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Die vorliegende Arbeit beschreibt die biochemische und strukturelle Charakterisierung von Schlüsselenzymen verschiedener essentieller Stoffwechselwege. Die Kristallstrukturen der Transketolase (TK) aus Zea mays und der 3,4-Dihydroxy-2-butanon 4-phosphat Synthase (DBPS) aus Candida albicans konnten durch molekularen Ersatz gelöst werden. Die Struktur der DBPS im Komplex mit Ribulose 5-phosphat zeigte eine bisher bei Ortholog-Strukturen nicht beobachtete Konformation des für die Katalyse essentiellen sauren Loops, welche offenbar auf die Abwesenheit zweiwertiger Kationen zurückzuführen ist. Die TK-Struktur im Komplex mit Thiaminpyrophosphat wurde zur Erstellung eines modellierten Enzym-Substrat-Komplexes herangezogen. Die GTP-Cyclohydrolase I aus Arabidopsis thaliana konnte als erstes pflanzliches Ortholog löslich in E. coli exprimiert werden. Daten der Gleichgewichtssedimentationsanalyse weisen im Gegensatz zu früheren Berichten auf das Vorliegen eines Homotetramers hin. This work describes the biochemical and structural characterization of key enzymes of different essential metabolic pathways. The crystal structures of transketolase (TK) of Zea mays and 3,4-dihydroxy-2-butanone 4-phosphate synthase (DBPS) of Candida albicans were solved using molecular replacement techniques. The structure of DBPS in complex with ribulose 5-phosphate uncovered a hitherto unknown conformation of the catalytically essential acidic loop. This conformation obviously occurs only in the absence of divalent cations. The crystal structure of TK in complex with thiamine pyrophosphate was used to build a model of the enzyme-substrate-complex. As the first ortholog of the plant kingdom, GTP-cyclohydrolase I of Arabidopsis thaliana was expressed solublely in a recombinant E. coli -system. Sedimentation equilibrium centrifugation of the purified enzyme indicated the existence of a homotetramer, in contrast to former reports suggesting a homodimer.

Der Sauerstoffsensormechanismus in Paraganglien von Säugern ist bisher nicht vollständig geklärt. Die aus dem Nebennierenmark der Ratte isolierte Tumorzelllinie (PC12) eignet sich auf Grund ihrer hohen Sensitivität gegenüber O2-Schwankungen als Modell für O2-chemosensitive Zellen. Hypoxie induziert in PC12-Zellen eine vermehrte ROS-Bildung sowie eine Zunahme der TH- und ADM-Genexpression. In PC12-Zellen sind Mitochondrien für den Hypoxie-bedingten ROS-Anstieg verantwortlich. Es existieren verschiedene Erkenntnisse, die für eine Beteiligung der ein Hämprotein und drei Eisenschwefelcluster enthaltenden Succinatdehydrogenase, die gleichzeitig Komplex II der mitochondrialen Atmungskette darstellt, im Sauerstoffsensormechanismus sprechen. Eine mögliche Beteiligung von Komplex II in der Hypoxie-bedingten ROS-Bildung und Hypoxie-induzierten Zunahme der TH- und ADM-Genexpression wurde durch die Inkubation mit spezifischen Komplex II-Inhibitoren untersucht. Die vermehrte Transkription der TH- und ADM-mRNA unter Hypoxie wurde anhand der quantitativen RT-PCR gemessen. Die ROS-Produktion wurde nach Zugabe des Fluoreszenzindikators 2´7´-Dichlorfluorescin (DCF-DA) am Fluoreszenzmikroskop untersucht. Die Ergebnisse dieser Studie sprechen für eine partielle Beteiligung von Komplex II in der Hypoxie-bedingten ROS-Produktion. Hypoxie induziert in PC12-Zellen eine Zunahme der ROS-Produktion und einen Anstieg der TH- und ADM-mRNA, wobei diese vermutlich über separate Wege reguliert werden.

