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Tyrosinkinasen (TK) sind Schlüsselregulatoren der zellulären Signaltransduktion und beeinflussen Zellzyklus, Zellüberleben, Apoptose, Proliferation und Differenzierung. Die Dysregulation der TK-Aktivität trägt zur Entwicklung von Leukämie und anderen malignen Erkrankungen bei. So sind 25% der akuten lymphatischen Leukämien bei Erwachsenen (ALL) durch die BCR-ABL1-Translokation bedingt. Trotz intensiver Therapie beträgt das 5-Jahres-Überleben von erwachsenen Patienten mit ALL nur etwa 50 %. Als Alternative zu herkömmlichen Chemotherapeutika bietet der Einsatz von spezifisch wirkenden TK-Inhibitoren einen individualisierten Therapieansatz mit idealerweise weniger Nebenwirkungen und einem dadurch verbesserten Outcome. Um mögliche neue therapeutische Ziele zu identifizieren, wurde eine systematische Untersuchung der Expressionsveränderungen des gesamten Tyrosinkinoms durchgeführt. Eine Vielzahl verschiedener Tyrosinkinasen zeigte starke Veränderungen im Expressionsprofil von ALL-Zellen. Ein Teil dieser Expressionsänderungen kam durch das veränderten Methylierungsprofil der ALL-Zellen zustande. EPHA7 und PTK2 sind potentielle Marker für B-Linien ALL und NTRK3, ERBB4 und ZAP70 für T-Linien ALL. Die interindividuell variierende Expression der Tyrosinkinasen EPHA3, EPHB3, KIT, ZAP70 und PDGFRB könnte eine genauere Risikoeinstufung ermöglichen. Insbesondere sind die Tyrosinkinasen ABL1, DDR1, EPHA7, FGFR1, ERBB4, FLT1, FLT3, FLT4, LCK, LTK, PTK2, PTK2B, PTK7, SRC, TEC und TYK2 vielversprechende therapeutische Ziele, die im hämatopoetischen System die Proliferation fördern und / oder die Apoptose hemmen. Eine proliferationsfördernde Wirkung von überexprimiertem FLT4 konnte erstmals gezeigt werden. Die Vielfalt der Veränderungen in der Tyrosinkinase-Expression scheint eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von ALL zu spielen und TK könnte vielversprechende neue therapeutische Ziele sein. Tyrosine kinases (TK) are key regulators of cellular signal transduction and affect cell cycle, cell survival, apoptosis, proliferation and differentiation. Dysregulation of TK activity contributes to the development of leukemia and other malignancies. So are 25 % of adult acute lymphoblastic leukemias (ALL) driven by the BCR-ABL1 translocation. Despite intensive therapy, the 5-year overall survival of adult patients with ALL is about 50 %. In contrast to conventional chemotherapeutic agents, the use of specific-acting TK-inhibitors offers an individualized therapeutic approach with less side-effects and a better outcome. To identify possible new therapeutic targets, a systematic survey of expression changes of the entire tyrosine kinome was carried out. A variety of different tyrosine kinases showed great changes in the expression profile of ALL-cells. Part of these expression changes can be attributed to a changed methylation profile in adult ALL. EPHA7 and PTK2 are potential markers for B-line ALL and the NTRK3, ERBB4 and ZAP70 for T-lines ALL. The interindividual varying expression of the tyrosine kinases EPHA3, EPHB3, KIT, ZAP70 and PDGFRB presumably allows a more precise risk classification. In particular, the tyrosine kinases ABL1, DDR1, EPHA7, FGFR1, ERBB4, FLT1, FLT3, FLT4, LCK, LTK, PTK2, PTK2B, PTK7, SRC, TEC and TYK2 are promising therapeutic targets, which promotes proliferation and/or inhibits apoptosis in the hematopoietic system. A proliferation promoting effect of overexpressed FLT4 could be shown for the first time. The variety of changes in the tyrosine kinase expression seems to play an important role in the development of ALL and TK could be promising new therapeutic targets.

Receptor tyrosine kinase (RTK)-dependent signaling has been implicated in the pathogenesis of acute lymphoblastic leukemia (ALL) of childhood. However, the RTK-dependent signaling state and its interpretation with regard to biological behavior are often elusive. To decipher signaling circuits that link RTK activity with biological output in vivo, we established patient-derived xenograft ALL (PDX-ALL) models with dependencies on fms-like tyrosine kinase 3 (FLT3) and platelet-derived growth factor receptor β (PDGFRB), which were interrogated by phosphoproteomics using iTRAQ mass spectrometry. Signaling circuits were determined by receptor type and cellular context with few generic features, among which we identified group I p21-activated kinases (PAKs) as potential therapeutic targets. Growth factor stimulation markedly increased catalytic activities of PAK1 and PAK2. RNA interference (RNAi)-mediated or pharmacological inhibition of PAKs using allosteric or adenosine triphosphate (ATP)-competitive compounds attenuated cell growth and increased apoptosis in vitro. Notably, PAK1- or PAK2-directed RNAi enhanced the antiproliferative effects of the type III RTK and protein kinase C inhibitor midostaurin. Treatment of FLT3- or PDGFRB-dependent ALLs with ATP-competitive PAK inhibitors markedly decreased catalytic activities of both PAK isoforms. In FLT3-driven ALL, this effect was augmented by coadministration of midostaurin resulting in synergistic effects on growth inhibition and apoptosis. Finally, combined treatment of FLT3D835H PDX-ALL with the ATP-competitive group I PAK inhibitor FRAX486 and midostaurin in vivo significantly prolonged leukemia progression-free survival compared with midostaurin monotherapy or control. Our study establishes PAKs as potential downstream targets in RTK-dependent ALL of childhood, the inhibition of which might help prevent the selection or acquisition of resistance mutations toward tyrosine kinase inhibitors.

