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Murine gammaherpesvirus 68 (MHV68) is a small-animal model suitable for study of the human pathogens Epstein-Barr virus and Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus. Here, we have characterized the roles of the endosomal Toll-like receptor (TLR) escort protein UNC93B, endosomal TLR7, -9, and -13, and cell surface TLR2 in MHV68 detection. We found that the alpha interferon (IFN-α) response of plasmacytoid dendritic cells (pDC) to MHV68 was reduced in Tlr9 −/− cells compared to levels in wild type (WT) cells but not completely lost. Tlr7 −/− pDC responded similarly to WT. However, we found that in Unc93b −/− pDC, as well as in Tlr7 −/− Tlr9 −/− double-knockout pDC, the IFN-α response to MHV68 was completely abolished. Thus, the only pattern recognition receptors contributing to the IFN-α response to MHV68 in pDC are TLR7 and TLR9, but the contribution of TLR7 is masked by the presence of TLR9. To address the role of UNC93B and TLR for MHV68 infection in vivo , we infected mice with MHV68. Lytic replication of MHV68 after intravenous infection was enhanced in the lungs, spleen, and liver of UNC93B-deficient mice, in the spleen of TLR9-deficient mice, and in the liver and spleen of Tlr7 −/− Tlr9 −/− mice. The absence of TLR2 or TLR13 did not affect lytic viral titers. We then compared reactivation of MHV68 from latently infected WT, Unc93b −/− , Tlr7 −/− Tlr9 −/− , Tlr7 −/− , and Tlr9 −/− splenocytes. We observed enhanced reactivation and latent viral loads, particularly from Tlr7 −/− Tlr9 −/− splenocytes compared to levels in the WT. Our data show that UNC93B-dependent TLR7 and TLR9 cooperate in and contribute to detection and control of MHV68 infection. IMPORTANCE The two human gammaherpesviruses, Epstein-Barr virus (EBV) and Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), can cause aggressive forms of cancer. These herpesviruses are strictly host specific, and therefore the homolog murine gammaherpesvirus 68 (MHV68) is a widely used model to obtain in vivo insights into the interaction between these two gammaherpesviruses and their host. Like EBV and KSHV, MHV68 establishes lifelong latency in B cells. The innate immune system serves as one of the first lines of host defense, with pattern recognition receptors such as the Toll-like receptors playing a crucial role in mounting a potent antiviral immune response to various pathogens. Here, we shed light on a yet unanticipated role of Toll-like receptor 7 in the recognition of MHV68 in a subset of immune cells called plasmacytoid dendritic cells, as well as on the control of this virus in its host.

Die altersabhängige Makuladegeneration (AMD) ist Hauptursache für schwere Sehstörungen in der westlichen Welt. Im Fokus dieser Arbeit steht die noch unklare Interaktion TLR-3 aktivierten retinalen Pigmentepithels (RPE) und retinaler Mikroglia,die für die Pathogenese der AMD und viraler Infektionen mitverantwortlich gemacht wird.Das Expressionsmuster ausgewählter Zytokine und Enzyme wurde mittels real-time RT-PCR offengelegt.Das RPE als Teil der Blut-Retina-Schranke fungiert als Schnittstelle zwischen der Aderhaut und der immunprivilegierten Retina.Die retinale Mikroglia ist die gewebeständige Abwehrzelle.Der TLR-3 ist Teil des angeborenen Immunsystems.Mit viraler doppelsträngiger RNA (dsRNA) als Ligand dient er der Virusabwehr. Wir etablierten eine Zellkultur retinaler Mikroglia. Zum Mikroglianachweis dienten Immunfärbungen mit Iba-1.Unsere Experimente zeigen, dass durch polyinosinic polycitidylic acid (Poly I:C – synthetische dsRNA) TLR-3 stimulierte retinale Mikroglia mit einer konzentrationsabhängigen Induktion der proinflammatorischen Zytokine IL-1β, IL-6,TNF-α und der Enzyme COX-2,iNOS reagiert. Die Interaktion TLR-3 stimulierten RPEs und retinaler Mikroglia ergab eine Expressionssteigerung von IL-1β, IL-6 und COX-2 gegenüber der mit identischer Poly I:C-Konzentration behandelten Kontrollgruppe retinaler Mikroglia. Wir detektierten eine Reduktion der Expression für iNOS, sowie ein erhöhtes Expressionsniveau für das antiinflammatorische Zytokin IL-10. Wir beobachteten eine Induktion von COX-2 und IL-1β bei gleichzeitiger Reduktion der Expression von iNOS– entsprechend einer Entzündungsreaktion mit gleichzeitiger Limitation der Neurotoxizität. Eine Aktivierung des RPEs könnte einen feed-forward Mechanismus vermittelt durch lösliche Fakoren, wie Zytokine auslösen,die retinale Mikroglia aktivieren und die beobachtete Immunantwort induzieren, deren Modulation ein Schritt vorwärts in der Therapie der AMD, aber auch akuter Prozesse, wie viraler Infektionen darstellt. Age-related macular degeneration (AMD) is the main reason for severe visual impairment in the western world.The focus of this exploration was on the then to be defined interaction of TLR-3 stimulated retinal pigment epithelium (RPE) and retinal microglia which appears to be an immanent element of AMD and viral infections.A cluster of cytokines and enzymes was tested in real-time RT-PCR in order to map the reactions.The RPE works as an interface between the choroid and the immune privileged retina.Retinal microglia is the resident immune cell of the retina.The toll-like 3 receptor (TLR-3) is part of the innate immune system with viral double stranded RNA (dsRNA) as its ligand.We established a cell culture of retinal microglia.For cell identification immunocytochemical staining with Iba-1 was conducted.Our experiments show that retinal microglia that has been stimulated with polyinosinic polycitidylic acid(Poly I:C-synthetic dsRNA)via TLR-3 reacts with a concentration dependent induction of the proinflammatory cytokines IL-1β, IL-6, TNF-α and of the enzymes COX-2 and iNOS.With focus on the interaction of TLR-3 stimulated RPE and retinal microglia we found an increase in the expression of IL-1β, IL-6, COX-2 and in basal stimulation,of the antiinflammtory IL-10 in retinal microglia that has been treated with supernatant of TLR-3 stimulated RPE in comparison to the control group of retinal microglia that had solely been treated with equal concentrations of Poly I:C.We observed an induction of the expression of COX-2 and IL-1β accompanied by a reduction of iNOS correlating to an inflammatory reaction chaperoned by a limitation of neurotoxicity.An activation of the RPE might induce a feed-forward mechanism via soluble factors like cytokines from RPE to retinal microglia resulting in the observed immune response.A modulation of the immune reaction of RPE and retinal microglia appears to be a step ahead in the therapy of AMD but also of acute processes like viral infections.

