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Fragestellung: Metamizol ist ein im klinischen Alltag oft angewendetes Analgetikum. In vorangegangenen Studien konnte gezeigt werden, dass Metamizol keinen negativen Einfluss auf die Frakturheilung unter physiologischen Bedingungen hat. Adäquate Vaskularisierung und Angiogenese sind Voraussetzung [zum vollständigen Text gelangen Sie über die oben angegebene URL]

Osteoporose als systemische Erkrankung des Skeletts imponiert histologisch durch eine gestörte Knochenarchitektur und unausgewogene Knochenumbauvorgänge. Die Knochendichte sinkt. In der klinischen Diagnostik spielt daher die DXA-Messung eine zentrale Rolle. Pathophysiologisch steht bei diesem Krankheitsbild das Missverhältnis aus gesteigerter Resorption mit geringer Formation von Knochensubstanz im Fokus. In dieses Gleichgewicht nehmen viele verschiedene Faktoren Einfluss. Die mit 95% häufigste Form der Osteoporose wird durch den postmenopausalen Östrogenmangel der Frau bedingt. In Deutschland lag die Prävalenz der Osteoporose im Jahre 2009 bei 14% der über 50 jährigen beider Geschlechter. Das Lebenszeitrisiko eine Osteoporose-assoziierte Fragilitätsfraktur zu erleiden liegt derzeit für Frauen bei bis zu 50%, bei Männern bis zu 22%. In Zukunft werden durch den demografischen Wandel diese Zahlen weiter anwachsen, sodass ein detailliertes Verständnis der Abläufe der osteoporotischen Defektheilung immer bedeutender wird.Anders als im menschlichen Körper konnte in dieser Studie im Schafmodell eine manifeste Osteoporose mit Abnahme der Knochendichte erst durch eine dreifache Osteoporoseinduktion mittels Ovarektomie, Kalzium- und Vitamin D-arme Diät sowie Glukokortikoidinjektionen (OVXDS) erreicht werden. Histologische Kennzeichen der Defektheilung in OVXDS waren der bis nach achtmonatiger Heilung verbleibende Weichteilkallus und bestehende Knorpelreste mit geringem Col X-Gehalt. Strukturelle Veränderungen konnten sowohl in Spongiosa als auch in Kortikalis beobachtet und auf diese Weise die weitreichenden Auswirkungen der Osteoporose dokumentiert werden. Weiterhin war der Anteil des knochentypischen Col I in OVXDS am geringsten und das osteozytäre Netzwerk gestört. Zusammen mit der osteozytären Überexpression von RANK-L mit gesteigertem RANK-L/ OPG-Quotienten konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass sich in OVXDS definitionsgemäß nach achtmonatiger Heilung eine Pseudarthrose entwickelte. Zusätzlich zur insuffizienten Heilung konnte histomorphometrisch eine Mineralisierungsstörung aufgedeckt werden, in der unkoordiniert kollagenes Gewebe verknöchert wird. In vivo wurden diese Vorgänge durch die geringste Mineralisationsrate bewiesen. Diese Erkenntnisse können in Zukunft dazu beitragen, die chirurgische Behandlung osteoporotischer Frakturen an die Herausforderungen anzupassen und die suffiziente Versorgung durch Entwicklung neuer Implantate und Materialien zu gewährleisten., Osteoporosis is systemic disease hallmarked by disturbed bone structure and bone remodeling through cellular imbalance. The reduction of bone density is clinically diagnosed using DEXA measurement in potentially osteoporotic patients. The imbalance, caused by increased resorption and decreased formation of bone, mark the pathophysiological symptoms of the diseases. The bone remodeling imbalance is multifactorial and most observed is the postmenopausal estrogen deficiency in women. Nevertheless, in Germany 14% of patients over 50 years of age are diagnosed with osteoporosis in both genders. Osteoporotic fragility fractures are associated to high mortality rate, 50% in females and 22% in males. Prospectively, mortality rates will grow even bigger in the aging community in industrial countries. Therefore, the profound understanding of the healing process of osteoporotic fractures is detrimental. The current study aims at understanding the fracture healing pattered in a sheep model of osteoporosis. The triple therapy of bilateral ovariectomy, multideficient diet and glucocorticoid administration (OVXDS) resulted in a lower bone density characterized by DEXA. A major study milestone was the reduction of number of experimental animals utilized. Therefore, defects were created in the iliac crest to serve characterization of osteoporosis progression and later time points of defect healing. After 8 months (M) of healing cartilaginous remnant with small areas of hypertrophic cartilage. The structural alterations in the bony bridging of cortices and formation of trabeculae reflected the effect of osteoporosis manifestation. Furthermore, inferior bone quality was correlated to small type I collagen positive areas. Osteocyte networking was disturbed with less spindle shaped osteocytes compared to spherical ones. Interestingly, overexpression of RANK-L in osteocytes despite a high RANK-L/ OPG global ratio correlated exponentially with treatment progression. Besides the delayed healing, inhomogeneous mineralized patches within the collagenous tissue were present. The double fluorochrome labelling of dynamic mineralization reflect the inferior mineralization rate in OVXDS after 8M of healing. Altogether, the lack of boney bridging, presence of deficient mineralization and cartilaginous remnants are hallmarks of pseudoarthrosis formation in osteoporotic fractures. The results gained in this work will serve as building block for the development of bone substitute materials designed to aid healing of osteoporotic fractures and avoid the formation of pseudoathrotic tissue.