Das Gen Neuregulin-1 (Nrg1), eines der größten Gene im Genom von Säugetieren, kodiert für eine Vielfalt verschiedener Isoformen, die entweder sezerniert oder als Transmembranmoleküle synthetisiert werden. Alle Nrg1-Isoformen besitzen eine EGF-ähnliche-Domäne, mit der sie an die Rezeptortyrosinkinasen ErbB3 bzw. ErbB4 binden. Diese bilden mit dem Korezeptor ErbB2 heteromere Rezeptoren aus, also ErbB3/ErbB2 bzw. ErbB4/ErbB2. Die Rezeptor-Heteromere werden durch Nrg1-Bindung aktiviert und setzen verschiedene intrazelluläre Signalwege in Gang, die so unterschiedliche zelluläre Antworten wie Proliferation, Migration, Überleben, und Differenzierung hervorrufen [Garratt et al., 2000, Bioessays 22, 987-996]. In den vorgelegten Arbeiten wurden die Verfahren der klassischen und konditionellen Mutagenese eingesetzt, um die Funktionen des Nrg1/ErbB Signalübertragungssystems während der embryonalen Entwicklung bzw. in postnatalen Stadien der Maus zu untersuchen. Während der Embryogenese werden die Nrg-Isoformen Typ I und Typ III u.a. im Endokard bzw. in sensorischen und Motoneuronen exprimiert. Durch einen Vergleich von Mäusen, bei denen gezielt spezifische Isoformen von Nrg1 mutiert wurden, konnte ich zeigen, dass Typ I Nrg1 die Entwicklung des Herzens und der aus der Neuralleiste gebildeten neuronalen Anteile der kranialen Ganglien steuert, während Typ III Nrg1 für die Entwicklung der Vorläufer der Schwann’schen Zellen unerlässlich ist [Meyer et al., 1997, Development 124, 3575-3586]. Da die Nullmutation von Nrg1 bzw. ErbB2/ErbB3/ErbB4 zur embryonalen Letalität führt, entwickelte ich einen Mausstamm, in dem ErbB2 konditionell inaktiviert werden konnte, um die Funktionen von Nrg1/ErbB-Signalen in der postnatalen Maus untersuchen zu können. Initial wurde mittels eines Krox20-cre-Treibers die Rolle des Signalsystems in ausdifferenzierenden myelinisierenden Schwann ’schen-Zellen untersucht [Garratt et al., 2000, J. Cell Biol. 148, 1035-1046]. Diese Untersuchungen zeigten zum ersten Mal, dass Nrg1-ErbB-Signale eine trophische Wirkung auf die Schwann’sche Zelle ausüben, und dadurch die Dicke der Myelinscheide im peripheren Nervensystem kontrollieren. Typ I und Typ III Nrg1-Isoformen werden als transmembran Moleküle synthetisiert und später durch Proteolyse in die extrazelluläre Matrix freigesetzt bzw. auf der axonalen Membran präsentiert. Michael Willem und Christian Haass (LMU, München) konnten in in vitro Experimenten zeigen, dass Typ III Nrg1 durch die Protease β-Sekretase (BACE1) gespalten wird. Die Inhibition dieser Sekretase ist einer der vielversprechendsten Therapieansätze für die Behandlung der Alzheimer Erkrankung, die mit Ablagerungen des Amyloid-Beta-Peptids, einem der Spaltprodukte von BACE1, assoziiert ist. Die physiologische Funktion der β-Sekretase BACE1 war bis vor kurzem ungeklärt, auch eine Nullmutation in der Maus zeigte keinen offensichtlichen Phänotyp. Aufgrund dieser Erkenntnisse galt BACE1 als Hauptziel der Wirkstoffentwicklung für Therapeutika der Alzheimer Erkrankung. Durch Vergleich der Phänotypen im Nervensystem von konditionellen ErbB2-Mutanten mit Mäusen, in denen BACE1 fehlte, konnte ich die essentielle Funktion von BACE1 in der Nrg1-abhängigen Myelinisierung der peripheren Nerven aufdecken [Willem et al., 2006, Science 314, 664-666]. Diese Arbeit lieferte den ersten Beweis dafür, dass die Proteolyse von Nrg1 für die Aktivität des Moleküls in vivo von zentraler Bedeutung ist. Somit müssen in Zukunft mögliche Nebenwirkungen einer auf BACE1-Hemmung basierenden Therapie aufgrund der nachgewiesenen physiologischen Funktion dieser Protease bei der Myelinisierung in Betracht gezogen werden. Nrg1/ErbB Signale aktivieren eine Reihe von Signalpfaden in der Schwann’schen Zelle die deren Entwicklung und Differenzierung steuern. In Zusammenarbeit mit Katja Grossmann, Profs. Carmen und