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Mit weltweit über 1,5 Millionen Todesfällen pro Jahr ist das Bronchialkarzinom ein häufig auftretendes und gleichzeitig aggressives Malignom. Eine späte Diagnose und limitierte Therapiemöglichkeiten sind die Hauptursachen dafür, dass die Prognose, trotz neuer Therapieansätze, oft immer noch schlecht ist. Auch beim seltener auftretenden Pleuramesotheliom ist die Prognose schlecht mit limitierten Therapiemöglichkeiten. Dies sind wichtige Gründe, warum bei beiden Krankheitsbildern dringend neue Therapien benötigt werden. Ein Ansatz könnte eine RNA-Interferenz vermittelte Hemmung bestimmter, für die Tumorzelle wichtiger Proteine darstellen. So gibt es bereits Studien, die siRNA als Therapie gegen verschiedene Krankheitsbilder aus diversen medizinischen Fachbereichen testen. In dieser Arbeit wurden mit SRF-siRNA, Survivin-siRNA, HIF1α-siRNA, HIF2α-siRNA, E2F1-siRNA und STAT3-siRNA siRNAs appliziert, die die Bildung von Proteinen inhibieren, welche an der Zellproliferation und Wachstum beteiligt sind. Insgesamt zeigten die Untersuchungen der Genexpression und der Zellzahl ein unterschiedliches Verhalten der verschiedenen Zelllinien auf die Transfektion mit den siRNAs, selbst wenn der gleiche histologische Subtyp vorlag. Die Großzellige Bronchialkarzinomzelllinie NCI-H640 reagierte auf den siRNA vermittelten Knockdown mit der größten Reduktion der Zellzahl. Der Knockdown von Survivin reduzierte die Zellzahl bei allen Zelllinien am wirksamsten. Als langfristiges Ziel steht die Behandlung von Patienten mit siRNA, die an einem Bronchialkarzinom oder einem MPM leiden. Dafür müssen die Effekte einer Therapie mittels RNAi in vivo geprüft werden. Unsere in vitro Ergebnisse legen allerdings nah, dass mit der richtigen siRNA in der idealen Konzentration, große Effekte erzielt werden könnten. In allem suggeriert diese Arbeit, dass eine personalisierte, multimodale Therapie zur Verbesserung des Überlebens unerlässlich ist. So könnte der Einsatz von siRNA vor allem Patienten in fortgeschrittenen Stadien oder mit chemoresistenten Tumoren als alternative adjuvante oder neoadjuvante Therapie, z.B. in Form einer isolierten Lungenperfusion, von großem Nutzen sein.

Eine der häufigsten Ursachen für die Entwicklung einer Herzinsuffizienz ist die dilatative Kardiomyopathie. Deren Entstehung liegt in bis zu 50% eine genetische Ursache zugrunde. Die dabei wirkenden molekularen Mechanismen sind nicht zufriedenstellend verstanden. In Vorversuchen unserer Arbeitsgruppe ist mit dem Calsarcin 1 defizienten Mausmodell gearbeitet worden, welche eine dilatative Kardiomyopathie mit linksventrikulärer Dilatation und Induktion der Hypertrophie assoziierten fötalen Gene ohne Hypertrophie der Kardiomyozyten entwickeln. Ausgehend von diesem Modell ist die microRNA, miR 301 3p, als herunterreguliert identifiziert worden. Ziel dieser Studie war nun die Identifizierung kardialer Zielstrukturen der miR 301a und deren Charakterisierung. Im Verlauf ist Cofilin 2 als Zielstruktur der miR 301a entdeckt worden, was durch Mutation der Bindestellen und Nachweis der in vitro Regulation verifiziert worden ist. Passend zu der verminderten Expression der miR 301a in den Calsarcin 1 defizienten Tieren zeigt sich eine verstärkte Cofilin 2 Expression bei gleichem Phosphorylierungsstatus, welcher auf eine vermehrte Cofilin¬ 2 Aktivität hindeuten kann. Weitere Mausmodelle des Herzversagens haben ebenfalls erhöhte Expressionsniveaus von Cofilin 2 gezeigt. Im Widerspruch zu den Calsarcin 1-/- Tieren ist hier auch miR 301a vermehrt exprimiert. Die hauptsächliche Expression sowohl von miR-301a als auch von Cofilin 2 findet sich dabei in Kardiomyozyten und weniger in kardialen Fibroblasten. Funktionell zeigen miR 301a und Cofilin 2 eine Übereinstimmung in der Regulierung des Serum Response Faktors, da miR 301a inhibierend und Cofilin 2 stimulierend auf die Aktivität des Serum Response Faktors wirken. In neonatalen Kardiomyozyten führt Cofilin 2 zu einer Induktion der Hypertrophie assoziierten Gene ohne Hypertrophie zu induzieren. Zusammenfassend implizieren die erhobenen Daten eine Beteiligung der miR 301a und Cofilin 2 in der Pathogenese der dilatativen Kardiomyopathie.