Hintergrund: Die Tuberkulose, eine durch Mycobacterium tuberculosis hervorgerufene Infektion, ist auch heute noch ein globales Gesundheitsproblem. Die Tuberkulose Suszeptibilität variiert stark unter infizierten Individuen und das Erkennen der Mykobakterien durch das angeborene Immunsystem beeinflusst wahrscheinlich den Krankheitsverlauf und -ausgang. Diese Arbeit beschreibt SNPs in den Toll-like Rezeptoren, welche die angeborene Immunantwort auf Mycobacterium tuberculosis verändern und die mit Tuberkulose in Südindien assoziiert sind. Methoden: Eine SNP Datenbank mit Informationen zu den jeweiligen Toll-like Rezeptor Polymorphismen und deren potentiellem Einfluss auf die Proteinstruktur wurde angelegt. In Hyderabad, Indien wurden eine Kohorte mit Tuberkulosepatienten und eine mit gesunden Kontrollen generiert. 206 Tuberkulose Patienten und 236 gesunde Kontrollen wurden auf SNPs in den Toll-like Rezeptoren 1, 2, 4, 7 und 8 hin untersucht. Das Vorhandensein dieser genetischen Variationen wurde anschließend mit Tuberkulose Suszeptibilität korreliert. Um individuelle Reaktionen auf Mycobacterium tuberculosis Lysate zu untersuchen wurden HEK293 Zellen mit Varianten eines Toll-like Rezeptor 1 SNPs transfiziert und PBMCs von genotypisierten, gesunden deutschen Individuen mit den entsprechenden Liganden in vitro stimuliert. Nach Stimulation wurden die NF-κB-Aktivierung bzw. TNF - Produktion gemessen. Zur statistischen Auswertung der Kohorten wurde ein Computerprogramm entwickelt und potentielle Auswirkungen des Toll-like Rezeptor 1 SNPs wurden in silico modelliert. Ergebnisse: Die Kohorten-Analyse ergab die Assoziation eines Toll-like Rezeptor 1 SNPs (248N, rs4833095) und eines Toll-like Rezeptor 8 SNPs (1M, rs3764880) mit Schutz vor TB und die Assoziation eines TLR4 SNPs (299D, rs4986790) mit erhöhtem Tuberkulose-Risiko bei Frauen. Funktionelle Untersuchungen an HEK Zellen, die mit Toll-like Rezeptor 1-248N transfiziert und mit Mycobacterium tuberculosis stimuliert wurden, zeigten eine erhöhte NF-κB Aktivierung bei dieser Toll-like Rezeptor 1 Genvariante. Zusätzlich wiesen Toll- like Rezeptor 1-248N exprimierende PBMCs von gesunden Kontrollen eine erhöhte TNFs Antwort auf Mycobacterium tuberculosis Lysate auf. Die in silico Modellierung zeigte eine deutliche Veränderung der Proteinstruktur von Toll-like Rezeptor1 durch die Mutation der Aminosäure 248, die die funktionellen Veränderungen erklären könnte. Fazit: Der SNP Toll-like Rezeptor 1-248N ist mit Schutz vor Tuberkulose in einer indischen Bevölkerung assoziiert, führt zu einer erhöhten Immunantwort auf Mycobacterium tuberculosis Lysate und vermutlich zu einer strukturellen Veränderung dieses Rezeptors., Background: Tuberculosis, a disease caused by Mycobacterium Tuberculosis infection, is still a global public health problem. TB susceptibility varies substantially in infected individuals, and mycobacterial recognition by the innate immune system may likely affect disease course and outcome. This research describes SNPs in the TB genes that functionally alter the innate immune response to MTB and are associated with TB susceptibility in India. Methods: A SNP database with information regarding the polymorhpisms and their potential influence on protein structure was created. In Hyderabad, India, cohorts of TB patients and healthy controls were generated. 206 patients and 239 controls from Hyderabad, India were analyzed for SNPs in the TLRs 1, 2, 4, 7 and 8. The frequency of the genetic variations subsequently was correlated with TB susceptibility. To test individual responses to MTB lysates, we stimulated human embryonic kidney (HEK) cells transfected with TLR1 variants, as well as PBMCs from genotyped, healthy German individu- als. NF-κB activation and TNF production were assessed respectively after stimulation of the cells. For statistical analysis of the cohorts, a computer software was programmed and potential consequences of the TLR1 SNP on protein structure were modeled in silico. Results: Cohort analysis revealed an association of a TLR1 SNP (248N, rs4833095) and of a TLR8 SNP (1M, rs3764880) with TB protection and an association of a TLR4 SNP (299D, rs4986790) with TB risk in females. Functional studies using HEK cell lines transfected with TLR1-248N and stimulated with MTB showed an increased NF-κB activation of this genetic variant. In addition to this, TLR1-248N expressing PBMCs from healthy controls exhibited an increased TNF response to MTB lysates. The in silico modeling gave evidence of changes in protein structure of TLR1 when the mutation was present potentially explaining the functional consequences. Conclusion: The TLR1-248N SNP is associated with TB protection in an Indian population, leads to an increased immune response to MTB lysate, and potentially to a structural change of this receptor.