Fragestellung: Das RANKL/OPG-System spielt im Knochenmetabolismus eine wesentliche Rolle, da u.a. durch RANKL Osteoklasten aktiviert werden. Bei Osteoporose ist dieser Mechanismus gestört. In vorangegangenen Studien konnten wir belegen, dass durch Virus-like Particles (VLPs) small interfering[zum vollständigen Text gelangen Sie über die oben angegebene URL], Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2018)

Fragestellung: In unserer stetig alternden Bevölkerung steigt die Prävalenz der Osteoporose als systemische Knochenerkrankung und ihre assoziierten Frakturen immer weiter an. Pathophysiologisch bleiben auf zellulärer Ebene viele Fragen weiter unklar. Fehlregulation des RANK-L/ OPG-[zum vollständigen Text gelangen Sie über die oben angegebene URL], Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2018)

Fragestellung: Die Osteoporose ist die häufigste Knochenerkrankung im hohen Alter und zählt laut WHO zu den größten Gesundheitsproblemen in unserer Gesellschaft. Die Osteoporose ist definiert durch eine reduzierte Knochendichte, die mit einem erhöhten Frakturrisiko verbunden[zum vollständigen Text gelangen Sie über die oben angegebene URL], Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2017)

Fragestellung: Die Behandlung der Osteoporose benötigt weitere Innovationen. Das RANKL/OPG-System spielt im Knochenmetabolismus eine wesentliche Rolle, da u.a. durch RANKL Osteoklasten aktiviert werden. Die Regulation dieses Systems ist bei Osteoporose gestört. In Vorversuchen haben wir[zum vollständigen Text gelangen Sie über die oben angegebene URL], Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2017)

Fragestellung: Knochenauf- und Abbau sind komplex reguliert, dabei spielt der Crosstalk, die Interaktion zwischen Osteoblasten und Osteoklasten, eine wichtige Rolle. Die Mechanismen dabei sind bisher weitgehend unbekannt, und die Rolle einer gestörten Zell-Zell-Interaktion in der Pathogenese von[zum vollständigen Text gelangen Sie über die oben angegebene URL], Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2017)

Fragestellung: Bone Morphogenic Proteins (BMPs) spielen eine Schlüsselrolle in der Knochenbildung. Die Gabe von BMP7 (OP-1) fördert die Knochenbildung nach komplexen Frakturen. Jedoch führten die hohen Therapiekosten, andauernde Sicherheitsbedenken sowie eine hohe Ausfallrate dazu, dass[zum vollständigen Text gelangen Sie über die oben angegebene URL], Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2016)

Fragestellung: Die Behandlung der Osteoporose ist weiterhin eine Herausforderung. Das RANK/OPG-System spielt im Knochenstoffwechsel eine wichtige Rolle, da u.a. durch RANKL Osteoklasten aktiviert werden. Die Regulation dieses Systems ist bei Osteoporose gestört. Neue Medikamente wie Denosumab[zum vollständigen Text gelangen Sie über die oben angegebene URL], Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2016)

Eine Vielzahl von Studien zeigte bereits auf, dass der RANKL-RANK-OPG-Signalweg eine bedeutende Rolle in der Pathogenese des Prostatakarzinomes spielt. Die prognostische Wertigkeit der Serumkonzentrationen von RANKL und OPG für das Wiederauftreten eines Prostatakarzinomes nach radikaler Prostatektomie wurde allerdings bisher nicht ausreichend erforscht. Dies ist die erste Studie, welche die prognostische Wertigkeit von Serum-Proteinen des RANKL-RANK-OPG-Signalweges bei Patienten mit lokal begrenztem Prostatakarzinom untersucht. Es wurde retrospektiv ein Fünf-Jahres-Follow-Up einer Kohorte von 157 Patienten, die sich an der urologischen Universitätsklinik Tübingen einer Prostatektomie unterzogen hatten, erhoben und mit präoperativen Serum-Konzentrationen von sRANKL- und OPG verglichen. Eine erhöhte präoperative sRANKL-Konzentration und ein erhöhter präoperativer sRANKL-OPG-Quotient erwiesen sich als unabhängige Prädiktoren für das postoperativ vermehrte Auftreten eines biochemischen Rezidivs. Bei Patienten mit einer sRANKL-Serumkonzentration auf oder oberhalb des Medians war der Anteil derer, die nach fünf Jahren kein biochemisches Rezidiv erlitten 72%, und unterhalb des Medians 85% (Tab. 9; Abb. 10, p=0,02*). Bei Patienten mit einem sRANKL-OPG-Quotienten oberhalb des Medians war der Anteil derer, die in 5 Jahren kein biochemisches Rezidiv erlitten 70%, derer auf oder unterhalb des Medians 86% (Tab. 9; Abb. 12, p=0,029*). Ein sRANKL-OPG-Quotient oberhalb des Medians entspricht daher einem relativen Risiko von 2,12 bzw. einer Odds Ratio von 2,59. Eine verminderte OPG-Konzentration wies zwar auf ein erhöhtes Risiko für ein biochemisches Rezidiv hin, jedoch erwies sich dieser Trend nach statistischer Analyse als nicht signifikant. Es zeigte sich jedoch eine mit anderen Studien übereinstimmende, altersabhängige Steigerung der OPG-Serumkonzentration. Diese Daten lassen die Hypothese zu, dass ein therapeutisches Eingreifen in den RANKL-Signalweg zu einer verbesserten Krankheitsprognose für Prostatakarzinom-Patienten führen kann. Der Ursprung einer erhöhten sRANKL-Serumkonzentration bei Prostatakarzinompatienten - entweder aus Tumorzellen oder aus dem Knochenmark - bleibt weiterhin zu identifizieren.

Fragestellung: Eine ausreichende Vaskularisierung und Angiogenese sind entscheidende Faktoren für eine erfolgreiche Frakturheilung. Es konnte in verschiedenen Studien gezeigt werden, dass Cilostazol, ein selektiver Inhibitor der Phosphodiesterase-3, durch Stimulation pro-angiogenetischer Wachstumsfaktoren[zum vollständigen Text gelangen Sie über die oben angegebene URL], Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2015)