Rho Family GTPase 1 (RND1) und Myeloid Leukemia Factor 1 (MLF1) sind zwei „Stretch“-abhängig regulierte Proteine, die bereits in neonatalen Rattenkardiomyozyten identifiziert und nun näher charakterisiert wurden. Es konnte gezeigt werden, dass RND1 vorwiegend nukleär und perinukleär auftritt und überexprimiert zu vergrößerten Zellleibern, der Reinduktion des fötalen Genprogrammes (Nppa, Nppb) und zu einem Anstieg der Rcan1-4-Expression führt. Die durch „Stretch“ und die Behandlung mit Phenylephrin ausgelösten Hypertrophie-erzeugenden Prozesse wurden durch RND1-Überexpression weiter verstärkt. Darüber hinaus konnte durch Einsatz von Proliferationsmarkern (Ki67, Phosphohiston H3) gezeigt werden, dass RND1 Einfluss auf den Zellzyklus nimmt und zu vermehrt proliferationsaktiven Zellen führt. Im Rahmen eines „Yeast two-Hybrid Screens“ wurde die direkte Interaktion mit Myozap, einem am SRF-„Signaling“ beteiligten Glanzstreifen-Protein, nachgewiesen. Verifiziert wurde dieses Ergebnis mithilfe von Co-Immunopräzipitationen. Sowohl im Luciferase-„Assay“ als auch auf Proteinebene resultierte die RND1-Überexpression in einer signifikant gesteigerten SRF-Aktivität. In Anlehnung an die RhoA-abhängige Wirkung von Myozap konnten wir für RND1 eine weniger ausgeprägte Abhängigkeit von RhoA ermitteln. Wir vermuten eine essenzielle Rolle beider Proteine im kardialen „Remodeling“. Der „Knockdown“ von MLF1 bewirkte neben einer Zunahme der Zelloberfläche auch eine Induktion von Nppa, Nppb und Rcan1-4. Des Weiteren konnten wir neben dem Hypertrophie-induzierenden Einfluss eine ebenfalls durch geringe MLF1-„Level“ ausgelöste Zunahme der Zellviabilität detektieren. Es zeigte sich eine durch MLF1 induzierte Zunahme der Expressionen von Caspase 3, Caspase 7 und Poly(ADP-ribose)-Polymerase, die bei reduziertem MLF1 vermindert exprimiert wurden. Diese Ergebnisse konnten in zwei etablierten Modellen der Apoptose-Induktion (Cisplatin, Hypoxie) bestätigt werden. Umgekehrt wurde die Zellproliferation durch niedrige MLF1-Spiegel über Aktivierung von D-Cylinen und Inhibition von p53 induziert. Der MLF1-„Knockdown“ schützt also möglicherweise Kardiomyozyten vor Apoptose und steigert ihre Fähigkeit zur Proliferation.