In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass sich humane MDSCs aus PBMCs durch Kultivierung und Zugabe von Stimulantien zuverlässig induzieren lassen. Dabei können sowohl monozytäre als auch granulozytäre MDSCs entstehen; dies hängt unter anderem von den zugegebenen Stimulantien ab. In ihrer immunsuppressiven Wirkung konnte bei Proliferationsversuchen mit humanen T-Zellen kein Unterschied zwischen diesen MDSC-Subtypen festgestellt werden. Durch Aktivierung von Toll-like Rezeptoren lassen sich MDSCs in Zellkultur induzieren. Dieser Vorgang ist grundsätzlich unabhängig davon, ob es sich um einen Toll-like Rezeptor handelt, der auf der Zelloberfläche oder intrazellulär an einer Membran lokalisiert ist. Viele Pathogene sind in der Lage, eine Vergrößerung der MDSC-Population hervorzurufen. Dies gilt auch für Kulturüberstand des hier verwendeten Methicillin-sensitiven S. aureus-Stammes RN6390. Im Gegensatz dazu führt Überstand des Methicillin-resistenten S. aureus-Stammes USA 300 zu einer Verhinderung der MDSC-Entstehung. Dieser Effekt wird konzentrationsabhängig vermittelt.

Das humane Hepatitis B Virus (HBV) ist der Erreger der Hepatitis B. Etwa 40% der Weltbevölkerung waren oder sind infiziert und etwa 350 Millionen leiden an einer chronischen HBV Infektion, die jährlich etwa 1 Million Todesfälle verursacht. Das Adeno-assoziierte Virus (AAV) wird in Gentherapieansätzen verwendet. In dieser Arbeit sollte die mögliche Erkennung von HBV und AAV durch das angeborene Immunsystem untersucht werden. Für diese Untersuchung wurde ein neues Protokoll etabliert, um primäre humane Leberzellen zu isolieren und zu kultivieren. Die im Zellkulturmodell erhobenen Ergebnisse weisen auf eine Erkennung beider Viren durch den Toll-like Rezeptor 2 in primären humanen Makrophagen sowie leberständigen Kupfferzellen und Endothelzellen hin. Die Erkennung von HBV wird außerdem von einem weiteren, die Phagozytose des Virus einleitenden Rezeptor unterstützt. Die Ergebnisse bieten neue Erkenntnisse bezüglich der Wichtigkeit der frühen Immunantwort auf HBV und der Effizienz von AAV für Therapieansätze.

Recognition of gram-negative and gram-positive bacteria by innate immune system using “pathogen associated molecular patterns” (PAMP) is mediated by Toll-like receptors (TLRs). Different TLRs share common signalling pathways yet exhibit specificity as well. Periodontal disease is initiated and maintained in the first line by gram-negative but also gram-positive bacterial infection of the gingival sulcus. To date only limited information is available on whether gram-positive and gram-negative bacteria induce different host responses (strength or quality). To elucidate these differential effects this work focused on proinflammatory cytokine releases by assessing ex vivo stimulation of whole blood with heat-killed gram-negative and gram-positive bacteria and thereof derived microbial products associated with distinct TLRs. Tumor necrosis factor-α and interleukin-8 release were measured in the supernatants by enzyme-linked immunosorbent assay. In addition, TLR-transfected HEK-293 cells were stimulated and innate immune responses of peritoneal macrophages from mice lacking TLR2 and TLR4 were tested. The results showed gram-negative and gram-positive species, involved in parodontal disease, inducing distinct patterns of cytokine production. Gram-negative species produced higher amounts of tumor necrosis factor-α while gram-positive species released higher amounts of the chemokine interleukin-8. Data from TLR knockout mice and TLR-transfected HEK-293 cells revealed a somehow specific role of TLR4 and TLR2 for the recognition of gram-negative and gram-positive bacteria. Interestingly F. nucleatum and P. gingivalis differed from the observations made for other gram-negative Bacteria. The revealed data demonstrate that periodontopathogenic gram-negative and gram-positive bacterial species induced different patterns of immunoregulatory activity, which is interpreted as the result of variable activation of different TLRs. These findings were discussed against the backround of parodontal disease and mucosal immunity., Das angeborene Immunsystem erkennt Gram-positive und Gram-negative Bakterien mit Rezeptoren, welche bakterielle Muster („pathogen associated molecular patterns“, PAMP) erkennen. Dabei spielen Toll-like Rezeptoren (TLR) eine zentrale Rolle. Verschiedene TLRs benutzen gemeinsame Signalwege, zeigen jedoch ebenso Unterschiede. Parodontalerkrankungen werden durch eine Besiedlung von Zahntaschen in erster Linie durch Gram-negative, aber auch durch Gram-positive Bakterien hervorgerufen und aufrechterhalten. Bislang gibt es nur begrenzte Erkenntnisse darüber, ob Gram-positive und Gram-negative Bakterien Immunantworten im angeborenen Immunsystem auslösen, welche sich qualitativ oder quantitativ unterscheiden. Um unterschiedliche Effekte der Immunaktivierung zu untersuchen wurde in dieser Arbeit humanes Vollblut ex vivo mit hitzeinaktivierten Gram-positiven und Gram-negativen Bakterien sowie deren Bestandteilen, welche TLRs aktivieren, stimuliert und die Freisetzung proinflammatorischer Zytokine gemessen. In den Stimulationsüberständen wurde mittels ELISA die Freisetzung von TNFα und IL-8 quantifiziert. Zusätzlich wurden TLR-transfizierte HEK-293 Zellen stimuliert und die Immunantwort TLR2- bzw. TLR4-defizienter Mäuse untersucht. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass periodontopathogene Gram-positive und Gram-negative Bakterien unterschiedliche Muster der Zytokinfreisetzung hervorrufen. Gram-negative Erreger bedingten eine höhere Freisetzung von TNFα, während Gram-positive Bakterien eine höhere IL-8 Freisetzung hervorriefen. Versuche an TLR-transfizierten HEK-293 Zellen und TLR-knockout-Mauszellen zeigten die spezifische Rolle von TLR4 bzw. TLR2 bei der Erkennung Gram-negativer bzw. Gram-positiver periodontopathogener Bakterien. Interessanterweise zeigten F. nucleatum und P. gingivalis ein von den oben genannten Beobachtungen für Gram-negative Bakterien abweichendes Bild. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass periodontopathogene Gram-negative und Gram-positive Bakterien unterschiedliche Muster immunregulatorischer Aktivität hervorrufen. Dies wird interpretiert als die Folge der unterschiedlichen Aktivierung verschiedener TLRs. Die Ergebnisse wurden in Zusammenhang der Pathogenese von Parodontalerkrankungen und mukosaler Immunität diskutiert.

