1. Evaluierung des Virusstamms Merlin-pAL1502 als Modell für klinische Cytomegalovirus-Isolate
- Author
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Paal, Caroline, Sinzger, Christian, and Essig, Andreas
- Subjects
Chromosomes, Artificial, Bacterial ,Mutagenese ,Virus replication ,Merlin-pAL1502 ,Cytomegalie-Virus ,Cytomegalovirus ,Replikation ,Humanes Cytomegalievirus ,zellassoziierte Ausbreitung ,Glykoproteine ,Pentamer ,ddc:610 ,klinische Isolate ,DDC 610 / Medicine & health ,Trimer ,Glycoproteins - Abstract
Das humane Cytomegalovirus (HCMV) breitet sich in vivo vermutlich sowohl zellfrei als auch zellassoziiert aus. Während die zellfreie Infektion mit Laborstämmen gut untersucht wurde, ist zum zellassoziierten Modus wenig bekannt. Als Modellvirus hierfür wurde kürzlich der HCMV-Stamm Merlin-pAL1502 entwickelt. Er unterscheidet sich von zellfrei wachsenden Stämmen durch ein niedriges Verhältnis von gO zu pUL128, die als alternative Komplexpartner von gH/gL die Virusausbreitung beeinflussen. Ob die niedrige gO-Expression repräsentativ für zellassoziierte Patienten-Isolate ist, war unklar. In dieser Arbeit sollte ein fluoreszierendes Derivat von Merlin-pAL1502 generiert werden, um Viruspartikel bei der zellassoziierten Ausbreitung zu visualisieren. Im zweiten Teil sollte überprüft werden, ob Merlin-pAL1502 klinische HCMV-Isolate nicht nur bezüglich des Ausbreitungsmodus, sondern auch hinsichtlich der Expression von gO repräsentiert. Das Genom von Merlin-pAL1502 lag als bakterielles artifizielles Chromosom vor. Mittels markerloser Mutagenese wurden das Kapsid-assoziierte pp150 (UL32) und das Hüllglykoprotein M (UL100) mit grün bzw. rot fluoreszierenden Proteinen fusioniert. Das resultierende Virus Merlin-pAL1502-UL32EGFP-UL100mCherry erlaubte es, nackte von umhüllten Viruspartikeln zu unterscheiden. In Anwesenheit eines Hemmstoffes akkumulierten umhüllte Viruspartikel, was für den Transfer umhüllter Viruspartikel bei der zellassoziierten Ausbreitung spricht. Im zweiten Teil wurden mittels quantitativem Westernblot acht klinische HCMV-Isolate und Merlin-pAL1502 bezüglich der Expression der von gO und pUL128 verglichen. Ein Zusammenhang mit dem Wachstum der Isolate und dem Genotyp der polymorphen gO-Proteins wurde durch Herdausbreitungsversuche und Sequenzierung untersucht. Die Expression von gO korrelierte positiv mit der Expression von pUL128, und war bei der Mehrzahl der Isolate signifikant höher als bei Merlin-pAL1502. Unterschiede in der Proteinsequenz von gO konnten die gO-Expressionslevel allein nicht erklären. gO korrelierte nicht mit der Herdgröße, und zellassoziierte Isolate exprimierten gO ähnlich stark wie ein zellfrei wachsender Stamm, was daraufhin deutet, dass eher pUL128 den Ausbreitungsmodus determiniert. Die Ergebnisse dieser Arbeit belegen erstmals einen Transfer kompletter Virionen bei der zellassoziierten Ausbreitung von HCMV, zeigen aber auch, dass es hinsichtlich der gO-Expression lohnend wäre, ein noch besser geeignetes zellassoziiertes Modellvirus auf der Basis der hier analysierten klinischen Isolate zu generieren.
- Published
- 2022
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