Verletzungen von Axonen wie sie zum Beispiel bei Abrissen von Nerven des peripheren Nervensystems oder im Rahmen von Schädel-Hirn-Traumata des zentralen Nervensystems auftreten, ziehen oftmals lebenslange Funktionseinbußen nach sich. Während eine Regeneration von Axonen im zentralen Nervensystem kaum möglich ist, ist das periphere Nervensystem bis zu einem gewissen Grad zur axonalen Regeneration in der Lage. Die Unterschiede in der Regenerationskapazität von peripherem und zentralem Nervensystem beruhen einerseits auf extrinsischen Faktoren wie der Mikroumgebung der verletzten Neurone und andererseits auf intrinsischen Faktoren wie einer läsionsinduzierten Anpassung der Genexpression in verletzten Neuronen. Von Bedeutung sind dabei zytoskelettale Gene und immediate early Gene (IEGs), die als schnell induzierbare Gene Modulatoren von Zelltod und -überleben darstellen und häufig für Transkriptionsfaktoren kodieren, die unter anderem die Expression nachgeschalteter Regenerations-assoziierter Gene (RAGs) steuern, die wiederum wesentlichen Anteil am Erfolg der axonalen Regeneration haben. Während zahlreiche dieser Regenerations-assoziierten Gene wie Galanin, GAP-43 oder SPRR1A die im peripheren Nervensystem zur intrinsischen Regenerationskapazität von Neuronen beitragen, identifiziert werden konnten, sind die entscheidenden Transkriptionsfaktoren, die am Anfang dieser Kaskade stehen, bislang unzulänglich charakterisiert. Ein vielversprechender Ansatz ist der Transkriptionsfaktor SRF. Dieser reguliert bereits während der Entwicklung des Nervensystems und bei der Gedächtnisbildung in Assoziation mit ternary complex factors (Elk-1, SAP-1 und NET) und myocardin-related transcription factors (zum Beispiel MAL) die Expression von immediate early Genen und zytoskelettalen Genen und in der Folge die Differenzierung von Neuronen. Im Rahmen von in vitro und in vivo Versuchen konnte eine Rolle von SRF für die axonale Regeneration dahingehend festgestellt werden, dass die Überexpression von SRF das Zellüberleben und das Nachwachsen von Axonen nach Axotomie förderte, während die Deletion von Srf in vivo zu einer Beeinträchtigung der axonalen Regeneration führte. Die Mechanismen, über die SRF diese proregeneratorische Funktion ausübt, wurden bislang unzureichend aufgeklärt. Eine Assoziation von SRF mit Kofaktoren aus der Familie der ternary complex factors oder der myocardin-related transcription factors erscheint jedoch auch im Kontext axonaler Verletzungen naheliegend. Um die Wirkmechanismen von SRF, unter Beachtung einer möglichen Konkurrenz von ternary complex factors und myocardin-related transcription factor um SRF, zu entschlüsseln, befasste sich diese Dissertation mit dem Beitrag, den die ternary complex factors zur axonalen Regeneration leisten. In dieser Arbeit konnte zunächst anhand von Luciferase-Assays mit transfizierten kultivierten cerebellären Neuronen eine inhibierende Wirkung von (cytoplasmatisch und nukleär lokalisiertem) unphosphoryliertem Elk-1 auf die Expression eines MAL-vermittelten Reportergens in vitro nachweisen werden. In vivo Versuche zur Rolle der ternary complex factors wurden anschließend unter Verwendung des bewährten Nervus facialis-Axotomie Modells an Elk-1-/-/Sap-1-/--Doppelmausmutanten und Wildtypmäusen durchgeführt. Anders als die Literatur zur SRF/ternary complex factor-vermittelten Expression von immediate early Genen und die in vitro Versuche zur Inhibition der MAL-vermittelten Reporter¬genexpression durch Elk-1 vermuten lassen, bewirkte die Deletion von Elk-1 und Sap-1 keine signifikanten Veränderungen in den Expressionsraten der beiden genannten Gengruppen. Ebenfalls unbeeinträchtigt von der Deletion von Elk-1 und Sap-1 war das Expressionsverhalten der Regenerations-assoziierten Gene. Entsprechend der weitgehend unbeeinträchtigten läsionsinduzierten Anpassung der Genexpression, wurden auch das Zellüberleben und das Nachwachsen durchtrennter Axone in die Zielregion durch die Deletion von Elk-1 und Sap-1 nicht signifikant beeinträchtigt. Zusammenfassend sprechen die Ergebnisse dieser Dissertation dafür, dass ternary complex factors in vivo keine essentiellen Partner von SRF für die Vermittlung seiner proregeneratorischen Funktion darstellen. Die zweite Klasse von SRF-Kofaktoren der myocardin-related transcription factors stellt damit in Zukunft einen interessanten Ansatzpunkt im Bestreben die Mechanismen hinter der proregeneratorischen Funktion von SRF zu entschlüsseln dar.

Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung des M-Bandenproteins Myomasp/LRRC39 im Kontext kardialer Hypertrophie. Hierzu wurde erstens die Wirkung von Myomasp/LRRC39-Überexpression und –Knockdown in neonatalen Rattenkardiomyozyten auf die Entstehung von Hypertrophie untersucht. Zweitens erfolgte die Phänotypisierung einer Myomasp/LRRC39-Knockout-Maus. Durch diese Arbeit konnte Myomasp/LRRC39 erstmals als Regulator von Hypertrophie in Kardiomyozyten in vitro identifiziert werden. Es konnte gezeigt werden, dass überexprimiertes Myomasp/LRRC39 die durch Phenylephrin induzierte Hypertrophie in neonatalen Rattenkardiomyozyten verhindern kann, während ein Myomasp/LRRC39-Knockdown diese verstärkt und selbst eine Hypertrophie induziert. Des Weiteren wurde gezeigt, dass der Calcineurin-NFAT-Signalweg durch Myomasp/LRRC39-Überexpression inhibiert und durch Myomasp/LRRC39-Knockdown induziert wird. Dies legt nahe, dass Myomasp/LRRC39 seine antihypertrophe Wirkung über den Calcineurin-NFAT-Signalweg entfaltet. Die Myomasp/LRRC39-Knockout-Maus zeigte keinen auffälligen Phänotyp: Es konnten hinsichtlich kardialer Morphologie und Funktion keine Unterschiede im Vergleich zu Wildtypen festgestellt werden. Jedoch waren die Proteine α-cardiac actin, Myomesin 1 und Myomesin 2 durch den Knockout geschlechtsabhängig beeinflusst. Dies deutet auf latente, subklinische Veränderungen in der M-Bandenarchitektur hin. Es ist zu vermuten, dass die hypertrophe Wirkung des Myomasp/LRRC39-Knockouts durch die Aktivierung antihypertropher Gegenregulationen kompensiert wird. Essentiell für das weitere Vorgehen wird sein, den Phänotyp der Myomasp/LRRC39-Knockout-Maus unter kardialer Belastung zu untersuchen sowie den genauen Mechanismus zu ermitteln, durch den Myomasp/LRRC39 mit dem Calcineurin-NFAT-Signalweg interagiert, um so die genaue Funktion von Myomasp/LRRC39 als vielversprechendem Regulator kardialer Hypertrophie zu bestimmen.

Hochfrequenz-Photoelektronenquellen mit supraleitenden Resonatoren (SRF-Gun) besitzen das Potential Elektronenstrahlen exzellenter Qualität und mit hohem Strahlstrom zu liefern, die für zukünftige Lichtquellen benötigt werden. An der Strahlungsquelle ELBE ist eine solche Quelle seit 2007 in Betrieb. In den vergangen Jahren wurde eine verbesserte Version (ELBE SRF-Gun II) entwickelt. Im Mai 2014 wurde die SRF-Gun II am Beschleuniger installiert. Das Poster stellt diese Elektronenquelle vor und berichtet über die Inbetriebnahme.