Receptor activator of nuclear factor (NF-) κB ligand (RANKL), sein zellulärer Rezeptor RANK und der Decoy-Rezeptor Osteoprotegerin (OPG) stellen ein essentielles Zytokinsystem für die Zellbiologie von Osteoklasten dar. Verschiedene Untersuchungen belegen die Bedeutung von Störungen des OPG/RANKL/RANK-Systems bei der Pathogenese metabolischer Knochenerkrankungen. In dieser Arbeit werden die wichtigsten Störungen des OPG/RANKL/RANK-Systems bei verschiedenen Osteoporoseformen dargestellt. Östrogenrezeptor- (ER-) Agonisten wie 17 β-Östradiol, Raloxifen und Genistein stimulieren die osteoblastäre Produktion von OPG durch Aktivierung von ER- α in vitro, während Lymphozyten von Patientinnen mit Östrogenmangel RANKL überexprimieren. Die parenterale Gabe von OPG vermag den mit Östrogenmangel assoziierten Knochenverlust im Tiermodell und in einer kleineren klinischen Studie zu verhindern. Glukokortikoide und Immunsuppressiva steigern gleichzeitig die RANKL-Expression und hemmen die OPG-Produktion in osteoblastären Zellen in vitro. Glukokortikoide sind auch in vivo imstande, die OPG-Serumspiegel deutlich zu reduzieren. Dagegen hemmen biomechanische Reize in vitro die RANKL-Produktion und steigern die OPG-Produktion. Ein Fehlen dieser biomechanischen Reize bei längerer Immobilisierung kann daher den RANKL/OPG-Quotienten steigern, während die tierexperimentelle Immobilisierungs-Osteoporose durch die parenterale Gabe von OPG gemildert werden kann.

Fragestellung: Beim polytraumatisierten Patienten kann eine verzögerte Frakturheilung bis hin zur Entstehung einer Pseudarthrose vermehrt beobachtet werden. Dabei sind die zugrundeliegenden Pathomechanismen aktuell nur unzureichend geklärt. Eine wichtige Rolle können hierbei die Vorläuferzellen[for full text, please go to the a.m. URL], Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2013)

Fragestellung: β-Trikalziumphosphat ( β-TCP) Keramiken werden als Knochenersatzmaterialien eingesetzt. Obwohl diese Materialien als resorbierbar gelten werden sie in grossen Knochendefekten unzureichend durch neugebildeten Knochen ersetzt. Unsere Hypothese war, dass mit einer Beschichtung[for full text, please go to the a.m. URL], Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2012)

Beim physiologischen Knochenstoffwechsel spielt das OPG/RANKL - System eine zentrale Rolle für das Vorliegen von Knochenauf - und abbau. RANKL fördert die Knochenresorption durch Steigerung der Anzahl und Aktivität funktionsfähiger Osteoklasten über Aktivierung seines osteoklastären Rezeptors RANK. Dieser Prozess wird durch seinen löslichen Antagonisten OPG inhibiert. Das Ziel der vorliegenden Studie war der Nachweis von OPG und RANKL in der Sulkusflüssigkeit und im Speichel bei Patienten mit dentalen Implantaten. 8 behandelte GCP Patienten mit Implantaten und 7 parodontal gesunde Probanden ohne Implantate waren an der Studie beteiligt. Neben den klinischen Parametern (ST, BNS, GI, GR) wurden Proben der Sulkusflüssigkeit und des Speichel entnommen. Die Untersuchung auf OPG und RANKL erfolgte mittels der ELISA-Technik. In der Sulkusflüssigkeit bei den GCP Patienten wurde OPG an den Implantaten in 30% (92,05pmol/l+/-131,84pmol/l) und an den Zähnen in 27% (195,65pmol/l+/-284,83pmol/l) der Proben nachgewiesen. In der Kontrollgruppe war OPG in 22% (80,66pmol/l+/-120,33pmol/l) der Proben nachweisbar. RANKL lag bei den GCP Patienten an 23% der Implantate (50,99pmol/l+/-82,55pmol/l) und 28% der Zähne (24,94pmol/l+/-39,18pmol/l) vor. In der Kontrollgruppe konnte RANKL in 8% (2,78+/-3,51pmol/l) der Proben gemessen werden. Im Speichel der GCP Patienten konnte OPG (0,38pmol/l+/-0,41pmol/l) in allen und bei den Kontrollen (0,53pmol/l+/-0,94pmol/l) in 6 von 7 Proben gemessen werden. RANKL (0,141+/-0,096pmol/l) wurde bei den GCP Patienten in 7 von 8 Proben und bei den Kontrollen (0,344+/-0,482pmol/l) in 4 von 7 Proben nachgewiesen. Weder im Speichel noch in der Sulkusflüssigkeit lagen Korrelationen zwischen OPG, RANKL und den klinischen Parametern vor. Abschließend bleibt festzustellen, dass in der Sulkusflüssigkeit in 20-30% der Proben OPG und RANKL nachweisbar war. Die RANKL Konzentration an den Implantaten der GCP Patienten war deutlich erhöht, jedoch statistisch nicht signifikant. In nahezu allen Speichelproben konnte OPG und RANKL in geringen Konzentrationen gemessen werden. Der Nachweis von OPG und RANKL in der Sulkusflüssigkeit und im Speichel ist ein vielversprechendes diagnostisches Nachweisverfahren für den Knochenstoffwechsel an Zähnen und Implantaten. Insbesondere sollte die Rolle des OPG und RANKL- Systems in der Etablierung und Aufrechterhaltung einer Osseointegration von Implantaten und der Entstehung von periimplantären entzündlichen Erkrankungen näher untersucht werden., The OPG/RANKL system is critical for physiological bone remodeling as RANKL, its cellular receptor RANK and its decoy receptor OPG crucially regulating osteoclastogenesis. Thus, the ratio of RANKL to OPG determines the rate of bone remodeling. The aim of this study was to determine osteoprotegerin (OPG) and receptor activator of NFκB ligand (RANKL) in crevicular fluid and saliva of periodontal healthy subjects and patients with treated generalized chronic periodontitis (GCP) and peri-implant healthy implants. Samples of crevicular fluids and saliva as well as clinical parameters were collected from 8 GCP patients with implants and 7 periodontal healthy subjects without implants. RANKL and OPG levels were measured using ELISAs. In GCP patients, OPG was detectable in 30% of the crevicular fluid around implants and in 27% around teeth. In controls, OPG was found in 22% of crevicular fluid. RANKL levels were determined in 23% of crevicular fluid around implants and in 28% around teeth, whereas it was found in 8% of controls. OPG and RANKL were detectable in nearly all saliva samples. In both groups, OPG and RANKL were not correlated with each other in the crevicular fluid or saliva samples. There was no correlation with clinical parameters. OPG and RANKL were detectable in 20-30% of the crevicular fluid samples. In GCP patients the RANKL levels around implants and the OPG levels around teeth were increased. As a conclusion, the detection of OPG and RANKL in crevicular fluid and saliva may provide a promising diagnostic indicator of bone remodeling for teeth and dental implants. The role of the OPG/RANKL system should be investigated in more detail with respect to the establishment and maintenance of osseointegration of implants and in the development of inflammatory peri-implant diseases. Nearly all saliva samples contained measureable amounts of OPG and RANKL.

