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Die Methanbildung aus H2 und CO2 ist die einzige Energie-liefernde Reaktion in vielen methanogenen Archaeen. Pro Mol gebildetem Methan werden vier Mol H2 verbraucht. Der Wasserstoff wird dabei durch Hydrogenasen aktiviert, wovon es in den meisten hydrogenotrophen Methanbildnern drei unterschiedliche [NiFe]-Hydrogenasen und eine [Fe]-Hydrogenase gibt. Von den vier Hydrogenasen ist die F420-reduzierende [NiFe]-Hydrogenase die quantitativ wichtigste, da sie über reduziertes F420H2 vier der acht zur CO2 Reduktion benötigten Reduktionsäquivalente bereitstellt. F420 ist ein 5 ́-Deazaflavinderivat, das zwar strukturell einem Flavin ähnelt, sich aber funktionell wie ein Pyridinnukleotid verhält, in dem es ein Hydrid und nicht einzelne Elektronen übertragen kann. Das Redoxpotential Eo ́ von F420 ist mit -360 mV aber um 40-mV negativer als das von NAD und NADP. Die Reduktion von F420 mit H2 (Eo ́= -414 mV) erfolgt daher auch nahe am thermodynamischen Gleichgewicht, insbesondere unter physiologischen Bedingungen, unter denen der H2-Partialdruck in Kulturen von methanogenen Archaeen sehr viel niedriger als ein Bar ist. Ziel der vorliegenden Arbeit war, die Struktur von FrhABG aufzuklären, wofür es eine Reihe unterschiedlicher Motive gab. Zum einen ist es die funktionelle Reversibilität, die dieses Enzym von allen bisher strukturell untersuchten Hydrogenasen unterscheidet. Zum anderen gehört FrhABG zur phylogenetischen Gruppe 3 [NiFe]-Hydrogenasen, von denen es noch keine Strukturen gibt; alle bisher strukturell aufgeklärten NiFe-Hydrogenasen gehören der Gruppe 1 an. Und letztlich, weil der FrhABG Komplex die Untereinheit B enthält, die phylogenetisch verwandt ist mit Untereinheiten, die in anderen F420-abhängigen Enzymen vorkommen wie in den F420- abhängigen Formiat Dehydrogenase, F420-abhängigen Glutamat-Synthase, F420-abhängigen Sulfit- Reduktase, den F420H2:Quinon-Oxidoreduktase und F420H2:Phenazin-Oxidoreduktase Komplexen, von denen es ebenfalls noch keine Strukturen gibt. Der F420-reduzierende FrhABG Komplex wurde aus Methanothermobacter marburgensis gereinigt. Nach 100-facher Anreicherung wurde eine homogene Präparation mit einer spezifischen Aktivität von 280 U/mg und einem apparenten Km für F420 von 40 μM erhalten. Die Präparation mit einer apparenten Molmasse von über 1000 kDa enthielt die drei Untereinheiten A, B und G im Verhältnis 1 zu 1 zu 1. Die makromolekulare Struktur von FrhABG legte es nahe, den multimeren Komplex zunächst Cryo-elektronenmikroskopisch (Cryo-EM) zu charakterisieren, was mit einer einmaligen Auflösung bis ~4 Å gelang. Auf Grund der hohen Auflösung war es möglich, das Kohlenstoffrückrad in die Elektronendichte zu modellieren. Das Heterotrimer bildet einen (FrhABG)12 Komplex mit einer molekularen Masse von etwa 1215 kDa. Dabei werden die Trimerisierung und die Multimerisierung hauptsächlich über Salzbrücken stabilisiert. Parallel zu den Cryo-EM Untersuchungen wurden Kristallisationsversuche von FrhABG durchgeführt. Die Kristallstruktur konnte bis zu einer Auflösung von 1.8 Å verfeinert werden, was eine exakte Analyse insbesondere der Metallzentren erlaubte. In der Kristallstruktur ist das [NiFe]-Zentrum in der FrhA Untereinheit viel deutlicher zu erkennen, als in der Cryo-EM Struktur. Das Nickelatom wird durch vier Cystein-Thiolate koordiniert, wobei zwei dieser Thiolate zusätzlich eine Brücke zu dem Eisenatom bilden. Weiter ist zu erkennen, dass das Eisen drei diatomische Liganden trägt, sehr wahrscheinlich ein CO und zwei CN-. Trotz des hohen Konservierungsgrads des aktiven [NiFe]-Zentrums, gibt es in seiner Umgebung ein paar markante Aminosäureaustausche, die unsere Vorstellung über Hydrogenasen erweitern. In der FrhG Untereinheit mit drei [4Fe4S]-Clustern weist das proximale [4Fe4S]-Cluster eine ungewöhnliche, in anderen [NiFe]-Hydrogenasen noch nicht beschriebene Koordinierung mit einem Aspartat anstelle eines Cysteins auf. Ebenfalls ungewöhnlich ist, dass der mediale Cluster ein [4Fe4S]- und nicht ein [3Fe4S]-Cluster ist und dass der mediale und distale [4Fe4S]-Cluster in eine Ferredoxin- ähnliche Struktur eingebettet sind. In der FrhB Untereinheit sind das [4Fe4S]-Cluster und das FAD, welches eine ungewöhnlich gestauchte Konformation aufweist, gut aufgelöst. Die Distanz zwischen dem [4Fe4S]-Cluster und dem FAD liegt bei 7,5 Å. FAD ist so angeordnet, dass es in van-der-Waals-Kontakt zu F420 kommt und ein Hydrid von F420H2 von der pro-S-Position akzeptieren kann, was aus Modellierungen hervorgeht. Um zu zeigen, dass FrhB tatsächlich die Untereinheit ist, an der F420 reduziert wird, wurde das Gen frhB aus Methanocaldococcus jannaschii in Escherichia coli überproduziert, gereinigt und charakterisiert. Die heterolog produzierte Untereinheit hatte eine molekulare Masse von etwa 31 kDa und enthielt sowohl FAD und als auch ein Eisen-Schwefel-Cluster. Das rekombinante Enzym katalysierte die Oxidation von F420H2 mit Benzylviologen als Elektronenakzeptor mit einer spezifischen Aktivität von 15 U/mg Protein, verlor aber seine Aktivität schnell, insbesondere beim Einfrieren. Diese und vorläufige Elektronenspinresonanzspektroskopische (ESR) Untersuchungen zum Redoxpotential der einzelnen [4Fe4S]-Cluster werden in Kapitel 3 der vorliegenden Arbeit beschrieben.