Transkriptionelle Netzwerke (Transkriptionsfaktoren, epigenetische Modulatoren und spezifische Zielgene) stellen die unterste Ebene der zellinternen Signalübertragung dar. Eingebettet in verschiedene stimulusabhängige Signalwege bedienen sich ihre Komponenten genetischer und epigenetischer Mechanismen, um Zielgene transkrip-tionell zu regulieren und Veränderungen der Chromatinstruktur hervorzurufen. In der vorliegenden Arbeit wurde die hierarchische Organisation und Zusam-mensetzung des MEK-ERK-abhängig gesteuerten transkriptionellen Netzwerks und seine Veränderung im Zuge der HRAS-vermittelten onkogenen Transformation von HA1-Zellen untersucht. Viele Arbeiten haben sich bereits eingehend mit der Charak-terisierung einzelner Komponenten und Zielgene beschäftigt (Wagner et al. 2005, Reddy et al. 2002, Sun et al. 2006, Kapitel 1). Im Unterschied zu den zitierten Studien wurde in der vorliegenden Arbeit ein umfassendes Protokoll zur genomweiten De-chiffrierung transkriptioneller Netzwerke unter Kombination von experimentellen und bioinformatischen Methoden entwickelt und durchgeführt. Die Analyse ge-nomweiter Expressionsprofile un- und U0126-behandelter immortaler und HRASV12-transformierter humaner Nierenepithelzellen (HA1EB, HA1ER) erlaubte die Identifi-zierung von 138 auf- und 103 abregulierten genspezifischen IDs der RAS-ERK-abhängig gesteuerten Signalkaskade. Regulierte Transkriptionsfaktoren wurden i-dentifiziert und im Westernblot, sowie zum Teil mittels Durchflusszytometrie und RT-PCR validiert und nachfolgend transienten siRNA-Experimenten unterzogen. Für die Transkriptionsfaktoren ELK3, SRF und den hierarisch darunter liegenden Faktor FRA1 wurden Expressionsprofile der spezifischen siRNA-vermittelten Hemmung in beiden Zelllinien erstell und mit bioinformatischen Methoden (TRAP, GSEA-GO) a-nalysiert um direkte und indirekte sowie gemeinsame Zielgene zu ermitteln. Zusätz-lich wurde der Effekt auf phänotypischer Ebene (Softagar, MTT) überprüft. In der vorliegenden Arbeit ließ sich keine direkte Hierarchie der drei Transkrip-tionsfaktoren SRF, FRA1 und ELK3 bestätigen. Allerdings konnte zum ersten Mal eine gemeinsam regulierte Gruppe von Genen identifiziert werden, die darauf schließen lässt, dass die drei Transkriptionsfaktoren sowohl in HA1EB, als auch in HA1ER Teile eines gemeinsam regulierenden Netzwerks sind. Aus den Proliferationsexperimenten wurde zudem bestätigt, dass jeder Transkriptionsfaktor individuell eine essentielle Rolle bei der Promotion maligner Eigenschaften spielt. Für alle drei Transkriptionsfak-toren konnte eine RAS-abhängige starke Verschiebung der spezifisch angesteuerten Gene nachgewiesen werden. Diese Verschiebung wurde mittels TRAP und GSEA auch für alternative Regulatoren der spezifischen Zielgene festgestellt. Die nähere Analyse der FRA1-abhängigen Zielgene führte zu neuen Erkenntnis-sen zur Umordnung des Transkriptoms im Zuge der onkogenen Transformation. Die FRA1-spezifischen Zielgene in HA1EB und HA1ER weisen unterschiedliche Funktio-nalitäten auf. So wurden in HA1EB viele Gene identifiziert, die im Rahmen der Im-munantwort eine Rolle spielen und in HA1ER nicht reguliert werden. In den RAS-transformierten HA1ER konnten dagegen Gene identifiziert werden, die in der Tu-morprogression eine Rolle spielen (FRA1, STAT3, MTA1, TCFL5). Die Verifizierungen mittels qPCR und ChIP bestätigten 5 der 38 möglichen FRA1-Zielgene. Von diesen, FRA1, AEBP1, FRA1, TCFL5, NPAS2 und YWHAZ ist lediglich FRA1 bereits als FRA1-Zielgen beschrieben. Die Funktionen der neu identifizierten RAS-abhängigen FRA1-Zielgene untermauerten bereits bekannte Funktionen der FRA1-vermittelten Transkription (Differenzierung, Proliferation, zirkadiane Rhythmen, Apoptose) und erweitern sie um verschiedene Aspekte wie Metabolismus und Rückkopplungen in die Signaltransduktion, die noch nicht für die RAS-abhängige FRA1-vermittelte Transktiption beschrieben worden sind. Dazu gehören unter anderem Interaktionen mit TGFbeta, WNT, JAK/STAT und JNK. Daneben sind in den HA1ER eine Vielzahl von Regulatoren des RHO-Signalwegs identifiziert worden, was für FRA1 auf bisher unbekannte Interaktionen mit RAC/RHO-Signalwegen schließen lässt. Transcriptional networks represent the final level of internal signal transmission. They are embedded in different signalling pathways and use genetic as well as epi-genetic mechanisms to regulate their according target genes. During oncogenic trans-formation they are undergoing massive rearrangements in composition, regulation and