6. Zusammenfassung Obwohl es in der Behandlung des Mammakarzinoms deutliche Fortschritte gibt, bleiben die Therapieoptionen für Hormonrezeptor-negative und ossär metastasierte Tumoren begrenzt. Die Entdeckung des RANKL/RANK/OPG-Systems im Jahre 1997 hat das Verständnis über die komplexe Regulation des Knochenstoffwechsels grundlegend beeinflusst. Das Zytokin RANKL, sein Rezeptor RANK und der Rezeptorantagonist OPG sind essenzielle Regulatoren der Osteoklastenbiologie. Zunehmend wird auch die Bedeutung von OPG und RANKL in der Tumorbiologie akzeptiert. So konnte gezeigt werden, dass RANKL die Migration von Brust- und Prostatakarzinomzellen in vitro und in vivo fördert. TRAIL ist ein Mitglied der TNF-Familie, das in malignen Zellen Apoptose induziert. Als Rezeptorantagonist für sowohl RANKL als auch TRAIL, besitzt OPG prinzipiell die Fähigkeit, zwei fundamentale Prozesse der Tumorbiologie zu beeinflussen, die Apoptose und die ossäre Migration. Östrogene regulieren vielfältige Zytokine und Wachstumsfaktoren in Östrogen-Rezeptor (ER)-positiven Brustkrebszellen. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Regulation des RANKL/OPG-Systems durch Östrogene und Androgene in der ER-positiven MCF-7- und der ER-negativen MDA-MB-231-Brustkrebszelllinie untersucht. In den hauptsächlich ER-α-exprimierenden MCF-7-Zellen führte die Exposition mit 17β-Estradiol und Testosteron zu einer dosisabhängigen Hemmung der OPG-mRNA-Expression und -Proteinsekretion um 70 bzw. 65%. Ferner konnte die Expression von RANKL in beiden Zelllinien nachgewiesen werden. Während IL-1β in beiden Zelllinien zu einer Induktion von RANKL führte, unterdrückte 17β-Estradiol die RANKL-Spiegel der MCF-7-Zellen, nicht aber der MDA-MB-231-Zellen. Die Suppression der OPG-Produktion durch 17β-Estradiol und Testosteron konnte durch die Gabe des Anti-Östrogens ICI 182,780 verhindert werden. Zudem konnte der Testosteron-Effekt durch einen Aromataseinhibitor blockiert werden, was darauf hinweist, dass Androgene die OPG-Spiegel in Brustkrebszellen indirekt nach einer Aromatisierung und Bindung an den ER beeinflussen können. Im zweiten Teil wurde die Expression und Modulation von OPG und TRAIL durch IL-1β und Dexamethason in den MCF-7- und den MDA-MB-231-Zellen untersucht. In beiden Zelllinien, wurden die OPG-mRNA-Spiegel und -Proteinsekretion zeit- und dosisabhänig durch IL-1β gesteigert und durch Dexamethason gehemmt. Im Gegensatz zu den MCF-7-Zellen exprimierten die MDA-MB-231-Zellen TRAIL, welches durch IL-1β gesteigert und durch Dexamethason unterdrückt wurde. TRAIL aktivierte die pro-apoptotischen Caspase-3,-7 und PARP und führte zum Zellverlust in den MDA-MB-231-Zellen, hatte jedoch keinen Einfluss auf die MCF-7-Zellen. Der OPG-Knock down mittels siRNA führte zu einer um 31% gesteigerten Apoptoserate im Vergleich zu mit Kontroll-siRNA behandelten MDA-MB-231-Zellen. Zudem schützte das ins konditionierte Medium sezernierte OPG die Zellen vor der TRAIL-vermittelten Apoptose. Dieser protektiven Effekte konnten durch die Blockade von OPG mit seinem spezifischem Liganden RANKL aufgehoben werden. Die Assoziation zwischen Zellschutz und OPG-Produktion in den MDA-MB-231-Zellen wurde ferner durch die Beobachtung unterstützt, dass die Modulation der OPG-Sekretion mittels IL-1β und Dexamethason vor einer TRAIL-Exposition zu einer Senkung bzw. Steigerung der Apoptose führte. Bisphosphonate sind etablierte Medikamente zur Behandlung von Knochenmetastasen, welche die Osteoklastenaktivität hemmen und so den Circulus vitiosus aus Osteoklast-Tumorzell-Interaktion unterbrechen. Im dritten Teil dieser Arbeit wurden die direkten Effekte von Zoledronsäure auf die MDA-MB-231- und MCF-7-Zellen evaluiert. Während Zoledronsäure (100 µM) die Zellproliferation der MDA-MB-231-Zellen nach 72 h hemmte und die Apoptose über eine Aktivierung von Caspase-3 und -7 induzierte, zeigten sich nur geringe Effekte in den MCF-7-Zellen. Des Weiteren steigerte Zoledronsäure die Expression von TRAIL in den MDA-MB-231-Zellen, hatte jedoch keinen Einfluss auf die Expression seines Rezeptorantagonisten OPG. In den MCF-7-Zellen wurden beide Zytokine durch die Gegenwart von Zoledronsäure gehemmt. Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit zwei potentielle Ergänzungen zur Therapie des Mammakarzinoms erforscht. Zum einen wurde der direkte pro-apoptotische Effekt von Zoledronsäure auf ER-negative Brustkrebszellen nachgewiesen und weiter geklärt. Zum anderen wurde die vielfältige Regulation des OPG/TRAIL/RANKL-Systems durch karzinomrelevante Substanzen untersucht. Die Bedeutung der endogenen OPG-Sekretion als Überlebensfaktor für TRAIL-sensitive Mammakarzinomzellen wurde dargestellt sowie die Möglichkeit diese Fähigkeit therapeutisch durch eine gezielte pharmakologische Hemmung der OPG-Sekretion zu nutzen., Summary Despite advances in the therapy of breast cancer, treatment options for women suffering from hormone receptor-negative breast cancer or bone metastases remain limited. The discovery of the RANKL/RANK/OPG system in 1997 has fundamentally influenced our knowledge about the complex regulation of bone metabolism. The cytokine RANKL, its receptor RANK and the decoy receptor OPG are essential regulators of osteoclast biology. OPG is also thought to play a role in tumor biology. It was shown that RANKL enhances the migration of breast and prostate cancer cells in vitro and in vivo. TRAIL is a member of the TNF ligand family that selectively induces apoptosis in malignant cells. As a decoy receptor for both RANKL and TRAIL, OPG has the unique ability to regulate two fundamental aspects of tumor biology, apoptosis and migration. Estrogen regulates various cytokines and growth factors in estrogen receptor (ER)-positive human breast cancer. In the first part of this study, the regulation of the RANKL/OPG system by estrogens and androgens in the ER-positive breast cancer cell line MCF-7 and the ER-negative breast cancer cell line MDA-MB-231 were analyzed. In MCF-7 cells, which predominantly express ER- , 17β-estradiol and testosterone dose-dependently decreased OPG mRNA levels and protein secretion by 70 and 65%, respectively. Furthermore, both cell lines expressed RANKL. While IL-1β induced RANKL expression in both cell lines, 17β-estradiol decreased RANKL expression only in MCF-7 cells. The inhibition of OPG production by 17β-estradiol and testosterone was specifically prevented by the pure anti-estrogen ICI 182,780, and the testosterone effect was prevented by an aromatase inhibitor. This indicates that androgens indirectly influence OPG expression in breast cancer cells after aromatization and binding of the ER. In the second part of this study the expression and modulation of OPG and TRAIL by IL-1β and dexamethasone were analyzed in MCF-7 and MDA-MB-231 cells. In both cells, OPG mRNA levels and protein secretion were dose- and time-dependently enhanced by IL-1β and suppressed by dexamethasone. In contrast to MCF-7 cells, MDA-MB-231 abundantly expressed TRAIL mRNA, which was enhanced by IL-1β and inhibited by dexamethasone. TRAIL activated pro-apoptotic caspase-3, -7, and poly-ADP-ribose polymerase and decreased cell numbers of MDA-MB-231, but had no effect on MCF-7 cells. Gene silencing using siRNA directed against OPG resulted in a 31% higher apoptotic rate compared to non-target siRNA-treated MDA-MB-231 cells. Furthermore, TRAIL induced significantly less apoptosis in cells cultured in conditioned media (containing OPG) compared to cells exposed to TRAIL in fresh medium lacking OPG and these protective effects were reversed by blocking OPG with its specific ligand RANKL. The association between cancer cell survival and OPG production by MDA-MB-231 cells was further supported by the finding that modulation of OPG secretion using IL-1β or dexamethasone prior to TRAIL exposure resulted in decreased and increased rate of apoptosis, respectively. Bisphosphonates are established drugs in the treatment of bone metastasis that inhibit osteoclast activity and interrupt the vicious cycle of osteoclast-tumor cell interactions. In the third part of this study the direct effects of zoledronic acid on MDA-MB-231 and MCF-7 breast cancer cells were evaluated. While zoledronic acid (100 µM) inhibited MDA-MB-231 cell proliferation after 72 h, and induced apoptosis via activation of caspase-3 and -7, it had only minor effects in MCF-7 cells. In addition, zoledronic acid induced the expression of TRAIL in MDA-MB-231 cells, but had no effect on the expression of its decoy receptor OPG. In MCF-7 cells, both cytokines were suppressed by zoledronic acid. In summary, this study investigated two potential concepts to target breast cancer. First, the direct apoptotic effects of zoledronic acid and its underlying mechanisms on the ER negative MDA-MB-231 cells were demonstrated. Second, the regulation of the OPG/TRAIL/RANKL system by multiple disease relevant substances was analyzed. The role of endogenously secreted OPG as a survival factor for TRAIL sensitive breast cancer cells was demonstrated as well as the possibility to therapeutically target this ability by pharmacologically suppressing the OPG secretion.

