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Der universelle intrazelluläre second messenger, cyclisches 3‘,5‘-Adenosinmonophosphat (cAMP), wird durch die Enzymgruppe der Adenylatcyclasen (ACn) gebildet. In Mammalia liegen neun von zehn Adenylatcyclase (AC) Isoformen als membrangebundene Proteine vor. Die Regulation dieser Enzyme aufgrund extrazellulärer Signale erfolgt indirekt über eigenständige Transmembranrezeptoren, i.d.R. G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCRs). In der Vergangenheit wurde für den Membrananker der ACn, der bis zu 40 % des Proteins umfasst, trotz einer evolutionären Konservierung von mehr als 400 Millionen Jahren, bisher keine eindeutige physiologische Funktion identifiziert. Des Weiteren zeigen die hexahelikalen Membrandomänen der ACn eine strukturelle Ähnlichkeit zu hexahelikalen Rezeptordomänen bakterieller Quorum sensing (QS) Systeme. Dies deutet auf eine bisher unbekannte physiologische Funktion des Membranankers der ACn hin. Der Austausch eines bakteriellen AC-Membranankers durch die Rezeptordomäne des QS Systems zeigte eine Stimulierung der Aktivität der entstandenen Chimäre durch den Liganden und bestätigt die Übertragung eines extrazellulären Signals auf die intrazelluläre katalytische Domäne. Ein zusätzlicher stark konservierter Sequenzabschnitt der ACn, das Cyclase-Transducer-Element (CTE), ist für die erfolgreiche Signalübermittlung essenziell. Dies lässt eine Rezeptorfunktion für bisher unbekannte Liganden vermuten. Der Austausch beider hexahelikaler Membrananker der humanen AC (hAC) Isoform 2 ergab eine Regulation der Gsα induzierten Stimulation durch den QS-Liganden. Hier zeige ich, dass sowohl Humanes Serum (HS) als auch Fötales Rinderserum (FBS) die Gsα-stimulierte Mammalia AC-Aktivität konzentrationsabhängig hemmt. Dies bestätigt i) die erfolgreiche Signaltransduktion und ii) suggeriert die Existenz bisher unbekannter AC-Liganden im Serum. Für die Charakterisierung der Liganden wurde das Serum auf unterschiedliche Stoffklassen untersucht. Verschieden aufgearbeitetes Rinderserum zeigte, dass Bestandteile des Immunsystems als mögliche Liganden nicht in Frage kommen. Eine chromatographische Auftrennung der Serumproteine und die anschließende Proteomanalyse deutete einige Proteine als potenzielle Liganden an. Eine Regulierung der AC-Aktivität durch diese Proteine blieb auch in Gegenwart von Gsα aus und zeigte, dass die Liganden keine Proteine sind. Die Extraktion des Serums mit polaren Lösungsmitteln bei saurem pH überführte die hemmenden Komponenten in die organische Phase. Dies favorisiert stark saure Lipide als Liganden. Die zukünftige Identifizierung von Lipiden als extrazelluläre Liganden der ACn würde eine Rezeptorfunktion der hAC Membrananker bestätigen. Damit eröffnet sich eine neue Dimension der Regulation von ACn und der Bildung des universellen second messengers cAMP, sowie der damit verbundenen Stoffwechselwege.