Walter Birchmeier und weiteren Wissenschaftlern wurden Src und MAPKinase als Nrg1 nachgeschaltete Signalpfade identifiziert, die für die frühe Entwicklung und spätere Ausdifferenzierung der Schwann’schen Zelle essentiell sind [Grossmann et al., 2009, PNAS 106, 16704-16709]. Nrg1-ErbB2/ErbB4-Signale sind unabdingbar für die embryonale Entwicklung des Herzens und deren Inaktivierung in der Maus führt zur Letalität am embryonalen Tag E10,5. Untersuchungen an Patientinnen mit metastasierendem Mammakarzinom, die mit einer antikörperbasierten Therapie (Herceptin®/Trastuzumab) gegen ErbB2 behandelt wurden, ergaben, dass ein Teil der Frauen an einer Herzinsuffizienz erkrankt war. In Zusammenarbeit mit dem Kardiologen Cemil Özcelik setzte ich einen konditionellen ErbB2-Stamm ein, um die Rolle von Nrg1/ErbB-Signalen im postnatalen Herzen zu untersuchen. Die Versuchsreihe ergab, dass ErbB2 für die Aufrechterhaltung der Pumpfunktion des Herzens benötigt wird [Özcelik et al., 2002, PNAS 99, 8880-8885], und konnte somit erklären, wie eine Behandlung mit Herceptin®/Trastuzumab zu einer Dysfunktion des Herzens führen kann. Die Etablierung genetisch veränderter Mäuse, in denen Nrg1 bzw. dessen Rezeptoren ErbB3/ErbB2 und ErbB4/ErbB2 mittels klassischer und konditioneller Mutagenese inaktiviert wurden, hat es ermöglicht, die Rolle der Nrg1/ErbB-Signalkaskade in der Entwicklung und Funktion des Herzens und sowie des peripheren Nervensystems von Säugetieren aufzuklären. In den letzten Jahren hat sich zunehmendes medizinisches Interesse auf die Funktion von Nrg1/ErbB-Signalen im zentralen Nervensystem fokussiert, da Mutationen in Nrg1, Nrg3 und ErbB4 mit Schizophrenie assoziert wurden. Vor kurzem konnte in Mausmodellen gezeigt werden, dass Nrg1/ErbB4-Signale den Aufbau und die Funktion von inhibitorischen GABA-ergen Schaltkreisen im Gehirn beeinflussen. Die Aufklärung der Rolle von Nrg1/ErbB-Signalen im embryonalen und adulten Gehirn und bei der Ätiologie von Erkrankungen des Nervensystems stellt damit ein sehr spannendes Thema für zukünftige Forschung dar., The gene Neuregulin-1 (Nrg1), one of the largest in the mamalian genome, encodes a diverse array of protein isoforms, which are either secreted or synthesised as transmembrane molecules. All Nrg1 isoforms possess an EGF-like domain, with which they bind to the receptor tyrosine kinases ErbB3 and ErbB4. These form heteromeric receptors together with the co-receptor ErbB2, i.e. ErbB3/ErbB2 or ErbB4/ErbB2. The heteromeric receptors are activated through binding of Nrg1, leading to stimulation of intracellular signaling pathways, and resulting in distinct types of cellular response such as proliferation, migration, survival and differentiation [Garratt et al., 2000, Bioessays 22, 987-996]. In the work presented here, the techniques of classical and conditional mutagenesis were used in order to investigate the role of the Nrg1/ErbB signal transduction cascade during embryonic development and in the postnatal mouse. During embryogenesis, Types I and III Nrg1 are expressed in the endocard and sensory/motoneurons, respectively. By comparing mice in which specific Nrg1 isoforms were mutated, I could show that Type I Nrg1 drives the development of the heart and of the neural-crest derived neuronal portions of the cranial ganglia, whilst Type III Nrg1 is essential for the development of Schwann cell precursors [Meyer et al., 1997, Development 124, 3575-3586]. Due to the fact that null mutations in Nrg1 as well as ErbB2/ErbB3/ErbB4 lead to embryonic lethality, I generated a mouse strain in which ErbB2 could be conditionally inactivated, in order to investigate the functions of Nrg1/ErbB signals in the postnatal mouse. Initially, the role of the signaling system in differentiating myelinating Schwann cells was analysed using a Krox20-cre driver [Garratt et al., 2000, J. Cell