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Ras-Proteine fungieren als molekulare Schalter in der Signaltransduktion essentieller zellulärer Prozesse, indem sie zwischen einem inaktiven GDP-gebundenen und einem aktiven GTP-gebundenen Zustand wechseln. Onkogene Ras-Mutationen, die in etwa 25 % aller humanen Krebsarten vorkommen und zu einer Fehlregulation des switch Mechanismus führen sind daher attraktive Zielstrukturen in der Präzisionsmedizin. Trotz jahrzehntelanger intensiver Forschung nach Entdeckung der Ras-Onkogene im Jahre 1981 waren Versuche, Ras gezielt zu adressieren, weitestgehend erfolglos und Ras-Proteine galten lange Zeit als nicht adressierbar (engl.: undruggable). Neue Hoffnung ergab sich jedoch im Jahr 2013 durch die erfolgreiche gezielte Adressierung der G12CMutation von Ras durch Kevan Shokat. Neben kovalenten Inhibitoren, die innerhalb der switch-II-Tasche irreversibel an die G12C-Mutation binden und deren Optimierung schließlich im Mai 2021 zur Zulassung des ersten KRasG12C-Inhibitors Sotorasib (Amgen) für die Behandlung von nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC) führte, wurden zudem Nukleotid-kompetitive Inhibitoren entwickelt, die ebenfalls kovalent an KRasG12C binden können. Strategien, die eine direkte Konkurrenz zur Nukleotidbindung beinhalten, wurden ursprünglich aufgrund der hohen Affinität von GDP/GTP für Ras und der hohen zellulären Nukleotid-Konzentrationen verworfen, erlangten jedoch durch die Kombination mit einem kovalenten Wirkmechanismus der Inhibitoren erneut Aufmerksamkeit im akademischen Umfeld. Die dabei am β-Phosphat der GDP-Derivate eingeführten elektrophilen Gruppen führten jedoch zu einer dramatischen Reduzierung der reversiblen Bindungsaffinität der Nukleotidderivate, da wichtige Wechselwirkungen mit dem Protein und dem Mg2+-Ion verloren gehen. Um diese Limitierung zu überwinden und diesen Ansatz der kovalenten Nukleotid-kompetitiven Inhibitoren an onkogene KRas-Varianten mit Cysteinen im P-loop (KRasG12C und KRasG13C) anzupassen, wurden im Rahmen dieser Arbeit mittels strukturbasiertem Wirkstoffdesign Nukleotidanaloga synthetisiert, die einen Thiolreaktiven Linker an den 2‘,3‘-OH-Gruppen der Ribose für eine kovalente Proteinmodifikation tragen. Anhand von massenspektrometrischen Experimenten konnte gezeigt werden, dass die dargestellten Nukleotidderivate selektiv an KRasG13C binden, ohne dabei KRasG12C sowie KRasWT zu adressieren. Mittels einer detaillierten kinetischen Charakterisierung wurden anschließend die Affinitäten der Nukleotidanaloga gegenüber KRas im Vergleich zu den unmodifizierten Nukleotiden bestimmt. Neben der Bestimmung der Kinetik der Nukleotidassoziation (kon) mit einer bereits etablierten stopped-flow Methode wurde im Rahmen dieser Arbeit zudem ein HPLC-basierter Assay zur Evaluierung der relativen Affinitäten der Nukleotidanaloga entwickelt. Die Affinitäten der dargestellten Nukleotidderivate sind dabei mit denen der unmodifizierten Nukleotide vergleichbar, sodass der eingeführte Linker keinen Einfluss auf die reversible Wechselwirkung und die Affinität hat, was bei einem Nukleotid-kompetitivem Ansatz von maßgeblicher Bedeutung ist. Im Rahmen dieser Arbeit konnte zudem gezeigt werden, dass bei KRasG13C, welches eine drastisch erhöhte intrinsische Nukleotidaustauschrate im Vergleich zum WT besitzt, infolge einer kovalenten Proteinmodifikation der SOS-katalysierter Nukleotidaustausch verhindert und kovalent modifiziertes KRasG13C im inaktiven Zustand stabilisiert wird. Eine gesteigerte GTP-Hydrolyse in Gegenwart von GAPs konnte für kovalent modifizierte KRasG13C im Vergleich zu KRasWT nicht beobachtet werden, die intrinsische GTP-Hydrolyse ist hingegen vergleichbar mit der von KRasWT. Die in dieser Arbeit generierten Komplexkristallstrukturen von KRasG13C-edaGDP und KRasG13C-bdaGDP ermöglichten darüber hinaus einen detaillierten Einblick in den Bindemodus der Nukleotidderivate und bestätigten den erwarteten Bindemodus sowie die kovalente Bindungsknüpfung an Cys13. Aufgrund der limitierten Verfügbarkeit von KRasG13C-abhängigen Krebszelllinien wurden zunächst erfolgreich artifizielle KRas-abhängige Zelllinien, darunter NIH-3T3 sowie Ba/F3-Zellen generiert, die in Zukunft für die Charakterisierung mutantenselektiver KRas-Inhibitoren genutzt werden können. Für die zelluläre Charakterisierung der in dieser Arbeit dargestellten Nukleotidanaloga, die aufgrund ihres anionischen Charakters nicht die Zellmembran überwinden können, wurden verschiedene Strategien für den Transfer in Zellen getestet, unter anderem ein NTP-Transporter vermittelter Transfer sowie die Elektroporation. Durch Elektroporation rekombinanter KRas-Proteine in Zellen konnte schließlich gezeigt werden, dass bei der Verwendung von kovalent modifiziertem KRasG13C eine onkogene Signalweiterleitung in vivo inhibiert wird, was die Möglichkeit des Einsatzes von kovalenten Nukleotid-basierten Inhibitoren bei KRasG13C-getriebenem Krebs verdeutlicht.