Class III adenylate cyclases are important transmitters for external signals into the intracellular second messenger cAMP. According to sequence similarities, they are classified into four distinct classes, IIIa-d. Among them, the classes IIIa and IIIb stand out the most not only for being present in both prokaryotic and eukaryotic cells but also for carrying a large hexahelical membrane anchor with a potential regulatory function. Previous work on membrane-bound adenylate cyclases has indicated the ability to perceive extracellular signals through the similarly structured quorum sensors CqsS and LqsS from V. harveyi and L. pneumophila. However, a possible regulatory mechanism by the membrane anchors has not been defined yet. One of 26 cyclases from S. meliloti, CyaCSm, shows a noteworthy similarity to succinate:quinone oxidoreductases regarding its membrane anchor. It is a monomer consisting of one 6TM domain, a ferredoxin domain, and a catalytic domain. According to UV-Vis measurements, four highly conserved histidine residues are binding two heme B molecules as a prosthetic group in the first four α-helices of the membrane anchor. Hence, specifically replacing these residues by alanine demonstrated that these histidines are responsible for binding of heme B. Subsequently, in vivo and in vitro measurements of these mutants indicated a significant decrease in AC activity. The hypothesis of AC regulation by the quinone Q0 and its reduced counterpart Q0H2 has been confirmed in this work. Experiments have shown a nearly threefold increase in cyclase activity under reduced (addition of Q0H2) to oxidized (addition of Q0) conditions. The formation of cAMP in mammalian cells is mainly regulated by GPCRs through the binding of the dissociated G protein subunit Gsα to the intracellular catalytic dimer. So far, direct regulation by an extracellular ligand for these adenylate cyclases has not been shown. First in vitro experiments on the effect of several hormones and neurotransmitters on the human adenylate cyclase isoform 5 showed no significant changes in the amount of produced cAMP after activation with Gsα. Only the addition of heat-inactivated human serum resulted in a significant inhibition of the Gsα-stimulated cyclase. This observation not only indicated the structural ability of the catalytic domains to recognize external signals, but also emphasizes the existence of a ligand in blood serum. The identification of ligands provides the basis for future research.

Adenylatcyclasen (ACn) sind ubiquitär in Pro- und Eukaryoten und wandeln extrazelluläre Reize in ein einheitliches intrazelluläres cAMP-Signal (3', 5'-cyclic AMP-Signal) um. Viele bakterielle sowie die meisten eukaryotischen ACn besitzen Membrananker mit sechs Transmembranhelices und kurzen, sie verbindenden Schlaufen. Eine Funktion für den überdimensionierten Membrananker (˃40% des Proteins) konnte bislang nicht nachgewiesen werden. Im Gegensatz zu den indirekt über G-Protein-gekoppelten Rezeptoren regulierten eukaryotischen ACn bleibt das Regulationssignal für prokaryotische ACn mit wenigen Ausnahmen unklar. Durch den Tausch des Membranankers der mykobakteriellen Rv1625c gegen den baugleichen Quorum-Sensing-Rezeptor CqsS (Cholera quorum sensing Sensor) von Vibrio harveyi wurde eine membranverankerte und aktive AC erzeugt, welche durch den für CqsS spezifischen Liganden CAI-1 (Cholera Autoinducer-1) direkt reguliert wurde. Zudem zeigten verschiedene Punktmutationen innerhalb des Membranankers und ein Austausch ganzer Transmembranhelices gegen die Aminosäuresequenz eines homologen QS-Rezeptors, dessen Beteiligung an einer Liganden-vermittelten Signalweiterleitung. Ebenso konnte bewiesen werden, dass die Signaltransduktion eine Homodimerisierung der Membrandomäne benötigt und diese, im Falle von CqsS (V. harveyi), irreversibel ist. Die Daten unterstützen die Hypothese, dass die Membrananker der Klasse III ACn Rezeptoren sind und die AC-Regulation in Bakterien und Wirbeltieren einem gleichen Regulationsmechanismus unterworfen ist. Dies würde eine neue Dimension in der direkten AC-Regulierung zusätzlich zu der indirekten Regulierung von GPCRs in eukaryotischen Organismen eröffnen.