Stickstoffmonoxid (NO) spielt eine bedeutende Rolle in der Regulation des Blutdruckes, es ist ein starker Vasodilatator. Mäuse mit genetisch inaktivierter endothelialer Stickstoffmonoxidsynthase (eNOS-/-) haben einen Bluthochdruck. Mäuse mit fehlender neuronaler NO-Produktion (nNOS-/-) zeigen einen erniedrigten Blutdruck in Narkose. Im Gegensatz dazu konnte in der Literatur eine Hemmung der Katecholaminfreisetzung durch neuronal gebildetes NO gezeigt werden. Es war deshalb das Ziel dieser Studie, die Kreislaufparameter von eNOS-/- und nNOS-/- Mäusen im wachen Zustand in Ruhe und unter Stress zu untersuchen. Außerdem wurde untersucht, ob nNOS die Expression des Schlüsselenzyms der Katecholaminsynthese, Tyrosinhydroxylase (TH), hemmt und die hämodynamische Antwort auf Stress abschwächt. Acht nNOS-/-, neun eNOS-/- und neun Wildtypkontrollmäuse (WT) erhielten einen Femoralarterienkatheter. Blutdruck und Herzfrequenz sowie die Körperkerntemperatur wurden 24h nach der Operation unter wachen Bedingungen in Ruhe und bei Erhöhung der Umgebungstemperatur aufgezeichnet. Die Tyrosinhydroxylase-mRNA-Expression und -Proteingehalt der Nebennieren wurden mittles RT-PCR und Western Blot bestimmt. In Ruhe zeigten eNOS-/- und nNOS-/- Mäuse einen signifikant erhöhten mittleren und diastolischen Blutdruck im Vergleich zu Wildtypkontrollen. Während des Hitzestresses war der initiale Blutdruckabfall bei den eNOS-/- Mäusen signifikant vermindert. Der stressinduzierte Anstieg von Blutdruck und Herzfrequenz war deutlich verstärkt bei nNOS-/- Mäusen im Vergleich zu WT und eNOS-/- Mäusen. Die TH-mRNA-Expression war zehnfach erhöht bei nNOS-/- Mäusen im Vergleich zu WT. Auch der Proteingehalt der Nebennieren war dreifach erhöht in nNOS-/- im Vergleich zu WT. Diese Ergebnisse zeigen, dass endothelial gebildetes NO hauptsächlich an der thermoregulatorischen Vasodilatation der Hautgefäße beteiligt ist. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass neuronal gebildetes NO die TH-Expression hemmt und die sympathisch vermittelte Stressantwort vermindert., Nitric oxide (NO) plays an important role in the circulatory regulation, it is a very potent vasodilator. Mice deficient of a functional endothelial NO synthase (eNOS-/-) exhibit hypertension. Mice lacking a functional neuronal NO production (nNOS-/-) were observed to be hypotensive under anaesthesia. In contrast, evidence from the literature suggests an inhibition of catecholamine release by NO derived from nNOS. Therefore it was the aim of this thesis to evaluate the circulatory parameters in eNOS-/- and nNOS-/- under conscious conditions at rest and in reponse to stress. Additionally, it was tested if nNOS inhibits the expression of the key enzyme of the catecholamine synthesis, tyrosine hydroxylase, and thereby reduces the hemodynamic responses to stressful stimuli. Eight nNOS-/-, nine eNOS-/-, and nine wild type controls (WT) were chronically instrumented with femoral artery catheters. 24h after surgery,resting blood pressure and heart rate were measured and then mice were exposed to an elevated ambient temperature. Arterial blood pressure together with heart rate and core temperature were recorded in conscious animals. Tyrosine hydroxylase mRNA expression and protein content in the adrenal gland were measured by RT-PCR and western blotting, respectively. At rest, eNOS-/- and nNOS-/- exhibited a significantly elevated mean and diastolic blood pressure compared to WT. During heat stress, the initial decrease in blood pressure seen in WT and nNOS-/- was significantly blunted in eNOS-/-. The stress-induced acceleration of heart rate and increase in blood pressure were much stronger in nNOS-/- compared to WT and eNOS-/- . TH mRNA expression was ten times larger in nNOS-/- than in WT. Correspondingly, protein content in the adrenal gland was increased threefold in nNOS-/- compared to WT. The results of this thesis indicate that endothelial derived NO predominantly mediates the thermoregulatory vasodilatation. Furthermore, it shows that neuronally derived NO inhibits TH expression and, therefore, limits the sympathetically-mediated responses to stressful stimuli, such as heat stress.