Das Bakterium Photorhabdus luminescens lebt in einer mutualistischen Symbiose mit Nematoden der Gattung Heterorhabditis. Die Nematoden dringen in das Hämozöl und den Gastrointestinaltrakt verschiedener Insektenarten ein und sondern dort über ihre Körperausgänge die Bakterien ab. Um die Immunabwehr des Insekts zu umgehen und das Insekt zu töten, sekretiert Photorhabdus luminescens eine Vielzahl von Virulenzfaktoren, insbesondere Tc-Toxine. Tc-Toxine sind aus jeweils einer A-, B- und C-Komponente aufgebaut, die einen 1,7 Megadalton großen Holotoxinkomplex bilden. Dieser Komplex enthält ein toxisches Enzym, das nach Übertragung in die Wirtszelle durch Modifikation von Proteinen zum Zelltod führt. In der hier vorliegenden Arbeit wurden die dreidimensionalen Strukturen der pentameren AKomponente (TcdA1-Präpore aus Photorhabdus luminescens) und des Heterodimers der Bund C-Komponente (TcdB2-TccC3 aus Photorhabdus luminescens) mittels Röntgenkristallographie bestimmt. Das TcdB2-TccC3-Heterodimer bildet eine kokonähnliche Struktur und enthält im C-terminalen Bereich von TccC3 eine intrinsische Aspartatproteasedomäne. Diese Domäne spaltet den C-Terminus von TccC3 ab, der als ADPRibosyltransferase C3 die eigentlich toxische Komponente bildet, die wahrscheinlich in einem entfalteten Zustand im Kokon vorliegt. Desweiteren verschließt ein unsymmetrischer β-Propeller den Kokon in TcdB2. Die TcdA1-Struktur zeigt ein Pentamer, das aus einer äußeren Hülle und einem zentralen Translokationskanal aufgebaut ist. Die äußere Hülle enthält Insertionen, die sich in rezeptorbindende Domänen und in ein neuraminidaseähnliches Pentamer falten. Aufgrund der Homologie zu Sialidasen könnte dieses Pentamer Glykoproteine in der Wirtszelle enzymatisch spalten. Die rezeptorbindenden Domänen zeigen Homologien zu Interleukin- und Interferon- Rezeptoruntereinheiten. Durch Interaktionen mit Mitgliedern dieser Zytokinrezeptorfamilie könnte das TcdA1-Pentamer an der Wirtszellmembran stabilisiert und die Penetration der Membran durch den TcdA1-Translokationskanal bei einer Konformationsänderung unterstützt werden.

Including more than 60 members in humans, Rab proteins constitute the largest subfamily of the Raslike superfamily of small GTPases which act as molecular switches and can exist in a GDP‐bound (inactive) and a GTP‐bound (active) conformation. The conversion between these states is carried out by regulatory factors: GTPase activating proteins (GAPs) stimulate GTP hydrolysis and guanine nucleotide exchange factors (GEFs) catalyze the GDP‐GTP exchange. Rab proteins interact with effector proteins only in the active state, thereby regulating vesicular trafficking in eukaryotic cells. For this purpose, the activity and the intracellular localization of Rab proteins need to be tightly regulated. In order to ensure their own survival, some intracellular pathogens have developed intriguing strategies for manipulation of intracellular vesicular transport processes and in particular of the Rab proteins involved. A prominent example of an intracellular pathogen that manipulates Rab proteins for its own benefit is Legionella pneumophila. In particular, the Legionella protein DrrA (defect in Rab recruitment A) was identified in the recent past as a protein that manipulates the intracellular localization and activity of Rab1. At the beginning of this work, structural studies on this protein showed the presence of an additional, previously uncharacterized domain possessing adenylyltransferase activity towards Rab1. The characterization of this enzymatic activity was the central subject of this work. Within this work, the x‐ray crystal structure of adenylylated Rab1 was solved. This structure showed that Rab1 was specifically modified on a tyrosine residue in the functionally important switch II region. Further studies of the effects of this modification showed that the interaction of Rab1‐AMP with GAPs and the human effector Mical‐3 are drastically inhibited, whereas the interaction with the GEF domain of the Legionella protein DrrA and the Legionella effector protein LidA are not significantly inhibited. Characterisation of the enzyme kinetics of DrrA and the recently identified deadenylylating enzyme SidD showed that Rab1:GTP is the preferred substrate of adenylylation by DrrA while SidD possesses a significantly lower substrate specificity towards the active or inactive conformation of Rab1. This work includes the first description and characterization of adenylylation as a posttranslational modification of Rab proteins. In the context of the current literature, the results of this work allowed the proposal of a model in which adenylylation temporarily inhibits deactivation of Rab1 by GAPs and thus the extraction of Rab1 from the Legionella containing vacuolar (LCV) membrane by GDI and Rab1 is entrapped at the LCV membrane. At a later stage of infection, deadenylylation by SidD allows for deactivation and extraction by GDI., Rab‐Proteine bilden mit mehr als 60 Mitgliedern im Menschen die größte Unterfamilie der Superfamilie Ras‐ähnlicher kleiner GTPasen, welche als molekulare Schalter in einer GDP‐gebundenen (inaktiven) und einer GTP‐gebundenen (aktiven) Konformation vorliegen können. Die Konversion der Aktivitätszustände erfolgt durch regulatorische Faktoren: GTPase aktivierende Proteine (GAPs) stimulieren die GTPHydrolyse und Guaninnukleotidaustauschfaktoren (GEFs) katalysieren den GDP‐GTP‐Austausch. In der aktiven Konformation interagieren Rab‐Proteine mit Effektorproteinen und regulieren den vesikulären Transport in eukaryotischen Zellen. Um vesikuläre Transportwege zum eigenen Vorteil zu nutzen haben einige intrazellulär lebende Pathogene erstaunliche Methoden zur Manipulation von Rab‐Proteinen entwickelt. Ein prominentes Beispiel eines solchen Pathogens ist Legionella pneumophila und insbesondere das Legionellenprotein DrrA (engl.: defect in Rab recruitment A), welches die intrazelluläre Lokalisation und den Aktivitätszustand von Rab1 manipuliert. Strukturelle Untersuchungen vor Beginn dieser Arbeit offenbarten eine weitere funktionelle Domäne von DrrA, welche Adenylyltransferase‐ Aktivität gegenüber Rab1 besitzt. Die Charakterisierung dieser Aktivität war zentrales Thema dieser Arbeit. Die innerhalb dieser Arbeit bestimmte Röntgenkristallstruktur des adenylylierten Rab1 zeigte, das Rab1 spezifisch an einem Tyrosin im Bereich des funktionell wichtigen switch II modifiziert wird. Weiterführende Untersuchungen offenbarten starke inhibitorische Effekte der kovalenten Modifizierung auf die Interaktion von Rab1 mit GAPs und dem humanen Effektorprotein Mical‐3, wohingegen die Interaktionen mit der GEF‐Domäne von DrrA und dem Legionellen Effektorprotein LidA nicht signifikant gestört sind. Enzymkinetische Untersuchungen von DrrA und dem kürzlich identifizierten deadenylylierenden Enzym SidD zeigten, dass die aktive Konformation von Rab1 das bevorzugte Substrat der Adenylylierung durch DrrA ist, wohingegen SidD beide Aktivitätszustände von Rab1 gleichermaßen als Substrat akzeptiert. Diese Arbeit umfasst die erste Beschreibung und Charakterisierung der Adenylylierung als posttranslationale Modifikation eines Rab‐Proteins. Im Kontext der aktuellen Literatur erlaubten die Ergebnisse dieser Arbeit die Erstellung eines Modells, in dem eine Deaktivierung von Rab1 durch GAPs und somit eine Extraktion von der Membran der Legionellen enthaltenden Vakuole (LCV) durch GDI temporär durch die kovalente Modifikation unterbunden wird und Rab1 an der LCV‐Membran arretiert wird. Erst durch das deadenylylierende Enzym SidD wird zu einem späteren Zeitpunkt der Infektion eine Deaktivierung und Extraktion wieder ermöglicht.