Meningeome sind hauptsächlich benigne Gehirntumore, deren primäre Behandlung die mikrochirurgische Resektion ist. Trotz radikaler Exstirpation neigen auch benigne Meningeome zur Bildung von Rezidiven (10-30%), deren weitere Behandlung auf Grund eines Mangels an chemotherapeutischen Therapien deutlich eingeschränkt ist. Bei der Entwicklung einer chemotherapeutischen Behandlung von benignen Tumoren müssen neben der Wirksamkeit des Medikaments auch mögliche Nebenwirkungen mit in Betracht gezogen werden, da diese den Patienten nicht unverhältnismäßig belasten sollten. Um verlässliche und reproduzierbare Ergebnisse bei der Verwendung von Meningeomprimärzellkulturen zu erhalten, war die Etablierung neuer sensitiver Methoden unerlässlich. Dazu gehörte die Auswahl eines optimalen Referenzgens für quantitative Real-Time PCR sowie die Optimierung der neuen Methode Taqman® Protein Assay für verschiedene Proteine unter anderem für aktive Caspase-3 als Apoptosenachweis. Für einen sicheren Apoptosenachweis ist es sinnvoll, zwei unterschiedliche Methoden zu verwenden, die zudem an verschiedenen Punkten im Ablauf der Apoptose messen. Als eindeutigen apoptotischen Nachweis wurden folgende Methoden angewandt: die immunhistochemische Färbung von einzelsträngiger DNA (ssDNA), Western Blot-Nachweis von geschnittener PARP1 und die Quantifizierung von aktiver Caspase-3 mit Hilfe von Taqman® Protein Assay. Während das Auftreten aktiver Caspase-3 und geschnittener PARP1 Kriterien früher Apoptose darstellen, kennzeichnet die Fragmentierung von DNA das Spätstadium der Apoptose. Der immunhistochemische Nachweis von ssDNA wurde dem wesentlich häufiger verwendeten TUNEL-Test vorgezogen, da der TUNEL-Test kein spezifischer Apoptosenachweis ist. Taqman® Protein Assay ist eine erst kürzlich entwickelte hochsensitive Methode zur Proteinquantifizierung, welche Antikörper mit Hilfe des „Proximity Ligation Assays“ mit der quantitativen Real-Time PCR verbindet. Die immunzytologische Färbung von ssDNA wies die Induktion von Apoptose in Meningeomen nach einer 24-stündigen Behandlung mit 2 µM Farnesol nach. Außerdem konnte gezeigt werden, dass die mit dem Taqman® Protein Assay quantifizierte Expression von aktiver Caspase-3 mit der mit Hilfe eines Western Blots nachgewiesenen geschnittenen PARP1-Expression korrelierte. Dabei wies der Taqman® Protein Assay eine signifikant höhere Sensitivität auf als ein klassischer Western Blot. Zudem konnte gezeigt werden, dass Farnesol in sehr niedrigen Dosen unterschiedlich auf Meningeome wirkt. Während in Gruppe 1 die Expression von aktiver Caspase-3 erst nach 2-stündiger Gabe von 2 µM Farnesol abrupt anstieg, erhöhte sich in Gruppe 2 der aktive Caspase-3 Level mit steigender Farnesol-Konzentration. Damit konnte mit Hilfe des Taqman® Protein Assay für aktive Caspase-3 demonstriert werden, dass aktive Caspase-3 bereits in sehr geringen Konzentrationen in Meningeomen zuverlässig detektiert und quantifiziert werden kann. Mit Hilfe der quantitativen Real-Time PCR und dem Taqman® Protein Assay war es möglich zu zeigen, dass Meningeome den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktorrezeptor 2 (VEGFR2) nur wenig bzw. nicht exprimieren. Zudem weisen Meningeome eine erhöhte thrombozytärer Wachstumsfaktorrezeptor beta (PDGFRbeta)- und eine reduzierte PDGFB-Expression auf. Meningeomprimärzellkulturen, die mit exogenem VEGF stimuliert wurden, wiesen eine deutlich erhöhte Proliferation auf. Wurde PDGFRbeta vor der Gabe von exogenem VEGFA gehemmt, hob sich dieser proliferierende Stimulus auf. Außerdem konnte belegt werden, dass VEGFA vergleichbar wie PDGFB konzentrations-abhängig die Tyrosin-Phosphorylierung von PDGFRbeta induziert. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde die Wirkung verschiedener Tyrosinrezeptor-Inhibitoren verglichen. Sunitinib, ein bereits zugelassenes Chemotherapeutikum, welches vorzugsweise KDR aber auch PDGFRbeta hemmt, beeinträchtigte die Migration von Meningeomen in gleicher Weise wie Tandutinib, das eine hohe Aktivität gegenüber PDGFRbeta aufweist aber eine sehr geringe Aktivität gegenüber KDR. Zudem konnte gezeigt werden, dass Gambogic Acid ebenso die Zellmigration von Meningeomen beeinträchtigt und dabei die VEGFA-induzierte PDGFRbeta-Tyrosinphosphorylierung unterdrückt. Damit ist es gelungen zu beweisen, dass erstens VEGFA in Meningeomen die Zellmigration hauptsächlich durch PDGFRbeta und nicht durch KDR reguliert und dass zweitens Gambogic Acid ein potenter Inhibitor des Meningeomwachstums in vitro ist. Meningiomas are mostly benign brain tumors. The primary treatment is microsurgical resection. Meningiomas are prone to develop recurrences (10-30%) despite radical extirpation, whose further treatment is significantly restricted due to the lack of chemotherapeutical therapies. In the development of a chemotherapeutical treatment of benign tumors not only the efficacy of a drug has to be taken into consideration but also possible side effects, so the