Biol. 148, 1035-1046]. These studies showed for the first time that Nrg1/ErbB serves to mediate trophic signals in the Schwann cell, through which the thickness of the myelin sheath in the peripheral nervous system is controlled. Type I and Type III Nrg1 isoforms are synthesised as transmembrane molecules and subsequently become proteolytically cleaved, whereby they are released into the extracellular matrix or presented on the axonal surface. Michael Willem and Christian Haass (LMU, Munich) could show in experiments in vitro that Type III Nrg1 is cleaved by the protease beta-Secretase (BACE1). The inhibition of this secretase is one of the most promising therapeutic strategies for the treatment of Alzheimer disease, which is associated with formation of plaques containing amyloid-beta-peptide, one of the cleavage products of BACE1. The physiological function of the beta- secretase BACE1 was until recently unclear, and studies of mouse BACE1 null mutants had not revealed any overt phenotypes. Because of this, BACE1 was considered as a suitable major target for the development of therapies for Alzheimer disease. By comparing nervous system phenotypes in conditional ErbB2 mutants with those of mice in which BACE1 was inactivated, I discovered the essential function of BACE1 in the Nrg1-dependent myelination of the peripheral nervous system [Willem et al., 2006, Science 314, 664-666]. This work was the first to show that proteolysis of Nrg1 is critically required for the activity of the molecule in vivo. Due to this, future work directed at development of a therapy against Alzheimer based on BACE1 inhibition has to take into account the function of this protease in myelination and activation of Nrg1 in the nervous system. Nrg1/ErbB signals activate a host of signaling pathways in Schwann cells that regulate their development and differentiation. In work performed together with Katja Grossmann, Profs. Carmen and Walter Birchmeier and other colleagues, Src and MAPKinase were identified as signal pathways downstream of Nrg1, which are essential for the early development and later differentiation of the Schwann cell [Grossmann et al., 2009, PNAS 106, 16704-16709]. Nrg1-ErbB2/ErbB4 signals are crucial for the embryonic development of the heart and their inactivation leads to lethality in the mouse at embryonic day E10.5. Examination of patients with metastatic breast cancer who were treated with an antibody-based therapy (Herceptin®/trastuzumab) against ErbB2 (HER2) revealed that a proportion of the women developed heart failure. Working together with the cardiologist Cemil Özcelik, I used a conditional ErbB2 mouse strain to investigate the role of Nrg1/ErbB signals in the postnatal heart. The experiments revealed that ErbB2 is essential for the maintenance of cardiac function [Özcelik et al., 2002, PNAS 99, 8880-8885] and provided an explanation as to how treatment with Herceptin®/trastuzumab leads to cardiac dysfunction in humans. The establishment of genetically altered mice in which Nrg1 or its receptors ErbB3/ErbB2 and ErbB4/ErbB2 have been inactivated through classical or conditional mutagenesis has enabled researchers to uncover the role of the Nrg1/ErbB signal transduction cascade in the development and function of the mammalian heart and nervous system. In the last decade, much medical interest has focused on the role of Nrg1/ErbB signals in the central nervous system, due to the association of mutations in Nrg1, Nrg3 and ErbB4 with schizophrenia. Recently, it could be shown in mouse models that Nrg1/ErbB4 signals influence the development and function of GABAergic circuits in the brain. The elucidation of the role of Nrg1/ErbB signals in the embryonic and adult brain and in the etiology of diseases of the nervous system provides thus an exciting area of research for the years to come.