Insgesamt mehr als 60 humane Rab-Proteine lokalisieren an spezifischen Organellen und regulieren den intrazellulären vesikulären Transport. In der inaktiven GDP-gebundenen Form existieren Rabs im Zytosol im Komplex mit dem Solubilisierungsfaktor GDI, der die C-terminalen hydrophoben Geranylgeranylreste gegen das wässrige Milieu des Zytosols abschirmt, wobei der Prenylanker Voraussetzung für die reversible Membranassoziation von Rab:GTP nach Aktivierung durch ein GEF ist. Rab-Proteine koordinieren als molekulare Schalter die Teilschritte vesikulärer Transportprozesse wie Abschnürung, Transport, Andocken und Fusion des Vesikels. Sowohl die Signalweiterleitung durch spezifische Interaktion mit Effektorproteinen als auch die Aktivierung und Deaktivierung durch GEFs bzw. GAPs ist im mechanistischen Detail bereits sehr gut verstanden. Gegenstand langjähriger Diskussion ist dagegen der zelluläre Mechanismus der spezifischen Lokalisation der 60 unterschiedlichen Rab-Proteine an ihre jeweilige Zielmembran. Neuere Untersuchungen haben mittels biochemischer Verfahren anhand des Legionellenproteins DrrA gezeigt, dass GEFs durch die Rab-Aktivierung GDI aus dem hochaffinen Rab:GDP:GDI-Komplex prinzipiell freisetzen können. Somit ist eine spezifische Membranrekrutierung von Rab-Proteinen durch membranständige GEFs denkbar. Die vorliegende Arbeit untersucht mittels zellbiologischer Ansätze die Rolle von GEFs hinsichtlich der spezifischen Membranlokalisation von Rab-Proteinen und korreliert die erhaltenen Ergebnisse mit biochemischen Analysen. Das endosomale Rab5 und sein GEF Rabex-5 wurden dabei als initiales Modellsystem gewählt. Die artifizielle mitochondriale Fehllokalisation von Rabex-5 bewirkt die spezifische Rekrutierung von Rab5A. Diese Rekrutierung ist sowohl von der Fähigkeit das Substrat Rab5A zu erkennen als auch von der enzymatischen Aktivität des GEFs abhängig. Weiterhin konnte mittels gezielt gewählter Rab5-Mutanten gezeigt werden, dass die GDI-vermittelte Extraktion des Rabs für die anschließende spezifische Lokalisation des Rabs durch das GEF essentiell ist. Zusätzlich führt eine verminderte GEF-Aktivität durch Einführung von Punktmutationen gleichermaßen zu einer Reduktion der GDI-Freisetzungsaktivität und korreliert darüber hinaus mit der verminderten Fähigkeit das Rab-Protein effizient an Organellen zu rekrutieren. Dies verdeutlicht die signifikante Korrelation dieser drei vermeintlich unabhängigen Prozesse. Die Bedeutung von GEFs für die spezifische Rekrutierung von Rabs konnte durch die systematische Ausweitung des experimentellen Systems auf die GEFs DrrA und Rabin8 und ihre Substrate Rab1 bzw. Rab8 zusätzlich untermauert werden. Die zellbiologische und biochemische Analyse der erwähnten GEFs und ihrer Rab-Substrate lässt somit den Schluss zu, dass die GEF-vermittelte Rab-Lokalisation ein genereller Mechanismus zur spezifischen subzellulären Rekrutierung von Rab-Proteinen an eine distinkte Organellenmembran darstellt.

Das intrazelluläre, pathogene Bakterium Legionella pneumophila manipuliert die von Rab-Proteinen regulierten Transportprozesse der eukaryotischen Wirtszelle, um ein replikations-permissives Kompartiment zu bilden. Die Mitglieder der Rab-Familie sind essentielle Regulatoren des intrazellulären vesikulären Transports und haben die Funktion von molekularen Schaltern: Rab-Proteine befinden sich entweder inaktiv im Zytosol im Komplex mit dem Protein GDI (engl.: GDP-dissociation inhibitor, GDI) oder sie werden an eine Membran lokalisiert, wo sie nach der Aktivierung durch einen GEF (engl.: guanine nucleotide exchange factor, GEF) zusammen mit Rab-Effektoren die Prozesse des vesikulären Transportes koordinieren.1 Die gezielte Manipulation von Rab1 durch die sekretierten Legionellenproteine DrrA und LidA führt zur Umleitung des Rab1-regulierten, frühen sekretorischen Transports an die bakterienenthaltende Vakuole (engl.: legionella containing vacuole, LCV). Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Analyse der molekularen Grundlagen der Rab-Manipulation durch die Legionellenproteine DrrA und LidA. DrrA enthält eine bi-funktionale, zentrale GEF-Domäne, die eine Rekrutierung von Rab1 an die LCV und die anschließende Aktivierung von Rab ermöglicht. Die Strukturen der GEF-Domäne von DrrA und ihres Komplexes mit Rab1 wurden in dieser Arbeit bestimmt und zeigten eine noch nicht beobachtete Proteinfaltung der GEF-Domäne. Aus der Komplexstruktur konnte der DrrA-katalysierte Mechanismus der Rab1-Aktivierung abgeleitet werden. DrrA ist das erste bakterielle RabGEF, das charakterisiert wurde und es besitzt eine hohe katalytische Effizienz4. Basierend auf der Rab1:DrrA-Komplexstruktur konnten GEF-defiziente Aminosäure-substitutionen eingeführt werden, deren biochemische Analyse die Ableitung des enzymatischen Mechanismus ermöglichten. Diese Untersuchungen zeigten erstmals, dass die GEF-Aktivität von DrrA die Freisetzung von Rab1 aus dem Komplex mit GDI vermitteln kann. Der Ort der DrrA-vermittelten Rekrutierung von Rab1 wird durch die Bindung von DrrA an die LCV bestimmt. Die C-terminale P4M-Domäne (PI4P binding of SidM/DrrA) verankert DrrA durch die Bindung von Phosphatidylinositol-4-Phosphat (PI4P) auf der LCV. Die Bestimmung der Affinität der P4M-Domäne zu PI4P ergab, dass die P4M-Domäne eine ungewöhnlich hohe Affinität zu PI4P besitzt (KD = 18 nM) und DrrA somit stabil mit der LCV