patient is not disproportionately strained. To obtain reliable and reproducible results using primary meningioma cell cultures it was essential to establish more sensitive methods. This included die selection of an optimal reference gene for quantitative Real-Time PCR as well as the optimization of the new method Taqman Protein Assay for various proteins for example active caspase-3 for apoptosis detection. For reliable apoptosis detection two different methods should be used, which in addition measure at different points in the apoptotic process. For the distinct detection of apoptosis the following methods were used: immunohistochemical staining of single-stranded DNA (ssDNA), determination of cleaved PARP1 using western blot, and the quantification of active caspase-3 using Taqman® Protein Assay. Whereas the appearance of active caspase-3 and cleaved PARP1 are a hallmark of early apoptosis, fragmentation of DNA characterizes late-stage apoptosis. The immunohistochemical detection of ssDNA was chosen over the commonly used TUNEL test, because TUNEL is not specific for apoptosis. Taqman® Protein Assay is a recently developed highly sensitive method for protein quantification, which utilizes antibodies and proximity ligation for quantitative Real-Time PCR. The immunohistochemical staining of ssDNA showed the induction of apoptosis in meningiomas after treatment with 2 µM farnesol for 24 hours. Expression of active caspase-3, which was quantified using the Taqman® Protein Assay, correlated with cleaved PARP1 expression, which was determined using western blot. Thereby the Taqman® Protein Assay exhibited a significantly higher sensitivity than the western blot. In addition, low concentrations of farnesol affected meningiomas differently. In group 1 the expression of active caspase-3 increased abruptly after treatment with 2 µM farnesol for 2 hours, whereas the level of active caspase-3 rose with increasing farnesol concentration. Summarizing the study showed, that Taqman® Protein Assay for active caspase-3 is able to reliably detect and quantify active caspase-3 in very low concentrations in meningiomas. Using quantitative Real-Time PCR and Taqman® Protein Assay it was possible to demonstrate, that meningiomas express little to none vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2) in vitro and in vivo. In addition, meningiomas display an increased platelet-derived growth factor receptor beta (PDGFRbeta) expression level and show a reduced PDGFB expression. Primary meningioma cell cultures, which were stimulated with exogenous VEGFA, exhibited a significant higher proliferation rate. If PDGFRbeta was inhibited before administration of exogenous VEGFA, this proliferative stimulus was abolished. Furthermore VEGFA induced concentration-dependent PDGFRbeta tyrosine phosphorylation comparable to PDGFB-induced PDGFRbeta tyrosine phosphorylation. Based on these results several tyrosine receptor inhibitors were tested. Sunitinib, an already approved chemotherapeutic agent, which inhibits preverentially KDR, but also inhibits PDGFRbeta, equally impaired migration of meningioma cells as tandutinib, which displays a high activity towards PDGFRbeta but a low activity towards KDR. Moreover gambogic acid equally impaired cell migration of meningiomas and also suppressed VEGFA-induced PDGFRbeta tyrosine phosphorylation. In the first place the study established that VEGFA regulates cell migration mostly through PDGFRbeta not KDR in meningiomas. Secondly it was able to show, that gambogic acid is a potent inhibitor of meningioma cell growth in vitro.

Rc1900c, eine Adenylatcyclase aus Mycobacterium tuberculosis, besteht aus einer N-terminalen alpha/beta-Hdrolase-Domäne und einer C-terminalen Cyclase-Domäne. Das Enzym zeigt eine außergewöhnliche Guanylatcyclase-Seitenaktivität von 7%. Ein kanonisches Lysin, das die Substratbindung definiert, und ein katalytisches Asparagin sind in Säugeradenylatcyclasen unerlässlich für Cyclaseaktivität. Sie entsprechen bei Rv1900c den Positionen N342 und H402. Über Mutationsanalyse konnte gezeigt werden, dass diese Aminosäurereste für die Aktivität von Rv1900c nicht zwingend notwendig sind. Strukturen der Cyclasedomäne mit einem ATP Analogon bilden asymmetrische Homodimere. Die nicht-kanonischen Aminosäurereste N342 und H402 zeigen keine Interaktion mit dem Substrat. Rv1900c, a Mycobacterium tuberculosis adenylyl cyclase, is composed of an N-terminal alpha/beta-hydrolase domain and a C-terminal cyclase homology domain. It has an unusual 7% Guanylyl cyclase side-activity. A canonical substrate defining lysine and a catalytic asparagine indispensable for mammalian adenylyl cyclase activity correspond to N342 and H402 in Rv1900c. Mutagenic analysis indicates that these residues are dispensable for activity of Rv1900c. Structures of the cyclase homology domain with an ATP analog form asymmetric homodimers. The noncanonical N342 and H402 do not interact with the substrate.