interaction. This leads to radical changes in the transcriptome and drives the on-cogenic phenotype of the according cells. My thesis employs the composition of the MEK-ERK-dependent transcriptional net-work and its alteration during the HRAS-oncogene-mediated transformation in HA1-cells. By commencing from already known components: SRF, Ternary Complex Fac-tors (TCF: SAP1, SAP2/ELK3, ELK1) and members of the AP1-complex (JUN, FOS-proteins) I analyzed the alteration in expression of secondary targets and their inter-action as well as their relation to the superior factors. Therefore I compared genome wide expression profiles (Affymetrix, HG-U133A) of immortal HA1EB and HRASV12-oncogene-transformed HA1ER-cells with and without U0126-induced MEK/ERK-inhibition and extracted several MEK/ERK-dependent transcription factors. Among them where FRA1 and ELK3, two transcription factors already known to be involved in oncogenesis and proliferation associated processes. ELK3 needs SRF as crucial binding partner to function. Therefor I also included SRF into the subsequent analysis. The three transcription factors function in different time-dependent hierarchy states so we supposed a putative hierachical network be-tween them. I established transient knockdown cells deriving from HA1EB and HA1ER for all three transcription factors and generated further expression profiles from them. Additionally I verified the importance of these transcription factors on survival and proliferation via MTT and Softagar experiments. Using different statis-tically and bioinformatical methods (GSEA, TRAP) in collaboration with the Max-Planck-Institute for molecular Genetics Berlin, several direct and indirect targets of these transcription factors were predicted. These were partially overlapping in all transcription factors. Also, in comparison of the immortal and the transformed cell line, a shift of functionalities and composition of the different target gene populations and collaborating factors could be detected for all three transcription factors. It was found that in HA1EB FRA1 seems more likely to regulate immunresponsive genes as well as genes associated with the cytoskeleton and nucleus organisation whereas in HA1ER FRA1 regulates a large group of transcription- and signalling-associated genes. Additionally it could be shown that in both cell lines FRA1 regulates genes in-volved in epigenetic processes as well as circadian rhythms which are known to be important aspects in oncogenic transformation. I verified 37 different putative target genes of FRA1 using qRT-PCR (Taqman) and partially also ChIP-analysis. Of these 37genes, 5 were fully validated as directly regu-lated targets of FRA1: FRA1, AEBP1, YWHAZ, NPAS2 and TCFL5. They imply functionalities connected to proliferation and differentiation (AEBP1, FRA1, TCFL5) as well as apoptosis (YWHAZ) cell cycle control and circadian rhythm (NPAS2, AEBP1), feedbacks into the signalling (YWHAZ, AEBP1) and metabolism (NPAS2, AEBP1). Summarised the work of this thesis contributes to the decipherment of the direct and indirect targets of the according transcription factors and strengthens the argument of a general and massive shift of the transcriptional network during oncogenic trans-formation of cells. The importance of all three transcription factors on the survival of genes could be proved via proliferation assays. Additionally the functionality of their according targets could be integrated into processes connected to oncogenic trans-formation.

Transmembrane signaling of chemokines is mediated by chemokine receptors, members of the G protein-coupled receptor family, which are coupled to pertussis toxin-sensitive and certain cases, also to pertussis toxin-insensitive G proteins. We have previously reported that stimulation with CCL2 of the two human CC chemokine receptors CCR2a and CCR2b transiently expressed in COS-7 cells resulted in inositol phosphate formation and serum response factor (SRF)-dependent transcriptional activation of a luciferase reporter gene. We now report that ligand-dependent induction of SRF activity was specifically mediated by Galphaq and Galpha14, but not by Galpha11 and Galpha16 in these cells. Furthermore we identified a juxtamembrane octapeptide that is important for interaction with the previously identified non-G-protein interaction partner tumor protein D52 of CCR2 receptors and that might be critically involved in Gq protein activation and intracellular trafficking of the receptor polypeptides.