assoziiert ist. Die Struktur der P4M-Domäne zeigte eine bisher für PIP-bindende Proteine noch nicht beobachtete Faltung. Durch die Identifizierung der PI4P-Bindungstasche und dem Vergleich der P4M-Domäne mit anderen PIP-bindenden Proteinen gelang die Erstellung eines realistischen Modells der Orientierung von DrrA und der DrrA-katalysierten Aktivierung von Rab1 auf der LCV. Das Legionellenprotein LidA ist an der Rekrutierung von Vesikeln an die LCV beteiligt und zeichnet sich durch die für einen Rab-Effektor ungewöhnliche Eigenschaft aus, neben der aktiven Form auch die inaktive Form von Rab1 zu binden6. Auf der LCV interagiert LidA mit dem von DrrA rekrutiertem Rab1. LidA interagierte mit einer Vielzahl unterschiedlicher Rab-Proteine sowohl in der aktiven, als auch zum Großteil in der inaktiven Form, aber nicht mit anderen kleinen GTPasen. Die Affinitäten von LidA zu Rab-Proteinen sind außergewöhnlich hoch und besitzen KD-Werte im niedrigen nanomolaren bis femtomolaren Bereich. Die Strukturbestimmung des Komplexes aus aktiven Rab8a und LidA zeigte eine neuartige Proteinfaltung von LidA. Dieses Legionellenprotein unterscheidet sich zu humanen Rab-Effektoren durch eine wesentlich komplexere Art der Rab-Bindung und einer erstaunlich großen Kontaktfläche zum Rab, was mit der außergewöhnlichen hohen Affinität zu Rab-Proteinen korreliert. Die Ergebnisse dieser Arbeit lieferten ein detailliertes Verständnis der molekularen Vorgänge der DrrA- und LidA-vermittelten Prozesse auf der LCV. Die Untersuchungen an DrrA zeigten erstmals, dass ein GEF in der Lage ist, die Dissoziation des Rab:GDI-Komplexes zu bewirken und führten zu der Hypothese, dass auch humane RabGEFs ähnliche Eigenschaften besitzen könnten. Die strukturellen und biochemischen Untersuchungen der P4M-Domäne belegen eine sehr stabile Assoziation von DrrA auf der LCV. Die Strukturbestimmung und biochemische Analyse der Rab-Bindungseigenschaften von LidA identifizierten dieses Protein als einen außergewöhnlichen Rab-Effektor mit außergewöhnlich hohen Affinitäten zu aktiven und inaktiven Rab-Proteinen. Diese besondere Eigenschaft impliziert die Rab-Effektor-untypischen Funktionen eines Rab- und/oder Vesikel-Rekrutierungsfaktors für LidA. Die detaillierte molekulare Analyse der auf Rab-Proteine spezialisierten, bakteriellen Proteine DrrA und LidA lieferte neue Blickwinkel auf die Kontrolle eukaryotischer, vesikulärer Transportprozesse.

Rab‐Proteine regulieren als molekulare Schalter eine Vielzahl von intrazellulären Transportprozessen. Diese Regulation erfolgt in zwei miteinander verschalteten Zyklen. Im ersten Zyklus wechseln die Rab‐Proteine zwischen einer membranständigen und einer cytoplasmatischen Lokalisation. Die Interaktion mit der Membran erfolgt durch die hydrophoben C‐terminalen Prenylanker der Rab‐Proteine, die – zur Erhöhung der Löslichkeit – im Cytoplasma von dem Protein GDI gebunden werden. Im zweiten Regulationszyklus werden die Rab‐Proteine aktiviert bzw. deaktiviert und so die Interaktion mit Effektorproteinen und die Aktivierung von Signalkaskaden reguliert. Da die Aktivierung durch Nukleotidaustausch zu GTP und die Deaktivierung der Rab‐Proteine durch Nukleotidhydrolyse in der Regel durch membranlokalisierte Proteine erfolgt, sind die zwei Regulationszyklen miteinander verschaltet. Die Aktivierung und Deaktivierung der Rab‐ Proteine wurde bis zum heutigen Zeitpunkt relativ detailliert charakterisiert, während wenige Daten zur Regulation der Rab‐Lokalisation vorliegen. DrrA, ein Protein aus dem Bakterium Legionella pneumophila, wurde als dual funktionaler Faktor identifiziert, der sowohl die Lokalisation durch Dissoziation des Rab:GDI‐Komplexes als auch die Aktivierung von Rab1 durch Nukleotidaustausch zu GTP beeinflussen kann (Machner und Isberg, 2007; Ingmundson et al., 2007). Diese Aktivitäten wurden in dieser Arbeit näher charakterisiert und es konnte gezeigt werden, dass es sich nicht um zwei separate Aktivitäten handelt. Die Charakterisierung der Nukleotidaustauschaktivität zeigte, dass DrrA ein sehr effektiver Nukleotidaustauschfaktor für Rab1 ist und es konnte gezeigt werden, dass diese Nukleotidaustauschaktivität die Basis für die in der Literatur beschriebene GDIFreisetzungsaktivität von DrrA ist. Aufgrund der Tatsache, dass die Affinität von GDI für GTPgebundenes Rab deutlich geringer ist als für GDP‐gebundenes Rab (Wu et al., 2010), kann DrrA durch Nukleotidaustausch verhindern, dass nach einer Dissoziation des Rab1:GDIKomplexes eine Reassoziation erfolgt. Hierdurch verschiebt DrrA das Gleichgewicht zwischen GDI‐gebundenem und freiem Rab‐Protein und bewirkt so indirekt eine vollständige Dissoziation des Rab1:GDI‐Komplexes. Um zu demonstrieren, dass dieser Freisetzungsmechanismus auf andere Rab‐Proteine und ihre Nukleotidaustauschfaktoren übertragbar ist, wurde diese Studie systematisch auf weitere Rab‐Proteine und ihre Nukleotidaustauschfaktoren erweitert. Der Nukleotidaustausch zu GTP nach der Dissoziation eines Rab:GDI‐Komplexes konnte bei allen untersuchten Rab‐Proteinen die Reassoziation der Komplexe inhibieren und so eine Freisetzung der Rab‐Proteine aus dem Komplex mit GDI bewirken. Diese Daten zeigen, dass der Regulationszyklus der Aktivierung von Rab‐Proteinen den Lokalisationszyklus prinzipiell beeinflussen kann, und somit die Lokalisation der Rab‐ Proteine durch ihre Aktivierung beeinflusst werden kann.