Das Gen CyaB1 aus dem Cyanobakterium Anabaena sp. PCC 7120 codiert für eine Adenylatcyclase, die aus zwei N-terminalen GAF-Domänen (GAF-A und GAF-B), einer PAS-Domäne, einer Klasse-IIIb-AC katalytischen Domäne und einer TPR-ähnlichen Domäne besteht. Die katalytische Domäne von CyaB1 wurde kinetisch charakterisiert und mit Punktmutationen wurden die durch Sequenzvergleiche vorhergesagten katalytischen Aminosäuren verifiziert. Mit Rekonstitutionsversuchen von Punktmutanten, die einzeln inaktiv sind, wurde die Bildung katalytisch aktiver Homodimere nachgewiesen. Die spezifische Aktivität des Holoenzyms stieg exponentiell mit der Inkubationszeit an, da das Reaktionsprodukt cAMP dosisabhängig und nukleotidspezifisch als Aktivator der enzymatischen Aktivität (EC50 bei 1 µM) fungiert. Damit wurde erstmalig cAMP als GAF-Domänen Ligand identifiziert. Punktmutationen in der GAF-A oder GAF-B Domäne von CyaB1 zeigten, dass für die Aktivierung eine Bindung von cAMP an die GAF-B Domäne erfolgt. Das cyanobakterielle GAF-Domänen Ensemble konnte gegen das GAF-A/-B-Ensemble der cGMP stimulierten Ratten-PDE-2 ausgetauscht werden und verwandelte CyaB1 in eine cGMP stimulierte Adenylatcyclase. Das demonstriert die funktionelle Konservierung des bewährten Prinzips der Aktivierung durch GAF-Domänen, das vor über 3 Milliarden Jahren entwickelt wurde und sich in alle Phyla ausbreitete.Weitergehende Versuch mit einzeln ausgetauschten oder deletierten GAF-Domänen sowie Chimären mit der mycobakteriellen AC Rv1625c zeigen, dass Tandem-GAF-Domänen nur als fein aufeinander abgestimmtes Ensemble funktionieren. In Cyanobakterien könnte CyaB1 als cAMP gesteuerter Nano-Schalter zur Stabilisierung einmal getroffener Entwicklungsentscheidungen dienen. The gene cyaB1 from cyanobacterium Anabaena sp. PCC 7120 codes for a modular protein consisting of two N-terminal GAF (GAF-A and GAF-B) domains and a PAS and single class III adenylyl cyclase catalytic domain. The kinetics of the catalytic domain were characterised and the catalytic active amino acids were defined using point mutations. The adenylyl cyclase is active as a homodimer as demonstrated by reconstitution from complementary inactive point mutants. The specific activity of the recombinant and purified holoenyzme increased exponentially with time because the reaction product cAMP dose-dependently and nucleotide-specifically activated cyaB1 (half-maximally at 1µM). This established cAMP as a novel GAF domain ligand. Using inactivating point mutants of either GAF-A or GAF-B domain revealed that cAMP activated cyaB1 via the GAF-B domain. We replaced the cyanobacterial GAF domain ensemble in the cyaB1 adenylyl cyclase by the GAF-A/GAF-B assemblage from the rat cGMP-stimulated phosphodiesterase type 2. This way we converted the cyanobacterial adenylyl cyclase to a cGMP-stimulated adenylyl cyclase and established in principle the functional conservation of the GAF domain ensemble over more than 2 billion years since the divergence of bacterial and eukaryotic lineages. Further experiments using single GAF-domain deletionmutants and chimeric proteins with single PDE-2 GAF-domains or the catalytic domain of the mycobacterial adenylyl cyclase Rv1625c revealed that the GAF-domains work as a delicate fine tuned ensemble.