Toll-like Rezeptoren (TLR) sind signalgebende Rezeptoren des angeborenen Immunsystems, die nach Kontakt mit Pathogenen eine Immunantwort auslösen und steuern. Diese Rezeptoren erkennen unterschiedliche Komponenten, wie z. B. bakterielles Lipopolysaccharid, Peptidoglykan, Flagellin oder doppelsträngige RNA. In dieser Arbeit wurden die Toll-like Rezeptoren 7 und 8 (TLR7 und TLR8) aus dem Menschen und der Maus identifiziert, kloniert und untersucht. Das Hauptaugenmerk lag auf der Identifizierung der Liganden von TLR7 und TLR8. Als erster Ligand für humanen TLR8 konnte mithilfe eines transienten Transfektionssytems eine Mischung aus den Nukleosiden Guanosin und Uridin identifiziert werden. Diese Beobachtung ließ sich bei murinem TLR8 jedoch nicht bestätigen. Die antivirale Substanz R-848 (Resiquimod) aus der Familie der Imidazoquinoline konnte als erster synthetischer Stimulus für humanen und murinen TLR7 sowie humanen TLR8 beschrieben werden. Über murinen TLR8 konnte wiederum keine Aktivierung von Immunzellen oder Sekretion von Zytokinen durch R-848 festgestellt werden. Im weiteren Verlauf konnte ein weiterer synthetischer Stimulus, der spezifisch für humanen und murinen TLR7 ist, identifiziert werden. Diese Substanz trägt den Namen Loxoribin (7-allyl-7,8-dihydro-8-oxo-guanosin), ist ein Analogon der Purinbase Guanosin und besitzt ebenfalls antivirale und antitumor Aktivität. Die Loxoribin-vermittelte Aktivierung von Immunzellen über TLR7 konnte durch die Verwendung von TLR7-und MyD88-defizienten Mäusen bestätigt werden. Schließlich konnte einzelsträngige GU-reiche RNA als physiologischer Ligand für humanen TLR8 und murinen TLR7 identifiziert werden. Die hier verwendete einzelsträngige RNA wurde in Form von Oligonukleotiden synthetisiert. Die Sequenz stammte aus der GU-reichen U5-Region des Humanen Immundefizienz Virus-1 (HIV-1; RNA40). Zusätzlich wurden noch zwei Varianten dieses RNA-Oligonukleotids synthetisiert, in denen jeweils alle Uridine (RNA41) und alle Guanosine (RNA42) gegen Adenosin ausgetauscht wurden. Im transienten Transfektionssystem konnte sowohl durch RNA40 als auch durch RNA42 eine Induktion von NF-κB durch humanen TLR8 ausgelöst werden. Durch Untersuchungen mit Zellen von TLR7-defizienten Mäusen konnte gezeigt werden, dass die, in den Zellen der Wildtyp-Maus beobachtete Sekretion inflammatorischer Zytokine durch RNA40 (RNA41 und RNA42 zeigten keinen Effekt) in der TLR7-/--Maus komplett aufgehoben war. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass endosomale Reifung für die Aktivierung von TLR7 und TLR8 notwendig ist. Im Gegensatz zu TLR2 und 4, die auf der Zelloberfläche exprimiert werden, ist von TLR9 bekannt, dass er von endosomaler Reifung abhängig ist und in intrazellulären Vesikeln lokalisiert ist. Aufgrund der Sequenzhomologie zu TLR9 wurden TLR7 und TLR8 ebenfalls daraufhin untersucht, ob sie diese Eigenschaft besitzen. Die TLR7 und TLR8-vermittelte Signalweiterleitung konnte konzentrationsabhängig durch die Inhibitoren der endosomalen Reifung, Bafilomycin A1 und Rab5 GTPase-Mutante vermindert werden. In Anlehnung an TLR9 ist dies ein Hinweis darauf, dass auch TLR7 und TLR8 in intrazellulären Kompartimenten exprimiert werden. Gegen den humanen TLR8 wurde ein monoklonaler Antikörper generiert. Dazu wurde auf DNA-Ebene ein Expressionsvektor konstruiert, der die Expression eines hTLR8-Fusionsproteins für die Immunisierung der Maus ermöglicht. Nach Herstellung von genügend Protein wurde die gereinigte extrazelluläre hTLR8-Domäne der Maus injiziert. Es wurden monoklonale Antikörper nach der Methode von Köhler und Milstein generiert. Vier Hybridomklone konnten bestimmt werden, die einen monoklonalen Antikörper gegen humanen TLR8 sezernieren. Toll-like receptors (TLR) are signaling receptors of innate immunity, which elicit and trigger an immune response after contact to a cognate pathogen. These receptors recognize different components, e.g. bacterial lipoploysaccharide, peptidoglycan, flagellin and double-stranded RNA, respectively. In this work, human and murine Toll-like receptors 7 and 8 were identified, cloned and examined. The main focus of this thesis was the identification of ligands for TLR7 and TLR8. First, by using a transient transfection system based on HEK293-cells, a mixture of the nucleosides guanosin and uridine could be identified as a ligand for human, but not murine TLR8. The antiviral compound R-848 (resiquimod) which belongs to the family of imidazoquinolines was first identified as synthetic stimulus for human TLR8 and murine TLR7. In further studies another synthetic compound could be identified activating exclusively human and murine TLR7. This compound named loxoribine (7-ally-7,8-dihydro-8-oxo-guanosine) is an analog of the purinbase guanosine and features antiviral and antitumor activity. The loxoribine-mediated activation of immune cells via TLR7 could also be shown by the utilization of TLR7- and MyD88-deficient mice. Finally, single-stranded GU-rich RNA oligonucleotides could be defined as the first physiological ligand for human TLR8 and murine TLR7. The sequence was derived from the GU-rich U5-region of human immunodeficiency virus-1 (HIV-1, RNA40). Two further variants of this RNA-oligonucleotide were synthesized in which all uridines or all guanosines, were replaced by adenosines, respectively. In our transient transfection system, a induction of NF-κB through human TLR8 could be elicited either by RNA40 or RNA42. Further, TLR7-deficient murine cells showed a complete abolishment of the wildtype-cells specific secretion of inflammatory cytokines after stimulation with RNA40 (In this context, neither RNA41 nor RNA42 showed any effect). In addition, it could be shown that activation of TLR7 and TLR8 is depending on endosomal maturation. In contrast to TLR2 and 4, which are expressed on the cell surface, TLR9 is known to be localized in intracellular vesicles and to be contingent on endosomal maturation. Due to the sequence homology among TLR9, TLR7 and TLR8 we examined if TLR7 and TLR8 also showed these characteristics. TLR7 and TLR8 mediated signaling could be decreased concentration-dependent by the inhibitors of endosomal maturation, bafilomycin A1 and Rab5 GTPase-mutant. Therefore TLR7, 8 and 9 form a subfamily within the TLRs that is expressed in intracellular compartments and recognizes intracellular nucleic acids. In further addition, a monoclonal antibody was generated against human TLR8. First, an expression vector was constructed enabling the expression and subsequent purification of a human TLR8-fusion-protein. After producing sufficient amounts of protein, mice were injected for immunization. Antibody secreting hybridomas were generated using the protocol established by Kohler and Milstein and four clones secreting a monoclonal antibody against human TLR8 were established.

