°C mit ad libitum Futter gehalten. Von Wildtypen und Mutanten wurde die Genexpression von UCP3, sowie von Schlüsselenzymen des Fettsäurestoffwechsels analysiert, um Hinweise auf eine mögliche Störung des Fettsäurestoffwechsels bei den Mutanten zu erhalten. Analysiert wurde die mRNA-Expression der mitochondrialen Thioesterase-I (MTE-I) und der Carnitin-Palmitoyltransferase-I (CPT-I). Im braunen Fettgewebe von Mutanten konnte weder die UCP3 mRNA, noch das UCP3-Protein mittels Northern bzw Western Blots nachgewiesen werden. Im braunen Fettgewebe von Wildtypen waren keine Unterschiede im mRNA-Spiegel zwischen Kontrollen, gefasteten und kaltakklimatisierten Hamstern feststellbar. Der Proteingehalt bei kälteexponierten Wildtyptieren war allerdings 3-fach höher und bei den gefasteten Tieren tendenziell erniedrigt gegenüber den Kontrollen. Die Analyse mRNA-Expression der MTE-I in Wildtyphamstern und Mutanten hat gezeigt, dass offenbar keine gekoppelte Regulation der Expression der MTE-I und UCP3 im braunen Fettgewebe erfolgt, womit offensichtlich keine direkte funktionelle Kopplung zwischen beiden Proteinen besteht. Es konnte jedoch feststellt werden, dass die Regulation von UCP3 und der MTE-I offenbar abhängig vom Fettsäurestoffwechsel im Gewebe erfolgt. Die mRNA-Expression der CPT-I mRNA im braunen Fettgewebe der Wildtypen und Mutanten war vergleichbar. Demzufolge gab es keine Anzeichen für eine veränderte Regulation oder eine Inhibition des Fettsäureimports in die Mitochondrien der Mutanten. Die Fettsäureoxidationskapazität des braunen Fettgewebes von gefasteten, kaltakklimatisierten und Kontroll-Wildtyphamstern und Mutanten wurde in Gewebeproben in vitro anhand der CO2-Produktion mit Oleat als Substrat ermittelt. Zudem wurde die Fettsäureoxidationskapazität von isolierten Braunfettmitochondrien aus kälteexponierten Wildtyphamstern und Mutanten durch Messung des O2-Verbrauchs in Anwesenheit von Palmitoyl-Carnitin als Substrat bestimmt. Diese Messungen haben ergeben, dass die mitochondriale Fettsäureoxidationskapazität des braunen Fettgewebes offensichtlich nicht durch das Fehlen von UCP3 beeinträchtigt wird. Auch die Messung des Fettsäurestoffwechsels in isolierten Mitochondrien von Wildtypen und Mutanten hat keine eindeutigen Hinweise auf eine Störung der mitochondrialen beta-Oxidation durch das UCP3 Defizit ergeben. Zusammenfassend kann man sagen, dass anhand der in dieser Arbeit durchgeführten Genexpressionsstudien und in vitro Messungen des Fettsäurestoffwechsels, kein direkter funktioneller Zusammenhang oder ein regulativer Einfluss von UCP3 auf den Fettsäurestoffwechsel bestätigt werden kann.