Abstract 3780 Background: Gaucher Disease (GD) is an autosomal recessive hereditary disorder of glycosphingolipid metabolism, characterized by accumulation of glucosylceramide in cells of the reticulo-endothelial system, due to the deficient activity of the lysosomal enzyme glucocerebrosidase. Bone manifestations are frequent in GD; nevertheless the pathophysiology of skeletal involvement is still not well understood. Aim: to investigate the role of the bone turnover biochemical markers in GD. In particular we evaluated markers involved in bone formation: Osteoprotegerin (OPG), carboxyterminal propeptide of type I procollagen (PICP), osteocalcin (OST) and in bone resorption: receptor activator of nuclear factor (NF)-kb ligand (RANKL), tartrate resistant acid phosphatase (TRAP5b). Methods: Bone turnover biochemical markers were evaluated on sera obtained from 5 GD patients and 5 healthy subjects matched for age and sex, by Elisa commercial available kits according to the manufacturers‘ instructions. Results: In GD patients we observed an increase of RANKL and a significant reduction of OPG, with a consequent significantly lower OPG/RANKL ratio. Despite of higher levels of TRAP5b and lowest levels of PICP in GD compared to healthy subjects the differences did not achieve statistical significance, likely due to the small number of subjects involved in the study. No differences we observed in serum levels of OST compared with controls. Data (means ± DS) are reported in Table 1. Conclusions: Our data confirm the presence of unbalanced bone turnover in GD patients, characterized by an altered modulation of the OPG/RANKL system (due mainly to reduced expression of OPG, besides increased production of RANKL), an increased resorption phase (TRAP5b) and a decreased neoformation phase (PICP), all of them contributing to skeletal alterations characteristics of these patients. Disclosures: No relevant conflicts of interest to declare.