Plasmazytoide Dendritische Zellen (pDZ) stellen im Immunsystem von Säugetieren eine extrem kleine Zellfraktion dar, die auf virale oder mikrobiologische Stimulation mit der Produktion großer Mengen von Interferon-alpha (IFN-alpha) reagiert. Im Rahmen dieser Arbeit, wurde ein Kultursystem etabliert, mit dem es möglich ist, diesen Zelltyp aus murinen Knochenmark zu generieren. Der Phänotyp der in vitro generierten pDZ sowie die Fähigkeit IFN-alpha zu produzieren wurde vor und nach Stimulation mit synthetischen Liganden für die Toll-like Rezeptoren (TLR) -2, -3, -4, -7 und -9 genauer untersucht. Es zeigte sich, dass die pDZ am besten auf die Liganden für TLR7 (Resiquimod, R-848) und TLR9 (CpG-DNA) reagierten. Bei den CpG-DNA Stimulationen zeigte sich aber auch, dass es große Unterschiede bei der IFN-alpha Produktion gibt, je nach dem welcher Typ an CpG-DNA verwendet wurde. Als kritische Komponente für die IFN-alpha Produktion konnte eine poly-Guanosin-Kette am 3’-Ende des CpG-Oligonukleotides identifiziert werden. Durch die Verwendung von TLR9 defizienten Mäusen konnte zudem gezeigt werden, dass die Produktion von IFN-alpha als Reaktion auf den natürlichen Stimulus Herpes simplex Virus-1 sowohl über TLR9 abhängige als auch unabhängige Wege erfolgt. Plasmacytoid dendritic cells (pDC) represent a very rare cell population within the mammalian immune system. This cell fraction is characterized as the main producer of Interferon-alpha (IFN-alpha) after microbial or viral stimulation. One intention of this work was to establish a culture system to generate pDC in vitro derived from murine bone marrow cells. The phenotype as well as the ability to produce high amounts of IFN-alpha was tested before and after stimulation of the generated cells with synthetic ligands for the Toll-like receptors (TLR) -2, -3, -4, -7 and -9. Best immunological reactions has been achieved after stimulations with the ligands for TLR7 (Resiquimod, R-848) and TLR9 (CpG-DNA).Within the CpG-DNA stimulations it turned out that there are great differences in the ability to induce production of high amounts of IFN-alpha depending on the CpG-DNA type. The Guanosin-chain at the 3’ end of the CpG-Oligonucleotide could be identified as the critical component for IFN-alpha production. In addition, with the utilization of TLR9 knock out mice it was possible to show that IFN-alpha production, due to stimulation with Herpes-simplex Virus -1, depends on a TLR9 dependent as well as a TLR9 independent signaling-pathway.

Die Rolle der Mastzelle (MC) als Effektorzelle in IgE-abhängigen Prozessen wie der Typ I Allergie ist seit langem bekannt. In den letzten Jahren konnte gezeigt werden, dass MC in weitere pathophysiologische Prozesse wie der Tumorentwicklung, rheumatoiden Arthritis, chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen (CED), Gewebsfibrose und Arteriosklerose involviert sind. Aber auch bei physiologischen Prozessen, z.B. der Abwehr von bakteriellen und parasitären Erkrankungen, der Wundheilung und Angiogenese sowie der Neuro-Immun-Interaktion, spielen MC eine Rolle. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Rolle menschlicher Darm-MC bei der Immunantwort gegen Pathogene untersucht. Es wurden zwei Fragestellungen bearbeitet: 1. Exprimieren menschliche Darm-MC Toll-like Rezeptoren (TLR), die konservierte Strukturen von Bakterien und Viren erkennen, und sind sie durch TLR-Liganden aktivierbar? 2. Führt die Infektion menschlicher Darm-MC mit verschiedenen E. coli und Shigellen Stämmen zur Aktivierung und welche Mechanismen liegen dieser Aktivierung zugrunde? Hierfür wurden MC mittels mechanischer und enzymatischer Aufbereitung aus der Mukosa chirurgischer Darmresektate isoliert. Nach Aufreinigung durch Positivselektion und mehrwöchiger Kultur betrug die MC-Reinheit 98-100%. Es konnte gezeigt werden, dass menschliche Darm-MC mRNA für TLR 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8 und 9 exprimieren, allerdings tolerant gegenüber TLR-Liganden sind. Stimulation menschlicher Darm-MC mit LPS (Lipopolysaccharide, TLR 4 Ligand), LTA (Lipoteichonsäure, TLR 2 Ligand), Zymosan (TLR 2 Ligand), poly I:C (polyinosinic-polycytidylic acid, TLR 3 Ligand), R848 (TLR 7/8 Ligand), CpG (C poly G oligo-desoxy-nucleotide, TLR 9 Ligand) bzw. Non CpG führten weder zur Freisetzung von Histamin, Leukotrienen, TNF-alpha oder IL-8, noch zur mRNA-Expression von TNF-alpha oder IL-8. Ähnliche Ergebnisse wurden nach Infektion menschlicher Darm-MC mit dem Stuhlisolat E. coli (O101:H-) oder dem probiotischen Stamm E. coli Nissle 1917 beobachtet. Selbst die pathogenen