Der Zellzyklus sowie die Mitose werden durch ein komplexes Netzwerk von Proteinen reguliert und angetrieben. Fehler in diesen Prozessen können zu einer deregulierten Proliferation und folglich zur Entstehung von Krebszellen führen. Bestandteile des Zytoskeletts sind nicht nur von entscheidender Bedeutung während der Mitose sondern auch in nachfolgenden Prozessen der Krebsentstehung. Chemische Substanzen, die modulierend auf den Zellzyklus, die Mitose und Bestandteile des Zytoskelettes wirken können, sind daher von großem Interesse in der Krebstheraphie. Ein Ziel dieser Arbeit war die Validierung und Bewertung in der Abteilung vorhandener High Content Screens zur Identifikation solcher Substanzen innerhalb Naturstoff-basierter Substanzbibliotheken. Daher wurde in einem Pilotprojekt ein paralleler Screen von 1500 Naturstoffen mittels des MDCK-F3- und des BSC-1 Phänotyp-Screens durchgeführt. Die Identifikation mehrerer bekannter Naturstoffe mit antimitotischer und Zytoskelettmodulierender Wirkung zeigte hierbei eine besondere Eignung des BSC-1 Phänotyp- Screens. Ein weiteres Ziel war die nähere Charakterisierung der biologischen Wirkung von, durch das High Content Screening identifizierten Substanzen. Mit Podoverin A, Maistemonin und Coreanosid F1 konnten mittels des BSC-1 Phänotyp-Screens innerhalb der Naturstoff- Substanzbibliothek unbeschriebene Bioaktivitäten dieser Substanzen erkannt werden. Nachfolgend konnte Podoverin A als antimitotische Substanz mit inhibitorischer Wirkung auf die zelluläre MT-Dynamik charakterisiert werden. Die Naturstoffe Maistemonin und Coreanosid F1 hingegen führten zu Modulationen der zellulären Aktinfilament-Organisation. Maistemonin, Coreanosid F1 und Podoverin A stellen daher interessante Leitstrukturen für die Synthese Naturstoff-basierter Substanzbibliotheken dar. Mittels des BSC-1 Phänotyp-Screens wurde daraufhin eine von Dr. Andrey Antonchick synthetisierte Naturstoff-basierte Substanzbibliothek aus 39 Spirooxindolen getestet. Die potentiell antimitotische Wirkung der hierdurch identifizierten Substanz (-)-6k konnte im weiteren Verlauf bestätigt werden. Neben einer Induktion von G2/M-Zellzyklusarrest führte die Substanz zu einer Inhibition der zellulären MT-Dynamik, wobei insbesondere eine Modulation der räumlichen Organisation des MT-Zytoskelettes auffallend war. Hierbei waren multiple MTOCs in BSC-1 Zellen und analog hierzu eine multipolare Mitose in HeLa-L Zellen erkennbar. Trotz der bekannten, inhibitorischen Wirkung des Spirooxindols Spirotrypostatin auf die αβ-Tubulin-Dynamik war die Wirkung von (-)-6k andersartig. Anhand eines etablierten ELISA Assays konnte außerdem eine für gewisse Spirooxindole typische, inhibitorische Wirkung der Substanz auf die p53/MDM2 Proteininteraktion ausgeschlossen werde. Somit gilt für die Substanz (-)-6k ein vorher unbeschriebenes Wirkprinzip der Spirooxindole als sehr wahrscheinlich. Die Identifikation des Zielproteins bietet einen interessanten Einstieg für weitere Untersuchungen zu dem Wirkstoff (-)-6k. Mittels des High Content Screenings einer, aus 150 THPs bestehenden Substanzbibliothek wurden Tubulexin A, B und C als antimitotische Substanzen identifiziert. Die zelluläre Untersuchung dieser Substanzen zeigte eine Induktion von G2/M-Arrest und Apoptose im niedrig mikromolaren Bereich. Außerdem inhibierten die Substanzen die MTRepolymerisation kältebehandelter BSC-1 Zellen. Die Studien zeigten somit ein gemeinsames Wirkprinzip der Tubulexine. Zur Identifikation des Zielproteins des bioaktivsten Derivates Tubulexin A wurde ein quantitativer, proteomischer Ansatz mittels SILAC basierter komparativer Affinitätschromatographie verwendet. Anhand dieses Ansatzes wurden, unter Berücksichtigung der zellulären Studien, αβ-Tubulin und CAS als potentielle Zielproteine identifiziert. Die Isolation durch die Tubulexin A Affinitätssonde konnte durch Immunodetektion bestätigt werden. Nachfolgend konnte die spezifische und physiologisch relevante Bindung von Tubulexin A an αβ Tubulin durch die inhibitorische Wirkung der Substanz auf die in vitro Tubulin-Polymerisation validiert werden. Dieses Ergebnis verdeutlichte, dass der zelluläre Effekt von Tubulexin A unabhängig von CAS erklärbar ist. Des Weiteren ist gezeigt worden, dass Tubulexin A ein potenter Ligand der Vinca Alkaloid- Bindestelle von αβ Tubulin ist: Unter den gewählten Bedingungen war dessen stöchiometrische Bindung an das Protein mit derer von Vinblastin vergleichbar. Die physiologische Wirkung von Tubulexin A betreffend ist neben einer spezifischen Bindung von αβ-Tubulin ein synergetischer Wirkmechanismus mit dem Protein CAS denkbar. Die Untersuchung eines solchen etwaigen Mechanismus bietet einen attraktiven Ausgangspunkt für weitere Studien. Aufgrund ihrer interessanten Bioaktivität, chemischen Zugänglichkeit, unverminderten Wirkung gegenüber Taxol resistente Zellen und einer möglichen synergetischen Wirkung auf αβ-Tubulin und CAS stellen die Tubulexine interessante Leitmotive für die Synthese Tubulexin-basierter Substanzbibliotheken dar. Es ist wahrscheinlich, dass hierdurch Substanzen mit größerer Potenz und erhöhter Selektivität gegenüber den Zielproteinen erhalten werden können.