Die Protein-Tyrosinphosphatase Shp2 ist ein zytoplasmatisches Enzym, welches unterhalb einer Reihe von Rezeptor-Tyrosinkinasen, Hormon- oder Zytokinrezeptoren als positiver Signalüberträger agiert. Ein konditionelle Shp2- Deletion wurde im Epithel des Wolff´schen Gangs und im Ureterepithel mit Hilfe der Kreuzung einer transgenen HoxB7/Cre-Mauslinie und einer Shp2fl- Mauslinie erzielt. Die entsprechenden Nachkommen besitzen rudimentäre Nieren bei der Geburt und sterben kurz darauf. Die nähere Analyse der Shp2-defizienten Nieren zeigt einen starken Verzweigungsdefekt der Ureterknospe und eine verminderte Zellteilungsrate in den Ureterknospenspitzen. Ähnlich starke Phänotypen sind bisher nur bei Mutationen von Komponenten des GDNF/Ret-Signalwegs beobachtet worden. Es wurde deshalb vermutet, dass es einen Zusammenhang zwischen Shp2 und dem Ret-Signalweg in der Nierenentwicklung gibt. Die Expressionsanalyse der Ret-Zielgene Etv4, Etv5 und Wnt11 durch In-situ- Hybridisierung ergab, dass sie in der konditionellen Shp2-Mutante herunterreguliert sind. Eine Stimulation von Shp2-mutanten Nieren in Organkultur mit GDNF ergab, dass sie eine stark herabgesetzte Sensitivität für den Wachstumsfaktor haben. Des Weiteren wurde durch die Kreuzung der konditionellen Shp2-Mutante mit einer Spry1-Null-Mauslinie deutlich, dass das Auswachsen der vielfachen Ureterknospen und die exzessive Verzweigung der Ureterknospen in der Spry1-Mutante durch Verlust von Shp2 behoben werden konnte. D.h. die Doppelmutanten waren phänotypisch gleich wie Shp2- Einfachmutanten. Somit konnte für beide Gene eine genetische Interaktion nachgewiesen werden. In dieser Arbeit wurde demnach gefunden, dass die Tyrosinphosphatase Shp2 in der Nierenentwicklung in den GDNF/Ret-Signalweg einzuordnen ist, und dass Shp2 epistatisch unterhalb von Spry1 liegt., The tyrosine phosphatase Shp2 is a cytoplasmic enzyme, which acts as a positive signal transducer downstream of receptor tyrosine kinases, hormone and cytokine receptors. Through conditional mutagenesis in mice using a HoxB7/Cre line, Shp2 was deleted in the epithelium of the Wolffian duct and the ureteric bud. Mutant mice are born with rudimentary, displastic kidneys and die within one day. Analysis of the Shp2-deficient kidneys reveals branching defects of the ureteric bud and a low proliferation index in the ureteric bud tips. This phenotype resembles those of mutants for GDNF/Ret pathway components. The expression of the Ret target genes Etv4, Etv5 and Wnt11 is down-regulated in the conditional Shp2 mutants, and the kidneys have a reduced sensitivity for the growth factor GDNF in organ culture. These findings confirm that Shp2 functions downstream of the receptor tyrosine kinase Ret. Compound mutants of Shp2 and Spry1 were also examined. Spry1 is a feedback inhibitor of receptor tyrosine kinase signaling in the kidney, and Spry1-/- mutant mice show excessive kidney branching and multiplex kidneys. In contrast, compound Shp2; Spry1 mutants exhibit strongly reduced branching of the ureteric bud, similar to Shp2 single mutants. This suggests that Shp2 and Spry1 interact genetically in the epithelium of the Wolffian duct during ureter outgrowth and in branching, and that Shp2 is epistatically located downstream of Spry1.

Ziel der Arbeit war es, genetische Faktoren, die mit der Progression von Krebserkrankungen in Verbindung stehen könnten, zu identifizieren und näher zu charakterisieren. Die Bedeutung des bereits bekannten Gly388Arg Polymorphismus im FGFR4-Gen sollte für verschiedene Tumorarten hinterfragt und zur weiteren in vivo-Charakterisierung ein geeignetes Mausmodell etabliert werden. Weiterhin wurde für andere, an Signalübertragung beteiligte Proteine nach genetischen Veränderungen in Tumorzellen gesucht. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es, Substrate von Tyrosinphosphatasen durch verschiedene Methoden zu identifizieren und hierdurch deren biologische Funktion insbesondere im Kontext von Brustkrebs zu evaluieren Aim of the study was to identify and further characterize genetic factors that could be connected to cancer progression. The importance of the already known Gly388Arg polymorphism in the FGFR4 gene was investigated in different types of tumors and a mouse model was established for the in vivo characterization. Moreover other genes that are involved in the signal transduction were analyzed for genetic alterations in cancer cell lines. Furthermore new substrates of protein tyrosine phosphatases were identified by different methods to evaluate their functional role in the context of cancer.

In dieser Arbeit wurde die Funktion der Rezeptortyrosinkinase FGFR4 in Krebszellen analysiert. Signaltransduktionsstudien ergaben, dass die Proteintyrosinphosphatase SHP-2 und die Phospholipase PLC-gamma mit FGFR4 interagieren. Außerdem wurde gezeigt, dass FGFR4 mit FGFR1, 2 und 3 Rezeptordimere bilden kann. Die Keimbahnvariante FGFR4 Arg388 korreliert mit einer beschleunigten Tumorprogression. Anhand von zellphysiologischen Analysen konnte eine starke Hemmung der Motiliät von Brustkrebszellen durch Expression des FGFR4 Gly388 demonstriert werden, während FGFR4 Arg388 Expression die Motilität der Zellen leicht erhöhte. Die früher vorgeschlagene tumorsuppressive Funktion des FGFR4 Gly388 Allels wird durch diese Ergebnisse bestätigt. In this thesis the function of the receptor tyrosine kinase FGFR4 in cancer cells was analyzed. Signal tranduction studies revealed an interaction of FGFR4 with the protein tyrosine phosphatase SHP-2 and the phospholipase PLC-gamma. Moreover, the ability of FGFR4 to form heterodimers with FGFR1, 2, and 3 could be demonstrated. The germline variation FGFR4 Arg388 correlates with an enhanced tumor progression. Based on cell physiological assays a strong decrease in the motility of breast cancer cells exogeneously expressing FGFR4 Gly388 was observed, whereas FGFR4 Arg388 expression slightly increased cell motility. An earlier suggested tumor suppressive function of the FGFR4 Gly388 allele could be confirmed by the results obtained here.