Bakterien-Stämme, wie der invasive S. flexneri M90T und der FimH-exprimierende E. coli ORN 103(pSH2), induzierten keine signifikante Freisetzung der oben genannten Mediatoren. Zwar führten E. coli Stämme bei menschlichen Darm-MC zur Aktivierung der intrazellulären Signalmoleküle und Transkriptionsfaktoren ERK1/2, c-Fos und AP1. Diese Aktivierung reichte allerdings nicht aus, um eine vollständige Immunantwort auszulösen. Interessanterweise bewirkten die hämolytischen E. coli Stämme ATCC 25922 und 35218 eine starke Aktivierung menschlicher Darm-MC. Mit Hilfe isogener Hämolysin-negativer E. coli Mutanten und der Hämolysin positiven Transformante des probiotischen E. coli Nissle 1917 konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass menschliche Darm-MC sensible Effektorzellen für E. coli alpha Hämolysin sind. Sublytische Hämolysin Konzentrationen führten bei menschlichen Darm-MC über einen Kalzium-abhängigen Signalweg zur mRNA-Expression von TNF-alpha, IL-3, IL-5, IL-6, IL-8 und zur Freisetzung von Histamin und Leukotrienen. Der Einsatz von Inhibitoren intrazellulärer Signalmoleküle zeigte weiterhin, dass die durch Hämolysin bedingte Aktivierung der Zellen abhängig von L-Typ Kalzium Kanälen, Calcineurin und NFAT bzw. NFkappaB ist. Ansteigende Hämolysinkonzentrationen führten zur zweiten Phase der Aktivierung, die durch eine Lyse der Zellen gekennzeichnet war. The role of mast cells (MC) as effector cells in IgE dependent processes like the type 1 allergy has been known for a long time. During the decade, it has been shown that MC are also involved in other pathophysiological processes such as mucosal polyposis, rheumatoid arthritis, inflammatory bowl disease, tissue fibrosis, and atherosclerosis. Furthermore, MC play an important role in the regulation of host defense against microbes, tissue remodeling processes, and neuro-immunology-interaction. The first aim of the present study was to clarify the question whether human intestinal MC express toll-like receptors (TLR), which recognize conserved bacterial and viral components, and can MC be activated through TLR-ligands. The second major focus of the present study was to investigate if the stimulation of human intestinal MC with different E. coli and Shigella strains, respectively, results in an activation of MC and to identify the underlying mechanism(s). Accordingly, human intestinal MC were isolated from surgery tissue with a mechanical and enzymatical protocol. The purity of the MC cultures used in all experiments was between 98 and 100% which was achieved by positive selection (MACS). We could show, that human intestinal MC express mRNA for TLR 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, and 9. However, neither the stimulation with LPS (lipopolysaccharide, TLR 4 ligand), LTA (lipoteichoic acid, TLR 2 ligand), Zymosan (TLR 2 ligand), poly I:C (polyinosinic-polycytidylic acid, TLR 3 ligand), R848 (TLR 7/8 ligand), CpG (C poly G oligo-desoxy-nucleotide, TLR 9 ligand) and non CpG, respectively resulted in a release of histamine, leucotriens, TNF-alpha, or IL-8. Furthermore, mRNA expression levels of TNF-alpha and IL-8 were not induced by any of the treatments. Similar results where found when human intestinal MC were stimulated with E. coli (O101:H-) isolated from human faeces or the probiotic strain E. coli Nissle 1917. Even after stimulation with pathogenic bacteria strains such as the invasive S. flexneri M90T and the fimbriated E. coli, respectively, no induction of any of the parameters mentioned above was found. However, E. coli strains activate the intracellular signal molecule and transcription factors ERK1/2, c-Fos, and AP1, but this activation failed to induce a complete immune answer. In contrast, the hemolytic E. coli stains ATCC 25922 and ATCC 35218 provoked strong activation of intestinal MC. Using the isogenic hemolysin negative E. coli mutants and the hemolysin positive transformants of the probiotic E. coli Nissle 1917 it was shown, that human intestinal MC are sensitive target cells for E. coli alpha hemolysin. Stimulation of MC with sublytic concentration of hemolysin resulted in an induction of TNF-alpha, IL-3, IL-5, IL-6, IL-8 mRNA expression, the release of histamine as well as leucotrien. This activation was found to be regulated by calcium dependent signal cascades. Inhibition of intracellular signal molecules showed that the activation depends on L-typ calcium channels, calcineurin, NFAT and NFkappaB. Prolonged infection with hemolytic E. coli strains resulted in lysis of intestinal MC indicating a biphasic activation of hemolysin.