The clinical appearance of patients with cleidocranial dysplasia (CCD), which is caused by mutations in the RUNX2 gene, is characterized by anomalies of the clavicles, thorax, spine, pelvis and extremities and by disturbances of the skull and tooth development. Of orthodontic relevance are multiple supernumerary teeth associated with delayed tooth eruption. The present investigation is based on the hypothesis that an altered phenotypic expression of periodontal ligament (PDL) cells from CCD patients and a reduced ability of those cells to support the differentiation of bone-resorbing osteoclasts might contribute to delayed tooth eruption.To test this hypothesis, PDL cells from healthy donors and from two patients with clinically and molecular biologically diagnosed CCD were characterized for the basal and induced mRNA expression of osteoblast marker genes. The physiological relevance of the findings for the differentiation of osteoclasts was examined in an osteoclast assay, as well as in a co-culture model of PDL cells and osteoclast precursors.Both CCD patients displayed missense mutations of the RUNX2 gene. The in vitro experiments revealed an unaltered expression of RUNX2 mRNA, however especially in CCD patient 2 there was a reduced basal expression of mRNA for the key regulatory gene for bone remodeling RANKL. Furthermore, compared to the control cells from healthy donors, these factors were less inducible by stimulation of the cultures with 1alpha,25(OH)(2)D(3). In the osteoclast assays as well as in the co-culture experiments, PDL cells from the CCD patients showed a reduced capacity to induce the differentiation of active osteoclasts.These data indicate that PDL cells from CCD patients express a less distinctive osteoblastic phenotype resulting in an impaired ability to support osteoclastogenesis which might, in part, account for the delayed tooth eruption that can be observed clinically.

The dissertation is concerned with the evidence and regulation of OPG (Osteoprotegerin) and RANKL (Receptor activator of nuclear factor ĸB ligand) in human thyroid cancer cells. The cells used were SW579 (anaplastic), HTC+ and XTC (both follicular). These were stimulated with steroid hormones, drugs and Il-1β and examined by Northern blot and ELISA., Zusammenfassung RANKL (Receptor activator of nuclear factor κB ligand) und OPG (Osteoprotegerin), beides Mitglieder der TNF-Superfamilie, sind als Agonist und Antagonist eines neuen Zytokinsystems bisher in einer Vielzahl von Geweben und Zellsystemen beschrieben worden. Das RANKL/OPG-System spielt eine wichtige Rolle bei der Regulation des Knochenstoffwechsels, und Störungen dieses Zytokinsystems wurden bei verschiedenen Knochenerkrankungen nachgewiesen. Neuere Untersuchungen zeigen, dass das RANKL/OPG-System durch Interaktionen mit dem Apoptose-induzierenden Faktor TRAIL (Tumor necrosis factor-α-related apoptosis inducing ligand) möglicherweise auch bei malignen Erkrankungen von großer Bedeutung ist. Basierend auf den bisherigen Befunden zur Pathogenese des Schilddrüsenkarzinoms und den Vorarbeiten zum RANKL-OPG-System war es das Ziel der vorliegenden Arbeit, die Expression und Modulation der OPG-mRNA-Produktion und OPG-Proteinsekretion in humanen Schilddrüsenkarzinomzelllinien zu untersuchen. Die Genexpression wurde mittels Northern Blot, die Proteinsekretion mittels ELISA bestimmt. Die Schilddrüse konnte als ein Ort starker OPG-Expression identifiziert werden. Die von uns untersuchten Schilddrüsenkarzinomzellen SW579 zeigten im Vergleich zu benignen Schilddrüsenzellen deutlich erhöhte basale OPG-RNA-Spiegel. Es zeigte sich, dass die OPG-mRNA- und -Proteinspiegel durch Sexualhormone unterschiedlich reguliert wurden. 17β-Östradiol führte zu einem biphasischen Effekt, niedrige 17β-Östradiol Konzentrationen führten zu einer Steigerung der OPG-RNA-Expression und -Proteinproduktion, hohe zu einer Hemmung. Das adrenale Androgen DHEA (Dehydroepiandrosteron) hemmte die OPG-RNA und -Proteinsynthese dosisabhängig, während das gonadale Androgen 5α-DHT (Dihydrotestosteron) ebenfalls einen biphasischen Effekt (Steigerung bis zu einer Konzentration von 10P-9P M, Hemmung bei höheren Konzentrationen) auf die OPG-Expression aufwies. Die unterschiedliche Regulation von OPG in humanen Schilddrüsenkarzinomzellen könnte zum Teil die geschlechtsspezifischen Unterschiede im klinischen Verlauf dieser Erkrankung erklären. Der HMG-CoA-Reduktase-Inhibitor Lovastatin führte in den Schilddrüsenkarzinomzellen zu einer verminderten OPG-RNA und -Proteinsynthese. Die Ergebnisse anderer Arbeitsgruppen zeigten, dass Lovastatin imstande ist, bei Schilddrüsenkarzinomzellen Apoptose zu induzieren und zu einer Redifferenzierung anaplastischer Schilddrüsenkarzinomzellen führen kann. Das pro-inflammatorische Zytokin IL-1β steigerte – wie auch in anderen Zellsystemen – in den Schilddrüsenkarzinomzellen, die OPG-Expression. Die Behandlung der Schilddrüsenkarzinomzellen mit dem Proteinsyntheseinhibitor Cycloheximid hemmte die OPG-Proteinsekretion, aber steigerte die OPG-mRNA-Spiegel. Diese Befunde deuten auf eine fein-orchestrierte Regulation des RANKL/OPG-Systems durch Modulation der OPG-Komponente in humanen Schilddrüsenkarzinomzellen hin. Dabei spielen Sexualhormone, Zytokine und Medikamente eine wichtige Rolle. Diese Substanzen konnten in präklinischen Versuchen als Modulatoren der Apoptose oder als Redifferenzierungsfaktoren identifiziert werden. Dadurch könnte sich gerade bei den anaplastischen, nicht Jod-speichernden Schilddrüsenkarzinomen die Möglichkeit ergeben, diese prognostisch sehr ungünstigen Tumoren nach einer Sensibilisierung einer Radiojodtherapie zuzuführen. Zusammenfassend weisen die Ergebnisse darauf hin, dass die Schilddrüse sowohl einen Ort der OPG-Produktion als auch ein potenzielles Ziel von OPG darstellt. Die detaillierte Untersuchung von OPG und TRAIL in in vivo-Tumormodellen könnte in der Zukunft zu neuartigen Therapiestrategien für Patienten mit fortgeschrittenem Schilddrüsenkarzinom beitragen.

