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Titel und Inhalt 1 Einleitung 1 1.1 Speiseröhrenkrebs (Ösophaguskarzinom) 1 1.2 Apoptose: der programmierte Zelltod 3 1.3 Zellzyklusregulation 5 1.4 Der periphere Benzodiazepinrezeptor und seine Liganden 5 1.5 Fragestellung 12 2 Material 13 2.1 Antikörper 13 2.2 PCR-Primer 13 2.3 Zellkulturmedien, Zusätze, Chemikalien 14 2.4 Kits 15 3 Methoden 16 3.1 Zellbiologische Methoden 16 3.2 Molekularbiologische Methoden 23 3.3 Proteinchemische Methoden 28 3.4 Statistik 31 4 Ergebnisse 32 4.1 Charakterisierung von Primärzellkulturen humaner Ösophaguskarzinome 32 4.2 PBR-Expression in humanen Ösophaguskarzinomen 32 4.3 Aufnahmekinetiken von NBD-FGIN-1-27 36 4.4 Wachstumsstudien an Ösophaguskarzinom-Zellkulturmodellen 37 4.5 Bestimmung der Zytotoxizität von PBR-Liganden 42 4.6 Apoptoseinduktion durch PBR-Liganden 42 4.7 Zellzyklusuntersuchungen 50 4.8 Modulation extrazellulär regulierter Kinasen durch PBR-Liganden 52 4.9 Transkriptionelle Effekte von PBR-Liganden 55 5 Diskussion 61 5.1 PBR-Liganden als innovative Therapeutika für fortgeschrittene Ösophaguskarzinome 61 5.2 Der PBR, ein antiapoptotisches und proliferationsförderndes Protein 72 5.3 Abschließende Betrachtungen 76 6 Zusammenfassung 77 7 Summary 79 8 Literaturverzeichnis 81 9 Publikationsverzeichnis 95 9.1 Originalarbeiten 95 9.2 Übersichtsarbeiten 95 9.3 Eingereicht zur Veröffentlichung 95 9.4 Vorträge 96 9.5 Kurzveröffentlichungen und Posterabstracts 96 9.6 Auszeichnungen und Preise 99 10 Danksagung 100 11 Lebenslauf 101, Der periphere Benzodiazepinrezeptor (PBR) ist ein mitochondriales, transmembranäres Protein. Es ist mit dem permeability transition pore complex assoziiert, der eine Bedeutung für die Induktion mitochondrialer Apoptosesignalwege besitzt. In verschiedenen Tumorentitäten ist der PBR überexprimiert und besitzt vermutlich eine funktionelle Bedeutung für die Entstehung und Progression der Tumore. Die Modulation des PBR mittels spezifischer, exogener Liganden stellt daher eine Möglichkeit zur Entwicklung neuartiger pharmakologischer Therapiestrategien und zur Aufklärung der Funktion des PBR dar. Ziel dieser Arbeit war es, diesen Ansatz am Beispiel des Ösophaguskarzinoms zu untersuchen, das für seine sehr schlechte Prognose bekannt ist und dessen chemotherapeutische Behandlungsmöglichkeiten bisher unbefriedigend sind. Hierzu wurden Experimente an zwei Zelllinien der beiden histologischen Typen des Ösophaguskarzinoms, des Plattenepithel- und des Adenokarzinoms, sowie an Primärzellkulturen von humanen Ösophaguskarzinomen durchgeführt. Bei den Zelllinien KYSE-140 (Plattenepithel-) und OE-33 (Adenokarzinom) sowie allen Primärzellkulturen und auch Gewebeschnitten von Ösophaguskarzinomen wurde die Expression des mitochondrialen PBR nachgewiesen. In etwa einem Drittel der untersuchten Schnitte wurde zudem eine Überexpression des PBR im Tumorgewebe gezeigt. Der knockdown des PBR mittels antisense-Technologie führte in Ösophaguskarzinomzellen zu einer Wachstumsinhibition. Daher könnte der PBR im Ösophaguskarzinom eine Bedeutung für die Proliferation besitzen. PBR-Liganden hemmten dosis- und zeitabhängig die Proliferation der Ösophaguskarzinomzelllinien. Die Wirkung der Liganden beruhte sowohl auf der Induktion von Apoptose als auch auf einem Zellzyklusarrest am G1/S-Kontrollpunkt. Am Beispiel des PBR-Liganden FGIN-1-27 konnte der Mechanismus der PBR-Ligand-induzierten Apoptose und des Zellzykusarrests gezeigt werden: Zunächst wird der Zusammenbruch des mitochondrialen Membranpotenzials induziert, anschließend die Caspase-3-Aktivierung, die wiederum zur Aktivierung der p38MAPK führt. Dies bewirkt in der Folge zum einen die Fragmentation der DNA, zum anderen vermittelt die p38MAPK-Aktivierung den Zellzyklusarrest am G1/S-Kontrollpunkt. Die antiproliferativen Wirkungen der PBR-Liganden waren mit transkriptionellen Veränderungen Apoptose- und Zellzyklus-relevanter Gene assoziiert: Mittels cDNA-Array-Technologie und semiquantitativer