In dieser Dissertation wird über die Kristallstruktur des Enzyms 1,5-Anhydro-D-fruktose-Reduktase (AFR) berichtet, das in der Lage ist 1,5-Anhydro-D-fruktose (1,5-AF) streng NADPH-abhängig zu 1,5-Anhydro-D-mannitol zu reduzieren. 1,5-AF konnte in unterschiedlichen Organismen nachgewiesen werden. Es ist unter anderem in der Regulation des Glycogenhaushalts in Säugern beteiligt und konnte als Zwischenprodukt bei der Antibiotikaproduktion in Pilzen und Rotalgen nachgewiesen werden. AFR wurde in Gegenwart von Cofaktor kristallisiert. Der Oxidationszustand des Cofaktors konnte über Fluoreszenzmessungen an intakten Kristallen zu NADP+ bestimmt werden. Die Struktur konnte über SAD an Se-Met bis zu einer Auflösung von 2.2 Å bestimmt werden.AFR besteht aus zwei Domänen. Die N-terminale Domäne zeigt eine typische Rossmann Faltung und ist verantwortlich für die Cofaktor Bindung. Aufgrund der Struktur wurde die Spezifität von AFR gegenüber phosphoryliertem Cofaktor NADP(H) diskutiert und Möglichkeiten aufgezeigt, diese Cofaktorpräferenz zugunsten NAD(H) zu verschieben. In der C-terminalen Domäne konnten verschiedene Reste identifiziert werden, die wahrscheinlich in die Substratbindung und Katalyse involviert sind. Ein Histidinrest im aktiven Zentrum agiert wahrscheinlich als Säure-Basen-Katalysator indem er die Carbonylgruppe des Substrats polarisiert und so den Transfer des Hydridions von NADPH zum Substrat ermöglicht.Der zweite Teil der Dissertation beschäftigt sich mit der Kristallstruktur von SoxXA, einem Enzym, das in die Schwefeloxidation von Paracoccus pantotrophus involviert ist. Das Schwefeloxidations-System von P. pantotrophus (SOX) besteht aus mehreren Enzymen, die in der Lage sind Sulfid, molekularen Schwefel, Thiosulfat und Sulfit zu oxidieren und die gewonnenen Elektronen der Atmungskette zu Verfügung zu stellen. Der heterodimere Cytochrom c Komplex SoxXA agiert dabei als Häm-Enzym und verknüpft kovalent das Schwefel Substrat mit der Thiol-Gruppe von Cyst-138 des SoxYZ Komplexes. Die Kristallstruktur des Cytochrom c Komplexes SoxXA konnte bis zu einer Auflösung von 1.9 Å gelöst werden und zeigte eine ungewöhnliche Koordination in Form eines Cysteinthiolat an Häm2. Die Bindungstasche um das aktive Zentrum bei Häm2 bietet ausreichend Platz für ein (GGCGG)2 Dimer, das über die Cysteine kovalent verknüpft ist, und ein Analogon für den dimeren C-Terminus von SoxY2 darstellt. Anhand der Kristallstruktur und biochemischen Daten wurde ein Mechanismus für die kovalente Verknüpfung des Schwefelsubstrats mit der Sulphhydrylgruppe von Cys-138 von SoxY über eine kovalente Zwischenstufe an Cys251 von SoxA vorgeschlagen., In this PhD thesis the 2.2 Å crystal structure of the enzyme 1,5-anhydro-D-fructose reductase (AFR) is reported, which reduces the carbohydrate derivative 1,5-anhydro-D-fructose (1,5-AF) yielding 1,5-anhydro-D-mannitol in a strictly NADPH-dependent manner. 1,5-AF was identified in various organisms. It is involved in the regulation of the glycogen metabolism in mammalians and was identified to be an intermediate in the production of antibiotics in fungi and red algae. AFR was crystallized in the presence of cofactor. The bound dinucleotide is NADP+ as was determined by fluorescence measurements of the intact crystal to NADP+. The crystal structure was solved with the SAD-method using Se-Met incorporation.AFR consists of two domains. The N-terminal domain shows a Rossmann fold and is responsible for the cofactor binding. Based on the structure, the cofactor specificity of AFR towards phosphorylated cofactor NADP(H) is discussed and possibilities for a conversion of this cofactor specificity to the NAD(H) are suggested. In the C-terminal domain several residues could be identified, which are involved in substrate binding and catalysis. A histidine residue in the active site is believed to act as a acid base catalyst by polarisation of the carbonyl function of the substrate to enable the transfer of the hydride ion from NADPH onto the substrate.A second part of this thesis is concerned with the crystal structure of SoxXA, an enzyme which is involved in sulfur oxidation in Paracoccus pantotrophus. The sulfur-oxidizing enzyme system of P. pantotrophus (SOX) is composed of several proteins, which oxidize hydrogen sulfide, sulfur, thiosulfate or sulfite and transfer the generated electrons to the respiratory chain. The heterodimeric cytochrome c complex SoxXA functions as heme enzyme covalently linking the sulfur substrate to the thiol of the Cys-138 residue of the SoxY protein of the SoxYZ complex. The crystal structure of the cytochrome complex SoxXA was solved to a resolution of 1.9 Å. The axial heme-iron coordination involves an unusual Cys-251 thiolate at heme-2. The space in the active site pocket around heme-2 was sufficient for a (GGCGG)2 dimer covalently linked via a disulfide bridge, which is an analogue for the C-terminus of a SoxY2 dimer. On the basis of the crystal structure and biochemical data, a mechanism for the covalent linkage of the sulfur substrate to the sulphhydryl of Cys-138 of SoxY via a covalent intermediate at Cys251 of SoxA is proposed and discussed.

Das kleine GTP-bindende Protein Rab4a gehört zu der Familie der Rab-Proteine, die bei der Regulation des vesikulären Transportes eine wichtige Rolle als molekulare Schalter übernehmen. Grundlage ihrer Schalterfunktion ist ein Wechsel zwischen der aktiven, GTP-gebundenen und inaktiven, GDP-gebundenen Form, die durch regulatorische Proteine moduliert wird.Die Weitergabe der durch die Rab-Proteine übermittelten Signale geschieht über die Interaktion mit spezifischen Effektoren, die an die GTP-Form der Rab-Proteine binden. Die Wechselwirkung zwischen Rab-Protein und Effektor wird durch die Hydrolyse des gebundenen GTP beendet. Die Rab-Proteine zeigen eine breite Varianz der intrinsischen Hydrolyseraten, die durch die hochkonservierten, an der Nukleotidbindung beteiligten Aminosäuren nicht erklärt werden kann.Ziel dieser Arbeit war die strukturelle Charakterisierung von Rab4a in der GTP- und der GDP-Form, um zu einem besseren Verständnis der Hydrolysemodulation auf molekularer Ebene beizutragen und den Vergleich mit anderen GTP-bindenden Proteinen zu ermöglichen. Desweiteren sollte die Wechselwirkung von Rab4a mit den Rab4-bindenden Domänen des Effektors Rabaptin-5 charakterisiert und röntgenkristallographisch untersucht werden. Pull-down assays und Gelfiltrationsanalysen zeigen, daß der C-Terminus von Rab4 von entscheidender Bedeutung für die Interaktion mit Rabaptin-5 ist.Diese Ergebnisse wurden durch single-turnover-Hydrolyseexperimente bestätigt.Die Struktur von Rab4a konnte in der GppNHp (GTP-Analogon)- und der GDP-Form in hoher Auflösung bestimmt werden. Die Struktur der GppNHP-Form von Rab4 ähnelt den bereits bekannten Strukturen anderer Rab-Proteine. Die Struktur der GDP-Form von Rab4 enthält kein koordinierendes Magnesiumion und ist damit das erste bekannte Beispiel für eine Rab-Struktur in der magnesiumfreien, GDP-gebundenen Form. Die fehlenden Interaktionen des Magnesiumions mit dem Nukleotid werden durch neue Wechselwirkungen kompensiert, die ähnlich in der Struktur der kleinen GTPase RhoA im magnesiumfreien, GDP-gebundenem Zustand beobachtet wurden.