Das allergische Asthma ist eine chronisch entzündliche Erkrankung der Atemwege, die mit einer erhöhten Mukusproduktion, verschiedenen strukturellen Veränderungen der Atemwege und der Entwicklung einer Atemwegshyperreagibilität einhergeht. Die Vielfalt der Faktoren, die zur Initiation, Progression und Chronifizierung dieser Erkrankung beitragen ist ebenso komplex, wie ihr Phänotyp. In epidemiologischen Studien konnten bislang neben genetischen Faktoren auch Umweltfaktoren, wie der Lebens- und Hygienestandard, mit der Entwicklung dieser Erkrankung assoziiert werden. Daneben wurden im Rahmen der Hygiene-Hypothese Einflüsse identifiziert, die eher mit einem erniedrigten Risiko für die Entwicklung dieser Erkrankung einhergehen. Ganz besonders kontrovers wird in diesem Zusammenhang die Rolle viraler Infektionen der Atemwege beschrieben, wie sie durch das Respiratory Syncytial Virus (RSV) oder Rhinoviren verursacht werden. Solche Infektionen verursachen zumeist eine Exazerbation des bereits etablierten Asthmas, werden allerdings, zumal wenn sie im Kindesalter auftreten, sowohl mit einer initialisierenden wie auch mit einer protektiven Wirkung in Zusammenhang gebracht. Möglicherweise spielen dabei virale Toll-like Rezeptor- (TLR-) Liganden, wie virale einzel- bzw. doppelsträngige RNA eine bedeutende Rolle. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde speziell die Wirkung dieser TLR-3- bzw. TLR-7-Liganden auf die allergische Sensibilisierungs- bzw. Entzündungsreaktion untersucht. Im Mausmodell für das allergische Asthma konnte durch die systemische Applikation von synthetische TLR-3- oder TLR-7-Liganden die allergische Sensibilisierungsreaktion vollständig verhindert werden. Bei bereits erfolgter allergischer Sensibilisierung war die sekundäre Entzündungsreaktion in der Lunge nach Allergen-Rechallenge deutlich vermindert, wenn zuvor virale TLR-Liganden appliziert wurden. Sowohl die Infiltration eosinophiler Granulozyten, wie auch der Lymphozyten in das Lungengewebe als auch die bronchiale Hyperreagibilität waren signifikant erniedrigt. Daneben fanden sich Hinweise auf die Initiation einer allergenspezifischen TH1-Antwort. Da nach intra-peritonealer Injektion synthetischer TLR-3- bzw. TLR-7-Liganden Peritonealmakrophagen mit der Produktion von Interleukin 12 (IL-2) reagierten, wurde weiterhin die Rolle von IL-12 in diesem Zusammenhang näher charakterisiert. In sensibilisierten IL-12p35 defizienten Tieren hatte die Applikation viraler TLR-Liganden keine Verminderung der allergischen Entzündungsreaktion in der Lunge zur Folge. Auch die Atemwegshyperreagibilität blieb unverändert. Somit könnte die protektive Wirkung viraler Infektionen im Kindesalter auf eine durch virale TLR-Liganden induzierte TH1-Antwort basieren, die auf eine allergenspezifische TH2-Antwort gegenregulatorisch wirkt. Dieser Effekt scheint zumindest zum Teil durch IL-12 mediiert zu sein. Um die Rolle weiterer Faktoren innerhalb des Chronifizierungsprozesses des allergischen Asthmas zu charakterisieren wurde innerhalb der vorliegenden Arbeit ein Mausmodell etabliert, das den Phänotyp dieser Erkrankung möglichst komplett widerspiegelt. Durch eine zwölf-wöchige Allergenexposition wurde in sensibilisierten Mäusen eine chronische Entzündung der Atemwege induziert, die lymphozyten-domininiert ist und über einen Zeitraum von mindestens sechs Wochen nach Allergenkontakt persistiert. Die chronische Atemwegsentzündung ist dabei mit umfangreichen strukturellen Veränderungen der Atemwege, wie einer subepithelialen Fibrose, einer Becherzellhyperplasie und dem vermehrten Vorkommen von Fibroblasten und Myofibroblasten in der Atemwegswand assoziiert. Im Gegensatz zu vergleichbaren Modellen waren wiesen diese Tiere eine deutlich verstärkte Atemwegshyperreabilität sowie eine persistierende Atemweflusslimitation auf. In diesem Modell wurde nach vierwöchiger Allergnprovokation, die eine profunde Atemwegsentzündung allerdings ohne strukturelle Atemwegsveränderungen hervorrief, die weitere Infiltration eosinophiler Graulozyten durch die Applikation eines CCR-3-Antagonisten verhindert, um die Rolle dieser Zellen innerhalb des Chronifizierungsprozesses zu untersuchen. Durch die Applikation des CCR-3-Antagonisten konnte nicht nur die Infiltration eosinophiler Granulozyten, sondern auch eine subepitheliale Fibrose verhindert werden. Weiterhin zeigten diese Tiere eine erhebliche Verbesserung der Atemwegsreabilität. Somit spielen eosinophile Granulozyten eine entscheidende Rolle innerhalb der Prozesse, die sowohl in einem strukturellen Umbau der Atemwege wie auch in einer gesteigerten Atemwegsreagibilität resultieren., Allergic bronchial asthma is a chronic inflammatory disease of the airways that is characterized by increased mucus production, airway remodeling and development of airway hyperreactivity. The variety of factors contributing to the initiation, progression and chronification of this disease is as complex as its phenotype. Epidemiological studies identified genetic as well as environmental factors such as live and hygiene standards involved in the development of the disease. Furthermore few factors were identified that are associated with an abased risk for the development of allergic asthma. This observation led to the formation of the hygiene-hypothesis. Especially the role of viral infections of the airways mainly by respiratory syncytial virus (RSV) and rhino viruses is discussed controversially within this context. These infections represent the main cause of exacerbation when asthma has already been established, however, when appearing during early childhood they are associated with protective as well as with triggering effects on asthma development. Possibly viral toll-like receptors (TLRs) such as single or double stranded viral RNA play an important role within this context. It was part of this study to characterize the effects of viral TLR-3 or TLR-7 ligands on allergic sensitization as well as on allergic inflammation. In a murine model of allergic asthma the allergic sensitization could be completely suppressed by systemic application of synthetic TLR-3 and TLR-7 ligands. In already sensitized animals systemic application of synthetic TLR-ligands resulted in significant reduction of the secondary allergic reaction after allergen-rechallenge as characterized by diminished infiltration of eosinophils and lymphocytes into airway tissue and normalisation of airway reactivity to metacholine. Furthermore, hints on the initiation of a TH1-immune response could be identified. Because peritoneal macrophages produced large amounts of interleukin 12 (IL-12) after intra-peritoneal application of synthetic TLR3 as well as TLR-7 ligands, the role of IL-12 was further elucidated. The systemic application of synthetic TLR-3 as well as TLR-7 ligands did neither result in reduction of allergic airway inflammation nor in normalization of airway reactivity. Therefore, the protective effect of viral infections during early childhood may base upon a TLR ligand induced TH1 immune-response counterbalancing the allergen-specific TH2-immune response. This effect seems to be in parts mediated by IL-12. For the identification of factors contributing to the chronification of allergic bronchial asthma it was further scope of this study to establish an animal model that is able to reflect the human phenotype of this disease as close as possible. A chronic allergic airway inflammation was induced in sensitized animals by allergen exposure for about twelve weeks. This inflammation mainly consists of lymphocytes that persist in the airway mucosa even without allergen contact. Chronic airway inflammation was further associated with considerably stuctural changes of the airway wall as characterized by subepithelial fibrosis, goblet cell hyperplasia and increased numbers of fibroblasts and myofibroblasts. In contrast to other animal models of chronic allergic asthma airway hyperresonsiveness did not resolve over time and a persistant airflow limitation was observed. To further elucidate the mechanisms underlying the observed chronification of the asthmatic phenotype a CCR-3 antagonist was applied systemically for at least eight weeks starting after for weeks of allergen challenge. Antagonisation of CCR-3 resulted in marked reduction of the eosinophil infiltration in airway tissue as well as in broncho-alveolar lumen und was further associated with lack of subepithelial fibrosis. Besides, CCR-3 antagonist treated animals revealed complete normalisation of airway reactivity to metacholine. Therefore, eosinophils seem to play a major role within the process of chronification of allergic bronchial asthma, that lead to airway remodelling as well as to increased airway reactivity.