Aktivierende Mutationen in der Rezeptortyrosinkinase FLT3 stellen die häufigste genetische Alteration bei der akut myeloischen Leukämie (AML) dar. In dieser Arbeit wurde das onkogene Potential von neu beschriebenen, bislang noch nicht charakterisierten AML-assoziierten FLT3-Mutanten im Zellmodell nachgewiesen. Ferner wurde die Sensitivität verschiedener FLT3-Mutanten gegenüber selektiven FLT3-Tyrosinkinaseinhibitoren untersucht. Die Empfindlichkeit der untersuchten FLT3-Mutanten gegenüber FLT3-Tyrosinkinaseinhibitoren erwies sich als stark abhängig von der Art der Mutation im FLT3-Rezeptor.Die Untersuchung verschiedener FLT3-Mutanten in einem murinen Knochenmarktransplantationsmodell zeigte, dass Längenmutationen innerhalb der juxtamembranären Domäne der FLT3-Rezeptortyrosinkinase (FLT3-ITD) zu einer myeloproliferativen Erkrankung führen, wohingegen aktivierende Mutationen im Bereich der Tyrosinkinasedomäne (TKD) des FLT3-Rezeptors lymphatische Erkrankungen hervorrufen. Activating mutations of the FLT3 receptor tyrosine kinase are the most common genetic alteration in acute myeloid leukemia (AML). Here, the transforming potential of newly described, AML-associated FLT3 receptor mutants was demonstrated. Moreover, the sensitivity of different activating FLT3 receptor mutants towards several FLT3 tyrosine kinase inhibitors was investigated. The results indicate that these inhibitors have distinct activities against different mutants.Furthermore, the role of several FLT3 mutants in vivo was examined using a murine bone marrow transduction/ transplantation model. Mice that received a transplant of FLT3-ITD transduced bone marrow developed a myeloproliferative disease, whereas the tyrosine kinase domain mutants induced a lymphoid disorder in mice.

0\. TITELBLATT UND INHALTSVERZEICHNIS 1\. EINLEITUNG 1 1.1. Allgemeine Prinzipien der zellulären Signalverarbeitung 1 1.2. Rezeptor-vermittelte Signaltransduktion 1 1.2.1. Signaltransduktion durch Rezeptor-Tyrosin-Kinasen 2 1.2.2. Signaltransduktion durch G-Protein-gekoppelte Rezeptoren und heterotrimere G-Proteine 4 1.2.2.1. G-Protein-gekoppelte Rezeptoren und heterotrimere G-Proteine 4 1.2.2.2. Signaltransduktion durch Gα-Untereinheiten 9 1.2.2.3. Signaltransduktion durch Gβγ-Komplexe 11 1.3. Phosphoinositid-3-Kinasen 13 1.3.1. Phosphoinositide als intrazelluläre Botenstoffe 13 1.3.2. Einteilung der PI-3-Kinasen 13 1.3.3. Regulation der Klasse IA PI-3-Kinasen 17 1.3.4. Regulation der Klasse IB PI-3-Kinase γ 22 1.3.5. Zelluläre Funktionen der Klasse I PI-3-Kinasen 24 2\. FRAGESTELLUNG 30 3\. MATERIAL UND METHODEN 31 3.1. Material 31 3.1.1. Zellen 31 3.1.2. Plasmide 31 3.1.3. Enzyme und Reaktionssysteme 32 3.1.4. Chemikalien 33 3.1.5. Antikörper 34 3.1.6. Sonstige Materialien 35 3.2. Methoden 35 3.2.1. Konstruktion von Expressionsplasmiden 35 3.2.2. Zellkultur, Transfektion und Mikroinjektion 38 3.2.3. Immunoblot-Analyse von Ganzzell-Lysaten 38 3.2.4. Gelfiltration 39 3.2.5. Immunpräzipitation und in vitro PI-3-Kinase-Assay 39 3.2.6. Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie 40 3.2.7. Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer 41 4\. ERGEBNISSE 43 4.1. Expression Fluoreszenz-markierter Klasse I PI-3-Kinase-Untereinheiten 43 4.2. Subzelluläre Lokalisation und Translokation der RTK-regulierten Klasse IA PI-3-Kinase β 45 4.2.1. Subzelluläre Lokalisation der PI-3-Kinase β und ihrer Untereinheiten 45 4.2.2. RTK-vermittelte Membrantranslokation der Klasse IA PI-3-Kinase β 47 4.3. Subzelluläre Lokalisation und Translokation der Gβγ-regulierten Klasse IB PI-3-Kinase γ 49 4.3.1. Charakterisierung der Fluoreszenz-markierten PI-3-Kinase γ-Untereinheiten 50 4.3.1.1. Überprüfung der Heterodimerisierung der Fluoreszenz-markierten PI-3-Kinase γ-Untereinheiten 50 4.3.1.2. Überprüfung der enzymatischen Aktivität der Fluoreszenz-markierten PI-3-Kinase γ und ihrer Stimulierbarkeit durch Gβγ 53 4.3.2. Subzelluläre Lokalisation der PI-3-Kinase γ und ihrer Untereinheiten 