ClpB aus T. thermophilus kooperiert mit dem DnaK-Chaperonsystem in der Reaktivierung von Proteinaggregaten. ClpB gehört zur Gruppe der AAA+-Proteine, die durch die konservierte AAA-Kassette charakterisiert werden. Diese Domänen sind für die Nukleotidbindung und Hydrolyse der Proteine verantwortlich. Anhand von Sequenzvergleichen kann ClpB in vier Domänen eingeteilt werden: Der N-terminalen Domäne folgt die erste AAA-Kassette, die durch eine Linkerdomäne mit der zweiten AAA-Kassette verbunden ist. Ziel dieser Arbeit war es die Funktionen der einzelnen Domänen in der Deaggregationsreaktion genauer zu charakterisieren. Für diese Untersuchungen mussten zunächst neue Substratproteine zur Messung der Chaperonaktivität etabliert werden. Es konnte gezeigt werden, dass die N-terminale Domäne nicht essentiell für die Oligomerisierung, ATPase-Aktivität und Chaperonfunktion von ClpB ist. Sie ist an der Bindung von Casein beteiligt, interagiert jedoch nicht mit anderen Substraten.Die Linkerdomäne bildet eine funktionelle Einheit mit der ersten AAA-Kassette des Proteins. Daher kann ClpB in zwei Hälften mit jeweils einer AAA-Kassette unterteilt werden. In die erste AAA-Kassette mit der Linkerdomäne und in die zweite AAA-Kassette. Die beiden AAA-Kassetten sind nicht mehr funktionell aktiv und in der Oligomerisierung stark eingeschränkt. Ihre ATPase-Aktivität ist jedoch unterschiedlich. Die erste AAA-Kassette ist inaktiv, die zweite AAA-Kassette sehr aktiv in ATPase-Aktivitätsmessungen. Die beiden AAA-Kassetten können einen Komplex ausbilden, der biochemische Eigenschaften wie ClpB besitzt und über Chaperonaktivität verfügt. Dies zeigt, dass für die Chaperonaktivität die kovalente Verknüpfung der AAA-Kassetten von ClpB nicht notwendig ist. Die Komplexbildung führt zudem zu einer reduzierten ATPase-Aktivität der zweiten AAA-Kassette, was auf eine regulative Funktion der ersten AAA-Kassette und eine katalytische Funktion der AAA-Kassette im ATPase-Zyklus hinweist., ClpB from T. thermophilus cooperates with the DnaK chaperone system during the reactivation of protein aggregates. ClpB belongs to the group of AAA+-proteins, which are characterised by the conserved AAA cassette. This protein domain is responsible for nucleotide binding and hydrolysis. Based on sequence comparisons ClpB can be divided in four domains: the first AAA cassette, which is connected to the second AAA cassette by a linker domain, follows the N-terminal domain. In this work the functions of the domains in the disaggregation reaction were characterised. It was shown that the N-terminal domain is not essential for the oligomerisation, ATPase activity and chaperone function of ClpB. The N-terminal domain is required for casein binding but does not interact with other substrate proteins. The linker domain forms a functional unit with the first AAA cassette. Therefore ClpB can be in two halves: in the first AAA cassette with the linker domain and in the second AAA cassette. The two AAA cassettes have no chaperon activity and are severely reduced in their oligomerisation capacity but differ in their ATPase activity. The first AAA cassette is inactive, the second AAA cassette active in ATPase activity measurements. The AAA cassettes form a complex, which has chaperone activity and similar biochemical properties as ClpB. This demonstrates that a covalent linkage of the AAA cassettes of ClpB is not necessary for chaperone activity. In addition complex formation leads to a decrease in ATPase activity of the second AAA cassette indicating a regulating function of the first AAA cassette and a catalytic function of the AAA cassette in the ATPase cycle of ClpB.

Das molekulare Chaperon ClpB aus T. thermophilus gehört zu der AAA+-Familie derATPasen, die konservierte Nukleotidbindungsdomänen enthalten und ringförmige Oligomerebilden. Die Aufgabe von ClpB in der Zelle ist es, in funktioneller Kooperation mit demDnaK-System Proteinaggregate aufzulösen und zu reaktivieren.Ziel dieser Arbeit war es, die Rolle der beiden Nukleotidbindungsdomänen (NBD) von ClpBfür die Chaperonaktivität, Oligomerisierung, Nukleotidbindung und ATPase-Aktivität zucharakterisieren. Wie Gelfiltrationsanalysen zeigen unterliegt ClpB einem dynamischenOligomerisierungsgleichgewicht, welches durch das gebundene Nukleotid und dieIonenstärke beeinflusst wird. Fluoreszenztitrationen mit dem fluoreszierendenNukleotidanalogon mant-ADP belegen, dass die Bindungsaffinität der hochaffinen NBD2stark vom oligomeren Zustand von ClpB abhängig ist. Auch die Analyse der ATPase-Aktivität deutet auf Kooperativität zwischen den beiden NBDs hin. Mit Hilfe von Stopped-Flow-Messungen mit mant-ADP und Fluoreszenzanisotropiemessungen mit AlexamarkiertemClpB wurde ein Bindungsmodell entwickelt, welches die welchselseitigeAbhängigkeit von Oligomerisierung und Nukleotidbindung beschreibt.Studien mit Modellsubstraten Luziferase und a-Glucosidase belegen außerdem, dass ClpBdirekt mit aggregierten Proteinen wechselwirkt. Die Isolation eines spezifischen ClpB-DnaKKomplexesin Ko-Elutionsexperimenten weist darauf hin, dass ClpB und DnaK einenKomplex bilden und in einer konzertierten Aktion auf aggregierte Substratproteine einwirken.