Receptor activator of NF-kB-Ligand (RANKL) and osteoprotegerin (OPG) play essential roles in bone metabolism and immun responses. RANKL activates RANK, wich is expressed by osteoclasts and dendritic cells, whereas OPG acts as its decoy receptor. The role of RANKL and OPG in thyroid physiologie remainded unclear. The shown data suggest that RANKL and OPG are produced in the thyroid galnd by thyroid follicular cells, are regulated by cytokines and TSHm, and are capable of modulating dendritic cell functions. Thus, these cytokines may represent important local immunmregulatory factors involved in the pathogenesis of autoimmun thyroid diseases., Die Aufgabe der für die Immunantwort und den Knochenstoffwechsel entscheidenden TNF-Liganden und -Rezeptoren-Familienmitglieder RANKL, OPG und RANK war in der Pathophysiologie und Physiologie der Schilddrüse lange ungeklärt. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die Schilddrüse sowohl ein Ort der Produktion, als auch ein Zielorgan des OPG/RANKL-Zytokin-Systems ist. RANKL und OPG werden von follikulären Schilddrüsenzellen produziert, sie werden moduliert durch proinflammatorische und immunmodulatorische Zytokine und haben Einfluss auf die Funktion von dendritischen Zellen. Dies lässt auf ein lokales immunmodulatorisches Sytem schließen, das in der Pathogenese autoimmuner Schilddrüsenerkrankungen eine entscheidende Rolle zu spielen scheint.