The respiratory tract is shielded by a multi-component host defense system that involves structural, physical and functional mechanisms. Secretions of the airways contain proteins and peptides that directly kill pathogens or modulate the inflammatory response. It was the aim of this study to investigate the innate immune response of the respiratory tract and of bronchiolar epithelial cells to bacterial infections under the influence of cigarette smoke and allergic inflammation. First, the innate immune response of human bronchiolar epithelial cells (HBEC) was characterized in vitro. Toll-like receptors could be detected in HBEC. Furthermore, HBEC could be activated by pathogens and parts of pathogens like flagellin. This activation resulted in increased expression of cytokines, chemokines and antimicrobial peptides (AMP). Next, the concentration of the two AMP LL-37/hCAP18 and human β-defensin 2 (hBD-2) was measured in airway secretions of patients with community acquired pneumonia and patients with chronic obstructive pulmonary disease (COPD). In the case of COPD patients there was a corellation between the level of inflammation and the concentration of AMP. During an exacerbation significantly increased concentrations of AMP could be detected. Smoking increases the susceptibility to pulmonary infection and is the most important risk factor for the development of COPD. Chronic infection likely contributes to the development of COPD. In this study is postulated that cigarette smoke inhibits the activation of components of the innate immune system in response to a bacterial infection. With sensitive ex-vivo analysis the level of hBD-2 in pharyngeal washing fluids of patients with community acquired pneumonia was measured. Current or former smoking was associated with a significant suppression of hBD-2 levels. In vitro experiments showed that exposure of differentiated airway epithelium to smoke inhibits the induction of hBD-2 by bacteria and that this effect is mediated by reactive oxygen species. These findings show that smoke suppresses the induction of innate immune functions and implicate this mechanism in the pathogenesis of pneumonia and COPD. The allergic inflammation of the respiratory tract is associated with incresead levels of Th2-cytokines. In the present study is shown that Th2-cytokines suppress defensin expression of HBEC in vitro. Furthermore, in vivo studies with a murine asthma model showed that the allergic inflammation leads to a defect in the defense of a bacterial infection. This defect was connected with a delayed clearence of the bacterial infection, with a reduced release of pro-inflammatory cytokines, an inhibited influx of neutrophils into the lung and a reduced release of the AMP CRAMP into the lung. The present study shows that airway epithelium is an active player in the innate immune response of the lung and that cigarette smoke and allergic inflammation inhibit the activation of components of the innate immune system in response to bacterial infections., Die Atemwege des Menschen sind von einem mehrzelligen Epithel ausgekleidet. Dieses Atemwegsepithel ist nicht nur eine physikalische Barriere für Pathogene, sondern auch aktiv an der angeborenen Immunität beteiligt. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, Komponenten der angeborenen Immunantwort des Respirationstrakts und des Atemwegsepithels bei bakterieller Entzündung unter Einfluß von Zigarettenrauch und allergischer Entzündung zu charakterisieren. Als erstes wurde die angeborene Immunantwort von Atemwegsepithelzellen in vitro untersucht. Es zeigte sich, daß Atemwegsepithelzellen Toll-like Rezeptoren (TLR) exprimieren und sich durch Pathogene sowie deren Bestandteile aktivieren lassen. Dies zeigte sich in der Induktion von Zytokinen, Chemokinen und antimikrobiellen Peptiden. Als nächstes wurden die beiden antimikrobiellen Peptide LL-37/hCAP-18 und hBD-2 in Atemwegssekreten von Pneumoniepatienten und Patienten mit COPD (chronic obstructive pulmonary disease) basierend auf einem α1-Antitrypsin-Mangel nachgewiesen. Im Fall der Patienten mit COPD ergab sich ein Zusammenhang zwischen Entzündung und den Konzentrationen von hBD-2 und LL-37/hCAP-18. Während einer Exazerbation waren die Konzentrationen von hBD-2 und von LL-37/hCAP-18 signifikant höher als nach dem Abklingen der Exazerbation. Rauchen ist die wichtigste Ursache für chronische Bronchitis und COPD. Es wurde daher die Auswirkung von Zigarettenrauch auf die angeborene Immunität von Atemwegsepithelzellen untersucht. Es ergab sich, daß Zigarettenrauch in vitro einerseits zu einer MAP Kinasen und NF-κB abhängigen Abgabe pro-inflammatorischer Zytokine führte, anderseits aber Rauch die durch Bakterien induzierte Expression von β-Defensinen hemmte. Es zeigte sich weiter, daß an der geminderten β-Defensin Expression reaktive Sauerstoffspezies beteiligt sind. In Rachenspülwassern von Patienten mit einer Pneumonie ergab sich eine negative Korrelation zwischen der Konzentration des β-Defensins hBD-2 und den „Packyears“, d.h. der Menge an gerauchten Zigaretten. Bei der allergischen Entzündung des Respirationstrakts spielen Th2-Zytokine eine Rolle. Die in dieser Studie durchgeführten in vitro Experimente zeigten, daß Th2-Zytokine die Expression von β-Defensinen bei Atemwegsepithelzellen hemmen. In vivo Studien in einem murinen Asthma-Modell ergaben darüber hinaus, daß die allergische Entzündung zu einem Abwehrdefekt bei einer bakteriellen Infektion führt. Dieser Abwehrdefekt, der sich in einer verzögerten Klärung der bakteriellen Infektion zeigte, konnte auf eine geminderte Abgabe pro-inflammatorischer Zytokine, einen geminderten Einstrom von neutrophilen Granulozyten und eine geminderte Abgabe des antimikrobiellen Peptids CRAMP zurückgeführt werden. Die vorliegende Studie zeigt, daß das Atemwegsepithel aktiv an der angeborenen Immunität beteiligt ist und daß äußere Einflüsse wie Zigarettenrauch aber auch eine allergische Entzündung das Abwehrsystem der Lunge beeinflussen.