55 4.3.3. Stabilität der monomeren PI-3-Kinase γ-Untereinheiten 58 4.3.4. Membranrekrutierung der PI-3-Kinase γ durch Gβγ 59 4.4. G-Protein-vermittelte Aktivierung der PI-3-Kinase γ 65 4.4.1. PI-3-Kinase γ-vermittelte Membrantranslokation einer PtdIns-3,4,5-P3-bindenden PH-Domäne 66 4.4.2. Notwendigkeit der p101-Untereinheit für die G-Protein-vermittelte Aktivierung der PI-3-Kinase γ in vivo 70 4.4.3. Aktivität einer Membran-assoziierten PI-3-Kinase γ 71 4.4.4. Bestätigung der Befunde zur Aktivierung der PI-3-Kinase γ durch Gβγ in vivo durch alternative Methoden 79 4.4.4.1. Translokation der Fluoreszenz-markierten PH-Domäne der Btk in HEK293-Zellen 79 4.4.4.2. Phosphorylierung der Akt/PKB in HEK293-Zellen 82 4.4.4.3. Translokation der Fluoreszenz-markierten PH-Domäne der GRP1 in glatten Gefäßmuskelzellen 84 4.5. Membranrekrutierung der PI-3-Kinase γ durch Ras 87 5\. DISKUSSION 94 5.1. Subzelluläre Lokalisation und RTK-vermittelte Membrantranslokation der Klasse IA PI-3-Kinase β 96 5.2. Subzelluläre Lokalisation und Gβγ-vermittelte Membrantranslokation der Klasse IB PI-3-Kinase γ 98 5.3. Heterodimerisierung von p101 und p110γ 100 5.4. Mechanismus der Aktivierung der PI-3-Kinase γ durch Gβγ 101 5.5. Stabilität der monomeren Klasse I PI-3-Kinase-Untereinheiten 106 5.6. Membranrekrutierung von heterodimerer PI-3-Kinase γ und monomerer p110γ durch Ras 107 5.7. Klasse I PI-3-Kinasen als mögliche Angriffspunkte für Pharmaka 108 6\. ZUSAMMENFASSUNG 111 7\. LITERATURVERZEICHNIS 115 EIGENE PUBLIKATIONEN 137 LEBENSLAUF 139 DANKSAGUNG 140, Die Rezeptor-regulierten Klasse I PI-3-Kinasen generieren das Membranlipid PtdIns-3,4,5-P3, was zur Rekrutierung und Aktivierung verschiedener Effektoren mit hieran bindenden PH-Domänen führt. Auf diese Weise kontrollieren sie wichtige zelluläre Prozesse wie Wachstum, Differenzierung oder cytoskelettale Veränderungen. Ihre Regulation und Funktion ist aber erst unvollständig verstanden. Da die Klasse I PI-3-Kinasen vorwiegend im Cytosol gefunden werden, ging man davon aus, daß sie zunächst selbst an die Membran zu ihrem Substrat rekrutiert werden, was in der vorliegenden Arbeit erstmals mittels Fluoreszenz-mikroskopischer Untersuchungen in lebenden Zellen gezeigt wurde. Die heterodimeren Klasse I PI-3-Kinasen werden nach ihren nicht-katalytischen Untereinheiten weiter eingeteilt: Die Klasse IA PI-3-Kinasen α, β und δ werden typischerweise durch Rezeptor-Tyrosin-Kinasen (RTK) aktiviert, wobei ihre nicht-katalytische p85-Untereinheit als Adapter fungiert, der über SH2-Domänen die Interaktion mit dem phosphorylierten Rezeptor vermittelt. Entsprechend wurde hier am Beispiel der PI-3-Kinase β die RTK- und p85-vermittelte Translokation des heterodimeren Enzyms aus dem Cytosol an die Membran gezeigt. Die einzige bekannte Klasse IB PI-3-Kinase γ hat anstelle der p85- eine p101-Untereinheit und wird typischerweise über G-Protein-gekoppelte Rezeptoren durch Gβγ-Komplexe stimuliert. Hierbei war umstritten, welche Rolle die p101 spielt, und ob Gβγ das Enzym ebenfalls an die Membran rekrutiert und hierdurch aktiviert. Es wurde gezeigt, daß Gβγ die PI-3-Kinase γ tatsächlich aus dem Cytosol an die Membran rekrutiert, und zwar durch Interaktion mit ihrer p101-Untereinheit, die insofern also ebenfalls als Adapter fungiert. Zur Untersuchung der enzymatischen Aktivität und Rezeptor-vermittelten Aktivierung der Klasse I PI-3-Kinasen wurde die PtdIns-3,4,5-P3-Bildung durch die Membrantranslokation von hieran bindenden markierten PH-Domänen sichtbar gemacht und auf diese Weise gezeigt, daß die p101 auch für die G-Protein- vermittelte Aktivierung der PI-3-Kinase γ in vivo notwendig ist. Eine künstlich Membran-assoziierte PI-3-Kinase γ war bereits ohne Stimulation enzymatisch aktiv, konnte aber durch Gβγ noch weiter stimuliert werden, offenbar also durch einen allosterischen Mechanismus. Beides war unabhängig von der An- oder Abwesenheit der p101. Gβγ interagiert also auch direkt mit der katalytischen p110γ-Untereinheit, nur