Summary: The modulation of cellular processes of apoptosis is essential for the normal physiology of cells and of fundamental importance for carcinogenesis. The disturbance of cellular control mechanisms of apoptosis is considered as the critical event in the initiation and the progression of tumours. Reduced apoptosis is further recognised as an important mechanism for the resistance of tumour cells to radio- and chemotherapy. The ductal adenocarcinoma of the pancreas belongs to those tumours which are nearly always resistant to a conventional chemotherapy. Based on actual results of the pathogenesis of pancreatic cancer and the previous findings referring the RANKL/OPG system, it was the aim of this thesis to examine the expression and modulation of OPG mRNA production and OPG protein secretion in human pancreatic cancer cell lines. The following adenocarcinoma cell lines PaTu 8988t, PaTu 8988s, PC-2 und Capan-2 were analysed and the effect of steroid hormones, cytokines and different drugs on the OPG expression was evaluated. The gene expression was determined using northern blot analysis and PCR, the protein secretion by ELISA. Osteoprotegerin (OPG) und Receptor activator of nuclear factor-κB ligand (RANKL) represent specific receptors and ligands of the TNF superfamily, the production of which could be proven up to now in different human tissues. Following the proof of OPG mRNA in pancreatic tissue with the help of a commercial northern blot, OPG could be detected in two of the four examined pancreatic carcinoma cell lines (PaTu 8988t und PC-2). The cell lines PaTu 8988s and Capan-2 on the other hand showed no production of OPG. In addition PaTu 8988t cells expressed RANKL mRNA. In the case of testosterone there was an inhibition dependent on dose and duration of OPG mRNA und protein expression in the pancreatic cancer cell line PaTu 8988t by 70-77%, whereas 5α-DHT and 17β-estradiol showed no effects. The adrenal androgen DHEA impeded the OPG production by 83%. In the case of PC-2 cells on the other hand the OPG expression was lowered by the gonadal androgen 5α-DHT. After the exposition of the cell line PaTu 8988t to the glucocorticoid dexamethasone there was a dose dependent inhibition of OPG mRNA levels and OPG protein production by 23%. Because of the important role of cytokines in the field of tumour immunology and the modulation of apoptosis in pancreatic cancer different cytokines (IL-1β, TNF-α and IL-8) were examined referring their regulation of OPG production. In contrast to many other cell types, these cytokines however showed no influence on OPG expression – except IL-8 –. The treatment with IL-8 resulted in a slight increase in the production of OPG mRNA production in PaTu 8988t cells. The HMG-CoA reductase inhibitors lovastatin and cerivastatin showed an inhibiting effect on the OPG mRNA and OPG protein expression in human pancreatic adenocarcinoma cell lines. Lovastatin as a statin of the first generation reduced the OPG mRNA and protein secretion in PaTu 8988t cells by 90%. In addition OPG mRNA and protein levels were reduced by Cerivastatin in PaTu 8988t cells by 27% and in PC-2 cells by 39%. The reduction through statins war dependent on dose and duration. The inhibition of the OPG production in pancreatic carcinoma cell lines was a further proof of the pleiotropic effects of statins, which should be clinically examined concerning their apoptosis modulation effects on pancreatic carcinoma cells. In conclusion these results in connective view with the results of other groups indicate that the pancreas represents both a site of production and a potential target of OPG, an important osteotropic and apoptosis-modulating cytokine of the TNF receptor superfamily. Future studies should not only investigate the precise interaction of OPG and TRAIL, but also their importance for the creation, progression and metastasis of the pancreatic carcinoma. These findings could be the basis of future clinical studies in which the pinpointed modulation of apoptosis could be implemented as therapeutical principle with patients with pancreatic cancer., Zusammenfassung: Die Modulation zellulärer Apoptoseprozesse ist nicht nur essenziell für die normale Zellphysiologie, sondern auch von fundamentaler Bedeutung in der Karzinogenese. Störungen zellulärer Kontrollmechanismen der Apoptose gelten als kritisches Ereignis in der Initiierung und Progression von Tumoren. Eine reduzierte Apoptoserate wird ferner als wichtiger Mechanismus für die Resistenz von Tumorzellen gegenüber einer Radio- und Chemotherapie angesehen. Das duktale Adenokarzinom des Pankreas gehört zu den Tumoren, die weitgehend resistent gegenüber einer konventionellen Chemotherapie sind. Basierend auf den bisherigen Befunden zur Pathogenese des Pankreas-karzinoms und den Vorarbeiten zum Thema RANKL-OPG-System war das Ziel der vorliegenden Arbeit, die Expression und Modulation der OPG-mRNA-Produktion und OPG-Proteinsekretion in humanen Pankreaskarzinomzelllinien zu untersuchen. Als Zellmodelle wurden die Adenokarzinomzelllinien PaTu 8988t, PaTu 8988s, PC-2 und Capan-2 analysiert und der Effekt von Steroidhormonen, Zytokinen und Medikamenten auf die OPG-Expression evaluiert. Die Genexpression wurde mittels Northern Blot und PCR, die Proteinsekretion mittels ELISA bestimmt. Osteoprotegerin (OPG) und Receptor activator of nuclear factor-κB ligand (RANKL) stellen spezifische Rezeptoren und Liganden der TNF-Superfamilie dar, deren Produktion bislang in verschiedenen humanen Geweben nachgewiesen werden konnte. Im Anschluss an den Nachweis von OPG-mRNA im Pankreasgewebe mittels eines kommerziellen Northern Blots konnte OPG auf mRNA- und Proteinebene in zwei der vier untersuchten Pankreaskarzinomzelllinien (PaTu 8988t und PC-2) nachgewiesen werden. Die PaTu 8988s- und Capan-2-Zellen zeigten dagegen keine Produktion von OPG. Zusätzlich exprimierten PaTu 8988t-Zellen auf mRNA-Ebene RANKL. Für Testosteron ergab sich eine dosis- und zeitabhängige Hemmung der OPG-mRNA- und -Proteinexpression in der Pankreaskarzinomzelllinie PaTu 8988t um 70 bis 77%, während 5α-DHT und 17β-Östradiol keine Effekte hatten. Das adrenale Androgen DHEA hemmte die OPG-Produktion um 83%. In den PC-2- Zellen hingegen senkte das gonadale Androgen 5α-DHT die OPG-Expression. Nach der Exposition der Zelllinie PaTu 8988t durch das Glukokortikoid Dexamethason kam es ebenfalls zu einer dosisabhängigen Hemmung der OPG-mRNA-Spiegel und der OPG-Proteinproduktion um 23%. Aufgrund der wichtigen Rolle von Zytokinen im Rahmen der Tumorimmunologie und der Modulation der Apoptose beim Pankreaskarzinom wurden unterschiedliche Zytokine (IL-1β, TNF-α und IL-8) hinsichtlich ihrer Regulation der OPG-Produktion untersucht. Im Gegensatz zu vielen anderen Zelltypen jedoch hatten diese Zytokine – IL-8 ausgenommen – keinen Einfluss auf die OPG-Expression. Die Behandlung mit IL-8 führte zu einer leichten Steigerung der OPG-mRNA-Produktion in PaTu 8988t-Zellen. Die HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren Lovastatin und Cerivastatin zeigten in Pankreaskarzinomzelllinien hemmende Effekte auf die OPG-mRNA- und OPG-Proteinexpression. Lovastatin als Statin der ersten Generation senkte die OPG-mRNA- und -Proteinsekretion in PaTu 8988t-Zellen um 90%. Des Weiteren wurden die OPG-mRNA- und -Proteinspiegel durch Cerivastatin in PaTu 8988t-Zellen um 27% und in PC-2-Zellen um 39% gesenkt. Diese Hemmung durch Statine war dosis- und zeitabhängig. Die Hemmung der OPG-Produktion in Pankreaskarzinomzelllinien ist ein weiterer Beleg für die pleiotropen Wirkungen der Statine, die klinisch hinsichtlich ihrer Apoptose modulierenden Effekte auf Pankreaskarzinomzellen genauer untersucht werden sollten. Zusammenfassend weisen die eigenen Ergebnisse in Zusammenschau mit den Arbeiten anderer Gruppen darauf hin, dass das Pankreas sowohl eine Produktionsstätte als auch ein potenzielles Ziel von OPG darstellt, einem wichtigen osteotropen und Apoptose modulierenden Zytokin der TNF-Rezeptorsuperfamilie. Zukünftige Studien sollten die genaue Interaktion von OPG und TRAIL sowie ihre Bedeutung für die Entstehung, Progression und Metastasierung des Pankreaskarzinoms analysieren. Diese Erkenntnisse könnten die Basis künftiger klinischer Studien sein, in denen die gezielte Modulation der Apoptose als therapeutisches Prinzip bei Patienten mit Pankreaskarzinomen eingesetzt werden kann.

Paget's disease of the bone is a disorder in which there is marked increase in bone turnover by activated osteoclasts in localized parts of the skeleton. The newly formed bone is abnormal in structure and mineralization resulting in deformity and increased risk of fracture. The prevalence of the disease has decreased over the last 20 years to 2% in patients over 55 years of age. The etiology of the disease is still unknown. There is strong evidence for viral infection, but recently a genetic disposition has also been discussed. There are important advances in the understanding of the pathophysiology of Paget's disease. increased sensitivity of osteoclast-precursors to 1,25(OH)2Vitamin D3 and RANKL, mediated by IL6 have been described as a possible mechanism. For the diagnosis of the disease the finding of an elevated level of plasma alkaline phosphatase as a marker of increased bone turnover is of great importance. This parameter is also used for monitoring disease activity during therapy. Plain radiology and skeletal scintigraphy are necessary for the diagnosis. CT and MRT can be useful in specific cases. In the last decade bisphosphonates have increasingly assumed--according to their mechanism of action--the prime role in the management of Paget's disease. Recently, more potent bisphosphonates have been developed and therefore the goal of therapy has changed. Initial response to treatment in terms of reducing activity of alkaline phosphatase to normal levels is associated with increased remission duration. In this respect, risedronate and alendronate have proved superior to etidronate. Bisphosphonates have also been used extensively in the form of intravenous infusion in patients with Paget's disease. Especially when gastro-intestinal side-effects occur with oral medication, this might be useful. However, at present more studies are needed to find the optimal drug, the optimal dose and intervals of i.v. therapy.