Das Protein Titin ist in quergestreiften Muskeln neben Aktin und Myosin das dritthäufigste Muskelprotein. Titin besitzt neben einer Vielzahl von Bindungsstellen für andere Muskelproteine zusätzlich eine Serin/Threonin-Kinase-Domäne, die als Titin-Kinase bezeichnet wird. Es wird vermutet, dass Titin und insbesondere die Titin-Kinase maßgeblich an der Signaltransduktion des quergestreiften Muskels beteiligt sind. Protein-Kinase-Inhibitoren stellen geeignete biochemische Werkzeuge dar, um solche Signaltransduktionswege zu untersuchen. Stellvertretend für die Titin-Kinase konnten für ausgewählte Enzyme aus der Gruppe der Serin/Threonin-Kinasen erstmalig fluoreszenzmarkierte bifunktionelle Inhibitoren synthetisiert werden, welche aus einer Nukleotid- und einer fluoreszenzmarkierten Peptid-Komponente bestehen, die durch einen kovalenten Linker in einem geeigneten Abstand zueinander fixiert werden. Es konnte gezeigt werden, dass die synthetisierten Verbindungen zu einer Inhibition im unteren mikromolaren Bereich führen und unter zellulären Bedingungen spezifisch mit der jeweiligen Ziel-Kinase kolokalisieren. Die Grundvoraussetzungen für eine Visualisierung von Signaltransduktionswegen mittels solcher bifunktioneller Inhibitoren sind somit erfüllt. Darauf aufbauend konnte ein entsprechender potentieller bifunktioneller Inhibitor für die Titin-Kinase synthetisiert werden, der nun für Untersuchungen der Signalwege der Titin-Kinase im quergestreiften Muskel sowie für die Kristallisation verwendet werden kann. Weiterhin konnte eine neuartige bifunktionelle Inhibitor-Matrix für die Affinitätschromatographie generiert werden, mit der es möglich war, eine rekombinante Kinase aus einem komplexen Zelllysatgemisch zu isolieren., Besides actin and myosin, titin is the third-most prevalent muscle protein in the striated muscle. Titin contains a number of binding sites for other muscle proteins and an additional serine/threonine-kinase domain, called the titin kinase. It is supposed that titin and especially titin kinase play an important role in the signal transduction of striated muscle. Protein kinase inhibitors are suitable biochemical tools for the investigation of such signalling pathways. In this work, in a representative manner to titin kinase, fluorescently labeled bi-substrate inhibitors for selected enzymes from the family of serine/threonine-kinases were synthesized for the first time. The inhibitors were composed of a nucleotide and afluorescently labeled peptide fragment and were kept in the right distance by an appropriate covalent linker. It could be shown that these inhibitors lead to inhibition in the low micromolar range and co-localize specifically with their respective kinases under cellular conditions. So, we could fulfill the prerequisites for the use of such bi-substrate inhibitors for the visualization of signalling pathways. Based on this approach an appropriate bi-substrate inhibitor for titin kinase was synthesized which can now be used for the investigation of signalling pathways of titin kinase in striated muscle and also for the co-crystallization with titin kinase. Furthermore, an innovative bi-substrate inhibitor matrix for affinity chromatography was synthesized which allows the isolation of a recombinant protein kinase from a complex cell lysate.

Neben den in DNA natürlich vorkommenden Nukleobasen Adenin, Cytosin, Guanin und Thymin findet man auch die methylierten Basen N6­Methyladenin, N4­Methylcytosin und C5­Methylcytosin. Durch diese Methylierung wird der Informationsgehalt der DNA erhöht und dient verschiedenen Systemen innerhalb der Zelle als Signal. Die Modifikation wird durch DNA­Methyltransferasen (DNA­MTasen) katalysiert. In dieser Arbeit wird die Bindung der Dam DNA­MTase aus Escherichia coli, welche zu der Gruppe der N6­Adenin DNA­MTasen gehört , an DNA charakterisiert. Dieses Enzym bindet dabei als Dimer an die DNA und übertägt die Methylgruppe mittels eines Basenausklapp­Mechanismus. Weiterhin konnte die Dam DNA­MTase kristallisiert werden und der Tyrosinrest des hochkonservierten DPPY­Motivs als an der DNA­Bindung beteiligte Aminosäure identifiziert werden.

In der vorliegenden Arbeit wird die chemische Totalsynthese der Ras-Bindungsdomäne von c-Raf1 (RBD) mit verschiedenen Modifikationen und Funktionalisierungen, unter Ausnutzung der nativen chemischen Ligation zweier Peptidsegmente, beschrieben. Dabei wurden zwei fluoreszierende, nicht-codierte Aminosäuren in die RBD eingebaut und Modifikationen für die zielgerichtete Immobilisierung der Proteine eingeführt. Der Einbau der nicht-codierten Aminosäuren N3-Nitrobenzofurazan-L-2,3-diamino-propionsäure (NBD-Dap) oder L-(6,7-Dimethoxy-4-coumaryl)-alanin an Position 91 der RBD erlaubt die Detektion der Wechselwirkung der RBD mit dem Proto-Onkoprotein Ras. Das Fluoreszenzverhalten wurde eingehend untersucht, wobei auch Fluoreszenzlebenszeitmessungen durchgeführt wurden. In Stopped flow Versuchen wurden KD-Werte (zwischen 170 nM und 610 nM) für die Wechselwirkung von Ras und verschiedenen RBD-Proteinen bestimmt. Ein C-terminaler His-Tag wurde benutzt, um die RBD/L91NBD-Dap/His auf einer Ni-NTA-beschichteten Oberfläche zu immobilisieren. Ausgehend davon wurde ein Biosensor entwickelt, der den Nachweis von aktiviertem Ras erlaubt. Die Nachweisgrenze liegt bei einer Konzentration von 300 nM aktiviertem Ras. Des Weiteren wurde eine C-terminal verkürzte Form des Ras-Proteins durch chemische Totalsynthese hergestellt. Dazu wurden drei Peptidsegmente synthetisiert und durch native chemische Ligation miteinander verknüpft. Das Protein wurde in hoher Reinheit erhalten und unter Ausnutzung von GppNHp (ein nicht-hydrolysierbares GTP-Analogon) als Faltungsgerüst, gelang die Faltung in die biologisch aktive Tertiärstruktur. Mit dem Ras-RBD-System ist es zum erstenmal gelungen ein biologisches System aus zwei Proteinen vollständig chemisch zu synthetisieren und volle biologische Funktionsfähigkeit zu erhalten. Weiterhin konnten die RBD und Ras an den C-Termini mit den Farbstoffen Cy5 und Alexa 488 markiert werden. Dazu wurden kurze Peptide synthetisiert, an die die Fluorophore gekoppelt wurden und die zusätzlich einen His-Tag enthielten. Ras und RBD mit C-terminalen Thioestern wurden aus Intein-Fusionsproteinen gewonnen und in dieser Form zur Ligation mit den synthetisierten Peptiden eingesetzt. Die resultierenden fluoreszenzmarkierten Proteine waren für Energietransfermessungen mit Alexa 488 (als Donor) und Cy5 (als Akzeptor) geeignet und erlaubten die Beobachtung der Komplexbildung aus aktiviertem Ras und RBD. Damit wurde ein genereller Weg zur C-terminalen Fluoreszenzmarkierung von Proteinen aufgezeigt. Außerdem wurde die humane Thymidinmonophosphatkinase (TMPK) auf semisynthetischem Weg hergestellt. Dazu wurde der größte Teil des Proteins (TMPK 31-212) in E. coli exprimiert, wobei eine Protease-Schnittstelle vor der AS 31 eingeführt wurde, die es erlaubte ein N-terminales Cys zu generieren, das für die Ligationreaktion mit dem chemisch synthetisierten N-terminalen Peptid (AS 1-30) benötigt wird. Der Einbau des N3-Nitrobenzofurazan-L-2,3-diamino-propionsäure an Position 25, an Stelle eines Lys, bewirkte einen Rückgang der Phosphorylierungsaktivität des Enzyms um den Faktor 4.