RT-PCR wurde in beiden Ösophaguskarzinomzelllinien nach Behandlung mit PBR-Liganden eine starke Überexpression der growth arrest and DNA-damage-inducible-Gene gadd153 und gadd45 nachgewiesen, die von der Phosphorylierung der p38MAPK abhängig war. Die gadds sind als Apoptoseinduktoren und Regulatoren des Zellzyklus bekannt. Weiterhin wurde eine Aktivierung der ERK1/2 durch PBR-Liganden nachgewiesen. Die Hemmung dieses antiapoptotischen und mitogenen Stimulus führte zu einer überadditiven Steigerung der Apoptoseinduktion und der Zellzyklusarretierung durch PBR-Liganden. Die Aktivierung von ERK1/2 durch PBR-Liganden könnte die Basis für künftige Kombinationstherapien bilden. Der PBR stellt damit eine interessante Zielstruktur für die innovative pharmakologische Therapie von Ösophaguskarzinomen dar. Die mögliche klinische Anwendbarkeit der hier vorgestellten innovativen Therapiekonzepte sollte künftig durch in-vivo- Modelle und klinische Studien evaluiert werden., The periphal benzodiazepine receptor (PBR) is a mitochondrial transmembrane protein. It is associated with the permeability transition pore complex which participates in mitochondrial apoptosis pathways. PBR is overexpressed in various tumor entities and may be of functional relevance for tumorigenesis and tumor progression. Thus, the modulation of PBR by specific exogenous ligands represents a promising strategy for the development of innovative drug therapies and for the elucidation of PBRýs function. The aim of this study was to investigate this approach using esophageal carcinoma as a model, which is known for its very poor prognosis and the lack of curative treatment modalities. Experiments were performed using two established esophageal cancer cell lines representing the two different histologies, squamous cell and adenocarcinoma, as well as primary cell cultures of human esophageal carcinoma. The expression of the mitochondrial PBR was shown both in KYSE-140 (squamous cell) and OE-33 (adenocarcinoma) cell lines, all primary cell cultures, and tissues of esophageal carcinoma. One third of the histological sections displayed an overexpression of PBR in the tumor tissue versus normal mucosa. In KYSE-140 cells, the specific knockdown of PBR by antisense technology led to growth inhibition. Thus, PBR may regulate the proliferation of esophageal cancer cells. PBR ligands were shown to inhibit the proliferation of esophageal cancer cells in a time- and dose-dependent manner. The drug effects were due to an induction of apoptosis and an arrest of the cell cycle at the G1/S checkpoint. The mechanism of PBR-ligand-induced apoptosis and cell cycle arrest was then elucidated: A disruption of the mitochondrial membrane potential precedes and is required for caspase-3 activation elicited by PBR ligands. Caspase-3-activation then leads to p38MAPK activation which in turn induces DNA fragmentation and G1/S cell cycle arrest. The antiproliferative effects of PBR ligands were found to be associated with transcriptional alterations of genes involved in the regulation of apoptosis and cell cycle: Using cDNA microarrays and semi-quantitative RT-PCR, a strong up-regulation of the growth arrest and DNA-damage-inducible genes gadd45 and gadd153 was observed in response to PBR ligands. The expression of gadd genes was shown to be regulated by p38MAPK. Gadd genes are known regulators of apoptosis and cell cycle. Moreover, a PBR-ligand-mediated activation of the mitogenic and anti-apoptotic ERK1/2 was demonstrated. The inhibition of ERK1/2 activation led to an over-additive increase of apoptosis and cell cycle arrest caused by PBR ligands. The activation of ERK1/2 by PBR ligands may help to design combination therapies in the future. In conclusion, PBR represents an interesting target for the innovative pharmacological treatment of esophageal carcinoma. The transfer of these innovative therapeutic concepts to the clinical situation should be evaluated in vivo and in clinical studies in the future.