offenbar zu schwach, um sie p101-unabhängig an die Membran zu rekrutieren. Somit läßt sich ein Zwei- Schritt-Modell für die Aktivierung der PI-3-Kinase γ durch Gβγ ableiten: Im ersten Schritt rekrutiert Gβγ die PI-3-Kinase γ aus dem Cytosol an die Membran, und zwar durch Interaktion mit ihrer p101-Untereinheit, die hierfür als Adapter fungiert. Bereits die Colokalisation der Lipidkinase mit ihrem Substrat führt zu einer signifikanten PtdIns-3,4,5-P3-Bildung. An der Membran wird die PI-3-Kinase γ aber von Gβγ noch weiter aktiviert, und zwar durch direkte Interaktion mit der katalytischen p110γ-Untereinheit., Receptor-regulated class I PI-3-kinases produce the membrane lipid PtdIns-3,4,5-P3. This in turn induces recruitment and activation of diverse cellular effectors harboring PtdIns-3,4,5-P3-binding PH domains. Thereby, class I PI-3-kinases control important cellular functions such as growth, differentiation or cytoskelettal rearrangements. However, since PI-3-kinases have only recently been discovered, their regulation and function are not fully understood. Since class I PI-3-kinases are predominantly found in the cytosol, it has been assumed that they are recruited from the cytosol to the membrane, i. e. to their substrate, upon stimulation. This was shown here for the first time in living cells using fluorescence microscopy. Class I PI-3-kinases are heterodimeric enzymes, and are further classified according to their type of non-catalytic subunit: The p85 non-catalytic subunit of the class IA PI-3-kinases α, β and δ mediates their characteristic activation by receptor tyrosine kinases through interaction of its SH2 domains with the autophosphorylated receptor. Accordingly, using PI-3-kinase β as an example, it was shown here that upon RTK stimulation the heterodimeric enzyme indeed translocates from the cytosol to the plasma membrane in a p85-dependent manner. The only known class IB PI-3-kinase to date is PI-3-kinase γ. Instead of p85 it has a p101 subunit, and is typically activated via G protein-coupled receptors by Gβγ complexes. It is controversely discussed which role the non- catalytic p101 subunit plays, and whether PI-3-kinase γ is also membrane- recruited by Gβγ and activated in this way. Here it was shown that Gβγ recruits PI-3-kinase γ from the cytosol to the membrane, namely through interaction with its non-catalytic p101 subunit. In this respect p101 functions as an adapter, comparable to the role of the p85 subunit of class IA PI-3-kinases. To study the enzymatic activity and receptor-mediated activation of class I PI-3-kinases, PtdIns-3,4,5-P3 production was monitored by membrane translocation of fluorescence-tagged PtdIns-3,4,5-P3-binding PH domains. Using this method it was shown that the p101 subunit is also required for the G protein-mediated activation of PI-3-kinase γ in vivo. A membrane-targeted PI-3-kinase γ mutant displayed enzymatic activity without further stimulation, but was further stimulated by Gβγ, indicating an allosteric activation at the membrane. Both, basal activity and further stimulation of the membrane- targeted enzyme were independent of the absence or presence of p101. Hence, Gβγ directly interacts with the catalytic p110γ subunit - although with a weaker affinity than p101, which therefore acts a high affinity adapter mediating the membrane recruitment of the heterodimeric enzyme. In conclusion, a two-step model for the activation of PI-3-kinase γ by Gβγ is postulated, with specific roles for either subunit: As a first step, Gβγ recruits the enzyme from the cytosol to the membrane through interaction with its non- catalytic p101 subunit as a mandatory adapter. As a consequence of its intrinsic basal enzymatic activity, the colocalization of the lipid kinase with its substrate readily induces some PtdIns-3,4,5-P3 production. However, at the membrane, PI-3-kinase γ is further allosterically activated by Gβγ by direct interaction with its catalytic p110γ subunit.